Kvantitative cellebiologi af Neurodegeneration i Drosophila gennem saglig analyse af Fluorescently mærket proteiner ved hjælp af ImageJ

Summary

Vi har udviklet en enkel og fleksibel arbejdsproces for at udtrække kvantitative data fra fluorescens-imaging-baserede celle biologiske undersøgelser af protein sammenlægning og autophagic flux i centralnervesystemet af Drosophila modeller af neurodegeneration.

Abstract

Med den stigende forekomst af neurodegenerative sygdomme er det stadig vigtigt at forstå de underliggende Patofysiologi, der fører til neuronal dysfunktion og tab. Fluorescens-baserede billedbehandling værktøjer og teknologier aktiverer hidtil uset analyse af subcellulært neurobiologiske processer, men der er stadig behov for uvildig, reproducere og let tilgængelig tilgange til at udtrække kvantificerbare data fra billeddiagnostiske undersøgelser . Vi har udviklet en enkel og fleksibel arbejdsproces for at udtrække kvantitative data fra fluorescens-baserede imaging studier ved hjælp af Drosophila modeller af neurodegeneration. Specifikt, vi beskriver en nem at følge, semi-automatiserede tilgang ved hjælp af Fiji/ImageJ for at analysere to cellulære processer: først skal vi kvantificere samlede proteinindhold og profil i Drosophila optik lobe ved hjælp af fluorescerende-tagged mutant huntingtin proteiner; og for det andet vurderer vi autophagy-lysosomet flux i Drosophila visuelle system med ratiometric-baserede kvantificeringen af en tandem fluorescerende reporter for autophagy. Vigtigere, indeholder protokollen skitseret her et semi-automatiske segmentering skridt for at sikre alle fluorescerende strukturer er analyseret at minimere udvalg bias og øge opløsningen af subtile sammenligninger. Denne fremgangsmåde kan udvides til analyse af andre celle biologiske strukturer og processer involveret i neurodegeneration, såsom proteinholdige puncta (stress granulat og synaptic komplekser), samt membran-bundet rum (mitokondrier og membran menneskehandel vesikler). Denne metode giver en standardiseret, men kan tilpasses referencepunkt til billedanalyse og kvantificering, og kunne lette pålidelighed og reproducerbarhed over marken, og i sidste ende forbedre mekanistisk forståelse af neurodegeneration.

Introduction

Neurodegenerative sygdomme rammer millioner af mennesker hvert år og forekomsten er stigende med en aldrende befolkning¹. Mens hver neurodegenerativ sygdom har en unik ætiologi, er sammenlægning af fejlfoldede proteiner og fordelingen af proteostasis netværket fælles patologiske kendetegnende for mange af disse sygdomme. Belyse, hvordan afbrydelse af disse grundlæggende og indbyrdes forbundne processer går skævt er at bidrage til neuronal dysfunktion og celle død afgørende for forståelse neurodegenerative sygdomme samt vejlede terapeutiske indgreb. Fluorescens-baseret tænkelig giver mulighed for undersøgelse af disse komplekse og dynamiske processer i neuroner og har i høj grad bidraget til forståelsen af neuronal cellebiologi. Analyse af fluorescently mærket proteiner er udfordrende, især når eksperimenter udført i vivo, meget kompakt væv, forskellige celletyper og morfologiske heterogenitet. Manuelt assisteret kvantificering er overkommelige og ligetil, men er ofte tidskrævende og menneskelige bias. Derfor er der behov for en uvildig, reproducere og let tilgængelig tilgange til at udtrække kvantificerbare data fra billeddiagnostiske undersøgelser.

Vi har skitseret en enkel og smidig arbejdsgang ved hjælp af Fiji/ImageJ, en kraftfuld og frit tilgængelige billedbehandling software^2,3, for at udtrække kvantitative data fra fluorescens imaging studier i eksperimentelle modeller af neurodegeneration bruger Drosophila. Ved at følge denne protokol for at kvantificere protein sammenlægning og autophagic flux — to cell biologiske funktioner, der er særdeles relevante for neurodegenerative sygdomme patologi — vi viste følsomhed og reproducerbarhed af denne fremgangsmåde. Analyse af fluorescently mærket mutant huntingtin (Htt) proteiner i Drosophila optik lap viste antal, størrelse og intensitet af protein aggregater. Vi visualiseres en tandem fluorescerende reporter fra autophagic flux i Drosophila visuelle system, som viser forskellige emission signaler afhængigt af afdelingsmæssig miljø⁴. Ratiometric-baseret analyse af tandem reporter tilladt for en kvantitativ og omfattende overblik over autophagy-lysosomet flux fra autophagosome formation, modning og transport til nedbrydning i lysosomet, og fremhævet desuden sårbare segmenter afbrudt i neurodegenerative betingelser. Vigtigere, i begge analyser gennemført vi semi-automatiske tærskel og segmentering trin i vores protokol at minimere bevidstløs bias, øge prøveudtagning magt, og levere en standard for at lette sammenligninger mellem lignende undersøgelser. Ligetil arbejdsprocessen er beregnet til at gøre kraftfulde Fiji/ImageJ plugins (udviklet af dataloger baseret på matematiske algoritmer) mere tilgængeligt for neurobiologists og biovidenskab samfundet som helhed.

