Kvantitativa cellbiologi för Neurodegeneration i Drosophila genom förutsättningslös analys av Fluorescently märkta proteiner med hjälp av ImageJ

Summary

Vi har utvecklat en enkel och anpassningsbar arbetsflöde för att extrahera kvantitativ data från fluorescens-imaging-baserade cell biologiska studier av protein aggregering och autophagic flux i det centrala nervsystemet Drosophila modeller av neurodegeneration.

Abstract

Med den ökande förekomsten av neurodegenerativa sjukdomar är det allt viktigare att förstå underliggande patofysiologin som leder till neuronal dysfunktion och förlust. Fluorescens-baserat imaging verktyg och tekniker möjliggör oöverträffad analys av subcellulär neurobiologiska processer, ändå finns det fortfarande ett behov av opartisk, reproducerbar och tillgängliga metoder för att extrahera kvantifierbara data från studier avbildning . Vi har utvecklat en enkel och anpassningsbar arbetsflöde för att extrahera kvantitativ data från fluorescens-baserat imaging studier Drosophila modeller av neurodegeneration. Specifikt, beskriver vi en lätt att följa, halvautomatisk metod med Fiji/ImageJ för att analysera två cellulära processer: först, vi kvantifiera sammanlagda proteinhalten och profil i den Drosophila optic LOB med lysrör-taggade mutant huntingtin protein; och för det andra, vi bedöma autofagi-Lysosomen flux i Drosophila visuella systemet med proportionerlig-baserade kvantifiering av tandem fluorescerande reporter av autofagi. Ännu viktigare, innehåller protokollet beskrivs här ett halvautomatiskt segmentering steg för att säkerställa alla fluorescerande strukturer analyseras att minimera urval bias och öka upplösning av subtila jämförelser. Detta tillvägagångssätt kan förlängas för analys av andra cell biologiska strukturer och processer inblandad i neurodegeneration, såsom proteinhaltiga puncta (stressgranula och synaptic komplex), samt som membran-bundna fack (mitokondrier och membranet människohandel blåsor). Denna metod ger en standardiserad, men anpassningsbar referenspunkt för bildanalys och kvantifiering, och kunde underlätta pålitlighet och reproducerbarhet över fältet, och som i slutändan förbättra mekanistisk förståelse av neurodegeneration.

Introduction

Neurodegenerativa sjukdomar drabbar miljontals människor varje år och incidensen ökar med en åldrande befolkning¹. Medan varje neurodegenerativ sjukdom har en unik etiologi, är aggregering av felveckning proteiner och uppdelning av proteostasis nätverket gemensamma patologiska kännetecken för många av dessa sjukdomar. Belysa hur störningar av dessa grundläggande och inbördes relaterade processer går snett är för att bidra till neuronal dysfunktion och cell död kritisk för förståelse neurodegenerativa sjukdomar samt vägledande terapeutiska interventioner. Fluorescens-baserat imaging möjliggör undersökning av dessa komplexa och dynamiska processer i nervceller och har starkt bidragit till vår förståelse av neuronala cellbiologi. Analys av fluorescently märkta proteiner är utmanande, särskilt när experimenten utförs i vivo, på grund av mycket kompakta vävnader, olika celltyper och morfologiska heterogenitet. Manuellt assisterad kvantifiering är prisvärda och enkla, men är ofta tidskrävande och föremål för mänsklig partiskhet. Därför finns det ett behov av opartisk, reproducerbar och tillgängliga metoder för att extrahera kvantifierbara data från studier avbildning.

Vi har sammanställt en enkel och anpassningsbar arbetsflöden med Fiji/ImageJ, en kraftfull och fritt tillgängliga bildbehandling programvara^2,3, extrahera kvantitativ data från fluorescens imaging studier i experimentella modeller av neurodegeneration använda Drosophila. Genom att följa detta protokoll för att kvantifiera protein aggregering och autophagic flux — två cell biologiska funktioner som är mycket relevanta för neurodegenerativa sjukdomen patologi — vi visat känslighet och reproducerbarhet av detta synsätt. Analysen av fluorescently märkta muterade huntingtin (Htt) proteiner i den Drosophila optic loben visade antal, storlek och intensitet av protein aggregat. Vi visualiserat en tandem fluorescerande reporter på autophagic flux i Drosophila visuella system, som visar olika utsläpp signaler beroende på den compartmental miljö⁴. Proportionerlig-baserad analys av tandem reporter tillåtet för en kvantitativ och heltäckande bild av autofagi-Lysosomen flux från autophagosome bildning, mognad och transport till nedbrytning i lysosomen, och dessutom markeras utsatta fack störs i neurodegenerativa sjukdomar. Ännu viktigare, i båda analyser genomfört vi semi automatiserade tröskelvärde och segmentering steg i våra protokoll till minimera omedvetna fördomar, öka provtagning makt och ger en standard för att underlätta jämförelser mellan liknande studier. Det enkla arbetsflödet är avsedd att göra kraftfulla Fiji/ImageJ plugins (utvecklat av datavetare som baseras på matematiska algoritmer) mer tillgängliga för neurobiologists och biovetenskap samhället i stort.

