Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

Published: August 3, 2018 doi: 10.3791/58041
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Miller School of Medicine, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation (Yantai University), Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

Summary

פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.

Abstract

עם עליית השכיחות של מחלות ניווניות, חשוב יותר ויותר להבין פתופיזיולוגיה כבסיס שמוביל בתפקוד עצביים ואובדן. כלי דימות מבוססות קרינה פלואורסצנטית וטכנולוגיות לאפשר ניתוח חסר תקדים של תהליכים הנוירוביולוגי subcellular, אך עדיין יש צורך גישות לא משוחדת, הדירים נגיש עבור חילוץ מידע כמיתים הדמיה מחקרים . פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מחקרי הדמיה באמצעות מודלים דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים. באופן ספציפי, אנו מתארים גישה easy-to-בצע, חצי אוטומטיות באמצעות פיג ' י/ImageJ לנתח שני תהליכים תאיים: קודם כל, אנחנו לכמת חלבון צבירה ותוכן הפרופיל באונה אופטיים דרוזופילה באמצעות מוטציה מתויג פלורסנט huntingtin חלבונים; שנית, נוכל להעריך autophagy-ליזוזום השטף במערכת דרוזופילה חזותית עם מבוססי רציומטרי כימות של עיתונאי פלורסנט טנדם autophagy. חשוב לציין, פרוטוקול שמפורטות כאן כולל צעד פילוח חצי אוטומטי כדי להבטיח שמבנים פלורסנט כל מנותחות כדי למזער את הטיית בחירה וכדי להגדיל את הרזולוציה של השוואות עדין. גישה זו ניתן להרחיב לניתוח של מבנים ביולוגיים אחרים תאים, תהליכים מעורבים הקשורים ניוון מוחיים, כגון puncta proteinaceous (מתח בגרגרים, מתחמי סינפטית), כמו גם כמו קרום מאוגד תאים (המיטוכונדריה, קרום. שלפוחית סחר בבני אדם). שיטה זו מספקת סטנדרטית, אך הפניה וישימה הצבע עבור ניתוח תמונות ו כמת, יכול להקל על אמינות ועל הפארמצבטית לחצות את השדה ואת בסופו של דבר לשפר את ההבנה מכניסטית של הקשורים ניוון מוחיים.

Introduction

מחלות ניווניות משפיעות על מיליוני אנשים מדי שנה ועל השכיחות עולה עם אוכלוסייה הזדקנות1. בעוד כל מחלות ניווניות יש אטיולוגיה ייחודי, צבירה של חלבונים misfolded של התמוטטות של הרשת פרוטוסטאזיס חדישים נפוצות פתולוגיים רבים של מחלות אלו. שחקרתי כיצד הפרעה של תהליכים אלה לתקצב ויסודי משתבשת לתרום למוות בתפקוד של תאים עצביים חיוני להבנת מחלות ניווניות, כמו גם המנחה התערבויות טיפוליות. דימות מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מאפשר לחקירה של תהליכים אלה מורכבים ודינאמיים בנוירונים והוא תרם רבות להבנת הביולוגיה דופאמינרגיים. ניתוח של חלבונים מתויגות fluorescently הוא מאתגר, במיוחד כאשר הניסויים מתבצעים ויוו, עקב רקמות קומפקטית מאוד, סוגי תאים שונים, והטרוגניות מורפולוגי. כימות באופן ידני בסיוע במחיר נוח ולא פשוטה, אך היא לעתים קרובות ועתירת בכפוף נטאי אנושי. לכן, אין צורך גישות לא משוחדת, הדירים נגיש עבור חילוץ מידע כמיתים הדמיה מחקרים.

אנחנו המחולקות זרימת עבודה פשוטה וישימה באמצעות פיג ' י/ImageJ, תמונת עוצמה ונגיש באופן חופשי עיבוד תוכנה2,3, כדי לחלץ נתונים כמותיים מלימודי הדמיה פלורסצנטיות ניסיוניות של הקשורים ניוון מוחיים באמצעות דרוזופילה. לפי פרוטוקול זה לכמת צבירת חלבון, שטף autophagic — שני תאים תכונות ביולוגיות שאינן רלוונטיות גבוהה לפתולוגיה מחלות ניווניות — להדגים את הרגישות ואת הפארמצבטית של גישה זו. ניתוח של חלבונים huntingtin מוטציה fluorescently מתויג (Htt) באונה אופטיים דרוזופילה גילה את מספר, גודל, ואת האינטנסיביות של אגרגטים חלבון. אנו דמיינו, עיתונאי פלורסנט טנדם השטף autophagic בתוך מערכת הראייה דרוזופילה , אשר מציג אותות פליטה שונים בהתאם לסביבה compartmental4. ניתוח המבוסס על רציומטרי של הכתב טנדם המותר עבור תצוגה כמותיים ומקיף של השטף autophagy-ליזוזום autophagosome היווצרות, התבגרות, תחבורה כדי השפלה ליזוזום, בנוסף מודגשות. פגיע תאים בהתנאים ניווניות. חשוב, הן בניתוח לנו ליישם סף חצי אוטומטיות והשלבים פילוח פרוטוקול שלנו כדי לצמצם הטיה לא מודעת, להגדיל את כוח דגימה, מספקות תקן כדי להקל על השוואות בין מחקרים דומים. זרימת עבודה פשוטה נועד להפוך עוצמה תוספים פיג ' י/ImageJ (שפותחה על ידי מדעני מחשב מבוסס על אלגוריתמים מתמטיים) נגיש יותר neurobiologists ולקהילה מדעי החיים בכללותו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיקולים וההכנות עבור תכנון הניסוי ניתוח תמונה

  1. Predetermine נייד אנטומיים, מתאים, או סמנים subcellular לשמש ציוני דרך עבור סטנדרטיזציה של אזור בעל עניין (ROI) מדגמים שונים, לדוגמה 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), סמני ממברנה, פלורסנט לשפות אחרות חלבון, וכו '.
  2. בחר בסמן פלורסנט המפרידים puncta דיסקרטית מעבר רמות הרקע למבנה של ריבית.
    הערה: פרוטוקול זה ממוטב מבנים proteinaceous (למשל, אגרגטים חלבון misfolded), קרום מכורך organelles (למשל, כתב autophagy). כדי להמחיש צבירת חלבון, שבר מתויג RFP N-מסוף של חלבון Htt אנושי עם חבל polyQ פתוגניים חזרה 138 (RFP-hHttQ138) היה בשימוש5. מוטציה בחלבון Htt טפסים אגרגטים cytoplasmic כשאני לידי ביטוי תחת עצביים מנהלי התקנים ספציפיים כגון elav-GAL45,6. כדי להמחיש autophagosome-ליזוזום השטף, שימש אקטין-GAL4 לנהוג ubiquitously ביטוי של הכתב mCherry-GFP-Atg8a טנדם. puncta mCherry - וה-GFP-חיוביים מצביעים על autophagosomes, השטף מנוטר כמו GFP פלורסצנטיות הוא מתרצה בסביבה חומצית של ליזוזום, איפה mCherry חומצה-רגישות נשאר עד החלבון מפורק7. לניתוח רציומטרי, ערוץ אחד זה מהווה סמן עקבית של המבנה שניתן משמש פילוח או במידת הצורך שתחזית של שניים או יותר ערוצים יכול לשמש כדי ניסחו מבנים, אבל לא שתואר במפורש ב פרוטוקול זה. בדוגמה זו, mCherry משמש עבור פילוח של חלקיקים Atg8-חיובית, כפי שהוא חסר חומצה-רגישות יישארו בתא ברחבי שטף דרך בשביל.
  3. להוריד ולהתקין קוד פתוח התמונה ניתוח בפלטפורמת ImageJ או פיג'י — ההתפלגות המועדפת של ImageJ עם ארוזות תוספים2,3.
  4. התקן את התוסף עבור h-maxima אינטראקטיבי קו פרשת המים.
    הערה: פרוטוקול זה משתמשת פיג'י; תוספים נוספים עשויות להידרש ImageJ. התוסף שפותחה על ידי בנואה Lombardot עבור SCF-MPI-CBG הוא זמין באינטרנט (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
  5. נווט אל "עזרה | עדכן', בחר 'ניהול עדכון אתרים' מ "המעדכן ImageJ," בחר SCF-MPI-CBG עדכון האתר מהרשימה, ואז לסגור ולהפעיל מחדש פיג'י.