Protocol

1. overvejelser og forberedelser til at designe billede analyse eksperiment

1. Forudbestemme egnet anatomiske, cellulær eller subcellulært markører til at tjene som vartegn for standardisering en region af interesse (ROI) på tværs af forskellige prøver, for eksempel 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), membran markører, lokaliserede fluorescerende protein, osv.
2. Vælg en fluorescerende markør, der kan afgrænse diskrete puncta ud over baggrundsniveauer for strukturen af interesse.
   Bemærk: Denne protokol er optimeret til proteinholdige strukturer (fx, fejlfoldede protein aggregater) og membran-bundet organeller (fx, autophagy reporter). For at visualisere protein sammenlægning, blev en RFP-tagged N-terminal fragment af menneskelige Htt protein med en sygdomsfremkaldende polyQ tarmkanalen af 138 gentagelser (RFP-hHttQ138) brugt⁵. Den mutante Htt protein danner cytoplasmatisk aggregater når udtrykt under neuronal specifikke drivere som elav-GAL4^5,6. For at visualisere autophagosome-lysosomet flux, blev actin-GAL4 brugt til allestedsnærværende drev udtryk for tandem mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8a reporter. mCherry - og normal god landbrugspraksis-positive puncta angiver autophagosomes, og flux er overvåget som normal god landbrugspraksis Fluorescens er slukket i det sure miljø i lysosomet, hvor syre-ufølsom mCherry forbliver indtil proteinet er forringet⁷. For ratiometric analyse, kan en enkelt kanal, der er en konsekvent markør struktur bruges til segmentering, eller eventuelt en projektion af to eller flere kanaler kan bruges til at afgrænse strukturer, men ikke udtrykkeligt beskrevet i denne protokol. I dette eksempel bruges mCherry til segmentering af Atg8-positive partikler, som det er syre-ufølsom og forbliver i skuffen hele flux gennem vej.
3. Hent og Installer den lukke op kilde billede analyse platform ImageJ eller Fiji — den foretrukne distribution af ImageJ med bundtet plugins^2,3.
4. Installere plugin for h-maxima interaktive vandskel.
   Bemærk: Denne protokol bruger Fiji; ekstra plugins kan være påkrævet for ImageJ. Den plug-in udviklet af Benoit Lombardot til SCF-MPI-CBG er tilgængelige online (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Naviger til "hjælpe | Opdatere", Vælg"Administrer opdatering sites"fra"ImageJ Updater", Vælg webstedet SCF-MPI-CBG update fra listen, og derefter lukke og genstarte Fiji.

2. brain dissektion og immunfluorescens farvning

1. Gøre silikone elastomer-foret dissektion retter.
   1. Hæld silikone elastomer komponenter i et bægerglas som angivet af fabrikanten og rør godt indtil blandes grundigt.
   2. Bruge en pipette til at fylde 5 cm vævskultur retter en tredjedel til halvdelen fuld (ca. 10 mL af elastomer blanding). Tillad alle boblerne til at stige op til overfladen og fjern forsigtigt med filtrerpapir. Dække retterne og placere dem på en plan overflade til at helbrede i 48-72 timer ved stuetemperatur (RT).
2. Dissekere Drosophila hjernen og visuelle system hvis det er nødvendigt.
   1. Udføre Drosophila hjernen dissektion som tidligere beskrevet^8,9. Udføre dissektion i elastomer-foret dissektion retter, ved hjælp af en elastomer bunden for at stabilisere hjernen for at undgå skadeligt væv eller pincet.
   2. For at holde lamina intakt under dissektion, slide to pincet under nethinden og forsigtigt rive gennem midten af øjet til at fjerne nethinden. Trække væk retinale væv knyttet til lamina med pincet afholdt parallel med overfladen, lamina.
      Bemærk: Resterende pigment vil vaske i følgende trin og normalt forstyrrer ikke antistof farvning og billedbehandling.
   3. Fortynd 37% formaldehyd i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til at foretage en endelig koncentration på 3,7% frisk før brug i en 500 µL microcentrifuge tube. Overføre dissekeret hjernen til microcentrifuge tube med løsning og Inkuber i 15 min. ved RT med blid vuggende.
      Bemærk: Formaldehyd har en naturlig tendens til at blive oxideret, produktion af myresyre. Derfor er det foreslået at delprøve 37% formaldehyd til opbevaring og fortyndes til 3,7% frisk før hver brug. Overdrevne fiksering eller under fiksering vil påvirke integriteten af væv og fluorescens¹⁰.
   4. Vask 3 gange med PBTx (PBS med 0,4% Triton X-100) i 15 min.
3. Udføre Immunhistokemi og montere prøver.
   1. Hvis antistoffarvning er nødvendig, skal du fjerne PBTx, tilføje primære antistof fortyndet i PBTx med 5% normal ged serum og Ruger på en alikvot mixer natten over ved 4 ° C.
   2. Fjerne primære antistof og vask 3 gange med PBTx til 15 min. Tilføje sekundær antistof fortyndet i PBTx med 5% normal ged serum og Inkuber i 1 time på RT eller natten over ved 4 ° C. Vask 3 gange med PBTx til 15 min.
   3. Hvis DAPI farvning er nødvendig, fjerne PBTx, tilføje DAPI løsning (stock løsning: 5 mg/mL, fortyndes til en arbejdsgruppe koncentration på 15 µg/mL i PBTx), og der inkuberes i 10 min. ved RT. Wash 3 gange med PBTx til 15 min.
   4. For at rydde væv, skal du placere en dråbe af montering medium på midten af en mikroskopi dias med en spacer i ét lag klar tape på begge sider. Overføre hjernen på dråbe af montering medium, og vente 1-2 min, indtil hjernen bliver gennemsigtig. Fjern forsigtigt montering medium med en pipette.
   5. For at montere, anvende en dråbe frisk montering medium på hjerner på diaset. Omhyggeligt overlay en cover glas at undgå boblerne. Forsegle kanterne med gummi cement, og lufttørre på RT for 20 min. Fortsæt til billede erhvervelse for de bedste resultater.

3. billede erhvervelse

1. Optimere mikroskop erhvervelse parametre, herunder rumlige opløsning, mål, zoom, scanning hastighed, og øge størrelse, at maksimere opløsning af strukturer af interesse at lette halvautomatiske segmentering under billedanalyse.
   Bemærk: Det kan være nyttige til at fange et eksempelbillede og teste halvautomatiske segmentering (i trin 5 i denne protokol) før imaging alle eksperimentelle prøver. På denne måde kan brugeren justere indstillinger, så analytiske værktøjer kan let skelne den biologiske struktur af interesse.
2. Juster billede detektor kontrolelementer for at fange den højeste signal-støj-forholdet og højeste dynamikområde af modellen.
   1. Bruge en LUT (look up table), der angiver pixel mætning (eksponering for høj) eller undersaturation (offset for lavt) mens du justerer indstillinger (figur 3B, rød angiver pixel mætning af en Hi/Low LUT).
   2. Kontroller indstillinger for gevinst og forskydning er passende for alle eksperimentelle grupper, som eksperimentelle manipulationer sandsynligt ændrer strukturen af interesse.
      Bemærk: Det er bydende nødvendigt, at de samme indstillinger bruges til alle grupper til at foretage kvantitative sammenligninger.
3. Billede via væv til at fange alle data.
   Bemærk: Det anbefales at fange alle de tilgængelige data under én imaging session og til at definere en mere præcis område under ROI udvalg i trin 4, hvis det er nødvendigt.
4. Gemme billedet som filtypen understøttes af imaging-software for at bevare metadata såsom erhvervelse parametre og rumlige kalibrering. Gem billedet med et filnavn, herunder eksperimentelle dato, genetiske baggrund og fluorescerende reportere, antistoffer, eller farvestoffer svarende til kanaler scannet såsom [eksperimentelle gruppenavn] _ [modellen navn] _ [eksperiment dato] _Ch1. [Fluorophore-mål /Dye]_Ch2.[Fluorophore-Target/Dye], osv.

4. Fiji/ImageJ billede Import og ROI udvalg

1. Åbne et billede i Fiji. Brug "Bio-formater Import Options" dialogboksen, skal du vælge "Vis stak med: Hyperstack" og "farvetilstand: gråtoner".
   Bemærk: Det anbefales at åbne filtypen mikroskop som metadata såsom rumlige kalibrering kan læses af Fiji.
2. Identificer et område fra et enkelt z-plan eller en projektion udfra de markør kanaler, der kan bruges som en standardiseret ROI på tværs af enheder (figur 1, ROI udvælgelse).
   1. Brug "C" scrollbar til at se de kanaler, der bruges til at fange marker(s) udpeget i trin 1.1.
   2. Bruge "Z" rullepanelet til at flytte gennem de fokale planer. Vælge en enkelt skive eller Opret en projektion af flere udsnit ved at klikke på "billede | Stakke | Z projekt"og sæt"Start skive"og"Stop slice"til at omfatte ROI.
      Bemærk: Indstilling af typen " "projektion "til"Max intensitet"i"Z-projektet"dialogboksen er ofte bedst egnet til at understrege strukturer for segmentering i afsnit 5, selvom dette ikke måske er passende til alle applikationer. Hvis en anden type af projektion er påkrævet for analyse, sørge for at gemme og dokumentere denne fil som sådan for funktionen udvinding i afsnit 6 og/eller 7.
   3. Generere et nyt billede, der indeholder de kanaler og focal plane(s) af interesse at forenkle følgende trin i billed analyse protokol. Vælg "billede | Dublerede", ønskede"kanaler"(c) og"Skiver"(z), og ændre filnavnet for at afspejle udvalg (fx, [eksperimentelle gruppenavn] _ [modellen navn] _ [eksperimentere date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
3. Brug en af "markeringsværktøjer" på værktøjslinjen Fiji manuelt vælge en standardiseret ROI baseret på udvælgelseskriterier fastsættes i trin 4.2.
4. Tilføje ROI Investeringsafkast Manager ved at klikke på "Analyze | Værktøjer | ROI Manager "og klik på"Tilføj"menuen ROI Manager. Gemme ROI Investeringsafkast Manager menuen ved at klikke på "mere | Gem", og navngiv derefter filen afspejler ROI (fx, [eksperimentelle gruppenavn] _ [modellen navn] _ [eksperiment dato] _ [har] _ [z-plane(s)] _ [ROI beskrivelse]).
   Bemærk: Dette kan genåbnes i Fiji for senere analyser eller kan anvendes til andre kanaler eller billeder som i afsnit 5.3.

5. forbehandling og segmentering med h-maxima Watershedding

1. Udfør forbehandling på den kanal, der anvendes til at fange strukturerne af interesse.
   1. Hvis billedfilen består af flere kanaler, separate kanaler ved at klikke på "billede | Farve | Opdele kanaler"at isolere kanal af interesse.
   2. Anvende et filter som en median filter til at reducere støj eller Gaussisk sløring for udjævning ved at klikke på "processen | Filtre | Filtrer type"(fx"Median Filter"eller"Gaussian Blur").
      1. Prøve forskellige filtre og filtrere parametre på billeder fra hver eksperimentelle gruppe. Fortsæt gennem skridt 6.2 med et repræsentativt eksempel fra hver gruppe til at kontrollere segmentering ydeevne. Vælg filter og indstillinger for at lette segmentering af strukturer af interesse.
   3. Optage filter og indstillinger. Anvend disse parametre på tværs af eksperimentelle grupper.
   4. Gemme en kopi af billedet som en tiff-fil, herunder det anvendte filter for reference. Bruge et detaljeret navn som [eksperimentelle gruppenavn] _ [modellen navn] _ [eksperiment dato] _ [kanal] _ [z-plane(s)] _ [Filter med parametre].
2. Udføre segmentering af strukturer af interesse med interaktive h-maxima vandskel værktøj på forhåndsbehandlede billedet genereret og gemte i trin 5.1.
   1. Med forhåndsbehandlede billedet aktivt i Fiji, indlede h-maxima interaktive vandskel værktøj ved at klikke på "SCF | Mærkning | Interaktiv H_Watershed".
      Bemærk: Dette plugin beregner først afvanding og derefter tillader brugeren at undersøge virkningerne af lokale maxima og tærskel indstillinger på segmentering gennem en straks opdateret udskriftsbillede.
   2. Fra Kontrolpanel, justere frø dynamics (h), intensitet tærskel (T) og peak oversvømmelser (%) for at optimere segmentering.
      Bemærk: Altid henvise til det rå billede før forbehandling af afsnit 4.2 til manuelt kontrollere udførelsen af segmentering af strukturer af interesse.
   3. Når tilfreds med segmentering resultater, skal du vælge "Eksporter regioner maske" og vælge "Eksporter". Dette vil generere et binært billede af skelsættende resultater (figur 1, segmentering).
   4. Optage segmentering parametre; disse parametre skal anvendes på tværs af eksperimentelle grupper for kvantitative sammenligninger. Gemme binære resultater masken, hvis det ønskes for reference med segmentering parametre detaljeret i navnet som [eksperimentelle gruppenavn] _ [modellen navn] _ [eksperiment dato] _ [kanaler] _ [z-plane(s)] _ [Filter med parametre] _ [H_Watershed parametre].
3. Uddrag strukturer af interesse fra de skelsættende resultater.
   1. Åbn den gemte ROI fra trin 4.4, i ROI manager. Med den binære regioner maske fra trin 5.2.4 aktive, skal du vælge ROI fra ROI manager at anvende afbildningen at begrænse funktion udvinding til den standardiserede ROI.
   2. ROI aktive binære vandskel maske, skal du vælge "analyser | Analysere partikler"med"Tilføj til Manager"valgt i dialogboksen til at udtrække funktioner.
      Bemærk: Dette vil tilføje en partikel id for hvert bygværk afgrænset under segmentering til ROI Manager. Indstillinger er tilgængelige på denne menu for at udelade funktioner baseret på størrelse eller cirkularitet hvis nødvendig for at finpudse strukturer inkluderet i analysen.
   3. Gem partiklerne ved at klikke på "mere | Gem"fra menuen ROI manager. Sikre at identifikatorer er fravalgt og alle partikler vil alle være gemt i en zip-fil. Bruge et detaljeret navn som [eksperimentelle gruppenavn] _ [modellen navn] _ [eksperiment dato] _ [kanaler] _ [z-plane(s)] _ [Filter med parametre] _ [H_Watershed parametre] _ [strukturer].

