Summary
蛋白質の集合とのショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるオートファジーのフラックスの蛍光イメージングによる細胞生物学的研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。神経変性疾患。
Abstract
神経変性疾患の有病率上昇、ますます神経機能障害や損失につながる基本的な病態を理解することが重要です。まだイメージング研究から定量データを抽出するための公平な再現性のある、そしてアクセスのアプローチの必要性はまだ蛍光ベースのイメージング ツールとテクノロジを使用細胞神経生物学プロセスの前例のない分析.神経変性疾患のショウジョウバエモデルを用いた蛍光イメージング研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。具体的には、フィジー/ImageJ を使用した 2 つの細胞プロセスの分析に従って簡単、半自動化されたアプローチについて述べる: 最初に、私たち定量化タンパク質集計コンテンツとプロファイルを使用して蛍光タグ変異ショウジョウバエ視葉でhuntingtin 蛋白質;第二に、我々 はオートファジーのタンデム蛍光レポーターのレシオ メトリックに基づく定量化とショウジョウバエ視覚系におけるオートファジー ・ リソソーム フラックスを査定し、なさい。重要なは、ここで説明したプロトコルは、すべての蛍光灯の構造分析選択バイアスを最小化し、微妙な比較の解像度を上げるように半自動抽出法の手順を説明します。このアプローチは、他の細胞生物学的構造の分析の延長が可能し、同様、膜結合区画タンパク質涙点 (ストレス顆粒とシナプス複合体) などの神経変性疾患に関与するプロセス (ミトコンドリアと膜輸送小胞)。まだ適応参照画像の解析と定量化のためのポイントし、フィールド間で信頼性と再現性を促進し、最終的に神経変性のメカニズムの理解を高めるため、標準化されたこのメソッドを提供します。
Introduction
神経変性疾患は毎年数百万人に影響を与えるし、高齢化人口1の発生率が増加しています。各神経変性疾患では、ユニークな病因を持っているが、誤って折りたたまれたタンパク質の凝集およびプロテオステイシス ネットワークの内訳は、これらの疾患の多くの共通の病理学的特徴です。これらの基礎的かつ相互に関連するプロセスの中断がゆがんで行く方法を解明神経の機能不全や細胞の死に貢献する治療上の介在を導くと同様、神経変性疾患を理解することにとって重要です。蛍光ベースのイメージング ニューロンにおけるこれらの複雑で動的なプロセスの調査と神経細胞生物学の私達の理解に大きく貢献しています。蛍光付けられた蛋白質の分析は挑戦的な特に実験生体内で、コンパクトな組織、多様な細胞の種類、形態の多様性などを行った。手動でアシスト定量化手頃な価格と簡単な多くの場合時間がかかり、人間バイアスの対象です。したがって、イメージング研究から定量データを抽出するための公平な再現性のある、そしてアクセスのアプローチの必要性があります。
蛍光イメージング研究の実験モデルから定量的なデータを抽出する強力で自由にアクセスできる画像処理ソフトウェア2,3, フィジー/ImageJ を使用してワークフローをシンプルかつ適応を概説しました。ショウジョウバエを用いた神経変性疾患。蛋白質の集合とオートファジーのフラックスを定量化するこのプロトコルに従うことによって-2 つのセルの神経変性病に関連性の高い生物学的特徴-感度と再現性このアプローチのデモンストレーションを行った。ショウジョウバエ視葉における蛍光タグ変異ハンチンチン (Htt) タンパク質の解析では、数、サイズ、およびタンパク質凝集体の強度を明らかにしました。4コンパートメント環境に応じて異なる発光信号を表示するショウジョウバエ視覚系オートファジー フラックスのタンデム蛍光レポーターを可視化。タンデム記者のレシオ メトリック解析オートファゴソーム形成、成熟およびトランスポート、リソソームで分解するオートファジー ・ リソソーム フラックスの定量的かつ包括的なビューの許可し、脆弱性をさらに強調神経変性条件で破壊のコンパートメント。重要なは、両方の分析我々 はし無意識のバイアスを最小限に抑えるため、サンプリング力を高める同様の研究との比較を容易にする標準プロトコル半自動閾値処理と領域分割の手順が実装されます。簡単なワークフローは強力なフィジー/ImageJ プラグイン (数学的アルゴリズムに基づくコンピューター科学者によって開発された) のためにかと生命科学コミュニティにアクセス可能。
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Protocol
1. 注意事項と画像解析実験を設計するための準備
- たとえば適切な解剖学的、携帯電話、または異なるサンプルの間で利益 (率 ROI) の地域を標準化するためのランドマークとして機能する細胞内のマーカーを事前に定義 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 膜マーカー、ローカライズされた蛍光タンパク質等
- 興味の構造のバック グラウンド レベルを超える離散点を区切ることができます蛍光マーカーを選択します。
注: このプロトコルは、タンパク質の構造 (例えば、誤って折りたたまれたタンパク質凝集体) と膜結合型細胞小器官 (例えば、オートファジー記者) に最適です。蛋白質の集合を可視化、138 の繰り返し (RFP hHttQ138) の病原性 polyQ 管とヒトの Htt 蛋白質 RFP タグ N 末端フラグメントは使用5です。変異体の Htt タンパク質は細胞質骨材elav GAL45,6など神経の特定のドライバーの下で表される場合を形成します。オートファゴソームとリソソームのフラックスを視覚化するには、アクチン GAL4は普遍的タンデム mCherry GFP Atg8a レポーターの発現をドライブに使用されました。mCherry と GFP 陽性を示す、オートファゴソームとフラックスが GFP 蛍光は蛋白質が低下7まで酸を区別しない mCherry に至ります、リソソームの酸性環境で急冷されことを監視します。レシオ メトリック解析構造の一貫したマーカーは、1 つのチャンネルを分割に使用されるまたは構造を記述する 2 つ以上のチャネルの投影を使用できます必要に応じて、明示的に述べたがこのプロトコルでできます。この例では、酸を区別しない、経路を介してフラックス中のコンパートメントに残ります Atg8 肯定的な粒子分離のための mCherry が使用されます。 - オープン ソースの画像解析プラットフォーム ImageJ またはフィジー ダウンロードしてインストール — 優先配布で ImageJ のバンドルのプラグイン2,3。