2. המוח לנתיחה, Immunofluorescence מכתים

  1. להפוך סיליקון לנתיחה מצופה elastomer מנות.
    1. שופכים סיליקון elastomer רכיבים לתוך גביע כמצוין על-ידי היצרן ומערבבים היטב עד ביסודיות מעורב.
    2. השתמש פיפטה למילוי 5 ס מ תרביות רקמה מנות שליש עד חצי מלאה (בערך 10 מ"ל של אלסטומר תערובת). לאפשר בועות לעלות אל פני השטח ולהסיר בעדינות עם נייר טישיו. לכסות את הכלים ומניחים על משטח רמת לרפא עבור 48-72 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
  2. לנתח דרוזופילה במוח, ואת מערכת הראייה במידת הצורך.
    1. לבצע ניתוח מוחי דרוזופילה כפי שתואר לעיל8,9. לבצע את הקרע במאכלים לנתיחה מצופה elastomer, שימוש של התחתון elastomer לייצב את המוח כדי למנוע נזק לרקמות או מלקחיים.
    2. כדי לשמור על הנדן שלם במהלך ניתוח, שקופיות מלקחיים שני מתחת הרשתית, לקרוע בעדינות דרך האמצע של העין כדי להסיר את הרשתית. למשוך משם כל רקמת רשתית המצורפת הנדן עם מלקחיים שנערך במקביל למשטח פרופריה.
      הערה: פיגמנט שיורית ייעלמו בכביסה בשלבים הבאים, בדרך כלל אינם מפריעים עם נוגדן מכתים והדמיה.
    3. לדלל 37% פורמלדהיד בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) כדי להפוך ריכוז סופי של 3.7% טרי לפני השימוש בצינור microcentrifuge 500 µL. להעביר את המוח גזור microcentrifuge צינור עם פתרון, תקופת דגירה של 15 דקות ב RT עם נדנדה עדין.
      הערה: פורמלדהיד יש נטייה טבעית להיות מחומצן, בהפקת חומצה פורמית. לכן, הוא הציע aliquot 37% פורמלדהיד לאחסון לדלל 3.7% טרי לפני כל שימוש. קיבוע יתר או תת קיבוע ישפיעו על היושרה של רקמות, קרינה פלואורסצנטית10.
    4. תשטוף 3 פעמים עם PBTx (PBS עם 0.4% טריטון X-100) למשך 15 דקות כל אחד.
  3. לבצע אימונוהיסטוכימיה והר דגימות.
    1. אם הנוגדן מכתים נחוצה, להסיר PBTx להוסיף נוגדן ראשוני מדולל ב PBTx עם סרום עז רגילה 5%, דגירה על מיקסר aliquot בין לילה ב 4 º C.
    2. הסר נוגדן ראשוני, לשטוף 3 פעמים עם PBTx למשך 15 דקות כל אחד. הוספת נוגדנים משניים מדולל ב PBTx עם סרום עז רגילה 5% ו תקופת דגירה של 1 h RT או לילה ב 4 º C. לשטוף 3 פעמים עם PBTx למשך 15 דקות כל אחד.
    3. אם נדרשת דאפי מכתים, להסיר PBTx, להוסיף פתרון דאפי (במניה פתרון: 5 מ"ג/מ"ל, לדלל את ריכוז העבודה של µg/mL 15 ב- PBTx), דגירה 10 דקות בשטיפת RT. 3 פעמים עם PBTx למשך 15 דקות כל אחד.
    4. כדי לנקות את הרקמה, במקום טיפה של הרכבה בינונית במרכז שקופית מיקרוסקופ עם כרווח של שכבה אחת של הסרט השקוף משני הצדדים. להעביר את המוח על גבי הירידה של הרכבה בינונית ולאחר לחכות 1-2 דקות עד המוח הופך שקוף. הסר בזהירות את המדיום הרכבה עם פיפטה.
    5. כדי לטעון, החל טיפה של הרכבה טרי בינוני אל המוח בשקופית. בזהירות כיסוי זכוכית מכסה הימנעות בועות. לאטום את הקצוות עם דבק גומי, מילה נהדרת-RT במשך 20 דקות להמשיך כדי ייבוא תמונות לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

3. ייבוא תמונות

  1. למטב את המיקרוסקופ רכישה פרמטרים, כולל רזולוציה מרחבית, אובייקטיבי, זום, סריקה מהירות, וצעד גודל, כדי להגדיל את הרזולוציה של המבנים עניין כדי להקל על פילוח אוטומטית למחצה במהלך ניתוח תמונות.
    הערה: זה עשוי להיות שימושי כדי ללכוד תמונה לדוגמה ובדוק פילוח חצי אוטומטיות (בשלב 5 של הפרוטוקול) לפני הדמיה כל דוגמאות ניסיוני. בדרך זו המשתמש יכול לשנות הגדרות הדמיה כך כלים אנליטיים ניתן בקלות להבחין המבנה הביולוגי של ריבית.
  2. כוונן פקדי תמונה גלאי כדי ללכוד את יחס אות לרעש הגבוה ביותר ואת טווח דינמי הגבוהה של הדגימה.
    1. השתמש LUT (להסתכל למעלה בטבלה) המציין פיקסל רוויה (חשיפה גבוהה מדי) או undersaturation (אופסט נמוך מדי) תוך התאמת הגדרות (איור 3B, אדום מציין פיקסל הרוויה על ידי LUT Hi/נמוך).
    2. ודא היסט ורווח הגדרות מתאימות עבור כל קבוצות הניסוי, כפי סביר ניסיוני מניפולציות לשנות את המבנה של ריבית.
      הערה: זה הכרחי כי באותן ההגדרות משמשים עבור כל קבוצות לערוך השוואות כמותית.
  3. תמונה דרך רקמות כדי ללכוד את כל הנתונים.
    הערה: מומלץ כדי ללכוד את כל הנתונים הזמינים במהלך מושב הדמיה אחד וכדי להגדיר אזור מדויקת יותר במהלך רועי הבחירה בשלב 4 במידת הצורך.
  4. שמור את התמונה סוג הקובץ נתמך על ידי תוכנת הדמיה כדי לשמר מטה-נתונים כגון רכישת פרמטרים וכיול מרחבית. לשמור את התמונה עם שם קובץ כולל נוגדנים תאריך, הרקע הגנטי או כתבים פלורסנט, ניסיוני, או צבעים המתאים ערוצי סריקה כגון _Ch1 _ [ניסוי תאריך] _ [הדגימה שם] [שם קבוצה ניסיונית]. [Fluorophore-יעד /Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye], וכו

