Summary
Мы разработали простой и адаптации рабочего процесса для получения количественных данных из ячейки на основе изображений флуоресценции биологических исследований агрегации белков и autophagic потока в центральной нервной системе дрозофилы моделей нейродегенеративные.
Abstract
С ростом распространенности нейродегенеративных заболеваний все более важно понять основные патофизиологии, что приводит к дисфункции нейронов и потери. На основе флуоресценции изображений инструменты и технологии позволяют беспрецедентный анализ субцеллюлярные нейробиологических процессов, пока сохраняется потребность в беспристрастной, воспроизводимые и доступные подходы для получения количественных данных из изображений исследования . Мы разработали простой и гибкой рабочий процесс, чтобы извлекать из на основе флуоресценции изображений исследования с использованием модели дрозофилы нейродегенеративные количественные данные. В частности, мы описываем easy-to последующие, полуавтоматическое подход с использованием Фиджи/ImageJ для анализа двух клеточных процессов: во-первых, мы количественно совокупного содержания белка и профиль в доле зрительного дрозофилы , с помощью люминесцентной меткой мутант гентингтина белков; и во-вторых, мы оцениваем autophagy Лизосома потока в системе дрозофилы визуальные с количественной оценки на основе ratiometric тандем флуоресцентные репортер autophagy. Важно отметить, что изложенные здесь протокол включает полуавтоматическая сегментация шаг, чтобы убедиться, что все флуоресцентные структуры анализируются к минимуму систематическая и увеличить разрешение тонкие сравнений. Этот подход может быть продлен для анализа других клеток биологических структур и процессов причастны нейродегенеративные, таких как белковых puncta (гранулы стресс и синаптическую комплексы), а также мембраны прыгните отсеков (митохондрии и мембрана везикулы торговли людьми). Этот метод обеспечивает стандартизированный, но адаптированы ссылку для анализа изображений и количественной оценки и могли бы способствовать надежности и воспроизводимости через поле и в конечном итоге повысить механистического понимания нейродегенеративные.
Introduction
Нейродегенеративные заболевания затрагивают миллионы людей каждый год, и растет с старение населения1. Хотя каждый нейродегенеративные заболевания имеет уникальный этиологии, агрегирование смятых протеинов и разбивка proteostasis сети общих патологических отличительными особенностями являются многие из этих болезней. Разъяснение, как нарушение этих основных и взаимосвязанных процессов идет наперекосяк вносить нейрональных дисфункции и клеток смерть имеет решающее значение для понимания нейродегенеративных заболеваний, а также руководящих терапевтических вмешательств. На основе флуоресценции изображений позволяет для расследования эти сложные и динамичные процессы в нейронах и внесла значительный вклад в наше понимание биологии нейрональные клетки. Анализ дневно тегами белков является сложной задачей, особенно когда эксперименты проводятся в естественных условиях, из-за весьма компактный тканей, типов различных клеток и морфологическая неоднородность. Вручную помощь количественной оценки является доступным и простым, но часто занимает много времени и при условии человека предвзятости. Таким образом существует потребность в беспристрастной, воспроизводимые и доступные подходы для получения количественных данных из изображений исследования.
Мы разработали простой и гибкой рабочего процесса с помощью Фиджи/ImageJ, мощный и свободно доступных изображений, обработки программного обеспечения2,3, чтобы извлечь количественные данные из флуоресценции изображений исследования в экспериментальной модели нейродегенеративные используя дрозофилы. Следуя этот протокол для количественного определения белка агрегации и autophagic потока — две ячейки биологических особенностей, которые весьма актуальны для нейродегенеративные заболевания патология — мы продемонстрировали чувствительность и воспроизводимость этого подхода. Анализ дневно тегами мутант гентингтина (НТТ) белков в доле зрительного дрозофилы показали, число, размер и интенсивность белка агрегатов. Мы визуализирована тандем флуоресцентные репортер autophagic потока в пределах дрозофилы зрительной системы, которая отображает различные выбросов сигналов в зависимости от среды полигамное4. На основе Ratiometric анализа тандем репортер позволяет представление количественных и всеобъемлющей autophagy Лизосома потока от autophagosome формирования, созревания и транспорта к деградации в Лизосома и дополнительно выделены уязвимые отсеки в нейродегенеративных условий. Главное в обоих анализах мы реализовали полуавтоматические ограничивание и сегментация шаги в нашей протокол к минимуму бессознательного смещения, увеличения отбора мощности и установить стандарт для облегчения сопоставлений между аналогичные исследования. Простой рабочий процесс предназначен для мощных плагинов Фиджи/ImageJ (разработанных компьютерных ученых, основанные на математических алгоритмов) более доступными для neurobiologists и наук о жизни сообщества в целом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. соображения и подготовка для проектирования эксперимент анализ изображений
- Предопределяют подходит анатомические, сотовых, или внутриклеточных маркеров, чтобы служить в качестве ориентиров для стандартизации региона интерес (ROI) через различные образцы, например 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), маркеры мембраны, локализованные люминесцентные белок и т.д.
- Выберите флуоресцентные маркер, который можно разграничить дискретных puncta Помимо фоновых уровней для структуры интереса.
Примечание: Этот протокол оптимизирован для белковых структур (например, смятых протеинов агрегаты) и мембранных органелл (например, autophagy репортер). Чтобы визуализировать агрегации белков, фрагмент ППП тегами N-терминальный человека Htt белка с патогенных polyQ тракта 138 повторяется (ППК hHttQ138) был используется5. Мутантный белок Htt образует цитоплазматических агрегатов при выраженных в нейрональных драйверам например elav-GAL45,6. Для визуализации потока autophagosome Лизосома, Актин GAL4 использовался повсеместно водить выражение тандем mCherry-GFP-Atg8a репортер. mCherry - и GFP-позитивных puncta указывают autophagosomes, и поток контролируется как GFP флуоресценции закаленных в кислой среде Лизосома, где кислоты регистра mCherry остается до тех пор, пока белок является деградированных7. Для ratiometric анализа один канал, который является маркером последовательной структуры может использоваться для сегментации, или если необходимо, что проекция двух или более каналов может использоваться для описания структур, хотя описанные явно не в настоящем Протоколе. В этом примере mCherry используется для сегментации Atg8-позитивных частиц, как она нечувствительна кислоты и будет оставаться в секции на протяжении всего потока через пути. - Скачать и установить открытым исходным кодом изображения анализ платформы ImageJ или Фиджи — распределение вероятностей ImageJ с комплекте плагины2,3.