- H マキシマ インタラクティブな流域のプラグインをインストールします。
注: このプロトコルを使用してフィジー;追加プラグイン ImageJ の必要があります。SCF MPI CBG のブノワ ・ Lombardot によって開発されたプラグインは、利用可能なオンライン (https://imagej.net/Interactive_Watershed) です。 - 移動"を助ける |「サイト更新管理」を選択"を更新、「ImageJ アップデーター」から SCF MPI CBG 更新サイトをリストから選択フィジーを再起動します。
2. 脳の解剖と免疫蛍光染色
-
シリコーンのエラストマー並んで解剖料理を作る。
- ビーカーに、製造元と徹底的に混合になるまでよく攪拌によって示されるエラストマー部品をシリコンに注ぐ。
- 5 cm に合わせてピペットを使用してティッシュの培養皿の 3 分の 1 の半分に完全な (エラストマー混合物の約 10 mL)。表面に上昇し、ティッシュ ペーパーで軽く削除任意の気泡を許可します。料理をカバーし、室温 (RT) で 48-72 時間を治すための平らな面の上に置きます。
-
ショウジョウバエ脳と視覚システムが必要に応じてを解剖します。
- 前述8,9としてのショウジョウバエ脳解離を実行します。有害な組織や鉗子を避けるために脳を安定させるためにエラストマーの下部を使用して郭清のエラストマーが並ぶ料理の解剖を実行します。
- 解剖時に板をそのまま維持するには、網膜の下 2 つの鉗子をスライドさせ、優しく網膜を削除する目の真ん中を通って引き裂きます。板面に平行に開催鉗子で板に接続されている任意の網膜組織を引き離します。
注: 残留色素は以下の手順で洗い流して、通常抗体染色・ イメージングと干渉しません。 - リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 500 μ L の微量遠心チューブに 3.7% の最終的な集中を使用する前に新鮮なする 37% ホルムアルデヒドを希釈します。解決策と微量遠心チューブに切り裂かれた脳を転送し、穏やかな揺動を室温で 15 分間インキュベートします。
注: ホルムアルデヒド ギ酸を生産に酸化する自然な傾向があります。したがって、それは因数、37% ホルムアルデヒド ストレージのために提案されると各使用前にたて 3.7% 希薄です。過剰固定またはアンダー固定組織と蛍光10の整合性に影響されます。 - PBTx で 3 回洗って (0.4% と PBS トリトン X-100) 15 分。
-
免疫組織染色を行い、標本をマウントします。
- 抗体染色が必要な場合 PBTx を削除、PBTx で 5% ヤギ血清を希釈した一次抗体を加え、4 ° C で一晩因数ミキサーでインキュベート
- 一次抗体を削除し、PBTx で各 15 分の 3 回を洗います。PBTx で 5% ヤギ血清を希釈した二次抗体を追加し、RT で 1 時間インキュベートまたは 4 ° C で一晩PBTx で各 15 分の 3 回を洗ってください。
- DAPI 染色が必要な場合 PBTx を削除、DAPI 溶液を追加 (貯蔵液: 5 mg/mL を 15 μ G/ml PBTx での作業濃度に希釈)、各 15 分の PBTx で 3 回した洗浄で 10 分間インキュベートし、。
- 組織をオフに、両面テープの 1 つのレイヤーのスペーサーと顕微鏡スライドの中央に取り付け中のドロップを配置します。転送実装中のドロップに脳と脳が透明になるまで 1-2 分待ちます。ピペットでメディアをマウントを慎重に取り外します。
- マウントするには、スライド上脳に新鮮な取付中のドロップを適用します。慎重に泡を回避するカバーガラスをオーバーレイします。ゴム系のエッジをシールし、20 分進む最良の結果のためのイメージ取得の常温空気乾燥します。
3. 画像の取得
- 顕微鏡集録パラメーター、空間分解能、目的、スキャン速度、ズームなどを最適化し、ステップ サイズ、画像解析中に半自動抽出法を容易にする興味の構造の解像度を最大にします。
メモ: サンプル イメージをキャプチャし、すべての実験試料のイメージングの前に (のこのプロトコル手順 5) 半自動抽出法をテストすると便利場合があります。この方法ではユーザーは分析ツールが興味の生物学的構造を容易に見分けることができるように、画像設定を調整できます。 -
最高の信号対雑音比と試料の高ダイナミック レンジをキャプチャするイメージ検出器のコントロールを調整します。
- ピクセルの彩度 (露出高すぎる) か (図 3 b、赤はこんにちは/低 LUT によってピクセルの彩度を示す) の設定を調整しながらの不飽和 (余りに低いオフセット) を示します LUT (ルックアップ テーブル) を使用します。
- ゲインとオフセットの設定は、実験操作可能性があります興味の構造の変更すべての実験群の適切なを確認します。
注: 定量的な比較を行うためすべてのグループに対して同じの設定を使用することが不可欠です。
- すべてのデータをキャプチャする組織をイメージ。