4. ייבוא תמונה פיג ' י/ImageJ ומבחר רועי

  1. פתח תמונה בפיג'י. השתמש בתיבת הדו-שיח 'אפשרויות ייבוא ביו-תבניות', בחר "נוף מחסנית עם: Hyperstack" ולהגדיר "מצב צבע: גווני אפור".
    הערה: מומלץ לפתוח את סוג הקובץ של מיקרוסקופ, כמטא-נתונים כגון כיול מרחבית יכול לקרוא פיג'י.
  2. זיהוי אזור z-מטוס בודד או הקרנה בהתבסס על פרופיל סמן זה יכול לשמש של רועי מתוקננת על פני דגימות (איור 1, רועי בחירה).
    1. השתמש בפס הגלילה "C" כדי להציג את פרופיל להשתמש כדי ללכוד את marker(s) המיועד בשלב 1.1.
    2. השתמש בפס הגלילה "Z" כדי לעבור בין המטוסים מוקד. בחרו פרוסה אחת או ליצור תחזית של פרוסות מרובות על-ידי לחיצה על "תמונה | ערימות | פרויקט Z", קבע"התחל slice","עצור slice"כדי להקיף את רועי.
      הערה: הגדרת סוג "הקרנה" כדי "מקס בעוצמה" בפרוייקט"Z" בתיבת הדו-שיח לעיתים קרובות המתאימה ביותר כדי להדגיש מבנים עבור פילוח של סעיף 5, אבל זה עשוי לא להיות מתאים עבור כל היישומים. אם סוג נוסף של השלכה נדרשת לצורך ניתוח, לטפל כדי לשמור ולתעד את קובץ זה ככזה לחילוץ כוללים סעיף 6 או 7.
    3. ליצור תמונה חדשה המכילה את פרופיל ואת plane(s) מוקד עניין כדי לפשט את הפעולות הבאות בפרוטוקול ניתוח התמונה. בחר "תמונה | כפולים", הגדר את הרצוי"ערוצים"(ג) ואת"פרוסות"(z) ושנה את שם הקובץ כדי לשקף את הבחירה (למשל, _ _ [שם הדגימה] [קבוצה ניסיוני שם] [הניסוי date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
  3. השתמש באחת "כלי הבחירה" בסרגל הכלים פיג'י לבחירה ידנית של רועי מתוקננת בהתבסס על הקריטריונים לבחירת שנקבע בשלב 4.2.
  4. להוסיף את רועי מנהל רועי על ידי לחיצה על "נתח | כלים | רועי מנהל "ולחצו על 'הוסף' בתפריט מנהל רועי. להציל את רועי ' מתפריט ' רועי מנהל על ידי לחיצה על "יותר | שמור"ולאחר מכן שם לקובץ כדי לשקף את רועי (לדוגמה, [קבוצה ניסיוני שם] _ [שם הדגימה] _ [ניסוי תאריך] _ _ [פרופיל] [z-plane(s)] _ [רועי תיאור]).
    הערה: זה יכול להיות מחדש בפיג'י בהמשך מנתח או שניתן להחיל על ערוצים או תמונות כמו סעיף 5.3 אחרים.

5. preprocessing ואת פילוח עם h-maxima Watershedding

  1. לבצע preprocessing בערוץ להשתמש כדי ללכוד את המבנים של ריבית.
    1. אם קובץ התמונה מורכבת ערוצים מרובים, הפרד את הערוצים על ידי לחיצה על "תמונה | צבע | לפצל ערוצים"כדי לבודד את הערוץ של עניין.
    2. החל מסנן כגון מסנן החציוני כדי להקטין רעש או טשטוש לפי עקומת גאוס להחלקת על ידי לחיצה על "תהליך | מסננים | לסנן סוג"(למשל, 'סינון' חציון' או"טשטוש לפי עקומת גאוס").
      1. לטעום מסננים שונים ולסנן פרמטרים על תמונות מכל קבוצה ניסיונית. המשך דרך שלב 6.2 עם דוגמה נציג מכל קבוצה כדי לבדוק את הביצועים פילוח. בחר את המסנן ואת הגדרות המאפשרים חלוקת המבנים של ריבית.
    3. להקליט את המסנן ואת ההגדרות. להחיל פרמטרים אלה קבוצות הניסוי.
    4. שמור עותק של התמונה כקובץ tiff כולל את המסננים שהוחלו לעיון. השתמש בשם נתונים היסטוריים כגון [קבוצה ניסיוני שם] _ [שם הדגימה] _ [ניסוי תאריך] _ _ [ערוץ] [z-plane(s)] _ [מסנן עם פרמטרים].
  2. לבצע פילוח של מבנים מעניינים עם הכלי קו פרשת המים h אינטראקטיבי-maxima על התמונה עיבוד מקדים נוצר ונשמר בשלב 5.1.
    1. עם התמונה עיבוד מקדים פעיל בפיג'י, ליזום כלי אינטראקטיבי קו פרשת המים של h-maxima על ידי לחיצה על "SCF | תיוג | H_Watershed אינטראקטיב".
      הערה: תוסף זה מחשב תחילה פרשת המים ולאחר מכן מאפשרת למשתמש לחקור את ההשפעות של maxima המקומי והאפשרויות הסף פילוח באמצעות דימוי הפלט מעודכן באופן מיידי.
    2. מהחלונית ' בקרה ', להתאים את הזרע דינמיקה (ח) עוצמת סף (T), שיא הצפה (%) כדי למטב את פילוח.
      הערה: תמיד להפנות לתמונה raw לפני preprocessing מ סעיף 4.2 לבחון באופן ידני הביצועים של פילוח של המבנים של עניין.
    3. כשאתה מרוצה פילוח התוצאות, בחר "ייצוא אזורים מסכת" ובחר "לייצא". פעולה זו תיצור תמונה בינארית של התוצאות קו פרשת המים (איור 1, סגמנטציה).
    4. להקליט את הפרמטרים פילוח; פרמטרים אלה צריך להיות מוחל על פני קבוצות ניסיוני להשוואות כמותיות. להציל את המסכה תוצאות בינארי במידת הצורך לעיון עם פרמטרים פילוח מפורט שם כגון [קבוצה ניסיוני שם] _ [הדגימה שם] _ [ניסוי תאריך] _ _ [ערוצי] [z-plane(s)] _ _ [מסנן עם פרמטרים] [פרמטרים H_Watershed].
  3. לחלץ את המבנים עניין מתוצאות קו פרשת המים.
    1. תפתח את רועי שנשמרו שלב 4.4, במנהל ROI. עם המסכה אזורים בינארי מהשלב 5.2.4 הפעיל, בחר רועי מהמנהל רועי כדי להחיל על התמונה כדי להגביל הדמיה כדי רועי סטנדרטית.
    2. עם רועי פעיל על המסכה פרשת בינארי, לבחור "נתח | ניתוח חלקיקים"עם"להוסיף את מנהל"שבחרת בתיבת הדו-שיח כדי לחלץ תכונות.
      הערה: פעולה זו תוסיף מזהה חלקיקים עבור כל מבנה מאפשרת במהלך פילוח למנהל ROI. אפשרויות זמינות בתפריט זה כדי לא לכלול תכונות בהתבסס על גודל או מעגליות במידת הצורך כדי ללטש מבנים כלולים בניתוח.
    3. להציל את החלקיקים על ידי לחיצה על "יותר | שמור"בתפריט מנהל רועי. ודא מזהי הן מסומנות כל החלקיקים כל יישמרו בקובץ ה-zip. השתמש בשם נתונים היסטוריים כגון [קבוצה ניסיוני שם] _ [הדגימה שם] _ [ניסוי תאריך] _ _ [ערוצי] [z-plane(s)] _ [מסנן עם פרמטרים] _ _ [H_Watershed פרמטרים] [מבני].