Protocol

1. överväganden och preparat för att utforma bild analys experimentet

1. Förbestämma lämplig anatomisk, mobilnät eller subcellulär markörer att tjäna som landmärken för att standardisera en region av intresse (ROI) över olika prover, till exempel 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI), membran markörer, lokaliserade lysrör protein, m.m.
2. Välj en fluorescerande markör som kan avgränsa diskret puncta bortom bakgrundsnivåerna för strukturera av intresse.
   Obs: Detta protokoll är optimerad för proteinhaltiga strukturer (t.ex., felveckning protein aggregat) och membran-bundna organeller (t.ex., autofagi reporter). För att visualisera protein aggregering, var en RFP-märkta N-terminala fragment av humant Htt protein med en patogen polyQ tarmkanalen av 138 repetitioner (RFP-hHttQ138) används⁵. Det muterade Htt-proteinet bildar cytoplasmiska aggregat uttryckt under neuronal specifika drivrutiner som elav-GAL4^5,6. För att visualisera autophagosome-Lysosomen flux, användes Aktin-GAL4 ubiquitously köra uttrycket av tandem mCherry-GFP-Atg8a reporter. mCherry - och GFP-positiva puncta indikerar autophagosomes, och flux övervakas som GFP fluorescens är kylda i den sura miljön i lysosomen, där syra-okänsliga mCherry förblir tills proteinet är degraderad⁷. För proportionerlig analys, kan en enda kanal som är en konsekvent markör av strukturen användas för segmentering eller om så är lämpligt en projektion av två eller fler kanaler kan användas för att avgränsa strukturer, men inte uttryckligen beskrivs i detta protokoll. I det här exemplet används mCherry för segmentering av Atg8-positiv partiklar, eftersom det är syra-okänsliga och förblir i kupén i hela flux via vägen.
3. Ladda ner och installera öppen källkod bild analysplattform ImageJ eller Fiji – Rekommenderad distribution av ImageJ med medföljande plugins^2,3.
4. Installera plugin för h-maxima interaktiva vattendelare.
   Obs: Detta protokoll använder Fiji; ytterligare plugins kan krävas för ImageJ. Plug-in utvecklat av Benoit Lombardot för SCF-MPI-CBG är tillgängliga online (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Navigera till ”hjälpa | Uppdatera ”, välj” Hantera uppdatering webbplatser ”från” ImageJ Updater ”, välja av SCF-MPI-CBG Update från listan, Stäng och starta om Fiji.

2. hjärnan dissektion och immunofluorescens färgning

1. Göra silikon elastomer-fodrade dissektion rätter.
   1. Häll silikon elastomer komponenter i en bägare som anges av tillverkaren och rör om väl tills blandas ordentligt.
   2. Använd en pipett för att fylla 5 cm vävnadsodling rätter en tredjedel till hälften full (ca 10 mL av elastomer blandning). Att eventuella bubblor att stiga upp till ytan och ta försiktigt bort med läskpapper. Täcka rätterna och placera dem på en plan yta att bota för 48 – 72 timmar vid rumstemperatur (RT).
2. Dissekera Drosophila hjärnan och visuella systemet om det behövs.
   1. Utföra Drosophila hjärnan dissektion som tidigare beskrivits^8,9. Utföra dissektion i elastomer-fodrade dissektion rätter, med en elastomer botten för att stabilisera hjärnan för att undvika skadlig vävnad eller pincett.
   2. För att hålla lamina intakt under dissektion, Skjut två pincett under näthinnan och försiktigt riva genom mitten av ögat för att ta bort näthinnan. Dra bort eventuella näthinnevävnad bifogas lamina med pincett hållas parallell med lamina ytan.
      Obs: Resterande pigment kommer att tvätta bort i följande steg och vanligtvis stör inte antikropp färgning och imaging.
   3. Späd 37% formaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att göra en slutlig koncentration på 3,7% färska före användning i ett 500 µL mikrocentrifug rör. Överföra dissekerade hjärnan till mikrocentrifug rör med fix-lösning och inkubera i 15 min på RT med mild gunga.
      Obs: Formaldehyd har en naturlig tendens att oxideras, producerar myrsyra. Därför är det förslag till alikvot på 37% formaldehyd för lagring och späd till 3,7% färska före varje användning. Överdriven fixering eller under fixering kommer påverka integriteten av vävnad och fluorescens¹⁰.
   4. Tvätta 3 gånger med PBTx (PBS med 0,4% Triton x-100) för 15 min varje.
3. Utföra immunohistokemi och montera exemplar.
   1. Om antikroppar färgning behövs, ta bort PBTx, Lägg till primär antikropp utspätt i PBTx med 5% normala get serum och ruva på en delmängd mixer över natten vid 4 ° C.
   2. Avlägsna primär antikropp och tvätta 3 gånger med PBTx för 15 min varje. Lägg till sekundära antikroppar utspätt i PBTx med 5% normala get serum och inkubera i 1 h på RT eller över natten vid 4 ° C. Tvätta 3 gånger med PBTx för 15 min varje.
   3. Om DAPI färgning behövs, ta bort PBTx, tillsätt DAPI lösning (stamlösning: 5 mg/mL, späd till en fungerande koncentration på 15 µg/mL i PBTx), och inkubera i 10 min vid RT. Wash 3 gånger med PBTx för 15 min varje.
   4. För att klara vävnaden, placera en droppe monteringsmedium på mitten av en mikroskopi bild med ett mellanlägg av ett lager av klar tejp på båda sidor. Överföra hjärnan på släpp av monteringsmedium och vänta 1 – 2 min tills hjärnan blir transparent. Ta försiktigt bort monteringsmedium med en pipett.
   5. För att montera, applicera en droppe av färska monteringsmedium på hjärnor i bilden. Noggrant överlagra en skyddsglaset att undvika bubblor. Försegla kanterna med gummi cement och lufttorka på RT för 20 min. Fortsätt till bild förvärv för bästa resultat.

3. bild förvärv

1. Optimera Mikroskop förvärv parametrar, inklusive rumslig upplösning, objektiva, zoom, avsökningen fart, och steg storlek, att maximera upplösning av strukturerna för intresse att underlätta halvautomatisk segmentering under bildanalysen.
   Obs: Det kan vara användbart för att fånga en exempelbild och testa halvautomatisk segmentering (i steg 5 i detta protokoll) innan imaging alla experimentella prover. På detta sätt kan användaren justera imaging inställningar så att analytiska verktyg kan lätt urskilja den biologiska strukturen av intresse.
2. Justera detektorn bildkontroller för att fånga den högsta signal-brus-förhållande och högsta dynamiska omfånget av preparatet.
   1. Använd en LUT (se tabell) som anger pixel mättnad (exponering för hög) eller undersaturation (offset för låg) medan du justerar inställningar (figur 3B, röd anger pixel mättnad av en Hi/Low LUT).
   2. Kontrollera inställningarna för gain och offset är lämpliga för alla experimentella grupper, som experimentella manipulationer sannolikt förändrar strukturen på intresse.
      Obs: Det är absolut nödvändigt att samma inställningar används för alla grupper för att göra kvantitativa jämförelser.
3. Bild genom vävnaden att fånga alla data.
   Obs: Det rekommenderas att fånga alla tillgängliga data under en bildsession och definiera en mer exakt område under ROI urval i Steg4 om det behövs.
4. Spara bilden som filtyp stöds av avbildningsprogrammet för att bevara metadata såsom förvärv parametrar och rumsliga kalibrering. Spara bilden med ett filnamn inklusive experimentella datum, genetisk bakgrund och fluorescerande reportrar, antikroppar eller färgämnen motsvarar kanaler skannade såsom [experimentella gruppnamn] _ [Specimen namn] _ [Experiment datum] _Ch1. [Fluorophore-målet /Dye]_Ch2.[fluorophore-Target/Dye], m.m.

4. Fiji/ImageJ Image-Import och ROI urval

1. Öppna en bild i Fiji. Använda dialogrutan ”Bio-format importalternativ”, Välj ”Visa stack med: Hyperstack” och ange ”färgläge: gråskala”.
   Obs: Det rekommenderas att öppna filtypen Mikroskop, som metadata såsom rumsliga kalibrering kan läsas av Fiji.
2. Identifiera ett område från ett enda z-plan eller en Framskrivning baserad på den markör kanal som kan användas som en standardiserad ROI över exemplar (figur 1, ROI urval).
   1. Använd ”C” rullningslisten för att visa den kanal som används för att fånga de marker(s) som anges i steg 1,1.
   2. Använd ”Z” rullningslisten för att flytta genom de fokala plan. Välj en cirkelsektor eller skapa en projektion av flera segment genom att klicka på ”bild | Stackar | Z-projekt ”och ange” Start slice ”och” Stop slice ”till att omfatta ROI.
      Du ställer in den ''projektion-typ ”till” Max intensitet ”i projektet” Z ”dialogrutan passar ofta bäst för att betona strukturer för segmentering i avsnitt 5, även om detta inte kanske är lämplig för alla program. Om en annan typ av projektion krävs för analys, ta hand att spara och dokumentera denna fil som sådan för funktionen utvinning i avsnitt 6 och 7.
   3. Generera en ny bild som innehåller kanalerna och fokal plane(s) av intresse att förenkla följande steg i protokollet bild analys. Välj ”bild | Duplicera ”, ange önskad” kanaler ”(c) och” skivor ”(z), och ändra filnamnet att återspegla markeringen (t.ex., det [experimentella gruppnamn] _ [Specimen namn] _ [experimentera date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
3. Använd någon av de ”urval verktyg” i verktygsfältet Fiji att manuellt välja en standardiserad ROI utifrån de urvalskriterier som anges i steg 4,2.
4. Lägg ROI ROI chefen genom att klicka ”analysera | Verktyg | ROI Manager ”och klicka” Lägg till ”på ROI Manager-menyn. Spara ROI ROI Manager på menyn genom att klicka på ”mer | Spara ”och döp filen till reflektera ROI (t.ex., [experimentella gruppnamn] _ [Specimen namn] _ [Experiment datum] _ [kanal] _ [z-plane(s)] _ [ROI Beskrivning]).
   Obs: Detta kan återupptas i Fiji för senare analyser eller kan tillämpas på andra kanaler eller bilder som i avsnitt 5.3.

5. förbehandling och segmentering med h-maxima Watershedding

1. Utför förbehandling på den kanal som används för att fånga strukturerna av intresse.
   1. Om bildfilen består av flera kanaler, separata kanaler genom att klicka på ”bild | Färg | Dela kanaler ”att isolera kanal av intresse.
   2. Tillämpa ett filter såsom en median filter för att minska buller eller Gaussisk oskärpa för utjämning genom att klicka på ”processen | Filter | Filtertypen ”(t.ex.,” Median Filter ”eller” Gaussian Blur ”).
      1. Prova olika filter och filtrera parametrarna på bilder från varje experimentella gruppen. Gå igenom steg 6,2 med ett representativt exempel från varje grupp att kontrollera segmentering prestanda. Välj filter och inställningar som underlättar segmentering av strukturerna för intresse.
   3. Registrera filter och inställningar. Applicera dessa parametrar över experimentella grupper.
   4. Spara en kopia av bilden som en tiff-fil inklusive tillämpade filtret för referens. Använda en detaljerad namn såsom [experimentella gruppnamn] _ [Specimen namn] _ [Experiment datum] _ [kanal] _ [z-plane(s)] _ [Filter med parametrar].
2. Utföra segmentering av strukturer av intresse med verktyget interaktiv h-maxima vattendelare på förbehandlas bilden skapas och sparas i steg 5.1.
   1. Starta verktyget h-maxima interaktiva vattendelare med förbehandlas bilden aktiva i Fiji, genom att klicka på ”SCF | Märkning | Interaktiva H_Watershed ”.
      Obs: Denna plugin beräknar först vattendelare och sedan tillåter användaren att undersöka effekterna av lokala maxima och tröskel alternativ på segmentering genom en direkt uppdaterad bild.
   2. Från Kontrollpanelen, justera utsäde dynamics (h), intensitet tröskel (T) och peak översvämningar (%) för att optimera segmentering.
      Obs: Se alltid raw-bild innan förbehandling från avsnitt 4.2 manuellt inspektera utförandet av segmentering av strukturerna för intresse.
   3. När nöjd med segmentering resultat, välj ”Exportera regioner mask” och välja ”exportera”. Detta genererar en binär bild av vattendelare resultaten (figur 1, segmentering).
   4. Registrera de segmentering parametrarna; dessa parametrar måste tillämpas över experimentella grupper för kvantitativa jämförelser. Spara binära resultat masken om så önskas för referens med segmentering parametrar beskrivs i namnet till exempel [experimentella gruppnamn] _ [Specimen namn] _ [Experiment datum] _ [kanaler] _ [z-plane(s)] _ [Filter med parametrar] _ [H_Watershed parametrar].
3. Extrahera strukturerna av intresse från vattendelare resultaten.
   1. Öppna den Spara ROI från steg 4,4, i ROI manager. Med den binära regioner masken från steg 5.2.4 aktiv, Välj ROI ROI chefen att tillämpa på bilden för att begränsa funktionen utvinning till standardiserade ROI.
   2. Med ROI aktiva på binära vattendelare masken, välja ”analysera | Analysera partiklar ”med” Lägg till Manager ”markerat i dialogrutan Extrahera funktioner.
      Obs: Detta kommer att lägga en partikel identifierare för varje struktur avgränsad under segmentering till ROI Manager. Alternativ är tillgängliga på den här menyn att utesluta funktioner baserat på storlek eller loopkontroll om behövs för att förfina strukturer ingår i analysen.
   3. Spara partiklarna genom att klicka på ”mer | Spara ”från menyn ROI manager. Säkerställa att identifierare är avmarkerat och alla partiklar kommer alla att sparas i en zip-fil. Använda en detaljerad namn såsom [experimentella gruppnamn] _ [Specimen namn] _ [Experiment datum] _ [kanaler] _ [z-plane(s)] _ [Filter med parametrar] _ [H_Watershed parametrar] _ [strukturer].