6. antal, område, og intensitet kvantificering og analyse

1. Åbne raw-billedet genereret og gemte i trin 4.2. Rulle til den kanal, der bruges til at indfange strukturerne af interesse.
   Bemærk: Det er afgørende at tage intensitet målinger fra raw-billede (før forbehandling) som anvender filtre i trin 5.1 ændringer pixelværdierne.
2. Åbn partikler fra funktionen udvinding i trin 5.3 og vælge "Vis alle" fra ROI Manager.
   Bemærk: Denne handling vil overlejre en oversigt over hver partikel på "ROI Manager" på billedet og bør matche kanterne af strukturer af interesse (figur 1, Feature udvinding).
3. Angive de ønskede mål ved at klikke på "Analyze | Sæt målinger".
   Bemærk: Området, intensitet og tæthed af partikler kan måles ved at vælge "område" og "integrerede tæthed". Når integreret tæthed er valgt, Fiji vil producere to værdier: 'Integreret tæthed' beregnet som produktet af området og grå middelværdien og 'Raw integreret tæthed' målt som summen af pixelværdierne. Tætheden af de fluorescerende proteiner i partiklerne beregnes som summen af pixelværdierne divideret med området. Antallet af partikler skabt taktfast 5.3 angiver mængden af partikler i vævet ROI defineret i trin 4.4.
4. Vælg "Foranstaltning" i menuen ROI Manager. Resultaterne udtrykkes i kalibrerede enheder, så længe målingerne er taget fra filer i Fiji er afledt fra den billedbehandlingsprogrammer. Kopierer resultaterne fra resultatvinduet og indsætte i regneark software til udarbejdelse og yderligere beregninger.

7. Ratiometric kvantificering og analyse af Data

1. Følg trin 6.1 og 6.2 åbne partikel-id'er på den første rå kanal af interesse.
2. Angive de ønskede mål ved at klikke på "Analyze | Sæt målinger".
   Bemærk: Den gennemsnitlige intensitet pr. partikel kan måles ved at vælge "Betyder grå værdi".
3. Fra ROI Manager skal du vælge "Foranstaltning". Kopiering af data fra resultatvinduet og indsætte i regneark software.
4. Flytte "C" scrollbar til den anden rå kanal af interesse, normal god landbrugspraksis i dette eksempel (figur 4A), og Gentag trin 7.2. og 7,3.
   Bemærk: De partikler, der er gemt i trin 5.3 standard til kanal og skive, som det blev genereret. Sørge for at sikre partikler anvendes til den korrekte kanal af interesse.
5. Beregn forholdet mellem intensitet fra én kanal til intensiteten af andet for hver partikel i programmet regneark.
6. Bruge en scatter plot til at visualisere og kvantificere ratiometric data fra fluorophores, der udviser individuelle ændringer reflekterende af underliggende biologiske processer.
   1. Generere en scatter plot i graftegning software.
      Bemærk: Hvert datapunkt repræsenterer en struktur af interesse, hvor intensiteten af den første fluorophore af interesse er værdien"x" og intensiteten af den anden fluorophore er den "y"målte værdi fra hver enkelt partikel.
   2. Indstille gating tærskler for hver fluorophore til at definere kvadranterne.
7. Bruge line profil til at visualisere fluorophore intensitet på tværs af en struktur af interesse.
   1. Vælg en ROI genereret i trin 5.3 og bruge værktøjet lineær på værktøjslinjen til at tegne en lige streg gennem ROI. Tilføj line ROI til ROI Manager.
   2. For hver kanal af interesse, med linje ROI aktive, skal du vælge "analyser | Plot profil".
      Bemærk: Funktionen plot profil vil generere et histogram plot og en tabel over værdier af intensitet langs linjen. Kopiere resultater måles fra hver kanal og indsætte i regneark software til at generere et plot viser begge kanaler langs linjen.