6. כמות, אזור, ואת עוצמת כימות וניתוח

  1. פתחו את התמונה גלם שהופקו ונשמרו בשלב 4.2. גלול כדי ערוץ המשמש עבור לכידת המבנים של ריבית.
    הערה: חיוני לקחת מידות העוצמה מתוך התמונה raw (לפני preprocessing) כמו החלת מסננים שלב 5.1 השינויים ערכי הפיקסלים.
  2. פתח את החלקיקים המתקבל הדמיה בשלב 5.3, בחר 'הצג הכל' ממנהל ROI.
    הערה: פעולה זו כיסוי מיתאר של כל החלקיקים על "רועי מנהל" על גבי התמונה, צריך להתאים את הקצוות של המבנים של הריבית (איור 1, הדמיה).
  3. להגדיר את המידות הרצויות על-ידי לחיצה על "נתח | קביעת המידות".
    הערה: אזור, אינטנסיביות וצפיפות של חלקיקים נמדד על ידי בחירת "אזור" ו "צפיפות משולב". כשבוחרים צפיפות משולב, פיג'י יהיה לייצר שני ערכים: 'משולב צפיפות' מחושבת המוצר אזור אפור הערך הממוצע ואת 'גלם משולב צפיפות' נמדד כסכום של ערכי פיקסלים. צפיפות של החלבון הניאון של החלקיקים מחושב כסכום של ערכי פיקסלים מחולק לאזור. מספר החלקיקים שנוצרו בשלב 5.3 מציין את כמות חלקיקים בתוך רקמת שרועי שהוגדרו בשלב 4.4.
  4. מתפריט רועי מנהל בחר "מדידה". התוצאות מבוטא ביחידות מכוילות כל עוד המידות לקוחים מתוך קבצי נגזר בפיג'י תוכנת הדמיה. להעתיק את התוצאות בחלון תוצאות ולהדביק לתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני עבור ההידור וחישובים נוספים.

7. רציומטרי כמת וניתוח נתונים

  1. בצע שלבים 6.1 ו- 6.2 לפתיחת מזהים חלקיקים בערוץ גולמי הראשון מעניין.
  2. להגדיר את המידות הרצויות על-ידי לחיצה על "נתח | קביעת המידות".
    הערה: ניתן למדוד את העוצמה הממוצעת לכל חלקיק על-ידי בחירת "מתכוון ערך אפור".
  3. ממנהל רועי בחר "מדידה". העתק נתונים מחלון תוצאות והדבק לתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני.
  4. לעבור הגלילה "C" בערוץ השני raw של עניין, GFP בדוגמה זו (איור 4A), וחזור על הצעדים 7.2. 7.3.
    הערה: החלקיקים הציל בשלב 5.3 יוגדרו כברירת מחדל הערוץ ופרוסות שממנו הוא הופק. לטפל כדי לוודא חלקיקים יוחלו לערוץ הנכון של עניין.
  5. לחשב את היחס שבין עוצמת מערוץ אחד ללחץ של השני במשך כל חלקיק בתוכנת הגיליון האלקטרוני.
  6. השתמש מגרש פיזור כדי להמחיש ולכמת נתונים רציומטרי fluorophores כי התערוכה רעיוני של תהליכים ביולוגיים כבסיס בודדים שינויים.
    1. צור מגרש פיזור graphing לתוכנה.
      הערה: כל נקודת נתונים מייצגת מבנה עניין כאשר עוצמת fluorophore הראשון של עניין הוא הערך"x" ועוצמת fluorophore השני הוא "ערך y" נמדד מאמצע כל חלקיק.
    2. הגדר gating סף עבור כל fluorophore להגדיר את הגזרות.
  7. השתמש פרופיל כדי להמחיש את עוצמת fluorophore על פני מבנה של ריבית.
    1. בחר רועי שנוצר בשלב 5.3 ולהשתמש בכלי קו ישר בסרגל הכלים כדי לצייר קו ישר דרך רועי. הוסף את השורה רועי למנהל ROI.
    2. בכל אחד מהערוצים של עניין, עם קו פעיל, רועי בחר "נתח | מגרש פרופיל".
      הערה: הפונקציה פרופיל מגרש יפיק מגרש היסטוגרמה וטבלה של הערכים של עוצמת לאורך הקו. העתק תוצאות נמדד מאמצע כל ערוץ ולהדביק לתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני כדי לייצר מגרש מציג שני ערוצי לאורך הקו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כימות של המספר, אזור, בעוצמה של מוטציה fluorescently מתויג Htt אגרגטים באונה אופטיים דרוזופילה

לחקור חלבונים misfolded צבירה במערכת העצבים המרכזית של מודל דרוזופילה של מחלת הנטינגטון, מוטציה מתויג RFP Htt אנושיים שאינם פתולוגיים (UAS-RFP-hHttQ15) או הרחבה פתולוגית ( UAS-RFP-hHttQ138), קרום GFP (UAS-mCD8::GFP)11 היו ביטוי משותף תחת הנהג פאן עצבית elav-GAL4. המוח של נקבות הזבוב 2 ימים לאחר וגיחתו (DAE) היו גזור, קבוע, מוכתם דאפי לפי סעיף 2 של הפרוטוקול. סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי בוצעה התמקדות האונה אופטיים עם 40 X שמן טבילה המטרה עדשה, 1.30 מפתח נומרי (NA), באמצעות מהירות סריקה של 8.0 µs לפיקסל והרזולוציה המרחבית של 1024 על 1024 פיקסלים (12 סיביות לפיקסל). גודל אופטימלי שלב נקבעים על-ידי הדמיה תוכנה היה מיקרומטר 1.08 לחתיכה בשביל המטרה עם השילוב הבא של עירור/פליטה אורכי גל: ערוץ 1) 488/510 עבור ה-GFP, ערוץ 2) 543/581 RFP, ערוץ 3) 405/461 של דאפי. התמונה גלאי הגדרות החלות על כל קבוצות כדי ללכוד תמונות מתאימים להשוואות, התבססו על הדגימה של RFP-Htt-Q138, אשר צוברת אגרגטים RFP-Htt בעוצמה גבוהה, ולא פתוגניים שאינם RFP-Htt-Q15 מיוחד שליטה, אשר שומרת רמות נמוכות של RFP-Htt ' מאטום לשקוף ' (איור 2). אם הגדרות תמונה רכישה נקבעו כדי להגדיל את הטווח הדינמי של הדגימה RFP-Htt-Q15, אז להיות רווי מצרפי RFP-Htt-Q138. לדוגמה, מיקרוסקופ של חלבון צבירת באונה אופטיים דרוזופילה נשמר כמו HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.