注: お勧め 1 つイメージング セッション中に利用可能なデータのすべてをキャプチャし、必要に応じて、手順 4 で ROI 選択中により正確な領域を定義します。 - 集録パラメーター空間キャリブレーションなどのメタデータを保持するためには、イメージング ソフトウェアでサポートされているファイルの種類として、イメージを保存します。実験の日、遺伝的背景、および蛍光レポーターの抗体を含むファイル名で画像を保存または [実験グループ名] _ [標本名] _ [実験日] _Ch1. などスキャンしたチャンネルに対応する染料 [Fluorophore ターゲット/Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye]など
4. フィジー/ImageJ イメージのインポートと投資収益率の選択
- フィジーでイメージを開きます。「バイオ形式読み込みオプション」ダイアログ ボックスを使用して、選択"とスタックの表示: Hyperstack"設定と"カラーモード: グレースケール」。
注: 空間キャリブレーションはフィジーで読むことができますよう、メタデータとして顕微鏡ファイルの種類を開くにはそれをお勧めします。 -
単一の z 平面または標本 (図 1、投資収益率の選択) の間で標準化された投資収益率として使用できるマーカー チャネルに基づく投影法から地域を特定します。
- 手順 1.1 で指定されたマーカーをキャプチャするために使用するチャネルを表示するのには"C"スクロール バーを使用します。
- "Z"のスクロール バーを使用すると、焦点面を移動します。1 つのスライスを選択するかをクリックして複数のスライスの射影を作成「画像 |スタック |運命の Z 計画"とセット」開始スライス"と「ストップ スライス」ROI を包含します。
注: "投影の種類を設定する」「Z プロジェクト」で「最大強度」にダイアログ ボックスよく最適ですセクション 5 で、セグメンテーションのための構造を強調するこれはすべてのアプリケーションのために適切かもしれないけれども。別のタイプの投影は、分析のため必要がある場合を保存し、このファイルは、セクション 6 および 7 の特徴抽出のように注意してください。 - チャンネルと画像分析のプロトコルでは、次の手順を簡素化する興味の焦点の plane(s) を含む新しいイメージを生成します。選択"画像 |重複する」、必要な「チャンネル」(c) と"スライス"(z) を設定し、(例えば、[実験グループ名] _ [標本名] _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) 実験選択内容を反映するファイル名前を変更します。
- 4.2 の手順で決定された選択基準に基づいて標準化された投資収益率を手動で選択するのにフィジー ツールバーの「選択ツール」の 1 つを使用します。
- 追加投資収益率 ROI マネージャーをクリックして"分析 |ツール |ROI マネージャー」および ROI マネージャー メニューの「追加」をクリックします。ROI マネージャーのメニューからクリックして投資収益率を保存」より |"を保存し、投資収益率を反映するようにファイルの名前 (例、[実験グループ名] _ [標本名] _ [実験日] _ [チャンネル] _ [z-plane(s)] _ [ROI 説明])。
注: これは後の分析をフィジーで再開することができます。 または他のチャネルまたはセクション 5.3 のように画像に適用できます。
5. 前処理と h マキシマ Watershedding とセグメンテーション
-
対象の構造をキャプチャするために使用するチャネルの前処理を実行します。
- イメージ ファイルは、複数のチャンネルで構成され場合をクリックして、チャンネルを分離」の画像 |カラー |チャンネルを分割"関心のチャネルを分離します。
- ノイズやクリックしてによる平滑化のためのガウスぼかしを抑えるメディアン フィルターなどのフィルターを適用する"プロセス |フィルター |フィルターの種類"(例えば、「メディアン フィルター」や「ブラー (ガウス)」)。
- 異なるフィルターをサンプリングし、各実験群からの画像のパラメーターをフィルター処理します。ステップ 6.2 セグメンテーションの性能を確認する各グループから代表的な例を続行します。フィルターおよび興味の構造の分割を容易にするための設定を選択します。
- フィルターの設定を記録します。実験グループにこれらのパラメーターを適用できます。
- 参考のため、適用されているフィルターを含む tiff ファイルとしてイメージのコピーを保存します。[実験グループ名] _ [標本名] _ [実験日] _ [チャンネル] _ など詳細な名前を使用して、[z-plane(s)] _ [フィルター パラメーター]。
-
前処理された画像生成し、5.1 の手順で保存をインタラクティブ h マキシマ流域ツールで対象の構造体の分割を実行します。
- フィジーで活躍のプリプロセス済みのイメージをクリックして h マキシマ インタラクティブ流域ツールを開始"SCF |ラベル |インタラクティブな H_Watershed"。
注: このプラグインは最初流域を計算し、ユーザーが極大と即座に更新された出力イメージを分割しきい値オプションの影響を探検します。 - コントロール パネルからシード ダイナミクス (h)、輝度しきい値 (T) とセグメンテーションを最適化する (%) の洪水ピークを調整します。
注: は、常に手動で対象の構造体の領域分割の性能を検査するためのセクション 4.2 からプリプロセスの前に raw 画像を参照します。 - 領域分割結果に問題がなければ、「エクスポート領域マスク」し「エクスポート」を選択します。これは、流域の結果 (図 1セグメンテーション) のバイナリ イメージが生成されます。
- 分割パラメーターを記録します。これらのパラメーターは、定量的な比較実験グループ全体に適用する必要があります。名 [実験グループ名] _ [標本名] _ [実験日] [チャンネル] _ _ などの詳細なセグメンテーション パラメーターと参照に必要な場合、バイナリ結果マスクを保存 [z-plane(s)] _ [フィルター パラメーター] _ [H_Watershed メーター]。
- フィジーで活躍のプリプロセス済みのイメージをクリックして h マキシマ インタラクティブ流域ツールを開始"SCF |ラベル |インタラクティブな H_Watershed"。