Representative Results

Kvantificering af antal, område og intensiteten af fluorescently mærket mutante Htt aggregater i Drosophila optik lap

At undersøge fejlfoldede protein sammenlægning i centralnervesystemet af et Drosophila model af Huntington's chorea, RFP-tagged mutant menneskelige Htt med en ikke-patologiske (UAS-RFP-hHttQ15) eller patologiske ekspansion ( UAS-RFP-hHttQ138) og membran normal god landbrugspraksis (UAS-mCD8::GFP)¹¹ var Co udtrykt under en pan-neuronal driver elav-GAL4. Hjerner af kvindelige fluer 2 dage efter eclosion (DAE) var dissekeret, fast og farves med DAPI ifølge § 2 i protokollen. Konfokal laser scanning mikroskopi blev udført med fokus på den optiske lap med en 40 X olie fordybelse mål linse, 1,30 numerisk blænde (NA), ved hjælp af en scanning hastighed 8,0 µs pr. pixel og rumlige opløsning på 1024 x 1024 pixel (12 bits per pixel). De optimale skridt størrelse bestemmes af imaging software var 1.08 µm pr. skive for målet med følgende kombination af excitation/emission bølgelængder: kanal 1) 488/510 for normal god landbrugspraksis, kanal 2) 543/581 for RFP og kanal 3) 405/461 for DAPI. Billede detektor indstillinger anvendes til alle grupper, der skal fange billeder egnet til sammenligninger, var baseret på en RFP-Htt-Q138 modellen, der ophobes høj intensitet RFP-Htt aggregater, snarere end et ikke-patogene RFP-Htt-Q15 kontrol prøveeksemplar, som fastholder lave niveauer af diffuse RFP-Htt (figur 2). Hvis erhvervelse billedindstillinger var placere hen til maksimere den dynamiske rækkevidde af en RFP-Htt-Q15 modellen, ville være mættet RFP-Htt-Q138 aggregater. Som et eksempel, var en Mikrograf af protein sammenlægning i Drosophila optik lap gemmes som HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.

Den hele optik lap var afbildet under mikroskopi og bestod af omkring 15 z-skiver, men efter imaging blev det fastslået, at analysere et enkelt z-plan var bedst at løse individuelle strukturer, ville ellers vises overlappende i en projektion skyldes den høj tæthed i vævet. For at bestemme en standardiseret ROI, blev C2 og C3 celle organer beliggende mellem medulla og lobula pladen optik lap¹² brugt som en anatomisk landemærke. I Fiji, billedet var således duplikeres for at afspejle kravene, analyse og blev gemt som en tiff fil benævnt HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, hvor z8 afspejler den ottende skive hvor C2 og C3 neuronal celle organer blev de fleste fremtrædende af DAPI farvning (figur 1A, Image erhvervelse). Af polygon markeringsværktøjet blev brugt til at manuelt vælge en ROI omkring den optiske lap med DAPI farvning og neuronal normal god landbrugspraksis signal som en guide (figur 1A, ROI udvalg, hvor gul angiver ROI og rød betegner høj forstørrelse billede vist for klarhed i de følgende paneler af arbejdsprocessen). Næste, en Gaussian Blur filter σ værdien er angivet til 1 blev anvendt til RFP-Htt kanal at udglatte billedet og lette segmentering (figur 1A, Forbehandler), og udførelsen af downstream segmentering og funktion ekstraktion med og uden at dette forbehandling trin er illustreret i figur 1A. Interaktive H-Watershed blev udført på billeder af RFP-Htt kanal med følgende parametre: seed dynamics, 30; intensitet tærskel, 500; Peak oversvømmelse (i %), 80; med 'Tillad opdeling' og 'Eksporter regioner maske' valgt (figur 1A, segmentering). Den resulterende binære regioner maske var gemt som HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent og bruges til at generere partikler med værktøjet analyser partikler med en mindstestørrelse udelukkelse af 0,4 µm² at definere protein aggregater^13,14 . De resulterende partikler blev reddet fra ROI manager som HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates og blev anvendt på den rå RFP-Htt kanal (før forbehandling) for at udtrække kvantitative billeddiagnostiske data (figur 1A, Feature udvinding).

Kvantificering af antallet af semi-automatisk segmenterede RFP-Htt aggregater fra standardiserede fokale planer gennem den optiske lap af Drosophila afslørede diffuse udtryk for den ikke-patogene Htt-Q15 ekspansion og ophobning af protein aggregater af sygdomsfremkaldende Htt-Q138 udvidelse (figur 2A-C). Summen af alle pixelværdier i hver partikel af 'Rå integreret tæthed' blev brugt til at sammenligne RFP-Htt indholdet af hver enkelt aggregat. Størrelse og intensitet profiler af alle aggregater fra en standardiseret brændplanet af fem forskellige optiske lapper udtrykker Htt-Q138 illustrere den robusthed og reproducerbarhed af denne arbejdsproces (figur 2D, E). Især, når aggregater blev overeksponeret under image erhvervelse (figur 3A, B), kvantificering af størrelsen og antallet af aggregater kan sammenlignes med aggregater fanget med ideelle eksponering (figur 3 c, D), men den intensiteten af overeksponeret aggregater bliver en funktion af størrelse som mættede pixels udviser den maksimale intensitet værdi (figur 3E, F). Oprettelse af passende eksponering scanningsparametre er derfor kritisk at udtrække hele spektret af kvantitative molekylære sammensætning af protein aggregater.

Ratiometric-baserede kvantificering af autophagy flux i Drosophila visuelle lamina ved hjælp af en tandem fluorescerende Atg8a reporter

For at vurdere autophagy-lysosomet flux i Drosophila visuelle system, mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8a reporter var allestedsnærværende udtrykt i kontrol eller Drosophila Spermin syntase (DSM'erne) homozygot mutant (DSM'erne^e/e) flyver med actin-GAL4 driver. DSM'erne^e/e flyver udstille neurodegeneration, der er forbundet med nedsat autophagic flux på grund af lysosomale dysfunktion¹⁵. Hjerner med vedlagte lamina af kvindelige fluer på 5 DAE var dissekeret, fast og farves med DAPI. Lamina var afbildet ved laser scanning konfokalmikroskopi med 100 X olie fordybelse mål linse, 1,35 numerisk blænde (NA), med en prøveudtagning hastighed 8,0 µs pr. pixel, og 12 bits per pixel optisk opløsning og trin størrelse af 1,2 µm.

Denne analyse blev udført på en max z-projektion af syv z-skiver gennem lamina at øge prøveudtagning magt af de sparsomme Atg8-positive strukturer (figur 1B, Image erhvervelse). Den standardiserede ROI var manuelt tegnet med værktøjet polygon markering omkring cellen kroppen layer afsløret af DAPI og baseret på godt karakteriseret anatomi og cellulære organisation af væv (figur 1BInvesteringsafkast udvalg, hvor gul angiver den ROI og rød betegner høj forstørrelse billede vist for klarhed i de følgende paneler af arbejdsprocessen)¹⁶. Tandem reporter bygger på egenskaberne stabilitet i normal god landbrugspraksis og mCherry fraspaltning at markere progression gennem autophagy-lysosomet vej, således at normal god landbrugspraksis er slukket af surhedsgraden i lysosomet hvor mCherry forbliver indtil det er nedbrudt. Derfor, den teknologiinvesteringer mCherry fluorophore blev brugt til segmentering i denne protokol. En Gaussian Blur filter med σ værdien 1 blev anvendt til mCherry kanal (figur 1B, Forbehandler), og interaktive H-Watershed blev udført med følgende parametre: seed dynamics, 0; intensitet tærskel, 800; Peak oversvømmelse (i %), 90; med 'Tillad opdeling' og 'Eksporter regioner maske' valgt (figur 1B, segmentering). Den resulterende binære regioner maske blev brugt til at generere partikler med værktøjet analyser partikler. De resulterende partikler blev anvendt til både rå mCherry og rå normal god landbrugspraksis kanaler (før forbehandling) for at udtrække kvantitative ratiometric data fra autophagy-lysosomet rum (figur 1B, Feature udvinding).

Visuel inspektion af mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8-positive strukturer angivet berigelse i regionen cellen kroppen af lamina, i overensstemmelse med tidligere betænkninger af retrograd transport af autophagic vesikler til cellen kroppen i neuroner¹⁷. Plot profil blev brugt til at visualisere mCherry og normal god landbrugspraksis intensitet på tværs af flere Atg8-positive strukturer (Se linje ROIs i figur 4A og deraf følgende intensitet profiler langs linjen i figur 4B), afsløre forskelle i reporter, hvor høje intensiteten af både fluorophores angiver autophagosomes (figur 4B3), høj mCherry og lav normal god landbrugspraksis angiver fusion med lysosomet som normal god landbrugspraksis er slukket i denne sure rum (figur 4B1), og endelig lav mCherry afspejler nedbrydning inden for lysosomet (figur 4B2). En scatter plot genereret fra den gennemsnitlige fluorophore intensiteten af semi-automatisk segmenterede mCherry-Atg8-positive partiklerne viser flux gennem autophagy-lysosomet vej, der blev derefter opdelt i diskrete trin af kvadrant analyse ( Figur 4 c). Plottet var opdelt i fire kvadranter bruger gating tærskler for normal god landbrugspraksis = 570, mCherry = 1.800. Tærsklerne blev sat baseret på kontrolgruppen ved hjælp af de følgende principper: (1) udformningen af tandem fluorescerende reporter og egenskaberne for de to fluorophores, så det teoretisk normal god landbrugspraksis bør ikke fluorescerer hvor der ikke er nogen mCherry signal (quadrant IV), og (2) fordelingen af Atg8-positive partikler afspejler fordelingen af autophagy-lysosomet pathway-relaterede rum i wild-type neuroner hvor basal autophagy er yderst effektiv^18,19. I lameller af kontrol fluer, omkring 25% af Atg8-positive partikler blev arkiveret lodret som autophagosomes (quadrant jeg), og halvdelen af puncta behandles autophagosome-lysosomet fusion (quadrant II og III); DSM'erne^e/e lameller er steget betydeligt autophagosomes eller dysfunktionelle lysosomer (quadrant jeg) og faldt autolysosomes (quadrant II og III), suggestive autophagosome akkumulering gennem defekter i autophagosome-lysosomet fusion og/eller lysosomale nedbrydning (figur 4 C, D). Kvantitative data understøttes også indlysende ophobning af Atg8-positive strukturer i lamina fra DSM'erne^e/e fluer (figur 4E). Ratiometric analyse af gennemsnitlige mCherry og normal god landbrugspraksis signal fremhævet en forskel mellem kontrol og DSM'erne^e/e gruppe (figur 4F) men kunne ikke detaljer den overordnede indflydelse på vej og heller ikke de specifikke skridt afsløret ved den Quadrant analyse.

Figur 1: Workflow gennem bias-minimeret, semi-automatiske segmentering af subcellulært strukturer i Drosophila hjernen med eksempler på Fiji. (A) repræsentative Konfokal micrographs fra enkelt brændplanet gennem den optiske lap af en Drosophila voksen hjerne udtrykker pan neuronal RFP-tagged mutant Htt og membran-målrettet normal god landbrugspraksis (elav-GAL4 > UAS-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) med DAPI farvning (billede erhvervelse). DAPI og normal god landbrugspraksis blev brugt til at vælge en ROI (gule) omkring optik lobe; rød boks angiver region forstørret gennem arbejdsgangen til klarhed (ROI udvalg). Forbehandling panel viser høj forstørrelse af raw-billede af RFP-HttQ138 kanal (øverst) og efter anvendelsen af en Gaussian Blur filter, σ1 (nederst). Segmentering af interaktive h-maxima vandskel ved hjælp af de angivne parameterindstillinger for frø dynamics bestemmes af h-maxima (h), global vandskel stop kriterier fastlagt af intensitet tærskel (T), og regionale stop kriterier fastlagt af peak oversvømmelse) %) udføres på RFP-HttQ138 rå (øverst) og Gaussisk sløret (bunden) billederne og skelsættende resultater fra regioner maske eksporteret fra vandskel plugin og omvendt for klarhed. Partikler genereret af analysere partikler (magenta) overlejret på RFP-HttQ138 raw-billeder (funktion udvinding). Pilene angiver aggregeringer, der er over segmenterede uden forbehandling og pilespidser angive strukturer, der undlader at adskille efter filtrering. (B) repræsentative Konfokal micrographs fra maksimal z-projektion af 7 fokale planer gennem den vandrette del af lamina af en kontrol og mutant (DSM'erne^e/e) Drosophila voksen udtrykker allestedsnærværende () NGL-mCherry-Atg8a actin-GAL4 > UAS-normal god landbrugspraksis-mCherry-Atg8) med DAPI farvning (billede erhvervelse). DAPI blev brugt til at vælge en ROI (gule) omkring cellen kroppen lag af lamina; rød boks angiver region forstørret gennem arbejdsgangen til klarhed (ROI udvalg). Forbehandling panel viser høj forstørrelse af mCherry kanal med Gaussian Blur filter, σ1 påføres både kontrol og mutant lamina. Segmentering af interaktive h-maxima afvanding udført på de filtrerede mCherry billeder med de angivne parameterindstillinger, og skelsættende resultater vises som binære regioner maske inverteret for klarhed. Partikler genereret af analysere partikler (magenta) overlejret på de rå mCherry og normal god landbrugspraksis billeder (funktion udvinding). Skalere barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: kvantificering af størrelsen, og intensiteten af mutant RFP-Htt aggregater er robust og reproducerbar. (A-B) Drosophila hjerner med RFP-hHttQ15 (A) eller RFP-hHttQ138 udtryk (B) under en pan-neuronal driver elav-GAL4 blev dissekeret og fast og optik lapper blev afbildet ved laser scanning Konfokal mikroskopi. Skalalinjen = 50 µm. (C) det gennemsnitlige antal af aggregater i hver gruppe kvantificeres fra et manuelt valgte ROI omkring den optiske lap og fokuseret på en standardiseret z-Skive (n = 5). (D-E) Størrelse (D) og total intensitet (E) af RFP-hHttQ138 aggregater kvantificeres fra standardiseret ROIs i optik lapper i 5 forskellige dyr. Aggregerede data er afbildet i log skala. Aggregater blev defineret som objekter større end 0,4 µm² (stiplet linje i D). Statistisk analyse, en-vejs ANOVA, NS: ikke signifikant; a.u.: vilkårlig enhed venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: billede overeksponering fører til unøjagtige intensitet målinger. (A-B) Repræsentative Konfokal Mikrograf af den samme optic lobe med ideelle eksponering (A) og overeksponering (B) pseudocolored med HiLo LUT i Fiji. Rødt i B angiver overeksponeret aggregater. Skalalinjen = 50 µm. (C) kvantificering af samlede størrelse efter gennemførelsen af h-maxima vandskel parametre til at oprette lignende segmentering resultater. Statistiske analyser, uafhængige prøver t -test, NS: ikke signifikant. (D) frekvens fordelingen af den samlede størrelse i ideelle og overeksponerede billeder. Aggregater med en størrelse fra 5 til 25 µm² blev yderligere arkiveret lodret i 4 kategorisk grupper. (E -F) Korrelation analyse af intensiteten af aggregater som en funktion af samlede størrelse (E). En referencelinje er trukket (sort), når alle pixels har en maksimal intensitet værdi på 4095. Grønne boks angiver aggregater under 10 µm² området vist i F. b: regression koefficient, Rasmussen²: determinationskoefficienten; a.u.: vilkårlig enhed venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Kvantificeringen af en tandem fluorescerende mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8a genetiske reporter afslører forskellige funktioner af autophagic flux i Drosophila. (A) repræsentative Konfokal micrographs af Drosophila lamina fra kontrol og DSM'erne^e/e mutant fluer allestedsnærværende udtrykker mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8a (actin-GAL4 > mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8a) og farvet for DAPI . Stiplet boxed områder af lamina cellen kroppen lag er vist i høj forstørrelse (til højre). Tallene angiver repræsentative Atg8a-positive strukturer afbildet i B og kvantificeres i C. (B) Histogram plot af fluorescens-intensiteten i arbitrære enheder (AU) langs linjen ROIs angivet i høj forstørrelse billeder i A. (C) mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8 strukturer afbildet af gennemsnitlig normal god landbrugspraksis intensitet som en funktion af gennemsnitlige mCherry intensitet målt fra kontrol og DSM'erne^e/e lamina (partikler målt fra 3 bladplader fra hver gruppe). Plottet var opdelt i fire kvadranter bruger gating tærskler for normal god landbrugspraksis = 570 og mCherry = 1800 med procentdelen af strukturer i hver kvadrant, anført af genotype. ()D) kvantificering af de gennemsnitlige procenter for mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8 kategoriseret i hver kvadrant i C (n = 3 lamina). ()E) kvantificering af antallet af mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8 puncta pr. lamina (gennemsnit ± SD, n = 3 lamina). (F) Ratiometric analyse af mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8 strukturer observeret i kontrol og mutant flyve lamina (mener med 95% CI, n = 3 lamina). Student t-test. P < 0,05, **P < 0,01. Sscale barer = 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den protokol, der er skitseret her kan bruges til håndfast og reproducerbar kvantificere celle biologiske processer visualiseret ved fluorescens-baseret tænkelig. Biologisk sammenhæng og tekniske begrænsninger skal overvejes nøje til at guide den eksperimenterende design. Fluorescerende markører for subcellulært strukturer af interesse, om immunhistokemiske, dye-baseret, eller genetisk udtrykt, skal skelnes over baggrunden af morfologi og intensitet. UAS/GAL4 system er meget udbredt at drive målrettet genekspression i Drosophila. Eksemplerne her bruges transgene linjer bærer GAL4 drivere til at aktivere omskrivning af fluorescently mærket proteiner under kontrol af UAS forstærker til at undersøge protein sammenlægning og autophagy i nervesystemet. Hvis samtidig udtryk for en eksperimentel UAS transgen kræves sammen med en fluorescerende reporter transgen, bør derefter kontrolgruppen også omfatte co-overekspression af en inkonsekvent transgen til kontrol for GAL4 dosering, for eksempel UAS-NGL eller UAS-lacZ. Standardiseret prøveforberedelse, er som skitseret her for Drosophila centralnervesystemet og visuelle system, fra dissektion, fiksering, antistof farvning, gennem montering, afgørende for optimal imaging og kvantificering.

God imaging praksis at Maksimer signal-støj-forholdet og dynamikområde er nødvendige for semi-automatiseret analyse og er altafgørende for præcise sammenligninger mellem eksperimentelle grupper. Billede erhvervelse parametre skal angives, således at journalisten ikke er overmættede, således at hele spektret af protein intensitet kan udvindes og kvantificeret (figur 3). For kvantitative sammenligninger, skal imaging udføres med samme parametre, erhvervelse og helst samme dag.