6. kvantitet, område, och intensitet kvantifiering och analys

1. Öppna raw bilden skapas och sparas i steg 4,2. Bläddra till den kanal som används för att fånga strukturerna av intresse.
   Obs: Det är viktigt att ta intensitet mätningar från raw-bilden (innan förbehandling) som tillämpa filter i steg 5.1 ändras pixelvärdena.
2. Öppna de partiklar erhålls från funktionen utvinning i steg 5.3 och välj ”Visa alla” från ROI Manager.
   Obs: Denna åtgärd kommer att överlagra en disposition av varje partikel på ”ROI Manager” på bilden och ska matcha kanterna av intresse (figur 1, funktionen extraktion) strukturer.
3. Ange de önskade mått genom att klicka på ”analysera | Ange mått ”.
   Obs: Det område, intensitet och täthet av partiklar kan mätas genom att välja ”område” och ”integrerad täthet”. När integrerad täthet väljs, Fiji kommer att producera två värden: 'Integrerad täthet' beräknas som produkten av området och grå medelvärdet och 'Raw integrerad täthet' mätt som summan av pixelvärdena. Täthet av fluorescerande protein i partiklar beräknas som summan av pixelvärdena dividerat med området. Antalet partiklar som genereras i steg 5.3 anger mängden partiklar inom vävnaden ROI definierade i steg 4,4.
4. Välj ”åtgärd” från menyn ROI Manager. Resultaten uttrycks i kalibrerade enheter så länge mätningarna är tagna från filer som härleds i Fiji från avbildningsprogrammet. Kopiera resultatet från resultatfönstret och klistra in i kalkylprogram för sammanställning och ytterligare beräkningar.

7. proportionerlig kvantifiering och dataanalys

1. Följ steg 6.1 och 6.2 öppna partikel identifierare på den första raw kanalen av intresse.
2. Ange de önskade mått genom att klicka på ”analysera | Ange mått ”.
   Obs: Genomsnittliga intensiteten per partikel kan mätas genom att välja ”menar grå värde”.
3. Från ROI Manager Välj ”mått”. Kopiera data från resultatfönstret och klistra in i kalkylprogram.
4. Flytta rullningslisten ”C” till den andra raw kanalen av intresse, god Jordbrukarsed i det här exemplet (figur 4A), och upprepa steg 7,2. och 7.3.
   Obs: Partiklarna sparade i steg 5.3 standard kanalen och skiva från vilket det skapades. Se noga till partiklar används till rätt kanal av intresse.
5. Beräkna förhållandet mellan intensiteten från en kanal till intensiteten av andra för varje partikel i kalkylprogram.
6. Använd ett spridningsdiagram att visualisera och kvantifiera proportionerlig data från fluorophores som uppvisar individuella förändringar reflekterande av underliggande biologiska processer.
   1. Generera ett spridningsdiagram i grafritande programvaran.
      Notera: Varje datapunkt representerar en struktur av intresse där intensiteten i den första fluorophore sevärdheter är värdet ”x” och andra fluorophore intensitet är ”y värde” mätt från varje partikel.
   2. Ange gating tröskelvärden för varje fluorophore att definiera kvadranterna.
7. Använd linje profil för att visualisera fluorophore intensitet över en struktur av intresse.
   1. Välj en ROI som genereras i steg 5.3 och Använd verktyget straight-line verktygsfältet Rita en rak linje genom ROI. Lägg till rad ROI till ROI Manager.
   2. För varje kanal av intresse, med linjen ROI aktiv, Välj ”analysera | Rita profil ”.
      Obs: Funktionen tomt profil genererar en histogram tomt och en tabell över värden för intensiteten längs linjen. Kopiera resultatet mätt från varje kanal och klistra in i kalkylprogram att generera en tomt som visar båda kanalerna längs linjen.

Representative Results

Kvantifiering av antal, yta och intensiteten i fluorescently märkta mutant Htt aggregerar i den Drosophila optic loben

Att undersöka felveckning protein aggregation i centrala nervsystemet en Drosophila modell av Huntingtons sjukdom, RFP-taggade mutant mänskliga Htt med en icke-patologiska (UAS-RFP-hHttQ15) eller patologisk expansion ( UAS-RFP-hHttQ138) och membran GFP (UAS-mCD8::GFP)¹¹ var samtidig uttryckt under en pan-neuronala driver elav-GAL4. Hjärnan hos kvinnliga flugor 2 dagar efter eclosion (DAE) var dissekeras, fast och fläckade DAPI enligt avsnitt 2 i protokollet. Confocal microscopy för laserscanning utfördes med fokus på den optiska LOB med 40 X objektiv nedsänkning för olja, 1.30 numeriska bländaröppningen (NA), använder en scan hastighet på 8,0 µs per pixel och rumslig upplösning på 1024 x 1024 pixlar (12 bitar per pixel). Den optimala stegstorlek bestäms genom bildprogram var 1,08 µm per segment för syftet med följande kombination av excitation/utsläpp våglängder: kanal 1) 488/510 för GFP, kanal 2) 543/581 för RFP och kanal 3) 405/461 för DAPI. Bild detektor inställningar tillämpas på alla grupper för att fånga bilder som är lämplig för jämförelser, baserades på en RFP-Htt-Q138 exemplar, som ackumuleras högintensiv RFP-Htt aggregat, i stället för ett icke-patogena RFP-Htt-Q15 kontroll exemplar, som upprätthåller låga nivåer av diffusa RFP-Htt (figur 2). Om förvärvet bildinställningar var inställt att maximera det dynamiska omfånget av en RFP-Htt-Q15 exemplar, då RFP-Htt-Q138 aggregaten skulle vara mättad. Som ett exempel sparades en Mikrograf av protein aggregation i den Drosophila optic loben som HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.

Den hela optic LOB var avbildad under mikroskopi och bestod av ca 15 z-skivor, men efter imaging bestämdes att analysera en enda z-plan var bäst att lösa enskilda strukturer som annars verkar överlappande i en projektion på grund av hög densitet inom vävnaden. För att avgöra en standardiserad ROI, användes C2 och C3 cell organ ligger mellan medulla och lobula plattan av optic LOB¹² som en anatomisk landmärke. I Fiji, bilden var således dubbleras för att återspegla krav som analys och sparades som en tiff-fil med namnet HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, där z8 återspeglar den åttonde biten där C2 och C3 neuronala cell kroppar var de flesta framträdande av DAPI färgning (figur 1A, bild förvärv). Polygon markeringsverktyget användes för att manuellt välja en ROI runt på optic LOB med DAPI färgning och neuronala GFP signal som en guide (figur 1A, ROI urval, där gult indikerar ROI och röda designerar hög förstoring bilden för klarhet i följande paneler av arbetsflödet). Nästa, en Gaussian Blur-filter med σ värdet 1 tillämpades till RFP-Htt kanal att släta bilden och underlätta segmentering (figur 1A, förbehandling) och utförandet av nedströms segmentering och funktionen extraktion med och utan detta förbearbetning steg illustreras i figur 1A. Interaktiva H-vattendelare utfördes på bilder av RFP-Htt kanalen med följande parametrar: utsäde dynamics, 30; intensitet tröskel, 500; topp översvämningar (i %), 80; med 'Tillåt splitting' och 'exportera regioner mask' valda (figur 1A, segmentering). Resulterande binära regioner masken sparades som HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent och används för att generera partiklar med verktyget analysera partiklar med en minimistorlek uteslutandet av 0,4 µm² att definiera protein aggregat^13,14 . De resulterande partiklarna räddades från ROI chefen som HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates och tillämpades på raw RFP-Htt-kanal (före förbehandling) för att extrahera kvantitativa imaging data (figur 1A, funktionen extraktion).

Kvantifiering av antalet halvautomatiskt segmenterade RFP-Htt aggregat från standardiserade fokal plan genom den optic LOB i Drosophila avslöjade diffust uttryck av icke-patogena Htt-Q15 expansion och ansamling av protein aggregat av sjukdomsframkallande Htt-Q138 expansion (figur 2A-C). Summan av alla pixelvärden i varje partikel som ges av 'Raw integrerad täthet' användes för att jämföra RFP-Htt innehållet i varje aggregat. Storlek och intensitet profiler av alla aggregat från en standardiserad fokalplan fem olika optic lober uttrycker Htt-Q138 illustrera den robusthet och reproducerbarhet av detta arbetsflöde (figur 2D, E). Särskilt när aggregaten var överexponerad under Bild Förvärvandet (figur 3A, B), kvantifiering av storlek och antal aggregat är jämförbara aggregat fångas med perfekt exponering (figur 3 c, D), men den intensitet av överexponerad aggregaten blir en funktion av storlek som mättade pixlar uppvisar maximal intensitetsvärdet (figur 3E, F). Inrätta lämpliga genomsökningsparametrar av exponering är därför avgörande för att extrahera hela skalan av kvantitativa molekylära sammansättning av protein aggregat.

Proportionerlig-baserade kvantifiering av autofagi flux i den Drosophila visuella lamina med en tandem fluorescerande Atg8a reporter

För att bedöma autofagi-Lysosomen flux i Drosophila visuella systemet, mCherry-GFP-Atg8a reporter uttrycktes ubiquitously i kontroll eller Drosophila spermine synthase (DSM-moduler) homozygota mutant (modul^e/e) flyger med Aktin-GAL4 förare. DSM-moduler^e/e flyger utställning neurodegeneration som är associerad med nedsatt autophagic flux på grund av lysosomala dysfunktion¹⁵. Hjärnor med bifogade lamina av kvinnliga flugor på 5 DAE var dissekeras, fast och fläckade DAPI. Lamina fotograferades av laserscanning konfokalmikroskopi med en 100 X olja nedsänkning objektiv, 1,35 numeriska bländaröppningen (NA), vid en provtagning hastighet 8,0 µs per pixel, och 12 bitar per pixel optisk upplösning och stegstorlek på 1,2 µm.

Denna analys utfördes på en max z-projektion av sju z-skivor genom lamina att öka provtagning makt glesa Atg8-positiv strukturer (figur 1B, bild förvärv). Den standardiserade ROI drogs manuellt med polygon markeringsverktyget runt cellkroppen lagret avslöjats DAPI och baserat på välkarakteriserad anatomi och cellulära organisation av vävnad (figur 1B, ROI urval, där gult indikerar den ROI och röda designerar hög förstoring bilden för tydlighet i följande paneler av arbetsflödet)¹⁶. Tandem reportern är beroende av egenskaperna stabilitet av god Jordbrukarsed och mCherry beståndsdelarna att markera progression genom autofagi-Lysosomen vägen, sådan att GFP är kylda av surhetsgraden i lysosomen där mCherry förblir tills det bryts. Därför användes 297Uuo mCherry fluorophore för segmentering i detta protokoll. En Gaussian Blur-filter med σ värdet 1 tillämpades på kanalen mCherry (figur 1B, förbehandling) och interaktiva H-vattendelare utfördes med följande parametrar: utsäde dynamics, 0; intensitet tröskel, 800; topp översvämningar (i %), 90; med 'Tillåt splitting' och 'exportera regioner mask' valda (figur 1B, segmentering). Resulterande binära regioner masken användes för att generera partiklar med verktyget analysera partiklar. De resulterande partiklarna tillämpades till både raw mCherry och rå GFP kanaler (före förbehandling) för att extrahera kvantitativ proportionerlig data från autofagi-Lysosomen fack (figur 1B, funktionen extraktion).

Visuell inspektion av mCherry-GFP-Atg8-positiva strukturer anges anrikning i regionen cellkroppen av lamina, överensstämmer med tidigare rapporter av retrograd transport av autophagic blåsor till cellkroppen i nervceller¹⁷. Plot profil användes för att visualisera mCherry och god Jordbrukarsed intensitet över flera Atg8-positiv strukturer (se linje ROIs i figur 4A och resulterande intensitet profiler längs linjen i figur 4B), avslöjar skillnader i reportern där hög intensiteten i båda fluorophores anger autophagosomes (figur 4B3), höga mCherry och låga GFP indikerar fusion med Lysosomen som GFP är härdas i detta sura fack (figur 4B1), och slutligen låg mCherry återspeglar nedbrytning inom Lysosomen (figur 4B2). Ett spridningsdiagram som genereras från medelvärdet fluorophore intensiteten i varje halvautomatiskt segmenterad mCherry-Atg8-positiv partikel illustrerar flöde genom autofagi-Lysosomen vägen som var sedan separeras i diskreta steg genom quadrant analys ( Figur 4 c). Tomten var uppdelad i fyra kvadranter använder Usenets trösklar av GFP = 570, mCherry = 1 800. Trösklarna var ställa baserat på kontrollgruppen använder följande huvudmännen: (1) utformningen av tandem fluorescerande reportern och egenskaper för de två fluorophores, så att teoretiskt GFP bör fluorescerar inte där ingen mCherry signal (kvadrant IV) och (2) fördelningen av Atg8-positiv partiklar speglar fördelningen av autofagi-Lysosomen väg-relaterade fack i vildtyp nervceller där basala autofagi är högeffektiva^18,19. I laminas kontroll flugor, omkring 25% av Atg8-positiva partiklarna var kastas i papperskorgen som autophagosomes (kvadrant jag), och hälften av puncta bearbetas bortom autophagosome-Lysosomen fusion (kvadrant II och III); DSM-moduler^e/e laminas hade ökat betydligt autophagosomes eller dysfunktionella lysosomer (kvadrant jag) och minskade autolysosomes (kvadrant II och III), tyder på autophagosome ackumulering genom defekter i autophagosome-Lysosomen fusion och/eller lysosomal nedbrytning (figur 4 C, D). Kvantitativa data stöds också uppenbar ackumulering av Atg8-positiv strukturer i lamina från DSM-moduler^e/e flugor (figur 4E). Proportionerlig analys av genomsnittlig mCherry och god Jordbrukarsed signal belyste en skillnad mellan kontroll och modul^e/e grupp (figur 4F) men kunde inte i detalj den totala påverkan på vägen eller de specifika steg som avslöjades av den kvadrant analys.

Figur 1: Arbetsflödes bias-minimeras, halvautomatisk segmentering av subcellulära strukturer i Drosophila hjärnan med exempel Fiji. (A) representativa confocal micrographs från enda fokalplan genom den optic loben av en Drosophila vuxna hjärnan att uttrycka panorera neuronala RFP-taggade mutant Htt och membran-riktade GFP (elav-GAL4 > UAS-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) med DAPI färgning (bild förvärv). DAPI och GFP användes för att markera en ROI (gul) runt den optic loben; röda rutan anger regionen förstoras genom arbetsflöde för tydlighet (ROI val). Förbearbetning panelen visar hög förstoring av raw-bild av RFP-HttQ138 kanal (överst) och efter applicering av en Gaussian Blur-filter, σ1 (nederst). Segmentering av interaktiva h-maxima vattendelare med angivna parameterinställningarna för utsäde dynamics bestäms av h-maxima (h), global vattendelare stopp kriterier fastställs av intensitet tröskel (T), och regionala stopp kriterier avgörs av högsta översvämningar) %) utförs på RFP-HttQ138 raw (överst) och Gaussisk suddig (nederst) bilder och vattendelare resultat från regioner mask exporteras från vattendelare plugin och inverterad för tydlighet. Partiklar som genereras av analysera partiklar (magenta) överlagras på RFP-HttQ138 raw-bilder (funktionen extraktion). Pilarna anger aggregat som är alltför segmenterade utan förbehandling och pilspetsar indikerar strukturer som misslyckas att skilja efter filtrering. (B) representativa confocal micrographs från maximal z-projektion av 7 fokal flygplan genom den horisontella delen av lamina av en kontroll- och mutant (modul^e/e), Drosophila vuxna uttrycker allestädes närvarande GFP-mCherry-Atg8a ( aktin-GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8) med DAPI färgning (bild förvärv). DAPI användes för att markera en ROI (gul) runt cellkroppen lagret av lamina; röda rutan anger regionen förstoras genom arbetsflöde för tydlighet (ROI val). Förbearbetning panelen visar hög förstoring av mCherry kanal med Gaussisk oskärpa filter, σ1 tillämpas på både kontroll och muterade lamina. Segmentering av interaktiva h-maxima vattendelare utföras på filtrerade mCherry bilder med de angivna parameterinställningarna och vattendelare resultat visas som binära regioner mask inverterad för tydlighet. Partiklar som genereras av analysera partiklar (magenta) överlagras på raw mCherry och god Jordbrukarsed bilder (funktionen extraktion). Skala barer = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 2: kvantifiering av storlek och intensitet av muterade RFP-Htt aggregat är robust och reproducerbara. (A-B) Drosophila hjärnor med RFP-hHttQ15 (A) eller RFP-hHttQ138 uttryck (B) under en pan-neuronala driver elav-GAL4 var dissekeras och fast och optic loberna var fotograferad av laserscanning konfokalmikroskopi. Skalstapeln = 50 µm. (C) det genomsnittliga antalet aggregat i varje grupp kvantifieras från ett manuellt valda ROI runt på optic LOB och fokuserade på en standardiserad z-slice (n = 5). (D-E) Storlek (D) och totala intensiteten (E) i RFP-hHttQ138 aggregat kvantifieras från standardiserade ROIs i optic loberna av 5 olika djur. Aggregerade data plottas i logaritmisk skala. Aggregat definierades som objekt större än 0,4 µm² (streckad linje d). Statistisk analys, envägs ANOVA, NS: inte betydande; a.u.: godtyckliga enhet vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 3: bild överexponering leder till felaktiga intensitet mätningar. (A-B) Representativa confocal Mikrograf av den samma optic lobe med perfekt exponering (A) och överexponering (B) pseudocolored med den HiLo LUT i Fiji. Rött i B anger överexponerad aggregat. Skalstapeln = 50 µm. (C) kvantifiering av sammanlagda storlek efter att genomföra h-maxima vattendelare parametrar att generera liknande segmentering resultat. Statistisk analys, oberoende samples t -test, NS: inte betydande. (D) frekvens distribution till den sammanlagda storleken i perfekt och överexponerade bilder. Aggregat med en storlek från 5 till 25 µm² var ytterligare kastas i papperskorgen i 4 kategoriska grupper. (E -F) Korrelation analys av intensiteten av aggregaten som en funktion av sammanlagda storlek (E). En referenslinje är dragna (svart) när alla pixlar har maximal intensitetsvärdet 4095. Gröna rutan visar aggregat under 10 µm² område visas i F. b: regressionskoefficienten, R²: determinationskoefficienten; a.u.: godtyckliga enhet vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4: Kvantifiering av tandem fluorescerande mCherry-GFP-Atg8a genetiska reporter avslöjar distinkta funktioner av autophagic flux i Drosophila. (A) representativa confocal micrographs av Drosophila lamina från kontroll och modul^e/e muterade flugor ubiquitously uttrycker mCherry-GFP-Atg8a (aktin-GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a) och färgas för DAPI . Streckad boxed områden av lamina cellkroppen lagret visas i hög förstoring (höger). Siffrorna anger representativa Atg8a-positiv strukturer ritas i B och kvantifieras i C. (B) Histogram plot av fluorescensintensiteten i godtyckliga enheter (AU) längs linjen ROIs anges i hög förstoring bilder i A. (C) mCherry-GFP-Atg8 strukturer ritas av genomsnittlig GFP intensitet som en funktion av genomsnittlig mCherry intensitet mätt från kontroll och modul^e/e lamina (partiklar mätt från 3 bladskivan från varje grupp). Tomten var uppdelad i fyra kvadranter använder Usenets trösklar av GFP = 570 och mCherry = 1800 med procentandelen av strukturer i varje kvadrant som anges av genotyp. ()D) kvantifiering av den genomsnittliga procentuella andelen mCherry-GFP-Atg8 kategoriseras i varje kvadrant i C (n = 3 lamina). ()E) kvantifiering av numrerar av mCherry-GFP-Atg8 puncta per lamina (medelvärde ± S.D., n = 3 lamina). (F) proportionerlig analys av mCherry-GFP-Atg8 strukturer observerats i kontroll och muterade flyga lamina (menar med 95% CI, n = 3 lamina). Student t-test. P < 0,05, **P < 0,01. Sscale barer = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Protokollet som beskrivs här kan användas för att kraftfullt och reproducibly kvantifiera cell biologiska processer visualiseras av fluorescens-baserad avbildning. Biologiska sammanhang och tekniska begränsningar måste övervägas noggrant vägleda experimentell design. Fluorescerande markörer av subcellulära strukturer av intresse, oavsett om immunhistokemisk, färgämnet-baserade eller genetiskt uttryckt, måste vara åtskiljbar ovan bakgrund av morfologi och intensitet. UAS/GAL4 systemet är allmänt används för att driva riktad genuttryck i Drosophila. De exempel som presenteras här används transgena linjerna bär GAL4 drivrutiner för att aktivera transkription av fluorescently märkta proteiner under kontroll av den UAS förstärkare att undersöka protein aggregering och autofagi i nervsystemet. Om samtidiga uttryck för en experimentell UAS transgenens krävs tillsammans med en fluorescerande reporter transgenens, bör sedan kontrollgruppen även co-överuttryck av en oviktiga transgenens till kontrollen för GAL4 dosering, till exempel UAS-GFP eller UAS-Lindholm. Standardiserade provberedning, är som beskrivs här för Drosophila centralanervsystemet och visuella systemet, från dissektion, fixering, antikropp färgning, genom montering, avgörande för optimal avbildning och kvantifiering.

Bra imaging metoder som maximerar signal-brus-förhållande och dynamiskt omfång är nödvändiga för halvautomatisk analys och är av största vikt för korrekta jämförelser mellan experimentella grupper. Bild förvärv parametrar bör fastställas så att reportern inte är överöstes så att hela skalan av protein intensitet kan utvinnas och kvantifieras (figur 3). För kvantitativa jämförelser, bör avbildning utföras med samma förvärv parametrar och helst samma dag.

ROI urval, bildbehandling, funktionen segmentering och funktionen extraktion med hjälp av öppen källkod plattform ImageJ/Fiji är ansökan-dependent; medan första parametrar måste definieras av användaren, kommer deras tillämpning över exemplar minimera bias samtidigt maximera kvantitativa data utdata. Det är kritiska till noggrant dokumentarbetsflöde och rekommenderas att spara en bild som en tiff-fil efter varje steg med fil namn beskriver tillämpas bearbetning. Detta kan vara särskilt användbart när du arbetar ut protokollet parametrar för första gången och kommer att fungera som en referenspunkt att säkerställa överensstämmelse mellan experimentella grupper vid varje steg i bildbehandling och analys. ROI urvalskriterier använda markörer eller anatomiska landmärken bör definieras från en kontrollgrupp, men försiktighet bör iakttas för att säkerställa att experimentella manipulationer inte förändrar de markörer eller sevärdheter på ett sätt som skulle förhindra tillförlitlig indikation på en standardisera ROI. En cirkelsektor eller en z-projektion av flera segment kan väljas till bäst nå målen om analysen, där en enda fokalplan kan vara användbart att förbättra separation av angränsande strukturer, och en z-projektion kan vara användbart för att analysera strukturer lokaliserade i hela volymen vävnad. Typ av z-projektion som används för segmentering och bildanalys bör noggrant och självständigt bestämmas. En maximal intensitet projektion kommer att producera en skarp bild, eftersom strukturerna är smartaste i planen där de är i fokus, och är oftast väl lämpad för segmentering. Bildanalys kan godtas på en maximal projektion, som i exemplet autofagi-Lysosomen analys; Atg8-positiv strukturer är mindre än storleken steg som används för provtagning, således mest noggrant representeras av maximalstyrkan från enda fokalplan som de fångades. Dock för analys av strukturer som är större än steg, kan en sum-projektion som lägger alla pixlar med samma xy koordinater mer exakt utgör intensitet uppgifter från varje struktur. Detta protokoll är utformat för att analysera en cirkelsektor eller en z-projektion av flera segment i 2D, kunde arbetsflödet anpassas lätt till analysera 3D-strukturer i en z-serien med flera av samma verktyg. 3D-analys vore önskvärt för en liten provstorlek av oregelbundet formade strukturer, där en z-slice som skär snett struktur skulle förvränga analysen.

Förbehandling med filter, såsom de föreslås i detta protokoll, kan minska buller samtidigt bevara kanterna för att underlätta upptäckten av strukturer av intresse under segmentering; bakgrund buller och fluorescerande markör inhomogenitet utan tillräcklig smoothing resulterar i alltför segmentering, medan inställningar som resulterar i alltför mycket oskärpa kommer bort detaljer och förhindra korrekt kant upptäckt. Segmentering av vattendelare anser bilden som en topografisk yta med en vattentäkt på lokala maxima — hög intensitet pixlar i en fluorescerande bild — som översvämningar tills den möter angränsande översvämmade områden där en dam, eller segment gräns, byggs²⁰. H-maxima vattendelare använder en användardefinierad tröskel (h-maxima dynamics i SCF-MPI-CBG plugin) att skilja meningsfull lokala maxima för att undvika alltför segmentering av strukturer som inte har en unik lokal maximala²¹. Interaktiva h-maxima vattendelare plugin genomfört i detta protokoll tillåter användaren att justera h-maxima dynamics (h), global vattendelare stopp kriterier fastställs av intensitet tröskel (T) och regionala stopp kriterier som fastställts av peak översvämningar (%), medan omedelbart Visa vattendelare resultat på en bild att kvalitativt utvärdera segmentering prestanda. Segmentering resultaten noga håller med de flesta struktur gränser, även om både över segmentering och ofullständig separation (figur 1A, röda pilar i funktionen utvinning) kan uppstå där fluorescerande märkning inhomogena eller vävnaden är tätt befolkade. Effektiviteten av halvautomatisk segmentering och analys steg kan utnyttjas för att öka provtagning makt och mildra segmentering fallgropar.

Efter segmentering och funktionen utvinning är det enkelt att extrahera morfologisk information såsom område, dimensioner och loopkontroll. Dessutom om bilder samlas på lämpligt sätt för att undvika överexponering, kan molekylär information också härledas från denna bildanalys av intensitet mätningar. När åtgärder av neurodegenerativa sjukdomen patologi extraheras och kvantifieras enligt detta synsätt, kan dessa åtgärder användas för att ta itu med ett antal viktiga frågor. Specifikt, har protokollet visat potential att använda bildanalys och kvantifiering av protein aggregat för att identifiera faktorer som påverkar protein aggregering och korrelera distribution, antal, storlek och protein densitet av aggregaten med neuronal dysfunktion och organismers hälsa. Proportionerlig-baserade kvantifiering kan användas för att informera sammanlagda interaktion med subcellulära komponenter eller processer under sjukdomsförloppet. Medan biokemiska och flödescytometri har tillämpats för att analysera interaktionen av aggregat och med andra subcellulära strukturer, cellys kan leda till protein förlust, ändra samlade egenskaper och störa protein-protein interaktioner²². mCherry-GFP-Atg8 har använts i stor utsträckning att övervaka autofagi genom fluorescensmikroskopi, särskilt i odlade celler²³, men opartiska och kvantitativa analysmetoder saknas. Dessutom i vivo analys med genetiskt kodade tandem reportern är utmanande och kräver starkt kontrollerad genetisk bakgrund och vävnad förberedelse. Detta protokoll beskriver verifierade metodik från vävnad förberedelse för imaging metoder kritiska att kvantifiera autofagi-Lysosomen fack. Med goda genetiska metoder råd bild analys metoder inklusive Atg-positiv partikel intensitet profiler och kvadrant analys med gating av individuella fluorescerande signaler, kraftfulla upptäckt och jämförelse av normala och patologiska autophagic flux i vivo i olika sjukdomsmodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749