-
流域の結果から対象の構造を抽出します。
- ステップ 4.4 から ROI マネージャーで保存された ROI を開きます。5.2.4 アクティブのステップからバイナリ領域マスク、標準化された投資収益率に特徴抽出を制限するイメージに適用する ROI マネージャーから ROI を選択します。
- バイナリ流域マスク上でアクティブの ROI を選択"分析 |粒子"分析「マネージャーに追加」と特徴を抽出する] ダイアログ ボックスで選択します。
注: これはセグメンテーション ROI マネージャーに中に線引きの各構造体の粒子の識別子を追加します。サイズまたは分析に含まれる構造体を絞り込むために必要な場合は真円に基づく機能を除外するのにはこのメニューでは、オプションがあります。 - クリックして、パーティクルを保存」より |"ROI マネージャー メニューから保存します。識別子が選択解除されて、すべての粒子はすべて zip ファイルで保存するを確認します。[実験グループ名] _ [標本名] _ [実験日] _ [チャンネル] _ など詳細な名前を使用して、[z-plane(s)] _ [フィルター パラメーター] _ [H_Watershed パラメーター] _ [構造]。
6. 数量、エリア、と強度の定量化、解析
- 生成され、4.2 の手順で保存された raw 画像を開きます。対象の構造をキャプチャするために使用するチャネルをスクロールします。
注: ピクセル値のステップ 5.1 変更フィルターの適用として (前処理) 前に raw 画像からの強度の測定を取ることが重要です。 - ステップ 5.3 の特徴抽出から得られた粒子を開き、ROI マネージャーから「すべて表示」を選択します。
注: この操作は、各粒子の「ROI マネージャー」イメージにアウトラインをオーバーレイ、対象 (図 1、特徴抽出) の構造の端を一致する必要があります。 - クリックして必要な測定値を設定"分析 |測定」。
注: 領域、強さ、および粒子の密度「領域」と「統合された密度」を選択することによって測定できます。統合された密度を選択すると、フィジーは、2 つの値を生成する: 領域と平均グレー値と 'Raw 集積密度' ピクセル値の合計として測定の積として計算 '密度統合された'。粒子の蛍光タンパク質の密度は、面積で割ったピクセル値の合計として計算されます。ステップ 5.3 で生成される粒子の数は、投資収益率は、手順 4.4 で定義されている組織内の粒子の数量を示します。 - ROI マネージャーのメニューから「メジャー」を選択します。結果は、フィジーでは、イメージング ソフトウェアから派生したファイルから測定は限り校正単位で表されます。結果ウィンドウから結果をコピーして、コンパイルおよびさらに計算を表計算ソフトに貼り付けます。
7. レシオ メトリックの定量化とそのデータ解析
- 6.1 と 6.2 興味の最初の raw チャネルの粒子識別子を開くにはの手順に従います。
- クリックして必要な測定値を設定"分析 |測定」。
注:「平均グレー値」を選択することで粒子あたり平均強度を測定できます。 されます - ROI マネージャーからは、「測定」を選択します。結果ウィンドウからデータをコピーし、表計算ソフトに貼り付けます。
- この例 (図 4 a) では GFP の関心の 2 番目の raw チャネルに"C"スクロール バーを移動し、7.2 の手順を繰り返します。7.3。
注: 手順 5.3 粒子はチャネルと生成されたスライスになります。粒子が関心の正しいチャネルに適用されるように注意してください。 - 表計算ソフトに各粒子の 2 番目の強さに 1 つのチャネルからの強度の比を計算します。
-
散布を使用して視覚化して個々 の変更を基になる生物学的プロセスの反射を示す fluorophores からレシオ メトリック データを定量化します。
- グラフ作成ソフトウェアで散布を生成します。
注: 各データ ポイントは、興味関心の最初の蛍光の強度は「x の値」、2 番目の蛍光の強度は各粒子の測定「y の値」の構造を表します。 - ゲートの象限を定義する各 fluorophore のしきい値を設定します。
- グラフ作成ソフトウェアで散布を生成します。
-
線を使用して、興味の構造間で蛍光強度を視覚化します。
- 手順 5.3 で生成された投資収益率を選択し、ツールバーの直線ツールを使用して、投資収益率を通る直線を描画します。行投資収益率 ROI マネージャーを追加します。
- 行投資収益率がアクティブになっていると、対象各チャネルを選択"分析 |"プロファイルをプロットします。
メモ: ヒストグラム プロット、線に沿って強度の値の表印刷プロファイル関数が生成されます。各チャンネルとラインに沿って両方のチャネルを示すプロットを生成するための表計算ソフトに貼り付けるから測定結果をコピーします。
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Representative Results
数、地域、およびショウジョウバエ視葉の蛍光タグ変異 Htt 骨材の強度の定量化
ハンチントン病、タグ付きの RFP の突然変異のショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるミスフォールド蛋白質の集合を調査する非病理学 (UA RFP hHttQ15) または病理学的拡張 (と HttUAS-RFP-hHttQ138) 膜 GFP (UA mCD8::GFP)11名あったパン神経ドライバー elav GAL4下共発現。雌成虫羽化 (DAE) 後 2 日の脳解剖、固定、DAPI 染色プロトコルのセクション 2 によると。共焦点レーザ走査型顕微鏡は、油浸対物レンズ、1.30 開口数 (NA)、ピクセルあたり 8.0 μ 秒のスキャン速度と 1024 の空間解像度を 1024 ピクセル (ピクセルあたり 12 ビット) による X 40 視葉に焦点を当てて行われました。イメージング ソフトウェアによって決定される最適ステップ サイズは次の励起/蛍光波長の組み合わせで目的のスライスあたり 1.08 μ m: GFP のチャネル 1) 488/510、チャネル 2) 543/581、RFP の DAPI のチャネル 3) 405/461。すべてに適用されるイメージ検出器設定の比較に適した画像をキャプチャするグループ、非病原性 RFP Htt Q15 コントロール標本を維持するよりもむしろ高強度 RFP Htt 集計を蓄積、RFP Htt Q138 標本に基づいていた拡散反射光の RFP Htt (図 2) の低レベル。画像集録設定された RFP Htt Q15 標本のダイナミック レンジを最大化するために、RFP Htt Q138 集計が飽和状態だろうが。例としてショウジョウバエ視葉におけるタンパク質凝集の顕微鏡写真は、HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI として保存されました。
全体の視葉は顕微鏡観察時し、約 15 z スライスから成ってが、イメージングと判断された後単一の z 平面を分析した構造が個人を解決する最善のそれ以外の場合表示されるため投影で重複している、組織内の高密度。標準化された投資収益率を決定するには、視葉12の髄質と lobula プレートの間に位置する C2 と C3 の細胞体は、解剖学的ランドマークとして使用されました。フィジー、イメージ分析の要件を反映するようにこのように重複していたし、HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP Htt_Ch3.DAPI_z8、z8 が C2 と C3 の神経細胞体が多かった 8 スライスを反映をという名前の tiff ファイルとして保存されました(図 1 a、画像集録) を汚す DAPI が顕著。多角形選択ツールを用いて DAPI 染色と神経の GFP 信号 (図 1 a、投資収益率の選択、黄色は投資収益率を示します、赤指定の高倍率画像のガイドとして使用して視葉周り ROI を手動で選択ワークフローの次のパネルで透明度)。次に、σ 値 1 に設定して、ガウスぼかしフィルターはイメージを滑らかにし (図 1 a, 前処理)、セグメンテーションと下流のセグメンテーションおよび特徴抽出とこれなしのパフォーマンスを容易にする RFP Htt チャネルに適用されました。図 1 aは、プリプロセス手順を示したものです。次のパラメーターを持つ RFP Htt チャンネルの画像をインタラクティブ H 流域を行った: 種の動態, 30;輝度しきい値、500;80 (%) で洪水のピーク; と '分割を許可' と 'エクスポート領域マスク' 選択 (図 1 a、セグメンテーション)。結果のバイナリ領域マスクは、HttQ138_Opticlobe として保存されました。01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent とタンパク質凝集体13,14 を定義する 0.4 μ m2の最小サイズ排除分析粒子の粒子を生成するために使用.結果として得られる粒子 HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates として ROI マネージャーから救われ、を抽出する (前処理) の前に生の RFP Htt チャネルに適用されました。定量的画像データ (図 1 a, 特徴抽出)。
非病原性の Htt Q15 膨張拡散反射光式と蛋白の蓄積のショウジョウバエ視葉で標準化された焦点平面から半自動的にセグメント化された RFP Htt 集計数の定量化が明らかに病気の原因となる Htt Q138 拡張 (図 2 a-C) による骨材。'生統合密度」によって与えられた各粒子内のすべてのピクセル値の合計は、各集計の RFP Htt コンテンツの比較に使われました。Htt Q138 を表現する 5 つの異なる視葉の標準化された焦点平面からすべての集計のサイズと強度プロファイルは、堅牢性とこのワークフロー (図 2 D, E) の再現性を示しています。特に、画像集録 (図 3 a, B) の中に骨材が露出した、凝集体のサイズと数の定量化が (図 3、 D)、理想的な露出で撮影した骨材に匹敵するただし、露出オーバーの骨材の強度飽和ピクセル展示 (図 3 e, F) の最大強度の値としてサイズの関数となります。したがって、適切なスキャン露光パラメーターの設定は、タンパク質凝集体の定量的分子組成の完全な範囲を抽出する重要です。
タンデム蛍光 Atg8a レポーターを用いたショウジョウバエ視覚葉身におけるオートファジー フラックスのレシオ メトリックに基づく定量化
コントロールに、ショウジョウバエ視覚系におけるオートファジー ・ リソソーム フラックスを評価する mCherry GFP Atg8a 記者が表現された普遍的またはショウジョウバエ スペルミン合成酵素(Dsm) のホモ接合体変異体 (Dsme/電子) が飛ぶアクチン GAL4ドライバー。Dsme/e 15ライソゾームの機能不全による障害 autophagic フラックスに関連付けられている展示神経変性が飛ぶ。添付薄板 5 DAE で雌成虫の脳解剖、固定、DAPI 染色します。レーザー走査共焦点顕微鏡、100 X 油水浸対物レンズ、1 ピクセルあたり 8.0 μ s、12 ピクセル光学解像度、ビットのサンプリング速度で 1.2 μ m のステップ サイズ 1.35 開口数 (NA)、板をイメージしました。
この分析は、スパース Atg8 肯定的な構造 (図 1 b、画像集録) のサンプリングの力を高めるためのラミナを 7 z スライスの最大 z 投影で実行されました。標準化された投資収益率は、DAPI によって明らかに、よ特徴付けられた解剖学および組織の細胞組織に基づいて、細胞体層周辺多角形選択ツールで手動で描いた (図 1 b、投資収益率の選択、黄色を示します、投資収益率と赤は、ワークフローの次のパネルでわかりやすくするため、高倍率の画像を示す)16。タンデムの記者は、mCherry が分解されるまで残っているリソソームの酸味による GFP を急冷するようマーク オートファジー ・ リソソーム経路を介して進行する GFP と mCherry 鎖の安定性に依存します。したがって、長寿命 mCherry 蛍光体は、このプロトコルの分割に使われました。Σ の値 1 を持つガウスぼかしフィルター (図 1 b前処理)、mCherry チャンネルに適用し、インタラクティブ H 流域が次のパラメーターで実行された: 種の動態, 0;輝度しきい値、800;90 (%) で洪水のピーク; と '分割を許可' と 'エクスポート領域マスク' 選択 (図 1 b、セグメンテーション)。結果のバイナリ領域マスクは、analyze ツールは粒子と粒子の生成に使用されました。結果として得られる粒子はオートファジー ・ リソソーム コンパートメント (図 1 b、特徴抽出) から定量的なレシオ メトリック データを抽出する (前処理) 前に生 mCherry と生の GFP のチャンネルの両方に適用されました。
MCherry GFP Atg8 陽性構造物の目視検査は、オートファジー小胞17ニューロンの細胞体への逆行性輸送の以前の報告と矛盾の薄層の細胞体地域で濃縮を示されました。MCherry と記者の違いを明らかに高いくつか Atg8 陽性構造 (行に図 4 aと4 b を図の線に沿って強度分布の結果を参照してください)、間で GFP 強度を視覚化するプロット プロファイルが使用されました両方 fluorophores の強さを示しているオートファゴソーム (図 4B3)、高 mCherry、低 GFP リソソームと融合 GFP は、この酸性コンパートメント (図・ 4b1 型) で急冷され、最終的に低 mCherry の低下を反映してリソソーム (図 4B2)。各半自動的にセグメント化された mCherry Atg8-肯定的な粒子の平均蛍光強度から生成された散布作業領域解析 (による離散的なステップに分かれていた、オートファジー ・ リソソーム経路を介してフラックスを示しています図 4)。プロットは GFP のゲートのしきい値を使用して 4 つの象限に分けられた = 570、mCherry = 1,800。しきい値は、次のプリンシパルを使用してコントロール グループに基づいて設定しました: (1) タンデム蛍光レポーターのデザインと 2 つの蛍光物質の特性、だからその理論的に GFP がない蛍光を発する mCherry 信号 (表示域がないです。IV) と (2) Atg8 肯定的な粒子の分布はオートファジー ・ リソソーム経路関連区画野生型ニューロン基底オートファジーが高効率18,19の分布を反映しています。コントロール ハエの杉の周り Atg8 肯定的な粒子の 25% はされたオートファゴソームとビニング (象限私)、涙点の半分はオートファゴソームとリソソームの融合を超えて処理 (象限 II および III);オートファゴソームまたは機能不全リソソームDsme/電子杉が大幅に増加 (象限私) と autolysosomes の減少 (象限 II および III)、オートファゴソームの欠陥蓄積の示唆に富むオートファゴソームとリソソームの融合やリソソーム劣化 (図 4 C, D)。定量的なデータは、 Dsme/電子ハエ (図 4E) から葉身 Atg8 陽性構造物の明白な蓄積でもサポートされます。平均 mCherry と gfp のレシオ メトリック解析コントロールとDsme/電子グループ (図 4 階) の違いを強調表示されますが、可能性ない経路も特定の手順によって明らかに全体的な影響の詳細、象限分析。
フィジーを例に用いたショウジョウバエ脳における細胞内構造のバイアスを最小化、半自動セグメンテーションを用いた図 1: ワークフロー 。(A) 代表的な共焦点顕微鏡を通して表現するショウジョウバエ脳の視葉単一焦点面からパン神経 RFP タグ変異体 Htt と膜をターゲットとした GFP (elav GAL4 > UAS-mCD8:GFP、UAS-RFP-hHttQ138) (イメージ取得) を汚す DAPI で。DAPI と GFP を用いて視葉; 周り (黄色) の ROI を選択赤いボックスは、領域の拡大写真 (ROI 選択) をわかりやすくするためのワークフローを示します。前処理パネルにガウスぼかしフィルター、σ 1 を適用後、RFP HttQ138 チャネル (top) の raw 画像の高倍率が表示されます (下)。シード ダイナミクスの示されたパラメーター設定を使用して対話型 h マキシマ流域分割 h-マキシマ (h)、輝度しきい値 (T) で定めるグローバル流域停止基準によって決定されで定める地域停止基準ピーク洪水 (%) は、RFP HttQ138 生 (上) とガウスぼかし (下) のイメージ、および流域のプラグインからエクスポートし、わかりやすくするために反転領域マスクから流域の結果に対して実行されます。によって生成された粒子は、粒子 (マゼンタ) RFP HttQ138 raw 画像 (特徴抽出) にオーバーレイを分析します。前処理をしなくてもオーバー セグメントは、集計を示す矢印と矢印を示す別のフィルタ リング後に失敗する構造。(B) 制御及び変異体 (Dsme/電子)ショウジョウバエユビキタス GFP mCherry Atg8a (を表現する大人の板の水平方向のセクションを介して 7 焦点面の最大 z 投影から代表的な共焦点顕微鏡アクチン GAL4 > UAS GFP-mCherry Atg8)DAPI 染色 (画像集録) と。DAPI はラミナ; の細胞体層周辺 (黄色) の ROI を選択に使用されました。赤いボックスは、領域の拡大写真 (ROI 選択) をわかりやすくするためのワークフローを示します。Σ 1 前処理パネルは、ガウスぼかしフィルター、mCherry チャネルの高倍率コントロールと変異ラミナの両方に適用されます。指定されているパラメーターの設定でフィルター処理された mCherry 画像をインタラクティブ h マキシマ流域分割実行され流域バイナリ領域マスクをわかりやすくするために反転で表示されます。によって生成された粒子は、粒子 (マゼンタ) GFP 画像 (特徴抽出)、生 mCherry でオーバーレイを分析します。スケール バー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: サイズの定量化と変異の RFP Htt 骨材の強度は、堅牢で再現。(A・B)RFP hHttQ15 (A) または RFP hHttQ138 式 (B) パン神経ドライバー elav GAL4の下でショウジョウバエ脳解剖され、固定および共焦点レーザー顕微鏡による光葉をイメージしました。スケールバー = 50 μ m。 (C) 視葉を手動で選択した ROI から定量化および標準化された z スライスに焦点を当てた各グループの集計の平均数 (n = 5)。(D・E)サイズ (D) と全磁力 (E) から定量化 RFP hHttQ138 集計の 5 の異なる動物の視葉で Roi を標準化しました。集計データは対数スケールにプロットされます。集計は、0.4 μ m2 ( Dの破線) を超えるオブジェクトとして定義されました。統計分析、一方通行 ANOVA、NS: 重要ではない;a.u.: 任意の単位この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 画像の露出オーバーは不正確な強度の測定につながる。(A・B)理想的な露出 (A) と同じ optic lobe とフィジーでヒロ LUT と露出オーバー (B) pseudocolored の代表的な共焦点顕微鏡の像。Bの赤は、露出オーバーの集計を示します。スケールバー = 50 μ m.(C) の定量化骨材寸法 h マキシマ流域パラメーターを実装した後同じような領域分割結果を生成します。統計分析、独立したサンプルのtテスト、NS: 重要ではないです。(D) 理想と露出オーバーの画像の合計サイズの頻度分布。5 から 25 μ m2のサイズで集計された 4 カテゴリ グループのビニングさらに。(E ・F)合計サイズ (E) の関数として骨材の強度の相関分析。すべてのピクセルは、4095 の最大強度の値を持っているとき、基準線は描画 (黒) です。緑のボックスは、 Fに示すように 10 μ m2の領域の下の集計を示します。b: 回帰係数, R2: 決定の係数a.u.: 任意の単位この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: タンデム mCherry GFP Atg8a 蛍光遺伝子レポーターの定量化は、ショウジョウバエにおけるオートファジーのフラックスの特徴を明らかにします。(A) mCherry GFP Atg8a を表現する普遍的制御とDsme/電子の変異ハエからショウジョウバエラミナの代表的な共焦点顕微鏡 (アクチン GAL4 > mCherry GFP Atg8a) DAPI 染色と.葉身細胞体層の破線のボックス化された領域は、(右) 高倍率を示しています。数字は、代表的な Atg8a 陽性構造物Bにプロットし、 Cで定量化を示します。(B) ヒストグラムを平均 mCherry 強度の関数としての平均震度の GFP でプロット A. (C) mCherry GFP Atg8 構造で高倍率画像で示される線・ ロワに沿って任意の単位 (AU) での蛍光強度のプロットします。コントロールとDsme/電子板 (各グループから 3 ラミナから測定粒子) から測定されます。プロットは GFP のゲートのしきい値を使用して 4 つの象限に分けられた = 570 と mCherry 遺伝子型によって示される各象限儀の構造の割合と 1800 年を =。(D) C の各象限に分類 mCherry GFP Atg8 の平均割合の定量化 (n = 3 のラミナ)。(E) 板あたり mCherry GFP Atg8 涙点の数の定量化 (平均 ± 標準偏差、n = 3 のラミナ)。(F) 制御と変異ハエ ラミナに現れた mCherry GFP Atg8 構造のレシオ メトリック分析 (95% 信頼区間の意味 n = 3 ラミナ)。スチューデントのt-テストします。P < 0.05 * *P < 0.01。Sscale バー = 2 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明されているプロトコルは、しっかりと再現性をもって量的蛍光ベースのイメージングで可視化した細胞生物学的プロセスに使用できます。生物学的文脈と技術的な制限は、実験的なデザインを導くため慎重に検討する必要があります。蛍光マーカー、興味の細胞レベル下の構造の形態と強度によって背景の上区別する必要があります免疫組織化学的、染料ベース、または遺伝的に表現されるかどうか。ショウジョウバエの標的遺伝子の発現をドライブにUA/GAL4システムを用い。次に示す例は蛋白質の集合と中枢神経系におけるオートファジーを調査するのに UA エンハンサーの制御の下で蛍光付けられた蛋白質の転写をアクティブにするのにトランスジェニック系統 GAL4 ドライバーを使用しました。実験の UAS 遺伝子の同時発現が蛍光レポーター遺伝子と共に必要な場合に、対照群にも GAL4 投与量、たとえばの制御を取るに足らない遺伝子の過剰発現の co を含める必要があります。UA GFPまたはUA lacZ。標準化試料ショウジョウバエ中枢神経系および郭清, 固定, マウントを汚す抗体からの視覚システムの紹介として最適なイメージングと定量にとって重要です。
良いダイナミック レンジおよび信号対雑音比を最大化するプラクティスをイメージングは半自動解析に必要な正確に比較実験グループの最優先事項です。記者のないタンパク質強度の完全な範囲の抽出を行い (図 3) を定量化して飽和状態は、画像集録パラメーターを設定必要があります。定量的な比較は、アクイジション ・ パラメーターは同じで、好ましくは同じ日にイメージングを実行してください。
投資収益率の選択、画像処理、機能セグメンテーション、オープン ソースのプラットフォームを使用して特徴量抽出 ImageJ/フィジーはアプリケーションに依存します。初期パラメーターは、ユーザーが定義する必要があります、一方標本間で応用はバイアスを最小限に定量的なデータ出力を最大化しながら。慎重にドキュメント ワークフローに重要な各ステップ ファイル名の詳細には、処理を適用した後、tiff ファイルとしてイメージを保存することをお勧めです。これは、画像処理の各ステップでの実験グループと分析の間の一貫性を確保するための参照ポイントとして初めてとなるパラメーター プロトコルを操作するときに特に役立ちます。制御グループからマーカーまたは解剖学的ランドマークを使用して投資収益率選択基準を定義する必要がありますが、実験的操作にマーカーやランドマークの信頼できる表示を妨げるようなやり方で変更しないことを確保するため注意が必要、投資収益率を標準化します。隣接する構造の分離を改善することができます単一焦点面 z 投影の構造を分析するのに役立ちますすることができます。 分析の目的に最適に対処する単一のスライスまたは複数のスライスの z 投影を選択できます。組織のボリューム全体をローカライズします。セグメンテーションと画像解析のために使用される z 投影の種類慎重に、独立して決定してください。最大強度投影構造が、彼らは、フォーカスがあり、分割に適しては、通常面で優秀なのでシャープな画像が生成されます。画像解析は、オートファジー ・ リソソーム分析の例のように、最大投影で許容できるかもしれませんAtg8 陽性構造物はサンプリングに使用するステップ サイズよりも小さく、最も正確に表現され最大強度によって彼らがキャプチャされた唯一の焦点面から。ただし、ステップ サイズを超える構造物の解析、同じ xy 座標を持つすべてのピクセルを追加合計投影は、各構造体の強度情報をより正確に表すことがあります。このプロトコルは、単一のスライスまたは 2 D で複数のスライスの z 投影を分析するために設計されています、ワークフローが同じツールのいくつかを使用して z 系列の 3 D 構造を解析する容易に合わせることができます。3 D 解析は、構造を斜めに交差する z スライスと分析を傾斜不整形構造物の小さなサンプル サイズの望ましいでしょう。
分割での対象の構造体の検出を支援するためにエッジを維持しながらノイズを減らすことができますこれらのこのプロトコルの提案など、フィルターで前処理一方、あまりにも多くのぼかしは、設定詳細を削除し、正確なエッジ検出を防ぐため十分なスムージングなしバック グラウンド ノイズと蛍光マーカーの不均質は過剰分割になります。流域分割は極大で水源と地形面としてイメージを考慮-蛍光画像の高輝度画素-隣接するダム、またはセグメント境界が20を建てられたが浸水地域を満たすまで洪水します。H マキシマ流域は、ユニークなローカル最大21を持たない構造の過剰分割を避けるために意味のある極大を区別するユーザー定義のしきい値 (SCF MPI CBG プラグイン h マキシマ ダイナミクス) を使用します。インタラクティブ h マキシマ流域のプラグインがこのプロトコルで実装できます h マキシマ ダイナミクス (h)、輝度しきい値 (T) で定めるグローバル流域停止基準ピーク洪水 (%) で定める地域停止基準を調整しながら即座に質的セグメンテーションの性能を評価するための出力画像を流域の結果を表示します。分割の結果は、ほとんどの構造境界密接に同意するだろう過セグメンテーションと不完全な分離 (図 1 a, 特徴抽出の赤の矢印) の両方があります蛍光標識は不均質や組織が、します。密に住まれました。半自動セグメンテーションと分析手順の効率は、サンプリングの力を高めるし、セグメンテーションの落とし穴を軽減するために活用できます。
分割と特徴抽出の後、領域、寸法、真円度などの形態情報を抽出するは簡単です。さらに、画像が露出オーバーを避けるために適切に収集された場合、分子情報もから推論できるこの画像解析強度測定による。神経変性病の対策を抜粋し、これにより定量化、一度これらの対策は重要な問題の数に対処するため使用できます。具体的には、プロトコル分布、数、サイズ、およびタンパク質凝集体の密度を洗い出し、蛋白質の集合に影響を与える要因を識別する画像解析とタンパク質凝集体の定量化を使用する可能性を示しています。神経機能障害と個体の健康。レシオ メトリック ベースの定量化は、病気の進行中に細胞レベル下のコンポーネントまたはプロセスと集計操作を通知する使用できます。一方、生化学とフローサイトメトリーは、集計とその他の細胞レベル下の構造の相互作用の分析に適用されている、セル換散できる蛋白質の損失につながる、集計プロパティの変更および蛋白質蛋白質の相互作用22を混乱させます。mCherry GFP Atg8 蛍光顕微鏡、培養細胞23で特にを介してオートファジーを監視に用いられているが、公平かつ定量的な分析方法が欠けています。さらに、遺伝子にエンコードされたタンデム レポーターを用いた生体内で解析が困難で、高度に制御の遺伝的背景と組織の準備が必要です。このプロトコルでは、オートファジー ・ リソソーム コンパートメントを定量化する重要なプラクティスをイメージングするティッシュの準備から検証方法について説明します。遺伝のグッドプラクティス Atg 正粒子強度プロファイルおよび個々 の蛍光信号によりゲートの 4 象限解析を含めたイメージ分析アプローチ余裕が強力な検出および通常の病理組織学的比較オートファジー フラックス生体内で多様な疾患モデルに。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、シーラとデビッド フエンテ神経因性疼痛研究プログラム大学院研究員 (J.M.B.) に支えられて、ロイス教皇生活フェロー プログラム (セ、Y.Z.、および J.M.B.) (セ) にスナイダー ・ ロビンソン財団を経てフェローシップ博士ジョン T.(セ) にマクドナルド財団契約、(R.G.Z.)、健康 (NIH) の HHSN268201300038C、R21GM119018、および R56NS095893 の国立衛生研究所からの助成金と泰山学者プロジェクトによって (山東省、中国の人々 の共和国) (R.G.Z.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