האונה אופטיים כולו היה עם תמונה במהלך מיקרוסקופ, כללה כ-15 z-פרוסות, אך לאחר דימות נקבע כי ניתוח z-מטוס בודד היה הטוב ביותר לפתרון יחיד מבני זה להופיע חופפים בתחזית בשל צפיפות גבוהה בתוך הרקמה. כדי לקבוע רועי מתוקננת, הגופות בתא C2, C3 ממוקם בין הלוח לשד, lobula אופטיים האונה12 שימשו נקודת ציון אנטומיים. בפיג'י, התמונה היתה כפולה ולכן כך שישקף את דרישות ניתוח ונשמר כקובץ tiff בשם HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, שבו z8 משקף את הפרוסה השמיני איפה C2 C3 עצביים תא גופים היו רוב בולט מאת דאפי מכתים (איור 1A, ייבוא תמונות). הכלי בחירה מצולע שימש כדי לבחור באופן ידני את רועי סביב האונה הראייה באמצעות צביעת דאפי ושידור עצביים GFP כמדריך (איור 1A, רועי בחירה, צהוב מציין רועי ואיפה באדום מייעד את התמונה בהגדלה המוצג עבור העמימות הלוחות הבאים של זרימת העבודה). בשלב הבא, Gaussian Blur להחיל מסנן על σ ערך מוגדר כ- 1 היה הערוץ RFP-Htt כדי להחליק את התמונה וכדי להקל על פילוח (איור 1A, Preprocessing), ואת הביצועים של פילוח במורד הזרם, הדמיה עם או בלי זה שלב preprocessing מודגם ב איור 1A. H אינטראקטיבי-קו פרשת המים בוצע על תמונות של הערוץ RFP-Htt עם הפרמטרים הבאים: זרע דינמיקה, 30; עוצמת סף, 500; שיא המוני (%), 80; עם 'לאפשר פיצול' ונבחר 'לייצא את המסכה אזורים' (איור 1A, סגמנטציה). המסכה אזורים בינארי וכתוצאה מכך היה לשמור HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent, ליצור חלקיקים עם הכלי חלקיקים נתח הדרה לגודל המזערי של מיקרומטר 0.42 להגדרת חלבון אגרגטים13,14 . החלקיקים וכתוצאה מכך נשמרו מהמנהל רועי כמו HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates, הוחלו על הערוץ RFP-Htt raw (לפני preprocessing) כדי לחלץ נתונים הדמיה כמותיים (איור 1A, הדמיה).

כימות של המספר של אגרגטים RFP-Htt באופן אוטומטי למחצה מקוטע ממטוסים מוקד מתוקננת דרך האונה הראייה של דרוזופילה חשף הביטוי ' מאטום לשקוף ' של הרחבת Htt-Q15 פתוגניים שאינם והצטברות של חלבון אגרגטים על ידי הרחבה Htt-Q138 גורמי מחלות (איור 2 א-ג). הסכום של כל ערכי הפיקסלים ב כל חלקיק שניתנו על ידי 'צפיפות משולב Raw' שימש לצורך השוואת התוכן RFP-Htt של כל צבירה. פרופילים גודל ועוצמה של אגרגטים כל ממטוס מוקד מתוקננת של חמש אונות אופטיים שונים המבטאים Htt-Q138 ממחישים את החוסן ואת הפארמצבטית של זרימת עבודה זו (איור דו-ממדי, E). ראוי לציין, כאשר אגרגטים היו חשיפת במהלך ייבוא תמונות (איור 3 א, ב'), כימות של הגודל ומספר אגרגטים הן דומות אגרגטים שנתפסו עם חשיפה אידיאלית (איור 3C, D), עם זאת עוצמת מצרפי overexposed הופך להיות פונקציה של גודל פיקסלים רווי כמוצג הערך העוצמה המקסימלית (איור 3E, F). לכן, הגדרת פרמטרים מתאימים החשיפה סריקה הוא קריטי כדי לחלץ את מלוא מגוון כמותיים ההרכב המולקולרי של אגרגטים חלבון.

מבוסס על רציומטרי כימות של השטף autophagy ב דרוזופילה הנדן חזותי באמצעות עיתונאי Atg8a טנדם פלורסנט

כדי להעריך autophagy-ליזוזום השטף ב מערכת הראייה דרוזופילה mCherry-GFP-Atg8a כתב בוטאה ubiquitously בשליטה או מוטציה דרוזופילה spermine סינתאז (dSms) homozygous (dSmse/e) זבובים עם נהג אקטין-GAL4 . dSmse/e זבובים הקשורים ניוון מוחיים התצוגה המשויכת לקויי שטף autophagic עקב חוסר תפקוד lysosomal15. מוחות עם פרופריה המצורפת של נקבות הזבוב-דיי 5 היו גזור, קבוע, מוכתם דאפי. הנדן צולמה על ידי סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית עם 100 X שמן המטרה טבילה עדשות, מפתח נומרי 1.35 (NA), מהירות דגימה של 8.0 µs לפיקסל ולאחר 12 סיביות לכל פיקסל רזולוציה אופטית, ואת גודל צעד מיקרומטר 1.2 לייזר.

ניתוח זה נערך ב- z max-תחזית של z-פרוסות שבע דרך הנדן כדי להגדיל את כוח דגימה של המבנים Atg8-חיוביות דליל (איור 1B, ייבוא תמונות). רועי מתוקננת צוייר ידנית בעזרת הכלי בחירה מצולע סביב השכבה גוף התא נחשף מאת דאפי, המבוסס על אנטומיה מאופיין היטב וארגון הסלולר של הרקמה (איור 1B, רועי בחירה, איפה צהוב מציין רועי ואדום מייעד את התמונה בהגדלה המוצג עבור בהירות של הלוחות הבאים של זרימת העבודה)16. הכתב טנדם מסתמך על יציבות מאפייני moieties GFP, mCherry כדי לסמן התקדמות דרך השביל ליזוזום autophagy, כך GFP הוא מתרצה על ידי החומציות ליזוזום איפה mCherry נשאר עד היא מושפלת. לכן, fluorophore mCherry longer-lived שימש פילוח של פרוטוקול זה. מסנן Gaussian Blur עם σ הערך 1 היה מוחל על התעלה mCherry (איור 1B, Preprocessing), ו- H אינטראקטיבי-קו פרשת המים בוצעה עם הפרמטרים הבאים: זרע דינמיקה, 0; עוצמת סף, 800; שיא המוני (%), 90; עם 'לאפשר פיצול', 'לייצא את המסכה אזורים' מסומנת (איור 1B, סגמנטציה). המסכה אזורים בינארי וכתוצאה מכך נעשה שימוש כדי ליצור חלקיקים עם הכלי חלקיקים נתח. החלקיקים וכתוצאה מכך הוחלו על raw mCherry והן ערוצי ה-GFP raw (לפני preprocessing) כדי לחלץ נתונים כמותיים רציומטרי של תאים autophagy-ליזוזום (איור 1B, הדמיה).