- Установите плагин для h Максима Интерактивные водосборных бассейнов.
Примечание: Этот протокол использует Фиджи; для ImageJ могут потребоваться дополнительные плагины. Подключаемый модуль, разработанный Benoit Lombardot для SCF-MPI-CBG-доступны онлайн (https://imagej.net/Interactive_Watershed). - Перейдите к «Справка | Обновление», выберите «Управление обновление сайтов» от «ImageJ Updater», выберите сайт обновления SCF-MPI-ЦБС из списка и затем закройте и перезапустите Фиджи.
2. мозг диссекции и иммунофлюоресценции пятнать
-
Делают силиконовые эластомера выстроились рассечение блюда.
- Наливайте силиконовые эластомера компонентов в стакан, как указано заводом-изготовителем и перемешать хорошо до тех пор, пока тщательно перемешивают.
- Использование пипетки для заполнения 5 см культуры ткани блюда одной трети до половины полный (около 10 мл смеси эластомер). Разрешить любые пузыри поднимаются на поверхность и аккуратно удалить с папиросной бумаги. Обложка блюда и разместить их на ровную поверхность для лечения для 48-72 ч при комнатной температуре (RT).
-
Вскрыть дрозофилы мозга и зрительной системы при необходимости.
- Выполнения диссекции дрозофилы мозга как описано8,9. Выполните рассечение в картонных эластомер рассечение блюда, с помощью эластомер снизу для стабилизации мозг, чтобы избежать повреждения ткани или щипцами.
- Чтобы сохранить нетронутыми пластинки во время вскрытия, сдвиньте две щипцы под сетчаткой и аккуратно слезоточивый через середины глаза, чтобы удалить сетчатки. Отведите в сторону любой ткани сетчатки, придает пластинки с щипцами, проведенных параллельно поверхности пластинки.
Примечание: Остаточные пигмент будет смыть в следующих шагах и обычно не мешают антитело пятная и обработки изображений. - Разбавьте 37% формальдегида в фосфат амортизированное saline (PBS), с тем чтобы сделать окончательный 3,7% концентрации свежий перед использованием в пробки microcentrifuge 500 мкл. Передать пробки microcentrifuge с решения расчлененных мозга и Инкубируйте 15 мин на RT с плавное покачивание.
Примечание: Формальдегид имеет естественную тенденцию к окислению, производя муравьиную кислоту. Таким образом он предложил Алиготе 37% формальдегида для хранения и разбавить до 3,7% свежей перед каждым использованием. Чрезмерной фиксации или недостаточная фиксация будет влиять на целостность ткани и флуоресценции10. - Вымойте 3 раза с PBTx (PBS с 0,4% Тритон X-100) за 15 мин.
-
Выполняют иммуногистохимии и смонтировать образцов.
- Если необходима Пятнать антитела, удалите PBTx, добавить основное антитело, разбавляют 5% нормальной козьего сыворотки в PBTx и инкубировать на аликвота смеситель на ночь при 4 ° C.
- Удаление основного антитела и промыть PBTx 3 раза за 15 мин. Добавление вторичного антитела, разбавляют 5% нормальной козьего сыворотки в PBTx и инкубировать 1 час на RT или на ночь при 4 ° C. Промыть PBTx 3 раза за 15 мин.
- Если DAPI окрашивания необходимо, удалить PBTx, добавить DAPI решение (фондовый раствор: 5 мг/мл, разбавляют до рабочей концентрации 15 мкг/мл в PBTx) и проинкубируйте втечение 10 мин на RT. мыть 3 раза с PBTx за 15 мин.
- Чтобы очистить ткани, поместите каплю монтажа средних на центр слайд микроскопии с распоркой один слой прозрачной клейкой ленты с обеих сторон. Передача мозг на падение среднего монтажа и ждать 1-2 мин до тех пор, пока мозг становится прозрачным. Осторожно удалите средство монтажа с пипеткой.
- Для монтирования, примените капли свежего монтажа средних на мозги на слайде. Тщательно наложение крышка стекла, избегая пузыри. Уплотнение края с резиновый клей и просушите в РТ на 20 мин приступить для захвата изображений для достижения наилучших результатов.
3. изображение приобретение
- Оптимизировать параметры приобретение микроскопа, включая пространственное разрешение, цель, масштаб, скорость сканирования, и шаг размер, чтобы максимизировать резолюции структур, представляющих интерес для облегчения полуавтоматическая сегментация во время анализа изображений.
Примечание: Это может быть полезным для захвата изображения образца и протестировать полуавтоматическая сегментация (в шаге 5 настоящего Протокола) перед изображений всех экспериментальных образцов. Таким образом пользователь может настройки изображений так, что аналитические инструменты могут легко различить биологической структуры интереса. -
Отрегулируйте изображение детектор захватить высокое соотношение сигнал шум и высокий динамический диапазон образца.
- Используйте LUT (смотрите таблицу), указывающее пиксель насыщения (воздействие слишком высока) или undersaturation (смещение слишком низкий) во время настройки (рисунок 3B, красный указывает пиксель насыщение Хай/Лоу LUT).
- Убедитесь, что усиление и смещение параметры подходят для всех экспериментальных групп, как экспериментальных манипуляций может изменить структуру интерес.