ROI udvælgelse, billedbehandling, funktion segmentering og funktion udvinding ved hjælp af open source platform ImageJ/Fiji er ansøgning-afhængige; mens oprindelige parametre skal defineres af brugeren, vil deres ansøgning på tværs af enhederne minimere bias mens maksimering kvantitative data output. Det er kritisk at omhyggeligt dokumentarbejdsgang og anbefalede at gemme et billede som en tiff-fil efter hvert trin med fil navn detaljering anvendt behandling. Dette kan være særligt nyttigt, når de arbejder ud protokol parametre for første gang og vil tjene som et referencepunkt at sikre sammenhæng mellem eksperimentelle grupper på hvert trin i billedbehandling og analyse. ROI udvælgelseskriterier bruger markører eller anatomiske landemærker bør defineres fra en kontrolgruppe, men man bør sikre, at eksperimentelle manipulationer ikke ændrer markører eller vartegn på en måde, der ville forhindre pålidelig indikation af en standardisere ROI. En enkelt skive eller en z-projektion af flere udsnit kan vælges man bedst takler mål for den analyse, hvor en enkelt brændplanet kan være nyttigt at forbedre adskillelse af tilstødende strukturer, og en z-projektion kan være nyttige til at analysere strukturer lokaliseret i hele væv volumen. Typen af z-projektion bruges til segmentering og billedanalyse bør omhyggeligt og uafhængigt afgøres. En maksimal intensitet projektion vil producere et skarpt billede, da strukturer er lyseste i fly hvor de er i fokus, og er normalt velegnet til segmentering. Billedanalyse kan være acceptabelt på en maksimal projektion, som i eksemplet med autophagy-lysosomet analyse; Atg8-positive strukturer er mindre end trin anvendes til udtagning af prøver, dermed er mest præcist repræsenteret ved den maksimale intensitet fra det eneste brændplanet hvorfra de blev fanget. For analyse af strukturer, der er større end størrelsen, skridt, kan en sum-projektion, der tilføjer alle pixels med de samme xy koordinater mere præcist repræsenterer intensitet information i hver struktur. Mens denne protokol er designet til at analysere en enkelt skive eller en z-projektion af flere udsnit i 2D, kunne arbejdsprocessen tilpasses let til at analysere 3D strukturer i en z-serien ved hjælp af flere af de samme værktøjer. 3D analyse ville være ønskeligt, at en lille stikprøve på uregelmæssigt formet strukturer, hvor en z-skive, som skråt skærer struktur ville skew analysen.

Forbehandling med et filter, som foreslået i denne protokol, kan reducere støj samtidig bevare kanter for at støtte påvisning af strukturer af interesse under segmentering; baggrund støj og fluorescerende markør uensartethed uden tilstrækkelig gulvafslibning vil resultere i over segmentering, mens indstillinger, medføre for meget Sløring fjerner detaljer og forhindre nøjagtig edge detection. Segmentering af vandskel mener billedet som en topografisk overflade med en vandkilde på lokale maxima-høj intensitet pixels i et fluorescerende billedet — der oversvømmelser, indtil det opfylder tilstødende oversvømmede områder hvor en dam eller segment grænse, er bygget²⁰. H-maxima vandskel bruger en bruger-defineret grænse (h-maxima dynamics i SCF-MPI-CBG plugin) til at skelne meningsfuld lokale maxima for at undgå overdreven segmentering af strukturer, der ikke har en enestående lokale maksimale²¹. Den interaktive h-maxima vandskel plugin implementeret i denne protokol tillader brugeren at justere h-maxima dynamics (h), global vandskel stop kriterier fastlagt af intensitet tærskel (T) og regionale stop kriterier fastlagt af peak oversvømmelser (%), mens straks visning vandskel resultaterne på en udskriftsbillede kvalitativt evaluere segmentering ydeevne. Segmentering resultater vil nøje er enig med de fleste struktur grænser, selvom både over segmentering og ufuldstændig adskillelse (figur 1A, røde pile i funktionen udvinding) kan forekomme hvor fluorescerende mærkning er inhomogene eller væv er tæt befolket. Effektiviteten af de semi-automatiske segmentering og analyse trin kan udnyttes til at øge prøveudtagning magt og mindske segmenteringen faldgruber.

Efter segmentering og funktion udvinding er det ligetil at udtrække morfologiske oplysninger såsom området, dimensioner og cirkularitet. Desuden, hvis billeder er indsamlet korrekt for at undgå overeksponering, Molekylær information kan også udledes af denne billedanalyse af intensitet målinger. Når foranstaltninger af neurodegenerativ sygdom patologi er udvundet og kvantificeres ved denne tilgang, kan disse foranstaltninger bruges til at behandle en række vigtige spørgsmål. Specifikt, har protokollen vist potentiale til billedanalyse og kvantificering af protein aggregater for at identificere faktorer, der påvirker protein sammenlægning og korrelere fordeling, antal, størrelse og protein tæthed af aggregater med neuronal dysfunktion og kropsligt sundhed. Ratiometric-baserede kvantificering kan bruges til at informere samlede interaktion med subcellulært komponenter eller processer i løbet af sygdomsprogression. Mens biokemiske og flowcytometri er blevet anvendt for at analysere interaktionen af aggregater og med andre subcellulært strukturer, celle lysis kan føre til tab af protein, ændre samlede egenskaber, og forstyrre protein-protein interaktioner²². mCherry-normal god landbrugspraksis-Atg8 har været meget anvendt til at overvåge autophagy gennem Fluorescens mikroskopi, især i kulturperler celler²³, men saglig og kvantitative analysemetoder er mangler. Desuden, i vivo analyse ved hjælp af genetisk kodet tandem reporter er udfordrende og kræver meget kontrolleret genetiske baggrund og væv forberedelse. Denne protokol beskriver verificerede metode fra væv forberedelse til imaging praksis kritisk at kvantificere autophagy-lysosomet rum. Med god genetiske praksis, image analyse tilgange herunder Atg-positive partikel intensitet profiler og kvadrant analyse med gating af individuelle fluorescerende signaler, har råd til kraftfulde påvisning og sammenligning af normale og patologiske autophagic flux i vivo i forskellige sygdomsmodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749