בדיקה ויזואלית של מבנים mCherry-GFP-Atg8-חיוביות ציין העשרה באזור גוף התא של הנדן, עקבי עם דוחות קודמים של העברת רטרוגרדית שלפוחית autophagic לגוף התא נוירונים17. מגרש פרופיל שימש לדמיין mCherry ועוצמה GFP על פני מספר מבנים Atg8-חיוביות (ראה קו ROIs איור 4A ו פרופילי בעוצמה הנוצרת לאורך הקו ב איור 4B), חשיפת הבדלי הכתב גבוהה האינטנסיביות של שני fluorophores מציין autophagosomes (איור 4B3), mCherry גבוהה ו- GFP נמוך מצביע על פיוז'ן עם ליזוזום כפי GFP הוא מתרצה במחלקה הזו חומצי (איור 4B1), סוף סוף mCherry נמוך משקף השפלה בתוך ליזוזום (איור 4B2). מגרש פיזור שנוצר בעצימות fluorophore הממוצע של כל החלקיקים mCherry-Atg8-חיובית באופן אוטומטי למחצה מקוטע מדגים שטף דרך בשביל autophagy-ליזוזום זה הופרד ואז שלבים נפרדים על-ידי ניתוח רביע ( איור 4C). העלילה היה מחולק לארבעה רביעים באמצעות סף חסימה של ה-GFP = 570, mCherry = 1,800. הסף נקבעו בהתבסס על קבוצת הביקורת באמצעות מנהלי הבאים: (1) העיצוב של הכתב פלורסנט טנדם והמאפיינים של fluorophores 2, כך תאורטית GFP צריך לא לזרוח שבו אין אות mCherry (רביע IV) ו- (2) התפלגות החלקיקים Atg8-חיוביות משקף את חלוקת autophagy-ליזוזום הקשורות מסלול תאי בנוירונים פראי-סוג איפה autophagy הבזליים יעילים ביותר18,19. ב- laminas של שליטה זבובים, בסביבות 25% של החלקיקים Atg8-חיוביות נזרקו כמו autophagosomes (רביע אני), ומעובדים מחצית puncta מעבר autophagosome-ליזוזום פיוז'ן (רביע II ו- III); laminas dSmse/e היה גדל באופן משמעותי autophagosomes או lysosomes לא מתפקדת (רביע אני) וירידה autolysosomes (רביע II ו- III), רמיזות של הצטברות autophagosome דרך הפגמים autophagosome-ליזוזום fusion ו/או השפלה lysosomal (איור 4 C, D). נתונים כמותיים נתמכים גם ברור הצטברות Atg8-חיוביות מבנים פרופריה מהזבובים dSmse/e (איור 4E). ניתוח רציומטרי של mCherry מתכוון ושידור GFP הדגיש את ההבדל בין קבוצת הבקרה ו- dSmse/e (איור 4F) אבל לא יכול פרט ההשפעה הכללית על השביל ולא את השלבים ספציפית על ידי ניתוח רביע.