Примечание: Важно, что те же параметры используются для всех групп сделать количественные сравнения.
- Изображение через ткани, чтобы захватить все данные.
Примечание: Рекомендуется для захвата всех имеющихся данных в течение одной сессии изображений и для определения более точной области во время выбора ROI на шаге 4 при необходимости. - Сохраните изображение как тип файла, поддерживаемый изображений программное обеспечение для сохранения метаданных, таких как приобретение параметры и пространственной калибровке. Сохранить изображение с именем файла, включая экспериментальные Дата, генетический фон и флуоресцентные репортеров, антитела, или красителей, соответствующие каналы сканирования как [имя группы] _ [имя образца] _ [эксперимент Дата] _Ch1. [Флюорофор цель /Dye]_Ch2.[Fluorophore-Target/Dye], и т.д.
4. Фиджи/ImageJ импорта изображений и выбор ROI
- Откройте изображение в Фиджи. Используйте диалоговое окно «Параметры импорта био-форматы», выберите «Просмотр стека с: Hyperstack» и «цветовой режим: серого».
Примечание: Рекомендуется открыть тип файла Микроскоп, как метаданные, такие как пространственной калибровке могут быть прочитаны Фиджи. -
Определите область от одной плоскости z или проекции, основанные на каналы маркер, который может использоваться как стандартизированные ROI различных образцов (рис. 1, выбор ROI).
- Используйте полосу прокрутки «C» для просмотра каналы, используемые для захвата marker(s), указанных в шаге 1.1.
- Используйте «Z» прокрутки для перемещения плоскости фокуса. Выберите один срез или создайте проекция нескольких фрагментов, нажав кнопку «изображение | Стеки | Проект Z» и установить «начало фрагмента» и «Остановить срез» охватывают ROI.
Примечание: Установка типа »проекции» до «Макс интенсивности» в проекте «Z» диалоговое окно часто лучше всего подходит подчеркнуть структур для сегментации в разделе 5, хотя это может не подходить для всех приложений. Если для анализа требуется другой тип проекции, позаботьтесь, чтобы сохранить и документ этот файл таким образом, для извлечения компонентов в разделе 6 или 7. - Создать новое изображение, содержащий каналы и фокальной плоскости, представляющие интерес для упрощения следующие шаги в протоколе анализа изображения. Выберите «изображение | Дубликаты», задайте нужное «каналы» (c) и «Фрагменты» (z) и изменить имя файла, чтобы отразить выбор (например, [имя группы] [имя образца] _ [эксперимент date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
- Используйте один из «выделение» на панели инструментов Фиджи вручную выбрать стандартизированных ROI на основе критериев отбора, определенный на шаге 4.2.
- Добавьте ROI рентабельность менеджер, нажав кнопку «анализировать | Инструменты | ROI менеджер» и нажмите кнопку «Добавить» в меню менеджера ROI. Сохранить рентабельность инвестиций ROI менеджер меню, нажав «более | Сохранить», а затем укажите имя файла для отражения ROI (например, [имя группы] [имя образца] _ [эксперимент Дата] _ [канал] _ [z-плоскости] _ [ROI описание]).
Примечание: Это может быть возобновлено в Фиджи для последующего анализа или могут быть применены к другим каналам или изображения как в раздел 5.3.
5. Предварительная обработка и сегментация с h Максима Watershedding
-
Выполняйте операции предварительной обработки на канал, используемый для захвата структуры интереса.
- Если файл изображения состоит из нескольких каналов, отдельные каналы, нажав «изображение | Цвет | Разделить каналы» изолировать канал интерес.
- Применить фильтр как медианный фильтр для уменьшения шума или Гауссово размывание для сглаживания, нажав «процесс | Фильтры | Тип фильтра» (например, «Медиана-фильтр» или «Гауссово размывание»).
- Отведайте различные фильтры и параметры на изображения из каждой экспериментальной группы фильтра. Выполните шаг 6.2 с репрезентативного примера из каждой группы, чтобы проверить производительность сегментации. Выберите фильтр и настройки, которые облегчают сегментация структур интерес.
- Запись фильтр и параметры. Применять эти параметры в экспериментальных группах.
- Сохраните копию изображения в виде файла tiff включая прикладной фильтр для справки. Используйте подробное имя, например [имя группы] [имя образца] _ [эксперимент Дата] _ [канал] _ [z-плоскости] _ [фильтр с параметрами].
-
Выполните сегментация структур интерес с инструментом интерактивного h Максима водосборных бассейнов на предварительно обработанного изображения создается и сохраняется в шаге 5.1.
- С предварительно обработанного изображения в Фиджи, инициировать средство интерактивного водораздел h Максима, нажав «СКФ | Маркировка | Интерактивная H_Watershed».
Примечание: Этот плагин сначала вычисляет водораздел и затем позволяет пользователю исследовать влияние местных Максима и порог параметры сегментации через мгновенно Обновлено вывода изображения. - Из панели управления настройте семян динамика (h), интенсивность порога (T) и Пик наводнения (%), чтобы оптимизировать сегментации.
Примечание: Всегда относятся к raw изображений перед препроцессирование из раздел 4.2, чтобы вручную проверить производительность сегментация структур интерес. - Когда удовлетворены результатами сегментации, выберите «Экспортировать регионы маска» и выберите «Экспорт». Это будет генерировать двоичное изображение результатов водораздел (рис. 1, сегментация).
- Запишите параметры сегментации; Эти параметры должны применяться во всех экспериментальных групп на количественных сопоставлениях. Сохранить маску двоичные результаты при желании для справки с параметрами сегментации, подробно изложены в имя как [имя группы] [имя образца] _ [эксперимент Дата] _ [каналы] _ [z-плоскости] _ [фильтр с параметрами] _ [H_Watershed параметры].
- С предварительно обработанного изображения в Фиджи, инициировать средство интерактивного водораздел h Максима, нажав «СКФ | Маркировка | Интерактивная H_Watershed».
-
Извлечь структуры интереса от водораздела результаты.
- Откройте сохраненный ROI от шаг 4.4, в менеджере ROI. С двоичной области маски из шага 5.2.4 активных выберите ROI от ROI менеджера для применения к изображению, чтобы ограничить функцию извлечения для стандартизированной ROI.
- С Руа, активных на бинарные водораздел маску, выберите «анализировать | Анализ частиц» с «Менеджер» выбран в диалоговом окне извлечь функции.
Примечание: Это будет добавить идентификатор частиц для каждой структуры, разделенное в ходе сегментации к диспетчеру ROI. Параметры доступны в этом меню, чтобы исключить функции, основанные на размер или замкнутости, если это необходимо для уточнения структур, включенных в анализ. - Нажав сохранить частицы «более | Сохранить» в меню менеджера ROI. Убедитесь, что выбран идентификаторы и все частицы будет сохранен в zip-файле. Используйте подробное имя, например [имя группы] [имя образца] _ [эксперимент Дата] _ [каналы] _ [z-плоскости] _ [фильтр с параметрами] _ [H_Watershed параметры] _ [структуры].
6. количество, области и интенсивности количественной оценки и анализа
- Откройте изображений в формате raw создается и сохраняется в шаге 4.2. Выделите канал, используемый для захвата структуры интереса.
Примечание: Очень важно для измерения интенсивности из raw изображений (до предварительной обработки) как применение фильтров в шаге 5.1 изменения значения пикселов. - Откройте частицы, полученные от добычи особенность в шаге 5.3 и выберите «Показать все» от менеджера ROI.
Примечание: Это действие будет наложение изложение каждой частицы на «ROI менеджер» на изображение и должно соответствовать края структуры интереса (рис. 1, функция извлечения). - Установите желаемый измерения, нажав кнопку «анализировать | Набор измерений».
Примечание: Площадь, интенсивности и плотности частиц может измеряться, выбрав «область» и «комплексной плотность». При выборе интегрированной плотность, Фиджи будет производить два значения: «Встроенный плотности» рассчитывается как произведение района и среднее значение серого и Raw интегрированный «плотности» измеряется как сумма значений пикселей. Плотность флуоресцирующего белка в частицы рассчитывается как сумма значений пикселов, разделенная на площадь. Количество частиц, созданного на шаге 5.3 указывает количество частиц в ткани, ROI, определенным в шаге 4.4. - ROI менеджер меню выберите «Мера». Результаты выражаются в калиброванных единицах, пока измерения взяты из файлов, полученных изображений в Фиджи. Копирование результатов из окна результаты и вставить в таблицу программное обеспечение для компиляции и дальнейших вычислений.
7. Ratiometric количественная оценка и анализ данных
- Выполните шаги 6.1 и 6.2 открыть идентификаторы частиц на первом канале сырье интерес.
- Установите желаемый измерения, нажав кнопку «анализировать | Набор измерений».
Примечание: Средняя интенсивность за частиц может измеряться, выбрав «Означает значение серого». - От менеджера ROI выберите «Мера». Копирование данных из окна результаты и вставить в таблицу программного обеспечения.
- Перенести второй канал необработанных интерес, GFP в этом примере (рис. 4A), scrollbar «C» и повторите шаги 7.2. и 7.3.
Примечание: Частицы, сохраненные на шаге 5.3 будет по умолчанию канал и срез, из которого он был создан. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что частицы применяются к правильный канал интерес. - Вычислите коэффициент интенсивности от одного канала с интенсивностью второй для каждой частицы в программном обеспечении электронной таблицы.
-
Используйте точечную диаграмму для визуализации и количественной оценке данных ratiometric от флуорофоров, выставлять отдельные изменения, отражающие основных биологических процессов.
- Создание точечной графического программного обеспечения.
Примечание: Каждая точка данных представляет собой структуру интерес, где интенсивность первого Флюорофор интерес значение «x» и интенсивность второй Флюорофор значение «y» измеряется от каждой частицы. - Установите стробирования пороговые значения для каждого Флюорофор для определения квадрантах.
- Создание точечной графического программного обеспечения.
-
Используйте линии профиля для визуализации Флюорофор интенсивности по всей структуры интереса.
- Выберите ROI, созданного на шаге 5.3 и использовать прямой инструмент на панели инструментов чтобы нарисовать прямую линию через ROI. Добавьте строку ROI к диспетчеру ROI.
- Для каждого канала интереса, с линией ROI активных, выберите «анализировать | Участок профиля».
Примечание: Функция профиля сюжет будет генерировать гистограммы сюжет и таблица значений интенсивности вдоль линии. Скопируйте результаты измерений от каждого канала и вставить в таблицу программное обеспечение для создания участка показаны оба канала вдоль линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Количественная оценка числа, область и интенсивность дневно тегами мутант Htt агрегатов в доле зрительного дрозофилы
Расследовать агрегации смятых протеинов в центральной нервной системе дрозофилы модели болезни Гентингтона, ЗП тегами мутант человека Htt с не патологических (UAS-ЗП hHttQ15) или патологического расширения ( UAS-RFP-hHttQ138) и мембраны GFP (UAS-mCD8::GFP)11 были совместно выразили под Пан нейронов драйвер elav-GAL4. Мозг женщины летит через 2 дня после eclosion (Дэ) были расчленены, фиксированной и витражи с DAPI согласно статье 2 протокола. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия была исполнена упором на доле оптика с 40 X Нефть погружения объектива, 1,30 числовой апертуры (NA), используя скорость сканирования 8.0 МКС на пиксель и пространственным разрешением 1024 x 1024 пикселей (12 бит на пиксел). Оптимальный шаг размер определяется изображений был 1.08 мкм на срез для цели с следующие комбинации длин волн возбуждения/выбросов: канал 1) 488/510 GFP, канал 2) 543/581 для ППП и канал 3) 405/461 DAPI. Изображения детектор параметры, применяемые ко всем группам для захвата изображения для сравнения, были основаны на ЗП-Htt-Q138 образца, который накапливается высокой интенсивности ППП-Htt агрегатов, вместо непатогенные ППП-Htt-Q15 управления образец, который поддерживает низкий уровень диффузных ППП-Htt (рис. 2). Если параметры приобретения изображений были установлены увеличить динамический диапазон ППП-Htt-Q15 образца, то будет насыщен ППП-Htt-Q138 агрегатов. В качестве примера Микрофотография агрегации белков в доле зрительного дрозофилы был сохранен как HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.
Вся оптика мочку был образы при микроскопии и состояла из примерно 15 z фрагментов, но после съемки, было установлено, что анализ одной плоскости z был лучшим для устранения отдельных структур, которые противном случае появились бы перекрытия в проекции из-за высокая плотность в ткани. Для определения стандартной ROI, C2 и C3 клеток тела, расположенный между продолговатого мозга и lobula пластины в лоб зрительный12 были использованы как анатомические ориентир. В Фиджи изображение таким образом был продублирован, чтобы отразить требования анализа и был сохранен в виде файла tiff с именем HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, где z8 отражает восьмой фрагмент, где C2 и C3 нейрональных клеток тела были наиболее видно, DAPI окрашивание (рис. 1A, захвата изображений). Выбор инструмента «Многоугольник» был использован вручную выбрать ROI вокруг оптической лепестка, используя DAPI окрашивание и нейрональных GFP сигнала в качестве руководства (рис. 1A, выбор ROI, где желтый цвет обозначает ROI и красный обозначает высокое увеличение изображения, отображаемого для ясность в следующие панели рабочего процесса). Далее фильтр Gaussian Blur с σ значением, равным 1 был применен к каналу ППП-Htt гладкое изображение и облегчения сегментации (рис. 1A, предварительная обработка) и производительность ниже по течению сегментации и возможность извлечения с и без этого предварительной обработки шаг иллюстрируется на рисунке 1A. Интерактивные H-водораздел была выполнена на изображениях ППП-Htt канала со следующими параметрами: семя динамика, 30; интенсивность порог, 500; Пик наводнения (в %), 80; с «позволяют разделять» и «экспорта регионов маски» выбран (Рисунок 1A, сегментация). Результирующий двоичный регионов маски был сохранен как HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent и используется для генерации частиц с инструментом анализа частиц с минимальный размер исключение 0,4 мкм2 для определения белков агрегатов13,14 . Результате частицы были спасены от ROI менеджера как HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates и были применены к сырой ППП-Htt канал (до предварительной обработки) для извлечения количественные данные изображения (рис. 1A, функция извлечения).
Количественная оценка количество полуавтоматически сегментирована ППП-Htt агрегатов от стандартизированных координационных плоскости через оптические мочку дрозофилы показали диффузных выражение непатогенные Htt-Q15 экспансии и накопление белка Агрегаты, расширение заболевани причиняя Htt-Q138 (рис. 2A-C). Сумма значений всех пикселей в каждой частицы, предоставленные «Raw комплексной плотности» был использован для сравнения ППП-Htt содержание каждого агрегата. Размер и интенсивность профили всех агрегатов от стандартизированных фокальной плоскости пяти различных оптических лопастями, выражая Htt-Q138 иллюстрируют надежность и воспроизводимость этого рабочего процесса (Рисунок 2D, E). Особенно, когда агрегаты были переэкспонированных во время захвата изображений (Рисунок 3А, B), количественная оценка размер и количество агрегатов сопоставимы с агрегатов, захватил с идеальной экспозиции (рис. 3 c, D), однако интенсивность переэкспонированных агрегатов становится функцией размера как насыщенный пикселей экспонат значение максимальной интенсивности (Рисунок 3E, F). Таким образом создание соответствующих параметров сканирования воздействия имеет решающее значение для извлечения полный спектр количественных молекулярного состава белков агрегатов.
Количественная оценка на базе Ratiometric autophagy потока в дрозофилы визуальные пластинки с помощью тандем флуоресцентный Atg8a репортер
Чтобы оценить autophagy Лизосома потока в зрительной системе дрозофилы , mCherry-GFP-Atg8a репортер был повсеместно выражается в управления или мухи дрозофилы Спермин синтазы (dSms) гомозиготных мутант (dSmse/e) с водителем Актин GAL4 . dSmse/e летит нейродегенеративные экспонат, связанный с нарушением autophagic потока из-за дисфункции лизосомальных15. Мозги с прилагаемой пластинки женского мух на 5 Дэ были расчленены, фиксированной и витражи с DAPI. Пластинки был воспроизведен образ лазерное сканирование конфокальная микроскопия с 100 X нефти погружения объектива, 1,35 числовой апертуры (NA), на скорости выборки 8.0 МКС на пиксель, и 12 бит на пиксель оптическое разрешение и размер шага 1,2 мкм.
Этот анализ проводился на Макс z проекция семи z ломтики через пластинки для увеличения мощности проб разреженных Atg8-положительных структур (рис. 1B, захвата изображений). Стандартизированные ROI вручную обращалось с выбора инструмента «Многоугольник» вокруг тела клетки слоя свидетельствуют DAPI и основываясь на хорошо изученных анатомии и клеточной организации ткани (рис. 1B, выбор ROI, где указывает желтый Рентабельность и красный обозначает высокое увеличение изображения, отображаемого для ясности в следующие панели рабочего процесса)16. Репортер тандем опирается на стабильность свойств GFP и mCherry постановление в ознаменование прогрессии через autophagy лизосомальных пути, таким образом, что GFP закаленном кислотность Лизосома, где mCherry остается до тех пор, пока он разлагается. Таким образом долгоживущих Флюорофор mCherry был использован для сегментации в настоящем Протоколе. Был применен фильтр Gaussian Blur с σ значение 1 на mCherry канал (рис. 1B, предварительная обработка), и была проведена интерактивная H-водораздел со следующими параметрами: семя динамика, 0; интенсивность порог, 800; Пик наводнения (в %), 90; с «позволяют разделять» и «экспорта регионов маски» выбран (Рисунок 1B, сегментация). Результирующий двоичный регионов маски был использован для создания частиц с инструментом анализа частиц. Результате частицы были применены как сырье mCherry, так и необработанные GFP каналов (до предварительной обработки) для извлечения данных количественных ratiometric из autophagy Лизосома отсеков (рис. 1B, функция извлечения).
Визуальный осмотр mCherry-GFP-Atg8-положительных структур указали обогащения в регионе клетки тела пластинки, в соответствии с предыдущими докладами Ретроградная транспорта autophagic везикулы в клетки тела нейронов17. Для визуализации mCherry и интенсивности GFP через несколько Atg8-положительных структур (см. строку ROIs в результате интенсивности профили вдоль линии в Рисунок 4Bи рис. 4A ), выявление различий в репортер, где использовался профиль участка интенсивность обоих флуорофоров указывает, что autophagosomes (Рисунок 4В3), высокой mCherry и низкой GFP указывает сплавливание с Лизосома GFP закаленных в этой кислой отсека (Рисунок 4Б1), и наконец низкой mCherry отражает ухудшение состояния в течение Лизосома (Рисунок 4B2). Точечная, созданные из средней Флюорофор интенсивности каждой частицы полуавтоматически сегментированный mCherry-Atg8-положительных иллюстрирует поток через autophagy лизосомальных пути, который затем был разделен на отдельные шаги квадрант анализа ( Рисунок 4 c). Сюжет был разделен на четыре квадранта, использование стробирования порогов GFP = 570, mCherry = 1800. Пороговые уровни были установлены на основе в группе управления, с помощью следующих участников: (1) конструкция флуоресцентных репортер тандем и свойства двух флуорофоров, так что теоретически GFP следует не флуоресцировать там, где нет сигнала mCherry (квадрант IV) и (2) распределение частиц Atg8-положительных отражает распределение autophagy лизосомальных пути, относящиеся отсеков в нейронах одичал тип где базальной autophagy является высокоэффективным18,19. В laminas управления мух, около 25% частиц Atg8-позитивные были сегментирования как autophagosomes (квадрант I), и половина из puncta обрабатываются за autophagosome Лизосома Фьюжн (квадранта II и III); dSmse/e laminas значительно увеличилась, autophagosomes или неблагополучных лизосом (квадрант я) и autolysosomes (квадранта II и III), наводящий autophagosome накопления через дефекты в autophagosome Лизосома фьюжн и/или лизосомальных деградации (Рисунок 4 C, D). Количественных данных поддерживает также очевидным накопление Atg8-положительных структур в пластинки от мух dSmse/e (Рисунок 4E). Ratiometric анализ средней mCherry и GFP сигнал подчеркнул разницу между группой контроля и dSmse/e (Рисунок 4F), но не может подробно общее влияние на пути ни конкретные шаги свидетельствуют квадрант анализ.
Рисунок 1: Процесс через к минимуму предвзятость, полуавтоматическая сегментация внутриклеточных структур в мозге дрозофилы , используя Фиджи с примерами. (A) представитель конфокальной микроскопии от одной фокальной плоскости через оптические мочку дрозофилы взрослого мозга выразив Пан нейрональных ППП тегами мутант Htt и мембраны целевой GFP (elav-GAL4 > бла-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) с DAPI окрашивание (получение изображения). DAPI и ГФП были использованы для выбора ROI (желтый) вокруг лоб зрительный; Красный флажок указывает, региона усиливается через рабочий процесс для ясности (выбор ROI). Предварительной обработки панели показывает высокое увеличение изображений raw ЗП-HttQ138 канала (сверху) и после применения фильтра Gaussian Blur, σ1 (внизу). Сегментация по интерактивного h Максима водораздела, с использованием указанных параметров для семян динамика определяется h Максима (h), глобальный водораздел стоп критериев определяется интенсивность порога (T), и региональных стоп критериев определяется Пик наводнения ( %) выполняются на ЗП-HttQ138 сырья (сверху) и Гаусса размыты (внизу) изображения и водораздел результаты из регионов маски экспортированных из плагин водосборных бассейнов и перевернутый для ясности. Частицы, порожденных анализ частиц (пурпурный) накладывается на ЗП-HttQ138 raw изображений (функция извлечения). Стрелки указывают агрегированные показатели, которые чрезмерно сегментирована без предварительной обработки и стрелки указывают на структуры, которые не могут отделить после фильтрации. (B) представитель конфокальной микроскопии от максимальная z проекции плоскостей 7 фокуса через горизонтальные секции пластинки мутант (dSmse/e) дрозофилы взрослых выражения повсеместно GFP-mCherry-Atg8a (и контроля актин GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8) с DAPI окрашивание (получение изображения). DAPI был использован для выбора ROI (желтый) вокруг тела клетки слоя пластинки; Красный флажок указывает, региона усиливается через рабочий процесс для ясности (выбор ROI). Предварительной обработки панели показывает высокое увеличение mCherry канала с фильтром Gaussian Blur, σ1 применяется как управления, так и мутантов пластинки. Сегментация по интерактивной h Максима водораздел на отфильтрованные mCherry изображений с указанных параметров, и показаны как двоичные регионов маски инвертированы для ясности результаты водосборных бассейнов. Частицы, порожденных анализ частиц (пурпурный) накладывается на mCherry сырье и GFP изображения (функция извлечения). Масштаб баров = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: количественная оценка размера и интенсивности мутант ППП-Htt агрегатов надежных и воспроизводимых. (A-B) Дрозофилы мозги с ЗП hHttQ15 (A) или ЗП hHttQ138 выражение (B) под Пан нейронов драйвер elav GAL4 были расчленены и фиксированной и оптические мочки были образы лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Шкалы бар = 50 µm. (C) среднее количество агрегатов в каждой группе количественно от вручную выбранных ROI вокруг лоб зрительный и сосредоточена на стандартизированных z ломтик (n = 5). (D-E) Размер (D) и общая интенсивность (E) ЗП hHttQ138 агрегатов, количественно от стандартизированной трансформирования в долях оптика 5 различных животных. Агрегированных данных выводится в лог масштаба. Агрегаты были определены как объекты более 0,4 мкм2 (пунктирная линия в D). Статистический анализ, односторонний дисперсионный анализ, NS: не, значительными; а.е.: произвольные подразделение пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: изображение передержка приводит к неточным интенсивности измерения. (A-B) Представитель конфокальный Микрофотография же optic lobe с идеальной экспозиции (A) и длительное (B) pseudocolored с HiLo LUT в Фиджи. Красный цвет в B указывает переэкспонированных агрегатов. Шкалы бар = 50 мкм. (C) количественная оценка совокупного размера после реализации h Максима водораздел параметров для получения аналогичных результатов сегментации. Статистический анализ, независимых выборок t -теста, NS: не значительные. Распределение частот в (D) совокупного размера в идеальной и Переэкспонированных изображений. Агрегаты с размером от 5 до 25 мкм2 были далее сегментирования в 4 группах категоричным. (E -F) Корреляционный анализ интенсивности агрегатов как функция совокупного размера (E). Контрольной линии является Рисованные (черный), когда все пиксели имеют значение максимальной интенсивности 4095. Зеленый флажок указывает агрегатов ниже 10 мкм2 области показано в F. b: коэффициент регрессии, R2: коэффициент детерминации; а.е.: произвольные подразделение пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Количественная оценка генетических репортер тандем флуоресцентный mCherry-GFP-Atg8a показывает особенности autophagic потока в дрозофилы. (A) представитель конфокальной микроскопии дрозофилы пластинки от управления и dSmse/e мутант мух, повсеместно выражения mCherry-GFP-Atg8a (актин GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a) и витражи для DAPI . Пунктирная штучной области слоя клеток тела пластинки приведены в большого увеличения (справа). Цифры показывают, представитель Atg8a-положительных структур построены в B и количественно в C. (B) гистограммы участок интенсивности флуоресценции в произвольных единицах (АС) вдоль линии ROIs указано в высокое увеличение изображения в а. (C) mCherry-GFP-Atg8 структуры построены средняя GFP интенсивностью в зависимости от интенсивности среднее mCherry измеряется от управления и dSmse/e пластинки (частицы, измеренная от 3 пластинки от каждой группы). Сюжет был разделен на четыре квадранта, использование стробирования порогов GFP = 570 и mCherry = 1800 с процентом структур в каждом квадранте, обозначается генотипа. (D) количественная оценка средней доли mCherry-GFP-Atg8 разделены на каждой штанге в C (n = 3 пластинки). (E) количественная оценка числа puncta mCherry-GFP-Atg8 на тонких металлических пластинах (среднее ± с.д., n = 3 пластинки). (F) Ratiometric анализ mCherry-GFP-Atg8 структур наблюдается в управления и мутантов летать пластинки (означает с 95% CI, n = 3 пластинки). Студент t-теста. P < 0,05, **P < 0.01. Sscale баров = 2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, изложенные здесь может использоваться для энергично и герметизации quantitate биологических процессов клетки визуализированы на основе флуоресценции изображений. Контекста биологических и технических ограничений необходимо тщательно направлять экспериментальный дизайн. Флуоресцентные маркеры внутриклеточных структур, представляющих интерес, ли иммуногистохимии, на основе красителя, или генетически выражено, нужно быть различимыми выше фона по морфологии и интенсивности. UAS/GAL4 система широко используется для привода экспрессии целевых генов в дрозофилы. Примеры, представленные здесь используется трансгенных линий, перевозящих GAL4 драйверы для активации транскрипции дневно тегами белков под контролем UAS усилитель для расследования агрегации белков и autophagy в нервной системе. Если наряду с флуоресцентные репортер трансген требуется одновременное выражение экспериментальной UAS трансген, то Группа контроля должны также включать co гиперэкспрессия несущественным трансген управления для дозировки GAL4, например Уан GFP или бас lacZ. Стандартизированные пробоподготовки, изложенные здесь для дрозофилы центральной нервной системы и зрительной системы, рассечение, фиксации, антитела, окрашивание, путем монтажа, имеет решающее значение для оптимального изображения и количественной оценки.
Хорошие практики, которые максимизируют отношение сигнал шум и динамический диапазон изображений необходимы для полуавтоматического анализа и имеют первостепенное значение для точных сопоставлений между экспериментальной группы. Параметров получения изображений должны устанавливаться таким образом, что репортер не перенасыщен, так что полный спектр белок интенсивность могут быть извлечены и количественно (рис. 3). Для количественного сравнения изображений должны выполняться с теми же параметрами приобретения и, желательно, в тот же день.
Выбор ROI, обработки изображений, функция сегментации и возможность извлечения с использованием платформы с открытым кодом ImageJ/Фиджи зависят от приложения; в то время как первоначальные параметры должны быть определены пользователем, их применение через образцы сведет к минимуму предвзятость при максимальном количественных данных вывода. Это важно тщательно документооборота и рекомендуется, чтобы сохранить изображение в виде файла tiff, после каждого шага с указанием имени файла применения обработки. Это может быть особенно полезным при разработке протокола, параметры в первый раз и будет служить в качестве точки отсчета для обеспечения согласованности между экспериментальных групп на каждом этапе обработки изображений и анализа. Критерии отбора ROI, с помощью маркеров или анатомические ориентиры должны быть определены из контрольной группы, однако следует позаботиться о том, чтобы обеспечить, что экспериментальных манипуляций не изменяют маркеры или достопримечательностями в пути, который не допускал бы надежным свидетельством Стандартизируйте ROI. Для наилучшим образом решать задачи анализа, где одной фокальной плоскости могут быть полезны для улучшения разделения соседних структур, и z проекция может быть полезен для анализа структуры может быть выбран один срез или z проекция нескольких фрагментов локализованные по всему объему ткани. Следует тщательно и независимо определить тип z проекции используется для сегментации и анализа изображений. Максимальная интенсивность проекция будет производить резкое изображение, поскольку структуры являются ярким в плоскостях, где они находятся в центре внимания и, как правило, хорошо подходит для сегментации. Анализ изображений могут быть приемлемыми на максимальной проекции, как показано в примере autophagy Лизосома анализа; Atg8-положительных структур меньше, чем размер шага, используемый для отбора проб, таким образом наиболее точно представлены максимальной интенсивности от единственного фокальной плоскости, из которого они были захвачены в плен. Однако для анализа структур больше, чем размер шага, сумма проекции, которая добавляет все пикселы с те же координаты xy может более точно представляют информацию интенсивности каждой структуры. Хотя этот протокол предназначен для анализа один срез или z проекция нескольких фрагментов в 2D, Рабочий процесс может быть легко адаптирован для анализа трехмерных структур в z серии, используя несколько из тех же инструментов. 3D анализ желательно для небольшого размера выборки неправильной формы структур, где z ломтик, наискось пересекающий структура бы исказить анализ.
Обработка с помощью фильтра, например, предложенных в настоящем Протоколе, может уменьшить шум при сохранении края для помощи обнаружения структур интерес при сегментации; фоновый шум и люминесцентные маркер неоднородности без достаточного сглаживания приведет к чрезмерной сегментации, в то время как параметры, которые приводят к слишком много размытие будет удалить деталь и предотвратить обнаружение точных края. Сегментация по водораздел рассматривает изображение как топографическая поверхность с источником воды на местном Максима — высокой интенсивности пикселей в флуоресцентного изображения — это наводнения пока он не встречает соседних затопленных районов, где плотина, или сегмента границы, построен20. H Максима водораздел использует определяемые пользователем порога (h Максима динамика в плагин SCF-MPI-ЦБС), чтобы отличить значимые локальные максимумы, чтобы избежать чрезмерной сегментация структур, которые не имеют уникальные местные максимум21. Интерактивная h Максима водораздел плагин реализован в этот протокол позволяет пользователю настроить h Максима динамика (h), глобальный водораздел стоп критериев определяется интенсивность порога (T) и региональные стоп критериев определяется Пик наводнения (%), в то время как мгновенно просматривать результаты водораздела на изображение вывода качественно оценить производительность сегментации. Сегментация результаты тесно будут согласны с большинство структуры границы, хотя чрезмерная сегментации и неполного разделения (рис. 1A, красные стрелки в функции извлечения) может произойти где люминесцентные маркировки неоднородных или ткани является густонаселенных. Эффективность полуавтоматическая сегментация и анализа шаги могут быть использованы для увеличения мощности выборки и уменьшения ошибок сегментации.
После сегментации и функция извлечения это просто извлечь морфологической информации как области, измерения и округлость. Кроме того если изображения собираются надлежащим образом избежать передержки, молекулярной информации можно также сделать вывод из этого анализа изображений путем измерения интенсивности. После того, как меры нейродегенеративные заболевания патология извлекаются и количественно этот подход, эти меры может использоваться для решения ряда важных вопросов. В частности протокол продемонстрировал потенциал для использования анализа изображений и количественной оценки белка агрегатов для выявления факторов, которые влияют на агрегации белков и сопоставлять распределение, количество, размер и плотность белка агрегатов с научные здоровья и нейрональных дисфункции. Количественная оценка на основе Ratiometric может использоваться для информирования совокупного взаимодействия с субцеллюлярные компоненты или процессы во время болезни. Хотя биохимические и проточной цитометрии были применены для анализа взаимодействия агрегатов и других внутриклеточных структур, лизис клеток может привести к потери белка, изменить статистические свойства и нарушить белок белковых взаимодействий22. mCherry-GFP-Atg8 широко используется для мониторинга autophagy через микроскопии флуоресцирования, особенно в культивируемых клеток23, но отсутствуют объективные и количественных аналитических методов. Кроме того в естественных условиях анализ с использованием генетически закодированный тандем репортер является сложной задачей и требует высоко контролируемых генетический фон и тканей подготовки. Этот протокол определяет проверенной методологии для визуализации практики критических для количественного определения autophagy Лизосома отсеков от подготовки ткани. С хорошей практикой генетических изображение анализа подходов, включая ГПТ позитивных частиц интенсивности профили и квадрант анализ с стробирования отдельных сигналов, флуоресцентные, могут позволить себе мощный обнаружения и сравнение нормальных и патологических autophagic потока в естественных условиях в модели различных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Шейла и Дэвид Фуэнте нейропатической боли исследовательской программы стипендий (для J.M.B.), Лоис Папа Римский жизни стипендиатов программы (C.L., ВМФ и J.M.B.), лектор Стипендия фонда Снайдер-Робинсон (чтобы C.L.), д-р Джон T . Фонд Макдональд (чтобы C.L.), контракты, субсидии, полученные от национальных институтов здравоохранения (НИЗ) HHSN268201300038C, R21GM119018 и R56NS095893 (R.G.Z.) и Тайшань ученый проекта (провинция Шаньдун, Китайская Народная Республика) (R.G.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
