Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

Summary

Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho simples e adaptável para extrair dados quantitativos de estudos biológicos fluorescência-imagem latente-à base de célula de agregação de proteínas e autophagic fluxo no sistema nervoso central de Drosophila modelos de Neurodegeneração.

Abstract

Com a crescente prevalência de doenças neurodegenerativas, é cada vez mais importante entender a fisiopatologia subjacente que leva à perda e disfunção neuronal. Tecnologias e ferramentas de imagem baseada em fluorescência permitem uma análise sem precedentes dos processos neurobiológicos subcellular, no entanto, há ainda a necessidade de abordagens imparciais, reprodutíveis e acessíveis para extrair dados quantificáveis de estudos de imagem . Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho simples e adaptável para extrair dados quantitativos de estudos de imagens baseada em fluorescência usando modelos da drosófila de neurodegeneração. Especificamente, nós descrevemos uma abordagem fácil de seguir, semi automatizada usando Fiji/ImageJ para analisar dois processos celulares: em primeiro lugar, podemos quantificar agregar conteúdo de proteína e perfil no lobo óptico drosófila usando fluorescente-tag mutante huntingtina proteínas; e em segundo lugar, avaliamos o fluxo de autofagia-lisossoma no sistema visual de drosófila com quantificação baseada em ratiometric de um repórter fluorescentes em tandem de autofagia. Importante, o protocolo descrito aqui inclui uma etapa de segmentação semi-automática para garantir que todas as estruturas fluorescentes são analisadas para minimizar o viés de seleção e aumentar a resolução de comparações sutis. Esta abordagem pode ser estendida para a análise de outras estruturas biológicas celulares e processos implicados na neurodegeneração, tais como partitura proteicas (grânulos de stress e complexos sinápticos), compartimentos, bem como membrana-limite (mitocôndrias e vesículas de tráfico de membrana). Este método oferece uma forma padronizada, ainda referência adaptável aponte para análise de imagens e quantificação e poderia facilitar a confiabilidade e reprodutibilidade através do campo e, finalmente, melhorar a compreensão mecanicista da neurodegeneração.

Introduction

Doenças neurodegenerativas afectam milhões de pessoas a cada ano e a incidência está aumentando com uma população de envelhecimento¹. Enquanto cada doença neurodegenerativa tem uma única etiologia, agregação de misfolded proteínas e desagregação da rede proteostasis são comuns características patológicas muitas destas doenças. Elucidar como interrupção destes processos fundamentais e inter-relacionados dá errado contribuir para a morte neuronal de disfunção e célula é fundamental para o entendimento das doenças neurodegenerativas, bem como orientar intervenções terapêuticas. Geração de imagens baseada em fluorescência permite a investigação destes processos complexos e dinâmicos em neurônios e contribuiu enormemente para a nossa compreensão da biologia celular neuronal. Análise de proteínas fluorescente etiquetadas é um desafio, especialmente quando são realizados experimentos na vivo, devido à heterogeneidade morfológica, tipos de diversas células e tecidos altamente compactos. Quantificação manualmente assistida é acessível e simples, mas muitas vezes é demorado e sujeito a viés humano. Portanto, há uma necessidade de abordagens imparciais, reprodutíveis e acessíveis para extrair dados quantificáveis de estudos de imagem.

Nós esboçamos um fluxo de trabalho simples e adaptável usando Fiji/ImageJ, uma software de^2,3, de processamento de imagem poderosa e livremente acessível para extrair dados quantitativos de estudos de imagiologia de fluorescência em modelos experimentais de Neurodegeneração utilizando drosófila. Seguindo este protocolo para quantificar a agregação da proteína e fluxo autophagic — duas células características biológicas que são altamente relevantes para a patologia de doenças neurodegenerativas — temos demonstrado a sensibilidade e a reprodutibilidade desta abordagem. Análise de proteínas fluorescente etiquetado huntingtina mutante (Htt) no lobo óptico Drosophila revelou o número, tamanho e intensidade de agregados de proteínas. Nós visualizado um repórter fluorescentes em tandem de autophagic fluxo dentro do sistema visual de Drosophila , que exibe sinais de emissão diferentes dependendo do ambiente compartimental⁴. Análise baseada em Ratiometric do repórter em tandem permitiu uma visão quantitativa e abrangente de fluxo de autofagia-lisossoma do autophagosome de formação, maturação e transporte para a degradação do lisossomo e adicionalmente destacou vulneráveis compartimentos interrompidos em condições neurodegenerativas. Importante, em ambas as análises implementamos limiarização semi-automático e passos de segmentação em nosso protocolo para minimizar o preconceito inconsciente, aumentar o poder de amostragem e fornecer um padrão para facilitar comparações entre estudos semelhantes. O fluxo de trabalho simples destina-se a fazer poderosos plugins de Fiji/ImageJ (desenvolvido por cientistas de computador baseados em algoritmos matemáticos) mais acessível a neurobiologia isto e a comunidade de Ciências da vida em geral.

Protocol

1. considerações e preparações para projetar o experimento de análise de imagem

1. Predeterminar celular anatômico, adequado ou subcellular marcadores para servir como pontos de referência para a padronização de uma região de interesse (ROI) em amostras diferentes, por exemplo 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), marcadores de membrana, fluorescentes localizadas proteína, etc.
2. Selecione um marcador fluorescente que pode delimitar a partitura discreta, além de níveis de plano de fundo para a estrutura de interesse.
   Nota: Este protocolo é otimizado para estruturas proteicas (por exemplo, agregados de misfolded proteínas) e membrana-limite organelles (por exemplo, repórter de autofagia). Para visualizar a agregação da proteína, um fragmento de RFP-tag N-terminal da proteína de Htt humana com um trato de patogenicidade polyQ de 138 repetições (RFP-hHttQ138) foi usado⁵. A proteína de Htt mutante forma citoplasmáticos agregados quando expressa sob neuronais drivers específicos, tais como DrosÃ-GAL4^5,6. Para visualizar o fluxo de autophagosome-lisossoma, Actina-GAL4 foi usado ubiquitously dirigir a expressão do repórter mCherry-GFP-Atg8a em tandem. partitura de GFP e mCherry --positivo indicar autophagosomes, e o fluxo é monitorado como fluorescência GFP é extinto o ambiente ácido do lisossomo, onde a diferenciação de ácido mCherry permanece até que a proteína é degradada⁷. Para análise de ratiometric, um único canal que é um marcador consistente da estrutura pode ser usado para segmentação, ou se for caso disso, que uma projeção de dois ou mais canais pode ser usada para delinear estruturas, embora não esteja explicitamente descrito neste protocolo. Neste exemplo, mCherry é usado para segmentação de partículas Atg8-positivo, pois é ácido-insensível e permanecerá no compartimento ao longo do fluxo através da via.
3. Baixe e instale a plataforma de análise de imagem open source ImageJ ou Fiji — a distribuição preferencial do ImageJ com pacote de plugins^2,3.
4. Instale o plugin para bacias hidrográficas interativo h-maxima.
   Nota: Este protocolo usa Fiji; plugins adicionais podem ser necessários para ImageJ. O plug-in desenvolvido por Benoit Lombardot para SCF-MPI-CBG está disponível on-line (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Navegue até "ajudar | Update", selecione"Gerenciar sites de atualização"do"atualizador do ImageJ", escolha o site de atualização do SCF-MPI-CBG da lista e então feche e reinicie o Fiji.

2. dissecção e mancha da imunofluorescência no cérebro

1. Fazer silicone elastômero-alinhado dissecação pratos.
   1. Despeje silicone componentes de elastômero uma proveta conforme indicado pelo fabricante e misture bem até que bem misturada.
   2. Usar uma pipeta para preencher 5cm pratos de cultura de tecidos de um terço a metade cheia (cerca de 10 mL da mistura de elastômero). Permitir que quaisquer bolhas subir para a superfície e remova cuidadosamente com papel absorvente. Cobrir os pratos e coloque-os sobre uma superfície plana para curar durante 48-72 h à temperatura ambiente (RT).
2. Disse o cérebro de Drosophila e sistema visual, se necessário.
   1. Execute Drosophila dissecação cerebral como descrito anteriormente^8,9. Faz a dissecação em pratos de dissecação elastômero-alinhado, usando um fundo elastômero para estabilizar o cérebro para evitar danificar tecido ou fórceps.
   2. Para manter a lâmina intacta durante a dissecção, deslize duas pinças sob a retina e suavemente rasgar no meio do olho para remover a retina. Me afasto qualquer tecido retinal anexado a lâmina com pinças realizadas paralelas à superfície da lâmina.
      Nota: Pigmento Residual não vai sair nas etapas a seguir e geralmente não interfere com anticorpo imagem e coloração.
   3. Dilua o formol de 37% em tampão fosfato salino (PBS) para fazer uma concentração final de 3,7% fresco antes de usar em um tubo de microcentrifugadora de 500 µ l. Transferir o cérebro dissecado para tubo de microcentrifugadora com solução de correção e incube por 15 min em RT com balanço suave.
      Nota: O formol tem uma tendência natural para ser oxidado, produzindo ácido fórmico. Portanto, é sugerida a alíquota a 37% de formaldeído para armazenamento e diluir a 3,7% fresco antes de cada utilização. Fixação excessiva ou insuficiente fixação afetará a integridade do tecido e fluorescência¹⁰.
   4. Lavar 3 vezes com PBTx (PBS com 0,4% Triton X-100) por 15 min cada.
3. Executar a imuno-histoquímica e montar espécimes.
   1. Se houver necessidade de anticorpos, remover PBTx, adicionar anticorpo primário diluído em PBTx com 5% de soro de cabra normal e incubar em um misturador alíquota durante a noite a 4 ° C.
   2. Remover o anticorpo primário e lavar 3 vezes com PBTx por 15 min cada. Adicione o anticorpo secundário diluído em PBTx com 5% de soro de cabra normal e incubar durante 1 h no RT ou durante a noite a 4 ° C. Lavar 3 vezes com PBTx por 15 min cada.
   3. Se houver necessidade de coloração de DAPI, remover PBTx, adicionar solução DAPI (solução: 5 mg/mL, diluir para uma concentração de trabalho de 15 µ g/mL em PBTx) e incubar durante 10 minutos a Wash RT. 3 vezes com PBTx por 15 min cada.
   4. Para limpar o tecido, coloque uma gota de meio de montagem sobre o centro de uma lâmina de microscopia com um espaçador de uma camada de fita transparente em ambos os lados. Transferir o cérebro para a gota de meio de montagem e esperar por 1 – 2 min até que o cérebro se torna transparente. Remova cuidadosamente o meio de montagem com uma pipeta.
   5. Para montar, aplica uma gota de meio de montagem fresco para o cérebro do slide. Cuidadosamente sobreposição de um vidro de tampa evitando bolhas. Selar as bordas com cola de borracha e deixe secar naturalmente em RT de 20 min. proceder à aquisição de imagem para obter melhores resultados.

3. aquisição de imagem

1. Otimizar os parâmetros de aquisição de microscópio, incluindo a resolução espacial, objetivo, zoom, verificação de velocidade, e passo o tamanho, para maximizar a resolução das estruturas de interesse para facilitar a segmentação semi-automática durante a análise de imagem.
   Nota: Pode ser útil capturar uma imagem de amostra e testar segmentação semi-automática (na etapa 5 do presente protocolo) antes de todas as amostras experimentais de imagem. Desta forma, o usuário pode ajustar as configurações de imagem para que ferramentas analíticas prontamente podem discernir a estrutura biológica de interesse.
2. Ajuste os controles de detector de imagem para capturar a maior relação sinal-ruído e faixa dinâmica maior da amostra.
   1. Use uma LUT (veja tabela) que indica a saturação de pixel (exposição muito alta) ou undersaturation (deslocamento muito baixo) enquanto ajusta configurações (Figura 3B, vermelho indica saturação pixel por uma LUT Hi/Low).
   2. Verificar configurações de ganho e deslocamento são apropriadas para todos os grupos experimentais, como manipulações experimentais provavelmente alteram a estrutura de interesse.
      Nota: É imperativo que as mesmas configurações são usadas para todos os grupos para fazer comparações quantitativas.
3. Imagem através do tecido para capturar todos os dados.
   Nota: É recomendável para capturar todos os dados disponíveis durante uma sessão de imagens e para definir uma área mais precisa durante a seleção do ROI na etapa 4, se necessário.
4. Salve a imagem como o tipo de arquivo suportado pelo software de imagem para preservar os metadados como parâmetros de aquisição e calibração espacial. Salve a imagem com um nome de arquivo, incluindo anticorpos data, fundo genético e repórteres fluorescentes, experimentais, ou corantes, correspondente aos canais digitalizados como _Ch1 _ [data de experiência] [nome do Grupo Experimental] _ [nome do espécime]. [fluoróforo-alvo /Dye]_Ch2.[Fluorophore-Target/Dye], etc.

4. Fiji/ImageJ imagem importação e seleção de ROI

1. Abra uma imagem em Fiji. Use a caixa de diálogo "Opções de importação de Bio-formatos", escolha "pilha de exibição com: Hyperstack" e defina "modo de cor: em tons de cinza".
   Nota: Recomenda-se abrir este tipo de arquivo do microscópio, como metadados, tais como calibração espacial pode ser lido por Fiji.
2. Identifica uma área de um único plano z ou uma projeção baseada o canal (s) marcador que pode ser usado como um ROI padronizado através de amostras (Figura 1, seleção de ROI).
   1. Use a barra de rolagem de "C" para exibir o canal (s) usado para capturar o marker(s) designados no passo 1.1.
   2. Use a barra de rolagem de "Z" para percorrer os aviões focais. Escolher uma única fatia ou criar uma projeção de várias fatias, clicando em "imagem | Pilhas | Projeto Z"e definir"fatia de início"e"Stop fatia"para englobar o ROI.
      Nota: Definindo o tipo de "projeção" a "Intensidade de Max" no projeto"Z" caixa de diálogo é muitas vezes mais adequada para enfatizar a estruturas de segmentação na seção 5, embora isto pode não ser apropriado para todas as aplicações. Se outro tipo de projeção é necessário para análise, ter cuidado para salvar e documentar este arquivo como tal para a extração do recurso na seção 6 e/ou 7.
   3. Gere uma nova imagem que contém o canal (s) e focal ais de interesse para simplificar as etapas a seguir o protocolo de análise de imagem. Selecione "imagem | "Duplicado", definir o desejado "canais" (c) e "Fatias" (z) e alterar o nome de arquivo para refletir a seleção (por exemplo, _ _ [nome do espécime] de [nome do Grupo Experimental] [experiência date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
3. Use uma das ferramentas"seleção" na barra de Fiji para selecionar manualmente um ROI padronizado com base nos critérios de seleção determinados na etapa 4.2.
4. Adicione o ROI com o gerente de ROI clicando em "Analyze | Ferramentas | ROI Manager "e clique em"Adicionar"no menu Gerenciador de ROI. Salve o ROI ROI Manager no menu clicando em "mais | Salvar"e nomeie o arquivo para refletir o ROI (por exemplo, [nome do Grupo Experimental] _ [nome do espécime] _ [data de experimento] _ [canal (s)] _ [z-ais] _ [Descrição de ROI]).
   Nota: Este pode ser reaberto em Fiji para análises posteriores ou pode ser aplicado a outros canais ou imagens como na seção 5.3.

5. pré-processamento e segmentação com h-maxima Watershedding

1. Execute de pré-processamento no canal usado para capturar as estruturas de interesse.
   1. Se o arquivo de imagem consiste em múltiplos canais, separar os canais, clicando em "imagem | Cor | Dividir canais"para isolar o canal de interesse.
   2. Aplicar um filtro, such as um filtro mediano para reduzir o ruído ou Desfoque Gaussiano para alisamento, clicando em "processo | Filtros | Filtro tipo"(por exemplo,"Filtro de mediana"ou"Gaussian Blur").
      1. Experimente diferentes filtros e filtrar parâmetros nas imagens de cada grupo experimental. Prossiga pelas passo 6.2 com um exemplo representativo de cada grupo para verificar o desempenho de segmentação. Selecione o filtro e configurações que facilitam a segmentação das estruturas de interesse.
   3. O filtro de registro e configurações. Aplica esses parâmetros através de grupos experimentais.
   4. Salve uma cópia da imagem como um arquivo tiff, incluindo o filtro aplicado para referência. Usar um nome detalhado como [nome do Grupo Experimental] _ [nome do espécime] _ [data de experimento] _ [canal] _ [z-ais] _ [filtro com parâmetros].
2. Realize segmentação de estruturas de interesse com a ferramenta de bacias hidrográficas de h-maxima interativo na imagem pré-processado gerado e salvo na etapa 5.1.
   1. Com a imagem pré-processado ativa em Fiji, iniciar a ferramenta de bacias hidrográficas interativo h-maxima clicando "SCF | Rotulagem | H_Watershed interativo".
      Nota: Este plugin primeiro calcula a bacia hidrográfica e em seguida, permite que o usuário explorar os efeitos de máximos locais e opções de limiar na segmentação através de uma imagem de saída instantaneamente atualizado.
   2. No painel de controle, ajuste a dinâmica da semente (h), limiar de intensidade (T) e pico de inundações (%) para otimizar a segmentação.
      Nota: Sempre se referem a imagem raw antes de pré-processamento da seção 4.2 para inspecionar manualmente o desempenho da segmentação das estruturas de interesse.
   3. Quando estiver satisfeito com os resultados da segmentação, selecione "Exportar máscara regiões" e escolha "Exportar". Isso irá gerar uma imagem binária dos resultados bacia hidrográfica (Figura 1, segmentação).
   4. Gravar os parâmetros de segmentação; esses parâmetros devem ser aplicados através de grupos experimentais para comparações quantitativas. Salvar a máscara binária resultados se desejado para consultas com parâmetros de segmentação detalhados no nome como [nome do Grupo Experimental] _ [nome do espécime] _ [data de experimento] _ [Canais] _ [z-ais] _ [filtro com parâmetros] _ [parâmetros de H_Watershed].
3. Extrai as estruturas de interesse dos resultados da bacia hidrográfica.
   1. Abra o ROI salvo de passo 4.4, no Gerenciador de ROI. Com a máscara de regiões binário da etapa 5.2.4 ativo, selecione o ROI do gerente do ROI para aplicar a imagem para limitar a extração de características para o ROI padronizada.
   2. Com o ROI ativo a máscara binária de bacias hidrográficas, escolher "Analyze | Analisar as partículas"com"Adicionar ao Gerenciador"selecionado na caixa de diálogo extrair características.
      Nota: Isto irá adicionar um identificador de partículas para cada estrutura delineado durante a segmentação para o Gerenciador de ROI. As opções estão disponíveis nesse menu para excluir recursos com base no tamanho ou forma circular se necessário para refinar estruturas incluídas na análise.
   3. Guarde as partículas clicando em "mais | Save"do menu do Gerenciador de ROI. Certifique-se que os identificadores serão desmarcados e todas as partículas serão todos salvos em um arquivo zip. Usar um nome detalhado como [nome do Grupo Experimental] _ [nome do espécime] _ [data de experimento] _ [Canais] _ [z-ais] _ [filtro com parâmetros] _ [parâmetros H_Watershed] _ [estruturas].

6. quantidade, área e intensidade de quantificação e análise

1. Abra a imagem raw gerado e salvo na etapa 4.2. Role para o canal usado para capturar as estruturas de interesse.
   Nota: É essencial para tirar medidas de intensidade de imagem raw (antes de pré-processamento) como a aplicação de filtros em mudanças de passo 5.1 os valores de pixel.
2. Abra as partículas obtidas na etapa 5.3 extração e selecione "Mostrar tudo" do Gerenciador de ROI.
   Nota: Esta acção overlay um esboço de cada partícula no "ROI Manager" na imagem e deve coincidir com as bordas das estruturas de interesse (Figura 1, extração de características).
3. Definir as medições desejadas clicando em "Analyze | Conjunto de medições".
   Nota: A área, intensidade e densidade de partículas podem ser medidos, escolhendo "área" e "densidade integrada". Quando é selecionada a densidade integrada, Fiji produzirá dois valores: 'Integrado densidade' calculada como o produto da área e valor de cinza médio e 'Raw integrado densidade' medido como a soma dos valores de pixel. Densidade da proteína fluorescente em partículas é calculada como a soma dos valores de pixel, dividida pela área. O número de partículas geradas na etapa 5.3 indica a quantidade de partículas dentro do tecido que ROI definido na etapa 4.4.
4. ROI Manager no menu escolha "Medida". Os resultados são expressos em unidades calibradas, enquanto as medições de arquivos derivados do software da imagem latente em Fiji. Copiar os resultados da janela de resultados e cole no software de planilha para compilação e mais cálculos.

7. Ratiometric quantificação e análise de dados

1. Siga as etapas 6.1 e 6.2 para abrir identificadores de partícula no primeiro canal cru de interesse.
2. Definir as medições desejadas clicando em "Analyze | Conjunto de medições".
   Nota: A intensidade média por partícula pode ser medida, escolhendo "Significa o valor de cinza".
3. Do Gerenciador de ROI selecione "Medida". Copiar os dados da janela de resultados e colar no software de planilha eletrônica.
4. Mover a barra de rolagem de "C" para o segundo canal cru de interesse, neste exemplo (Figura 4A), as boas práticas agrícolas e repita as etapas de 7.2. e 7.3.
   Nota: As partículas que salvou na etapa 5.3 padrão serão o canal e a fatia do qual ele foi gerado. Tome cuidado para garantir que as partículas são aplicadas para o canal correto de interesse.
5. Calcule a relação da intensidade de um canal para a intensidade do segundo para cada partícula do software de planilha eletrônica.
6. Use um gráfico de dispersão para visualizar e quantificar dados ratiometric de fluorophores que exibem alterações individuais reflexivas de processos biológicos subjacentes.
   1. Gere um gráfico de dispersão no software gráfico.
      Nota: Cada ponto de dados representa uma estrutura de interesse onde a intensidade da primeira fluoróforo de interesse é o valor de"x" e a intensidade da segunda fluoróforo é o valor"y", medido a partir de cada partícula.
   2. Defina limites para cada fluoróforo definir os quadrantes de gating.
7. Use linha perfil Visualizar fluoróforo intensidade através de uma estrutura de interesse.
   1. Selecione um ROI gerado na etapa 5.3 e usar a ferramenta em linha reta na barra de ferramentas para desenhar uma linha reta através do ROI. Adicione a linha ROI para o Gerenciador de ROI.
   2. Para cada canal de interesse, com a linha ROI ativo, selecione "Analyze | Traçar o perfil".
      Nota: A função de perfil de trama irá gerar uma trama de histograma e uma tabela dos valores de intensidade ao longo da linha. Copie os resultados medidos de cada canal e colar no software de planilha para gerar um enredo mostrando ambos os canais ao longo da linha.

Representative Results

Quantificação do número, área e intensidade de mutante fluorescente etiquetado Htt agrega no lobo óptico drosófila

Para investigar a agregação de misfolded proteínas no sistema nervoso central de um modelo de Drosophila da doença de Huntington, RFP-tag mutante Htt humana com uma expansão patológica ( ou não-patológica (UAS-RFP-hHttQ15) UAS-RFP-hHttQ138) e membrana GFP (UAS-mCD8::GFP)¹¹ foram co expressa sob um motorista pan-neuronal DrosÃ-GAL4. Cérebros de moscas fêmeas 2 dias após a eclosão (DAE) foram dissecados, fixo e manchados com DAPI, de acordo com a seção 2 do protocolo. Laser confocal, microscopia eletrônica de varredura foi realizado com foco no lobo óptico com um 40 X óleo imersão da lente objetiva, 1.30 abertura numérica (NA), usando uma velocidade de varredura de 8,0 µs por pixel e resolução espacial de 1024 por 1024 pixels (12 bits por pixel). O tamanho ideal passo determinado pelo software de imagem foi de 1,08 µm por fatia para o objetivo com a seguinte combinação de comprimentos de onda de excitação/emissão: canal 1) 488/510 de GFP, canal 2) 543/581 para RFP e canal 3) 405/461 para DAPI. Configurações de detector de imagem aplicadas a todos os grupos para capturar imagens adequadas para comparações, foram baseados em uma amostra de RFP-Htt-Q138, que acumula agregados de RFP-Htt de alta intensidade, em vez de uma amostra de controle de RFP-Htt-Q15 não patogénicas, que mantém baixos níveis de RFP-Htt difusa (Figura 2). Se as configurações de aquisição de imagem foram definidas para maximizar o alcance dinâmico de um espécime de RFP-Htt-Q15, os agregados de RFP-Htt-Q138 iria ser saturados. Como exemplo, uma micrografia de agregação da proteína no lobo óptico drosófila foi salvo como HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.

O lobo óptico inteiro foi fotografado durante a microscopia e consistia de cerca de 15 z-fatias, mas depois da imagem latente foi determinado que analisar um único plano z era o melhor para resolver o indivíduo estruturas que seria caso contrário aparecem sobreposto em uma projeção devido à alta densidade dentro do tecido. Para determinar um ROI padronizado, os corpos de célula C2 e C3 localizados entre a medula e lobula placa do lobo óptico¹² foram usados como um ponto de referência anatômico. Em Fiji, a imagem foi duplicada, assim, para refletir os requisitos de análise e foi salvo como um arquivo tiff chamado HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, onde z8 reflete a fatia oitava onde C2 e C3 corpos celulares neuronais eram mais proeminente por DAPI coloração (figura 1A, aquisição de imagem). A ferramenta de seleção de polígono foi usada para selecionar manualmente um ROI por aí o lobo óptico utilizando DAPI manchando e sinal GFP neuronal como guia (figura 1A, seleção de ROI, onde amarelo indica o ROI e vermelho designa a imagem de alta ampliação mostrada para clareza nos seguintes painéis de fluxo de trabalho). Em seguida, aplicou-se um filtro Gaussian Blur com valor σ, definido como 1 para o canal de RFP-Htt para suavizar a imagem e facilitar a segmentação (figura 1A, Preprocessing) e o desempenho de segmentação a jusante e extração com e sem este etapa de pré-processamento é ilustrada na figura 1A. H-microbacia interativo foi realizada nas imagens do canal RFP-Htt com os seguintes parâmetros: semente dinâmica, 30; limiar de intensidade, 500; pico de inundações (em %), 80; com 'permitir divisão' e 'máscara de regiões de exportação' selecionado (figura 1A, segmentação). A máscara de regiões binário resultante foi salvo como HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent e usado para gerar partículas com a ferramenta de analisar as partículas com uma exclusão de tamanho mínimo de 0,4 µm² definir agregações de proteínas^13,14 . As partículas resultantes foram salvos do gerente do ROI como HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates e foram aplicadas para o canal de RFP-Htt bruto (antes de pré-processamento) para extrair dados quantitativos de imagem (figura 1A, extração de características).

Quantificação do número de agregados de RFP-Htt semi-automaticamente segmentados de planos focais padronizados através o lobo óptico de Drosophila revelou expressão difusa da expansão não-patogênicas Htt-Q15 e acúmulo de proteínas agregados pela doença-causando expansão Htt-Q138 (Fig. 2A-C). A soma de todos os valores de pixel em cada partícula dada por 'Densidade integrada Raw' foi usada para comparar o conteúdo de RFP-Htt de cada agregado. Perfis de tamanho e intensidade de todos os agregados de um plano focal padronizado de cinco lóbulos ópticos diferentes, expressando Htt-Q138 ilustram a robustez e reprodutibilidade deste fluxo de trabalho (Figura 2D, E). Nomeadamente, quando agregados foram superexpostos durante a aquisição de imagens (Figura 3A, B), quantificação de tamanho e número de agregados são comparáveis aos agregados capturados com exposição ideal (Figura 3, D), no entanto, o intensidade dos agregados superexpostas torna-se uma função de tamanho como pixels saturados exibem o valor de intensidade máxima (Figura 3E, F). Portanto, criação de parâmetros de exposição digitalização adequada é fundamental para extrair toda a gama de composição molecular quantitativa de agregados de proteínas.

Baseado em Ratiometric quantificação do fluxo de autofagia em Drosophila lâmina visual usando um repórter de Atg8a fluorescente em tandem

Para avaliar o fluxo de autofagia-lisossoma no sistema visual de Drosophila , Atg8a-mCherry-GFP repórter ubiquitously foi expressa no controle ou moscas Drosophila espermina sintase (dSms) homozigoto mutante (dSms^e/i) com Actina-GAL4 driver. dSms^e/i voa neurodegeneração de exposição que está associada com o fluxo autophagic prejudicado devido à disfunção dos lisossomos¹⁵. Cérebros com lâmina anexado de moscas fêmeas da DAE 5 foram dissecados, fixo e manchados com DAPI. A lâmina foi fotografada por laser, microscopia confocal com um 100 X óleo imersão lente objetiva, 1,35 abertura numérica (NA), a uma velocidade de amostragem de 8,0 µs por pixel e 12 bits por pixel de resolução óptica e tamanho de passo de 1,2 µm.

Esta análise foi realizada em uma z-projeção máxima de sete z-corta a lâmina para aumentar o poder de amostragem das estruturas esparsas Atg8-positivo (figura 1B, aquisição de imagem). O ROI padronizado foi desenhado manualmente com a ferramenta ' Seleção ' polígono em torno da camada do corpo celular revelado por DAPI e baseado na anatomia bem caracterizada e organização celular do tecido (figura 1B, seleção de ROI, onde o amarelo indica a ROI e vermelho designa a imagem de alta ampliação mostrada pela clareza nos seguintes painéis de fluxo de trabalho)¹⁶. O repórter em tandem baseia-se nas propriedades de estabilidade da GFP e mCherry partes para marcar a progressão através da via autofagia-lisossoma, tal que a GFP é saciada pela acidez da lisossoma onde mCherry permanece até que ele se degrada. Portanto, o fluoróforo caudais de mCherry foi usado para segmentação neste protocolo. Um filtro Gaussian Blur com valor σ 1 foi aplicado para o canal de mCherry (figura 1B, Preprocessing) e interativo H-bacia hidrográfica foi realizada com os seguintes parâmetros: semente dinâmica, 0; limiar de intensidade, 800; pico de inundações (em %), 90; com 'permitir divisão' e 'máscara de regiões de exportação' selecionado (figura 1B, segmentação). A máscara de regiões binário resultante foi usada para gerar partículas com a ferramenta de partículas de analisar. As partículas resultantes foram aplicadas ao mCherry cru e canais GFP brutos (antes de pré-processamento) para extrair dados quantitativos ratiometric compartimentos de autofagia-lisossoma (figura 1B, extração de características).

Inspeção visual de estruturas de mCherry-GFP-Atg8-positivo indicado o enriquecimento da região do corpo celular da lâmina, consistente com relatórios anteriores de transporte retrógrado de vesículas autophagic para o corpo celular em neurônios¹⁷. Perfil de enredo foi usado para visualizar mCherry e intensidade da GFP através de várias estruturas Atg8-positivo (ver linha ROIs na Figura 4A e perfis resultante de intensidade ao longo da linha na Figura 4B), revelando diferenças no repórter, onde alta intensidade de ambos os fluorophores indica autophagosomes (Figura 4B3), mCherry de alta e baixa GFP indica a fusão com a lisossoma como GFP é saciada neste compartimento ácida (Figura 4B1), e finalmente mCherry baixo reflete a degradação dentro o lisossomo (Figura 4B2). Um gráfico de dispersão gerado da intensidade média fluoróforo de cada partícula de mCherry-Atg8-positivo semi-automaticamente segmentada ilustra o fluxo através da via de autofagia-lisossoma que foi então separado em etapas distintas por análise de quadrante ( Figura 4). O enredo foi dividido em quatro quadrantes usando associados limiares de GFP = 570, mCherry = 1.800. Os limiares foram definidos com baseados no grupo de controle, usando as seguintes entidades: (1) o projeto do repórter fluorescentes em tandem e as propriedades das dois fluorophores, que teoricamente GFP deve não fluorescem onde não há nenhum sinal de mCherry (quadrante IV) e (2) a distribuição de partículas Atg8-positivo reflete a distribuição de autofagia-lisossoma relacionados ao caminho compartimentos nos neurônios do selvagem-tipo onde autofagia basal é altamente eficiente^18,19. Nas lâminas de controle de moscas, cerca 25% das partículas Atg8-positivos foram guardados como autophagosomes (quadrante eu), e metade da partitura são processados além da fusão do lisossomo-autophagosome (quadrante II e III); podócitos dSms^e/i tinham aumentado significativamente autophagosomes ou disfuncionais lisossomos (quadrante eu) e diminuição da autolysosomes (quadrante II e III), sugestivo de acúmulo de autophagosome através de defeitos em fusão autophagosome-lisossoma e/ou degradação lisossomal (Figura 4 C, D). Dados quantitativos também apoiou óbvio acúmulo de estruturas de Atg8 positivo em lâmina de moscas dSms^e/i (Figura 4E). Análise de Ratiometric de mCherry médio e sinal de GFP destacou a diferença entre o grupo controle e dSms^e/i (Figura 4F) mas não poderia detalhar a influência global sobre o caminho nem as etapas específicas, reveladas pelo análise do quadrante.

Figura 1: Fluxo de trabalho através da segmentação de viés minimizado, semi-automático de estruturas subcelulares no cérebro drosófila usando Fiji com exemplos. (A) representante confocal micrografias de plano focal único através o lobo óptico de um cérebro de um adulto de Drosophila expressando pan neuronal RFP-tag mutant Htt e membrana-alvo GFP (drosÃ-GAL4 > UAS-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) com DAPI coloração (aquisição de imagens). DAPI e GFP foram usados para selecionar um ROI (amarelo) ao redor do lobo óptico; caixa vermelha indica a região ampliada através de fluxo de trabalho para fins de esclarecimento (seleção de ROI). Painel de pré-processamento mostra alta magnificação de imagem raw do canal RFP-HttQ138 (em cima) e após a aplicação de um filtro de desfoque gaussiano, σ1 (parte inferior). Segmentação por bacia hidrográfica de h-maxima interativos usando as configurações de parâmetro indicado para dinâmica de semente determinado pelo h-maxima (h), critérios de paragem de bacia hidrográfica global determinados pelo limiar de intensidade (T), e parada regional critérios determinados pelo pico (inundação %) realizada no RFP-HttQ138 cru (topo) e imagens de Gaussian turva (parte inferior) e resultados de bacias hidrográficas de regiões máscara exportados do plugin de bacias hidrográficas e invertido para maior clareza. As partículas geradas por analisam partículas (magenta), sobrepostas nas imagens raw de RFP-HttQ138 (extração). As setas indicam agregados que são excessivamente segmentados sem pré-processamento e setas indicam estruturas que não conseguem separar após filtragem. (B) representante confocal micrografias de z-projeção máxima de 7 aviões focais através da seção horizontal da lâmina de um controle e mutante (dSms^e/i), Drosophila adulto expressando onipresente (GFP-mCherry-Atg8a actina-GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8) com DAPI coloração (aquisição de imagens). DAPI foi usado para selecionar um ROI (amarelo) em torno da camada do corpo celular da lâmina; caixa vermelha indica a região ampliada através de fluxo de trabalho para fins de esclarecimento (seleção de ROI). Painel de pré-processamento mostra alta ampliação do canal de mCherry com filtro Gaussian Blur, σ1 aplicado a controle e lâmina mutante. Segmentação por bacia hidrográfica h-maxima interativo realizado nas imagens filtradas mCherry com as configurações de parâmetro indicado, e bacias hidrográficas resultados mostrado como máscara de regiões binário invertida para maior clareza. As partículas geradas por analisam partículas (magenta), sobrepostas no mCherry cru e imagens GFP (extração). Barras de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: quantificação do tamanho e intensidade de agregados de RFP-Htt mutantes são robusto e reprodutível. (-B) Cérebros de drosófila com RFP-hHttQ15 (A) ou expressão de RFP-hHttQ138 (B) sob um motorista pan-neuronal DrosÃ-GAL4 foram dissecados e fixados e os lóbulos de óptica foi fotografados por laser, microscopia confocal. Barra de escala = 50 µm. (C) o número médio de agregados em cada grupo quantificados de um ROI selecionado manualmente por aí o lobo óptico e focada em uma fatia-z padronizada (n = 5). (D-E) O tamanho (D) e intensidade total (E) de agregados de RFP-hHttQ138 quantificados de padronizado ROIs dos lóbulos de óptica de 5 animais diferentes. Dados agregados são plotados em escala logarítmica. Agregados foram definidos como objetos superiores a 0,4 µm² (linha tracejada em D). Análise estatística, One-Way ANOVA, NS: não significativo; u.a.: unidade arbitrária clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: superexposição da imagem leva a medições imprecisas intensidade. (-B) Micrografia confocal representativa do mesmo optic lobe com exposição ideal (A) e pseudocolored de superexposição (B) com o HiLo LUT em Fiji. Vermelho no B indica agregados superexpostos. Barra de escala = 50 µm. (C) quantificação de tamanho agregado após implementar parâmetros de bacias hidrográficas de h-maxima para gerar resultados semelhantes de segmentação. Análise estatística, t -teste de amostras independentes, NS: não significativo. (D) a distribuição de frequência do tamanho do agregado em imagens superexpostas e ideais. Agregados com um tamanho de 5 a 25 µm² foram mais guardados em 4 grupos categóricos. (E -F) Análise de correlação da intensidade dos agregados em função do tamanho de agregação (E). Uma linha de referência é desenhado (preto), quando todos os pixels tem um valor de intensidade máxima de 4095. Caixa verde indica agregados abaixo 10 µm² área mostrada em F. b: coeficiente de regressão, R²: coeficiente de determinação; u.a.: unidade arbitrária clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Quantificação de tandem fluorescente mCherry-GFP-Atg8a genética repórter revela características distintas de fluxo autophagic em Drosophila. (A) representante confocal micrografias de Drosophila lâmina de controle e dSms^e/i moscas mutantes ubiquitously expressando GFP-mCherry-Atg8a (actina-GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a) e manchado para DAPI . Tracejado Box áreas da camada do corpo celular de lâmina são mostradas em alta ampliação (à direita). Os números indicam estruturas representativas Atg8a-positivo plotagem em B e quantificado em C. (B) histograma plotagem da intensidade da fluorescência em unidades arbitrárias (AU) ao longo da linha ROIs indicados em imagens de alta ampliação em estruturas de mCherry-GFP-Atg8 r. (C) plotadas por média intensidade GFP em função da intensidade média mCherry medida de controle e dSms^e/i lâmina (partículas medidas de 3 lâminas de cada grupo). O enredo foi dividido em quatro quadrantes usando associados limiares de GFP = 570 e mCherry = 1800 com o percentual de estruturas em cada quadrante indicado pelo genótipo. (D) quantificação das percentagens médios das mCherry-GFP-Atg8 categorizados em cada quadrante em C (n = 3 lâmina). (E) quantificação do número de Atg8-mCherry-GFP partitura por lâmina (média ± D.P., n = 3 lâmina). (F) análise de Ratiometric de estruturas mCherry-GFP-Atg8 observada em controle e lâmina mosca mutante (quer dizer com 95% CI, n = 3 lâmina). Estudante t-teste. P < 0.05, * *P < 0,01. Barras de Sscale = 2 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O protocolo descrito aqui pode ser usado de forma robusta e reproducibly dosar processos biológicos de célula visualizados pela geração de imagens baseada em fluorescência. Contexto biológico e limitações técnicas precisam ser cuidadosamente considerados para guiar o projeto experimental. Marcadores fluorescentes de estruturas subcelulares de interesse, se imuno-histoquímica, à base de corantes, ou geneticamente expressa, precisa ser distinguíveis acima fundo pela morfologia e intensidade. O sistema UAS/GAL4 é amplamente utilizado para conduzir a expressão do gene alvo em Drosophila. Os exemplos aqui apresentados usado linhas transgênicas carregando drivers de GAL4 para ativar a transcrição de proteínas fluorescente etiquetadas sob o controle do realçador UAS para investigar a agregação da proteína e autofagia no sistema nervoso. Se a expressão simultânea de um transgene UAS experimental é necessária juntamente com um transgene repórter fluorescentes, então, o grupo de controle também deve incluir co-superexpressão de um transgene inconsequente de Controlarar para dosagem de GAL4, por exemplo UAS-GFP ou UAS-lacZ. Preparação da amostra padronizada, conforme descrito aqui para Drosophila SNC e sistema visual, de dissecação, fixação, anticorpo que mancha, através de montagem, é crítica para a quantificação e a imagem ideal.

Boas práticas que maximizam a relação sinal-ruído e faixa dinâmica de imagem são necessárias para a análise semi-automático e são primordiais para comparações precisas entre grupos experimentais. Parâmetros de aquisição de imagem devem ser definidos para que o repórter não está saturado para que toda a gama de intensidade de proteína pode ser extraída e quantificados (Figura 3). Para comparações quantitativas, a imagem deve ser realizada com os mesmos parâmetros de aquisição e de preferência no mesmo dia.

Seleção de ROI, processamento de imagem, segmentação de recurso e extração de recurso usando a plataforma open-source ImageJ/Fiji dependem do aplicativo; enquanto parâmetros iniciais devem ser definidos pelo usuário, sua aplicação através de amostras irá minimizar o viés maximizando a saída de dados quantitativos. É crítico para cuidadosamente fluxo de trabalho de documento e recomendável para salvar uma imagem como um arquivo tiff após cada etapa com detalhamento de nome de arquivo aplicada processamento. Isso pode ser especialmente útil quando se trabalha fora de parâmetros para a primeira vez e vai servem como um ponto de referência para garantir a consistência entre os grupos experimentais em cada etapa do processamento de imagem e análise de protocolo. Critérios de seleção de ROI usando marcadores ou pontos anatômicos devem ser definidos a partir de um grupo de controle, mas deve ter cuidado para garantir que manipulações experimentais não alteram os marcadores ou pontos turísticos em uma maneira que impeça uma indicação confiável de um padronize o ROI. Uma única fatia ou uma z-projeção de várias fatias pode ser selecionada para melhor atender os objetivos da análise, onde um único plano focal pode ser útil para melhorar a separação de estruturas de vizinhos, e uma projeção-z pode ser útil para a análise de estruturas localizadas em todo o volume de tecido. O tipo de z-projeção usada para segmentação e análise de imagem deve ser determinado com cuidado e de forma independente. Uma projeção de intensidade máxima irá produzir uma imagem nítida, uma vez que estruturas são mais brilhantes dos aviões onde eles estão em foco e geralmente são adequados para a segmentação. Análise de imagem pode ser aceitável em uma projeção máxima, como no exemplo de análise de autofagia-lisossoma; Estruturas de Atg8-positivo são menores do que o tamanho do passo utilizado para amostragem, portanto, com mais precisão são representados pela intensidade máxima de plano focal único do qual foram capturados. No entanto, para análise de estruturas maiores que o tamanho do passo, uma soma-projeção que adiciona todos os pixels com as mesmas coordenadas xy pode representar, com mais precisão, as informações de intensidade de cada estrutura. Enquanto este protocolo é projetado para analisar uma única fatia ou uma z-projeção de várias fatias em 2D, o fluxo de trabalho pode ser facilmente adaptado para analisar estruturas 3D em um z-series usando várias das mesmas ferramentas. Análise 3D seria desejável para um tamanho de amostra pequeno de estruturas de forma irregular, onde uma z-fatia que cruza obliquamente a estrutura seria distorcer a análise.

Pré-processamento com um filtro, tais como as sugeridas no presente protocolo, pode reduzir o ruído, preservando as bordas para auxiliar a detecção de estruturas de interesse durante a segmentação; homogeneidade de marcador ruído e fluorescentes fundo sem suavização suficiente irá resultar em excesso de segmentação, enquanto configurações que resultam em muita indefinição removerá o detalhe e evitar a detecção de bordas precisas. Segmentação por bacia hidrográfica considera a imagem como uma superfície topográfica com uma fonte de água no local maxima — pixels de alta intensidade em uma imagem fluorescente — que inunda para fora até que encontre vizinhas áreas alagadas, onde uma represa, ou limite do segmento, é construído²⁰. A bacia hidrográfica h-maxima usa um limite definido pelo usuário (dinâmica h-maxima no plugin SCF-MPI-CBG) para distinguir maxima local significativo para evitar excesso de segmentação de estruturas que não têm um único máximo local²¹. O plugin de bacias hidrográficas de h-maxima interativo implementado neste protocolo permite ao usuário ajustar a dinâmica h-maxima (h), critérios de paragem de bacia hidrográfica global determinados pelo limiar de intensidade (T) e paragem regional critérios determinados pelo pico de inundações (%), enquanto instantaneamente, exibindo resultados de divisor de águas em uma imagem de saída para avaliar qualitativamente o desempenho de segmentação. Resultados de segmentação perto vão concordar com a maioria dos limites de estrutura, embora tanto excesso de segmentação e separação incompleta (figura 1A, setas vermelhas na extração do recurso) podem ocorrer onde a rotulagem fluorescente é homogênea ou o tecido é densamente povoada. A eficiência da escadaria semi-automático de segmentação e análise pode ser aproveitada para aumentar o poder de amostragem e atenuar as armadilhas de segmentação.

Após a extração de características e segmentação, é simples para extrair informações morfológicas tais como área, dimensões e circularidade. Além disso, se imagens são recolhidas adequadamente para evitar a superexposição, informação molecular pode também ser inferida a partir desta análise de imagem através de medições de intensidade. Uma vez que as medidas de patologia de doenças neurodegenerativas são extraídas e quantificadas por esta abordagem, estas medidas podem ser usadas para resolver uma série de questões importantes. Especificamente, o protocolo demonstrou o potencial de usar imagem análise e quantificação dos agregados de proteína para identificar os fatores que influenciam a agregação da proteína e correlacionam a distribuição, número, tamanho e densidade de proteína dos agregados com disfunção neuronal e a saúde. Baseado em Ratiometric quantificação pode ser usada para informar agregada interação com componentes subcelulares ou processos durante a progressão da doença. Enquanto bioquímicos e citometria de fluxo foram aplicados para analisar a interação dos agregados e com outras estruturas subcelulares, lysis da pilha podem conduzir à perda de proteína, alterar propriedades agregadas e interromper de interações proteína-proteína²². Atg8-mCherry-GFP tem sido amplamente utilizada para monitorar autofagia através de microscopia de fluorescência, especialmente em culturas de células,²³, mas carecem de métodos analíticos quantitativos e imparciais. Além disso, na vivo análise usando o repórter geneticamente codificado em tandem é desafiadora e exige uma preparação altamente controladora de fundo e tecido genética. Este protocolo descreve a metodologia verificada desde a preparação do tecido para imagem práticas críticas para quantificar os compartimentos de autofagia-lisossoma. Com as boas práticas de genéticas, as abordagens de análise de imagem incluindo perfis de intensidade de partícula Atg-positivo e a análise de quadrante com retenção por sinais fluorescentes individuais, pode pagar deteção poderosa e comparação de normal e patológico autophagic fluxo na vivo em modelos de diversas doenças.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749