Figure 1
איור 1: זרימת העבודה דרך פילוח ממוזער-הטיה, חצי אוטומטיות של מבנים subcellular במוח דרוזופילה בעזרת פיג'י בדוגמאות. (א) micrographs קונאפוקלית נציג של יחיד במישור המוקד דרך האונה הראייה במוח למבוגרים דרוזופילה להביע פאן מוטציה מתויג RFP עצביים Htt ו- GFP, ממוקדות ממברנה (elav-GAL4 > UAS-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) עם דאפי מכתים (ייבוא תמונות). דאפי GFP שימשו כדי לבחור רועי (צהוב) סביב האונה אופטיים; התיבה האדומה מציינת אזור מוגדל באמצעות זרימת עבודה עבור בהירות (רועי בחירה). לוח preprocessing מציג בהגדלה של תמונת raw של הערוץ RFP-HttQ138 (למעלה) ואחרי יישום של מסנן Gaussian Blur, σ1 (למטה). פילוח לפי h אינטראקטיבי-maxima פרשת מים באמצעות קביעות הפרמטר שצוין עבור זרע dynamics נקבע על ידי h-maxima (h), קו פרשת המים העולמי עצירה בקריטריונים הנקבעים ע י עוצמת סף (T), ואת התחנה האזורית הקריטריונים שקבע שיא (מציפים %) לבצע raw RFP-HttQ138 (למעלה), טשטוש לפי עקומת גאוס (למטה) תמונות ותוצאות קו פרשת המים מן המסכה אזורים ייצוא של קו פרשת המים תוסף ולא הפוך עבור בהירות. חלקיקים שנוצרו על-ידי ניתוח חלקיקים (מגנטה) על תמונות raw RFP-HttQ138 (הדמיה). חיצים מציינים אגרגטים כי הם יתר מקוטע ללא preprocessing ולציין ראשי חץ מבנים להיכשל נפרד לאחר סינון. (B) micrographs קונאפוקלית נציג מ z-תמונה מוקרנת מרבי של 7 מטוסים מוקד דרך החלק האופקי של הנדן של שליטה או מוטציה (dSmse/e) דרוזופילה למבוגרים לבטא בכל מקום (GFP-mCherry-Atg8a אקטין-GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8) עם דאפי מכתים (ייבוא תמונות). דאפי היה משמש כדי לבחור את רועי (צהוב) סביב השכבה לגוף התא של הנדן; התיבה האדומה מציינת אזור מוגדל באמצעות זרימת עבודה עבור בהירות (רועי בחירה). לוח preprocessing מציג בהגדלה של ערוץ mCherry במסנן ' טשטוש לפי עקומת גאוס ', σ1 חלה על שליטה והן פרופריה מוטציה. פילוח לפי h אינטראקטיבי-maxima פרשת מים מתבצע על התמונות mCherry המסוננת עם קביעות הפרמטר שצוין, קו פרשת המים התוצאות המוצגות כמסיכת אזורים בינארי הפוכה על בהירות. חלקיקים שנוצרו על-ידי ניתוח חלקיקים (מגנטה) על mCherry גלם ותמונות GFP (הדמיה). גודל ברים = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: כימות של הגודל והעוצמה של אגרגטים RFP-Htt מוטציה זו לשחזור ועמיד. (A-B) דרוזופילה מוחות עם RFP-hHttQ15 (א) או ביטוי RFP-hHttQ138 (B) מתחת הנהג פאן עצבית elav-GAL4 היו גזור, קבוע, האונות הראייה היו עם תמונה על-ידי סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (ג) המספר הממוצע של אגרגטים בכל קבוצה לכמת מ רועי באופן ידני שנבחר סביב האונה אופטיים והתמקדה z-פרוסה מתוקנן (n = 5). (D-E) גודל (D) ואת האינטנסיביות הכולל (E) של אגרגטים RFP-hHttQ138 לכמת מ סטנדרטית ROIs בתוך האונות אופטיים חיות שונות 5. לצבור נתונים מותווים בקנה מידה יומן. אגרגטים הוגדרו כאובייקטים גדול מ- 0.4 מיקרומטר2 (קו מקווקו ברה). ניתוח סטטיסטי, חד-כיווני אנובה, NS: לא משמעותי; א א: יחידה שרירותית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: חשיפת יתר התמונה מובילה למידות בעוצמה לא מדויק. (A-B) נציג micrograph קונאפוקלית של optic lobe אותו עם חשיפה אידיאלית (A), חשיפת יתר (B) pseudocolored עם חילו LUT בפיג'י. אדום ב B מציין אגרגטים overexposed. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (ג) כימות של גודל הצבירה לאחר יישום h-maxima קו פרשת המים פרמטרים כדי להפיק תוצאות דומות פילוח. ניתוח סטטיסטי, דגימות עצמאית t -test, NS: לא משמעותי. (ד) התפלגות השכיחויות של גודל צבירה באידיאלי ותמונות overexposed. אגרגטים בגודל 5 מיקרומטר 252 נזרקו עוד 4 קבוצות קטגורית. (E -F) ניתוח המתאם של עוצמת מצרפי כפונקציה של גודל צבירה (E). קו הפניה הוא נמשך (שחור) כאשר כל הפיקסלים יש ערך העוצמה המקסימלית של 4095. הקופסה הירוקה מציינת אגרגטים מתחת 10 אזור2 מיקרומטר, שמוצג F. ב': מקדם רגרסיה, R2: מקדם הדטרמינציה; א א: יחידה שרירותית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: כימות של עיתונאי טנדם גנטי mCherry-GFP-Atg8a פלורסנט מגלה תכונות שונות של שטף autophagic ב דרוזופילה. (א) micrographs קונאפוקלית נציג של הנדן דרוזופילה מהזבובים שליטה ו- dSmse/e מוטציה ubiquitously לבטא mCherry-GFP-Atg8a (אקטין-GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a), מוכתם דאפי . מקווקו התחומים של שכבת תאי הגוף פרופריה מוצגים בהגדלה (מימין). המספרים מציינים מבנים Atg8a-חיוביות נציג ההתוויה של B , לכמת ב- C. היסטוגרמה (B) העלילה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית ביחידות שרירותי (AU) לאורך הקו ROIs המצוין בהגדלה תמונות במבנים mCherry-GFP-Atg8 א (ג) להתוות באינטנסיביות GFP רשע כפונקציה של עוצמת mCherry רשע נמדד מאמצע פרופריה שליטה ו- dSmse/e (חלקיקי נמדד מאמצע שנבזזו 3 מכל קבוצה). העלילה היה מחולק לארבעה רביעים באמצעות סף חסימה של ה-GFP = 570 ו- mCherry = 1800 עם האחוז של מבנים כל רביע שצוין על-ידי גנוטיפ. (D) כימות של האחוזים אכזרי של mCherry-GFP-Atg8 מקוטלגים כל רביע ב- C (n = 3 פרופריה). (E) כימות של המספרים של mCherry-GFP-Atg8 puncta לכל פרופריה (זאת אומרת ± ש, n = 3 פרופריה). (F) רציומטרי ניתוח של מבנים mCherry-GFP-Atg8 הנהוגות פרופריה לעוף מוטנטים ובקרה (כלומר עם 95% CI, n = 3 פרופריה). סטודנט t-מבחן. P < 0.05, * *P < 0.01. ברים Sscale = 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול שמפורטות כאן יכול לשמש robustly, reproducibly quantitate תא תהליכים ביולוגיים דמיינו ידי דימות מבוסס על קרינה פלואורסצנטית. ההקשר הביולוגי ומגבלות טכניות צריך להישקל בזהירות כדי להנחות הנבחנים. פלורסנט סמנים של מבנים subcellular של עניין, אם immunohistochemical, מבוסס-צבען, או ביטוי מבחינה גנטית, צריך להיות ניתן להבחנה מעל רקע על ידי מורפולוגיה ועוצמה. מערכת UAS/GAL4 משמש לנסיעה ביטוי גנים יישוב דרוזופילה. הדוגמאות המובאות משמש הטרנסגניים שורות נושא GAL4 מנהלי התקנים כדי להפעיל שעתוק של חלבונים fluorescently מתויגות תחת השליטה של משפר UAS לחקור צבירת חלבון ו autophagy במערכת העצבים. אם הביטוי בו זמנית של transgene UAS ניסיוני נדרשת יחד עם transgene הכתב פלורסנט, אז קבוצת הביקורת גם לכלול co-ביטוי של transgene חסר חשיבות כדי לשלוט על המינון GAL4, למשל UAS-GFP או UAS lacZ. הכנת הדוגמא מתוקננת, כפי שתואר כאן דרוזופילה מערכת העצבים המרכזית, מערכת הראייה, דיסקציה, קיבוע, נוגדן מכתים, באמצעות הרכבה, הוא קריטי עבור הדמיה אופטימלית, כימות.

טוב הדמיה שיטות להגדיל את יחס אות לרעש, טווח דינמי נחוצים לצורך ניתוח אוטומטי למחצה, בעל חשיבות עליונה עבור מדויק השוואות בין קבוצות הניסוי. יש להגדיר פרמטרים רכישת התמונה כך הכתב הוא לא רווי כך בטווח המלא של חלבון בעוצמה ניתן לחלץ לכמת (איור 3). להשוואות כמותיות, הדמיה צריכה להתבצע עם רכישת באותם הפרמטרים ורצוי באותו יום.

רועי הבחירה, עיבוד תמונה, תכונה פילוח הדמיה באמצעות פלטפורמת מודיעינים פתח ImageJ/פיג'י הינם תלויי-יישום; ואילו פרמטרים הראשונית חייבת להיות מוגדרת על-ידי המשתמש, היישום שלהם על פני דגימות יצמצם הטיה תוך מיקסום פלט נתונים כמותיים. זה קריטי בקפידה זרימת עבודה של מסמכים מומלצים כדי לשמור תמונה כקובץ tiff לאחר כל שלב עם שם קובץ המפרט החלת עיבוד. אפשרות זו שימושית במיוחד בעת עבודה פרוטוקול פרמטרים עבור פעם הראשונה והן הרצון לשרת כנקודת התייחסות כדי להבטיח עקביות בין קבוצות הניסוי בכל שלב בעיבוד תמונה וניתוח. רועי קריטריוני הבחירה באמצעות סמנים או אנטומי ציוני דרך צריכה להיות מוגדרת מקבוצת הבקרה, אך להקפיד על מנת להבטיח כי מניפולציות ניסיוני לא תשנה את סמני או ציוני דרך בדרך מונעות אינדיקציה אמינה לתקנן ROI. פרוסה אחת או z-תחזית של פרוסות מרובות שניתן לבחור להתייחס בצורה הטובה ביותר את היעדים של הניתוח, שבו מטוס מוקד בודד יכול להיות שימושי לשפר את ההפרדה של השכנה מבנים, z-תחזית יכולה להיות שימושית בניתוח מבנים מקומי בכל נפח הרקמה. הסוג של z-הקרנה עבור פילוח ועבור ניתוח תמונות בקפידה ובאופן עצמאי ייקבע. תחזית העוצמה המקסימלית יפיק תמונה חדה, מאחר מבנים המבריקים המטוסים שבו הם ממוקדים, הם בדרך כלל גם מתאים פילוח. ניתוח תמונות עשוי להיות מקובל על הקרנה מרבי, כמו בדוגמה של ניתוח autophagy-ליזוזום; Atg8-חיוביות מבנים קטנים יותר מהגודל שלב המשמש עבור הדגימה, ובכך בדייקנות מפליאה מיוצגים על-ידי העוצמה המקסימלית מהמטוס מוקד הבלעדית, שממנו הם נתפסו. עם זאת, לצורך ניתוח של מבנים גדול מהגודל צעד, סכום-תחזית המוסיפה כל הפיקסלים באותן קואורדינטות xy עשוי באופן מדויק יותר לייצג את המידע בעוצמה של כל מבנה. בעוד פרוטוקול זה מיועד לניתוח פרוסה אחת או z-תחזית של פרוסות מרובות ב- 2D, זרימת העבודה יכולה להיות מותאם בקלות כדי לנתח 3D מבנים בסדרה z-באמצעות אותם כלים. ניתוח תלת-ממד יהיה רצוי עבור גודל מדגם קטן של מבנים חריגה, איפה z-פרוסה מלכסן מבט ישר החותך את המבנה להטות את הניתוח.

עם מסנן, כגון אלה הציע ב פרוטוקול זה, קידוד יכול להפחית את הרעש תוך שמירה על קצוות לסייע זיהוי של מבנים עניין במהלך פילוח; רקע רעש, פלורסנט סמן inhomogeneity ללא החלקה מספקת תגרום פילוח יתר, בעוד הגדרות לגרום טשטוש מדי להסיר את פירוט ולמנוע גילוי קצה מדויק. פילוח לפי פרשת מים מחשיב את התמונה כמו משטח טופוגרפיות עם מקור מים במלון maxima מקומי – בעוצמה גבוהה פיקסלים בתמונה פלורסנט — זה מציף עד שיפגוש השכנה באזורים המוצפים שבו בנוי סכר, או קטע גבול,20. פרשת המים h-maxima משתמש סף מוגדר-משתמש (h-maxima דינאמיקה של תוסף SCF-MPI-CBG) כדי להבחין בין משמעות maxima מקומיים כדי להימנע פילוח יתר של מבנים שאין מקומי ייחודי המרבי21. התוסף קו פרשת המים h אינטראקטיבי-maxima ליישם פרוטוקול זה מאפשר למשתמש לשנות את הדינמיקה h-maxima (ח), קו פרשת המים העולמי עצירה בקריטריונים הנקבעים ע י עוצמת סף (T) והקריטריונים התחנה האזורית שקבע שיא הצפה (%), בעוד מיד הצגת תוצאות קו פרשת המים בתמונת הפלט להעריך איכותית פילוח ביצועים. פילוח התוצאות יסכים בשיתוף פעולה הדוק עם גבולות מבנה רוב, על פי פילוח יתר והן הושלמו ההפרדה (איור 1A, חצים אדומים ב הדמיה) עלולה להתרחש תיוג פלורסנט איפה inhomogeneous או הרקמה הוא מאוכלס בצפיפות היעילות של השלבים פילוח וניתוח חצי אוטומטיות, ניתן למנף כדי להגדיל את כוח דגימה או להמתיק פילוח החסרונות

לאחר פילוח, הדמיה, זה פשוט לחלץ מידע מורפולוגי כגון אזור, מידות מעגליות. יתר על כן, אם תמונות נאספים כראוי כדי למנוע חשיפת יתר, מידע מולקולרית שניתן גם להסיק בניתוח התמונה על-ידי עוצמת מדידות. ברגע מדדים של פתולוגיה של מחלות ניווניות חילוץ, לכמת לפי גישה זו, אמצעים אלה ניתן לפנות מספר שאלות חשובות. באופן ספציפי, הפרוטוקול הוכיחה את הפוטנציאל משתמש וניתוח תמונות, כימות של אגרגטים חלבון כדי לזהות גורמים משפיעים על צבירת חלבון, לתאם הפצה, מספר, גודל וצפיפות חלבון של מצרפי עם תפקוד עצביים ובריאות organismal. כימות מבוססי רציומטרי יכול לשמש כדי להודיע צבירה אינטראקציה עם רכיבים subcellular או תהליכים במהלך התקדמות המחלה. בעוד הביוכימי cytometry זרימה הוחלו לנתח את האינטראקציה של אגרגטים, עם מבנים subcellular אחרים, פירוק התא יכול לגרום לאובדן חלבון, לשנות מאפייני צבירה וכן לשבש אינטראקציות חלבון-חלבון22. mCherry-GFP-Atg8 כבר בשימוש נרחב כדי לפקח autophagy דרך מיקרוסקופ פלורסצנטיות, במיוחד ב תאים בתרבית23, אך לא משוחד ושיטות אנליטיות כמותיים חסרים. יתר על כן, אין ויוו ניתוח באמצעות הכתבת טנדם מקודדים גנטית הוא מאתגר ומחייב מבוקרת מאוד גנטי הכנת רקע ורקמות. פרוטוקול זה מתווה מתודולוגיה מאומת של רקמות הכנה הדמיה פרקטיקות קריטי לכמת autophagy-ליזוזום תאים. עם שיטות גנטיות טובות, הגישות ניתוח התמונה כולל Atg-חיוביים של חלקיקים בעוצמה פרופילים וניתוח רביע עם gating על ידי אותות פלואורסצנט בודדים, יכול להרשות גילוי עוצמה והשוואה בין נורמליים ופתולוגיים שטף autophagic ויוו במודלים המחלה מגוונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי שילה דוד פואנטה נוירופתי כאב מחקר התוכנית לתואר שני לאגודה (ל J.M.B.), הבחורים החיים של האפיפיור לויס תוכנה (כדי מודיע Y.Z., J.M.B.), קרן שניידר-רובינסון לאחווה Predoctoral (כדי מודיע), ה-ד ר ג'ון T . קרן מקדונלד (כדי מודיע), חוזים, מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 ו- R56NS095893 (R.G.Z.), ועל -ידי טאישאן מלומד לפרוייקט (מחוז שאנדונג, הרפובליקה העממית של סין) (R.G.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Corporation PF184250 Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish Corning 351008 Dissection dish
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20 Dissection tool
Sodium Chloride Sigma S3014 PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic  Sigma S5136 PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P5655 PBS solution
Triton X-100 Sigma T9284 Washing and antibody incubaton solution. 
37% Formaldehyde VWR 10790-710 Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) VWR 89000-022 Fixation, washing, and antibody incubaton. 
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) VWR 48312-004 Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) VWR 48393-172 Slides for confocal imaging
Rubber Cement Slime 1051-A Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories, Inc. H-1000 Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) 3M Company 810 Mounting
Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific PCN5000 Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)  Thermo Fisher Scientific D1306 Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope AmScope SM-1BNZ Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji NIH v1.51u With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope Olympus
Recombinant Construct Bloomington Drosophila Stock Center BL37749

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
  2. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  3. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
  4. Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
  5. Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
  6. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
  7. DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
  8. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
  10. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  11. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
  12. Fischbach, K. -F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
  13. Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
  14. Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
  15. Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
  16. Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
  17. Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
  18. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  19. Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
  20. Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
  21. Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
  22. Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
  23. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).

Tags

מדעי המוח גיליון 138 צבירה autophagy ImageJ פילוח רציומטרי הקשורים ניוון מוחיים דרוזופילה מוח
ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב <em>דרוזופילה</em> דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brazill, J. M., Zhu, Y., Li, C.,… More

Brazill, J. M., Zhu, Y., Li, C., Zhai, R. G. Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ. J. Vis. Exp. (138), e58041, doi:10.3791/58041 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter