Biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de ImageJ

Summary

Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives d’études biologiques de fluorescence dotés d’imagerie cellulaire d’agrégation des protéines et du flux autophagie dans le système nerveux central de Drosophila modèles de neurodégénérescence.

Abstract

Avec l’augmentation de la prévalence des maladies neurodégénératives, c’est de plus en plus important de comprendre la physiopathologie sous-jacente qui mène à la perte et la dysfonction neuronale. Technologies et outils d’imagerie par fluorescence permettent une analyse inédite des processus neurobiologiques subcellulaires, mais il n’y a toujours un besoin d’approches non biaisées, reproductibles et accessibles permettant d’extraire des données quantifiables des études d’imagerie . Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives de basés sur la fluorescence des études d’imagerie utilisant des modèles de drosophile de la neurodégénérescence. Plus précisément, les auteurs décrivent une approche facile à suivre, semi-automatique à l’aide de Fidji/ImageJ pour analyser deux processus cellulaires : tout d’abord, nous quantifier la teneur totale en protéines et profil dans le lobe optique de drosophile à l’aide de mutant fluorescentes-tag protéines de la huntingtine ; et en second lieu, nous évaluons le flux de l’autophagie-lysosome dans le système visuel de drosophile avec quantification ratiométrique-basé d’un reporter fluorescent en tandem de l’autophagie. Ce qui est important, le protocole décrit ici comprend une étape de segmentation semi-automatique pour s’assurer que toutes les structures fluorescents sont analysées afin de minimiser les biais de sélection et d’augmenter la résolution des comparaisons subtiles. Cette approche peut être étendue pour l’analyse des autres structures biologiques cellulaires et processus impliqués dans la neurodégénérescence, tels que punctums protéiques (granules de stress et complexes synaptiques), compartiments ainsi que membranaires (mitochondries et trafic des vésicules membranaires). Cette méthode fournit un standard, pourtant référence adaptable point pour l’analyse d’images et de la quantification et pourrait faciliter la fiabilité et la reproductibilité dans le champ et finalement renforcer l’interprétation mécaniste de la neurodégénérescence.

Introduction

Maladies neurodégénératives touchent des millions de personnes chaque année et l’incidence augmente avec un vieillissement de la population¹. Alors que chaque maladie neurodégénérative a une étiologie unique, agrégation de protéines mal repliées et ventilation du réseau protéostasie caractérisent commune pathologique d’un grand nombre de ces maladies. Élucider comment les perturbations de ces processus fondamentaux et interdépendants se dérègle pour contribuer à la mort neuronale de la dysfonction et de cellules est essentiel pour comprendre les maladies neurodégénératives, en plus de guider les interventions thérapeutiques. Imagerie par fluorescence permet l’étude de ces processus complexes et dynamiques dans les neurones et a grandement contribué à notre compréhension de la biologie cellulaire neuronale. L’analyse des protéines fluorescent étiquetés est un défi, particulièrement lorsque les expériences sont réalisées in vivo, en raison des tissus hautement compacts, types de diverses cellules et hétérogénéité morphologique. Quantification assistée manuellement est abordable et simple, mais il est souvent fastidieux et sous réserve de partialité humaine. Par conséquent, il y a une nécessité d’approches non biaisées, reproductibles et accessibles permettant d’extraire des données quantifiables des études d’imagerie.

Nous avons esquissé un workflow simple et adaptable à l’aide de Fidji/ImageJ, une image puissante et librement accessible, traitement logiciel^2,3, pour extraire des données quantitatives d’études par imagerie de fluorescence sur des modèles expérimentaux de neurodégénérescence à l’aide de drosophile. En suivant ce protocole afin de quantifier l’agrégation des protéines et du flux autophagique — deux cellules caractéristiques biologiques qui sont très pertinents à la pathologie de la maladie neurodégénérative — nous avons démontré la sensibilité et la reproductibilité de cette démarche. Analyse des protéines fluorescent étiqueté de la huntingtine mutante (Htt) dans le lobe optique de drosophile a révélé le nombre, la taille et l’intensité des agrégats de protéine. Nous avons visualisé un journaliste fluorescent en tandem du flux autophagie dans le système visuel de drosophile , qui affiche des signaux d’émission différentes selon l' environnement compartimenté⁴. Analyse comparative ratiométrique du reporter en tandem permettant une vision quantitative et globale du flux d’autophagie-lysosome de formation de l’autophagosome, la maturation et le transport à la dégradation dans le lysosome et a en outre souligné vulnérables compartiments perturbées dans les maladies neurodégénératives. Ce qui est important, dans les deux analyses, nous avons implémenté seuillage semi-automatisée et étapes de la segmentation dans notre protocole à minimiser le biais inconscient, augmenter la puissance de l’échantillonnage et fournir une norme pour faciliter les comparaisons entre des études similaires. Le flux de travail simple est destiné à rendre puissant plugins de Fidji/ImageJ (développés par des informaticiens basés sur des algorithmes mathématiques) plus accessibles aux neurobiologistes et la communauté des sciences de la vie en général.

Protocol

1. considérations et préparations pour la conception de l’expérience de l’analyse d’Image

1. Prédéterminer cellulaire anatomique, adapté, ou marqueurs subcellulaires pour servir de points de repère pour standardiser une région d’intérêt (ROI) dans les trois échantillons différents, par exemple 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), marqueurs membranaires, fluorescentes localisée protéines, etc.
2. Sélectionnez un marqueur fluorescent qui peut délimiter examen discret au-delà des niveaux de fond pour la structure d’intérêt.
   Remarque : Ce protocole est optimisé pour des structures protéiques (p. ex., agrégats de protéines mal repliées) et organites membranaires (p. ex., reporter de l’autophagie). Pour visualiser l’agrégation des protéines, un fragment de DP-tag N-terminale de la protéine humaine Htt avec une étendue de polyQ pathogènes de 138 répétitions (DP-hHttQ138) a été utilisé⁵. La protéine mutante de Htt forme des agrégats cytoplasmiques lorsqu’elle est exprimée dans les drivers spécifiques neuronales par exemple elav-GAL4^5,6. Afin de visualiser le flux de l’autophagosome-lysosome, Actine-GAL4 a été utilisé de façon ubiquitaire conduire expression du reporter en tandem mCherry-GFP-Atg8a. mCherry séropositifs et GFP examen indiquent des autophagosomes et le flux est surveillé comme fluorescence GFP est piégée dans le milieu acide de le lysosome, où mCherry insensible à l’acide reste jusqu'à ce que la protéine est dégradé⁷. Pour une analyse logométrique, un canal unique qui est un marqueur cohérent de la structure peut être utilisé pour la segmentation, ou le cas échéant, qu'une projection de deux ou plusieurs canaux peut servir à délimiter des structures, bien que non explicitement décrit dans ce protocole. Dans cet exemple, mCherry est utilisé pour la segmentation des particules Atg8-positif, car il est insensible à l’acide et restera dans le compartiment tout au long du flux à travers la voie.
3. Téléchargez et installez la plate-forme open source image analyse ImageJ ou Fidji — la distribution préférée d’ImageJ avec bundled plugins^2,3.
4. Installer le plugin pour bassin hydrographique interactive h-maxima.
   Remarque : Ce protocole utilise des Fidji ; plugins supplémentaires peuvent être nécessaires pour ImageJ. Le plug-in développé par Benoit Lombardot pour EFC-MPI-CBG est disponible en ligne (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Accédez à « aider | Mise à jour », sélectionnez « Sites de mise à jour de gérer » de la « ImageJ Updater », choisissez le site de mise à jour du SCF-MPI-CBG dans la liste et puis fermez et redémarrez Fidji.

2. Dissection et Immunofluorescence souillant le cerveau

1. Faites de silicone plats dissection bordées d’élastomère.
   1. Versez silicone composants élastomères dans un bécher comme indiqué par le fabricant et remuez bien jusqu'à ce que bien mélangé.
   2. Utiliser une pipette pour remplir 5 cm tissu Pétri un tiers à la moitié plein (environ 10 mL de mélange élastomère). Laissez les bulles montent à la surface et retirez doucement avec le papier de soie. Couvrir les plats et les placer sur une surface plane pendant 48 à 72 h à température ambiante (RT).
2. Disséquer la drosophile cerveau et système visuel si nécessaire.
   1. Effectuer la dissection de cerveau de drosophile comme décrit précédemment^8,9. Effectuer la dissection dans les plats de dissection bordées d’élastomère, en utilisant un fond d’élastomère pour stabiliser le cerveau pour éviter d’endommager les tissus ou une pince.
   2. Pour garder la lamina intacte au cours de la dissection, glissez deux pinces sous la rétine et déchirer délicatement au milieu de le œil à supprimer de la rétine. Jeter n’importe quel tissu rétinien, attaché à la lame avec une pince qui s’est tenue parallèlement à la surface du limbe.
      NOTE : Pigment résiduelle se lavent dans les étapes suivantes et habituellement n’interfère pas avec les anticorps de coloration et d’imagerie.
   3. Diluer à 37 % de formaldéhyde en solution saline tamponnée au phosphate (PBS), afin de faire une concentration finale de 3,7 % frais avant de l’utiliser dans un tube de microcentrifuge de 500 µL. Transférer le cerveau disséqué au tube de microcentrifuge avec fix solution et incuber pendant 15 min à ta douce à bascule.
      Remarque : Le formaldéhyde a naturellement tendance à s’oxyder, produisant de l’acide formique. Par conséquent, il est suggéré de formaldéhyde % aliquote du 37 pour stockage et diluer jusqu'à 3,7 % fraîchement avant chaque utilisation. Fixation excessive ou fixation sous affecteront l’intégrité des tissus et la fluorescence¹⁰.
   4. Laver 3 fois avec PBTx (PBS avec 0,4 % Triton X-100) pendant 15 minutes chaque.
3. Effectuer l’immunohistochimie et monter des spécimens.
   1. Si les anticorps est nécessaire, enlever PBTx, ajoutez l’anticorps primaire dilué dans PBTx avec 5 % de sérum de chèvre normal et incuber sur une table de mixage aliquote durant la nuit à 4 ° C.
   2. Enlever l’anticorps primaire et laver 3 fois avec PBTx pendant 15 minutes chaque. Ajoutez l’anticorps secondaire dilué dans PBTx avec 5 % de sérum de chèvre normal et incuber pendant 1 heure à la droite ou pour la nuit à 4 ° C. Laver 3 fois avec PBTx pendant 15 min chacun.
   3. Si la coloration DAPI est nécessaire, enlever PBTx, ajouter la solution au DAPI (solution mère : 5 mg/mL, diluer à une concentration de travail de 15 µg/mL en PBTx) et incuber pendant 10 min à Wash RT. 3 fois avec PBTx pendant 15 minutes chaque.
   4. Pour effacer le tissu, mettre une goutte de milieu de montage au centre d’une lame de microscope avec une cale d’espacement d’une seule couche de ruban adhésif transparent sur les deux côtés. Transférer le cerveau sur la goutte de milieu de montage et attendre 1 à 2 min jusqu'à ce que le cerveau devient transparent. Retirer délicatement le support de montage avec une pipette.
   5. Pour monter, appliquez une goutte de milieu de montage fraîches sur le cerveau sur la diapositive. Le recouvrement soigneusement une lamelle couvre-objet en évitant les bulles. Sceller les bords avec du ciment de caoutchouc et sécher à l’air à ta pendant 20 min. procédez à l’acquisition d’images pour de meilleurs résultats.

3. image Acquisition

1. Optimiser les paramètres d’acquisition microscope, y compris la résolution spatiale, objectif, zoom, vitesse, de balayage et l’étape de taille, afin d’optimiser la résolution des structures d’intérêt pour faciliter la segmentation semi-automatique lors de l’analyse de l’image.
   Remarque : Il peut être utile pour capturer une image de l’échantillon et tester la segmentation semi-automatique (à l’étape 5 du présent protocole) avant de tous les échantillons expérimentaux d’imagerie. De cette façon l’utilisateur peut ajuster les réglages d’imagerie afin que les outils d’analyse peuvent facilement discerner la structure biologique d’intérêt.
2. Ajuster les commandes du détecteur image pour capturer le rapport signal-bruit plus élevé et la gamme dynamique la plus élevée de l’échantillon.
   1. Utilisez une LUT (look up table) qui indique la saturation pixel (exposition trop élevée) ou une sous-saturation (décalage trop bas) tout en ajustant les paramètres (Figure 3 b, rouge indique la saturation pixel par une LUT Hi/Low).
   2. Vérifiez les réglages de gain et offset sont appropriés pour tous les groupes expérimentaux, comme les manipulations expérimentales susceptibles de modifient la structure d’intérêt.
      Remarque : Il est impératif que les mêmes paramètres sont utilisés pour tous les groupes de faire des comparaisons quantitatives.
3. Image à travers le tissu pour capturer toutes les données.
   Remarque : Il est recommandé de capturer toutes les données disponibles au cours d’une séance d’imagerie et pour définir une zone plus précise pendant la sélection du ROI à l’étape 4, si nécessaire.
4. Enregistrer l’image sous le type de fichier pris en charge par le logiciel d’imagerie afin de préserver les métadonnées telles que des paramètres d’acquisition et de calibration spatiale. Enregistrer l’image avec un nom de fichier, y compris expérimentaux anticorps date, fond génétique et des reporters fluorescents, ou colorants correspondant aux canaux numérisés tels que [nom du groupe expérimental] _ [nom du modèle] _ [expérience date] _Ch1. [Fluorophore-cible /Dye]_Ch2.[fluorophore-Target/Dye], etc.

4. Fidji/ImageJ Image importation et sélection de ROI

1. Ouvrez une image dans les îles Fidji. Utilisez la boîte de dialogue « Options d’importation de Bio-Formats », choisissez « pile vue avec : Hyperstack » et « mode couleur : en niveaux de gris ».
   Remarque : Il est recommandé d’ouvrir le type de fichier de microscope, sous forme de métadonnées telles que calibration spatiale peut être lu par les Fidji.
2. Identifier un domaine d’un seul plan z ou une projection fondée sur les canaux de marqueur qui peuvent être utilisés comme un ROI normalisé dans l’ensemble de spécimens (Figure 1, sélection de retour sur investissement).
   1. Utilisez la barre de défilement « C » pour afficher l’ou les canaux utilisé pour capturer le marqueur désigné à l’étape 1.1.
   2. Utilisez la barre de défilement « Z » pour parcourir les plans focaux. Choisir une tranche unique ou créer une projection de plusieurs sections en cliquant sur « Image | Piles | Projet de Z » et set « tranche de démarrage » et « Arrêt de tranche » pour englober le retour sur investissement.
      Remarque : Définition du type de " "Projection » à « Max intensité » dans le projet « Z » boîte de dialogue est souvent mieux adapté pour mettre en évidence des structures de segmentation dans la Section 5, si ce n’est peut-être pas approprié pour toutes les applications. Si un autre type de projection est requis pour l’analyse, prendre soin de sauvegarder et de documenter ce fichier en tant que tel pour l’extraction de caractéristiques dans l’article 6 et/ou 7.
   3. Générer une nouvelle image contenant l’ou les canaux et focal plane(s) d’intérêt afin de simplifier les étapes suivantes dans le protocole de l’analyse d’image. Sélectionnez « Image | Duplicate », établissez les désiré « Channels » (c) et les « Tranches » (z) et changer le nom du fichier pour refléter la sélection (par exemple, [nom du groupe expérimental] _ [nom du modèle] _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) l’expérience.
3. Utilisez un des « outils de sélection » dans la barre d’outils de Fidji de sélectionner manuellement un retour sur investissement standardisé selon les critères de sélection à l’étape 4.2.
4. Ajouter le retour sur investissement au gestionnaire du ROI en cliquant sur « Analyze | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement » et cliquez sur « Ajouter » dans le menu Gestionnaire de ROI. Enregistrer le retour sur investissement ROI Manager dans le menu en cliquant sur « plus | Enregistrer » et puis nommez le fichier afin de refléter le retour sur investissement (p. ex., [nom du groupe expérimental] [nom du spécimen] [date de l’expérience] _ [canaux] _ [z-plane(s)] _ [ROI description]).
   Remarque : Ceci peut être rouvert aux Fidji pour analyses à venir ou peut être appliqué à d’autres canaux ou les images comme dans l’article 5.3.

5. prétraitement et Segmentation avec h-maxima Watershedding

1. Effectuer le prétraitement au canal servant à capturer les structures d’intérêt.
   1. Si le fichier image se compose de plusieurs canaux, séparer les canaux en cliquant sur « Image | Couleur | Fractionner des chaînes » d’isoler le canal d’intérêt.
   2. Appliquer un filtre comme un filtre médian pour réduire le bruit ou le flou gaussien pour lisser en cliquant sur « processus | Les filtres | Filtre type » (par exemple, « Filtre médian » ou « Flou gaussien »).
      1. Goûtez les différents filtres et filtrer les paramètres sur les images de chaque groupe expérimental. Procéder par étape 6.2 avec un exemple représentatif de chaque groupe afin de vérifier les performances de la segmentation. Sélectionnez le filtre et les paramètres qui facilitent la segmentation des structures d’intérêt.
   3. Enregistrer les paramètres et le filtre. Appliquez ces paramètres sur des groupes expérimentaux.
   4. Enregistrez une copie de l’image au format tiff y compris le filtre appliqué pour référence. Utilisez un nom détaillé tels que [nom du groupe expérimental] [nom du spécimen] [date de l’expérience] _ [canal] _ [z-plane(s)] _ [filtre avec les paramètres].
2. Effectuer la segmentation des structures d’intérêt avec l’outil de bassin hydrographique interactive h-maxima sur l’image prétraitée généré et enregistré à l’étape 5.1.
   1. Avec l’image prétraitée active dans les îles Fidji, lancer l’outil de bassin hydrographique interactive h-maxima en cliquant sur « EFC | L’étiquetage | H_Watershed interactive ».
      NOTE : Ce plugin calcule d’abord le bassin et puis permet à l’utilisateur d’explorer les effets des maxima locaux et des options de seuil sur la segmentation par une image de sortie mise à jour instantanée.
   2. Dans le panneau de contrôle, régler les semences dynamique (h), seuil d’intensité (T) et le pic des inondations (%) afin d’optimiser la segmentation.
      Remarque : Se référer toujours à l’image raw avant de prétraitement de la Section 4.2 pour inspecter manuellement les performances de segmentation des structures d’intérêt.
   3. Lorsque vous êtes satisfait des résultats de segmentation, sélectionnez « Exporter les masque de régions » et choisissez « Exporter ». Cela va générer une image binaire des résultats du bassin versant (Figure 1, Segmentation).
   4. On enregistre les paramètres de segmentation ; ces paramètres doivent être appliqués dans l’ensemble des groupes expérimentaux pour des comparaisons quantitatives. Enregistrer le masque binaire des résultats si vous le souhaitez pour toute consultation avec les paramètres de segmentation détaillés dans le nom tel que [nom du groupe expérimental] [nom du spécimen] [date de l’expérience] _ [canaux] _ [z-plane(s)] _ [filtre avec les paramètres] _ [H_Watershed paramètres].
3. Extrait les structures d’intérêt des résultats du bassin hydrographique.
   1. Ouvrez le ROI sauvé de 4,4 étape, dans le gestionnaire de ROI. Avec le masque binaire de régions de l’étape 5.2.4 actif, sélectionnez le retour sur investissement dans le gestionnaire de ROI à appliquer à l’image de limiter l’extraction de caractéristiques pour le retour sur investissement standardisé.
   2. Avec le retour sur investissement est active sur le masque binaire de bassin hydrographique, choisissez « Analyze | Analyser les particules » avec « Ajouter à Manager » sélectionné dans la boîte de dialogue pour extraire des caractéristiques.
      Remarque : Cela va ajouter un identificateur de particules pour chaque structure délimitée au cours de la segmentation au gestionnaire de ROI. Options sont disponibles dans ce menu pour exclure les fonctionnalités basées sur la taille ou la circularité si nécessaire d’affiner les structures incluses dans l’analyse.
   3. Enregistrez les particules en cliquant sur « plus | Enregistrer » dans le menu Gestionnaire de ROI. Veiller à ce que les identificateurs sont désélectionnés et toutes les particules seront tous enregistrés dans un fichier zip. Utilisez un nom détaillé tels que [nom du groupe expérimental] [nom du spécimen] [date de l’expérience] _ [canaux] _ [z-plane(s)] [filtre avec les paramètres] [paramètres H_Watershed] _ [structures].

6. quantité, zone et intensité Quantification et analyse

1. Ouvrez l’image raw généré et enregistré à l’étape 4.2. Mettez en surbrillance le canal utilisé pour capturer les structures d’intérêt.
   Remarque : Il est essentiel de prendre des mesures d’intensité de l’image brute (avant le prétraitement) en appliquant des filtres en changements incrémentiels 5.1 les valeurs des pixels.
2. Ouvrez les particules provenant d’extraction de caractéristiques à l’étape 5.3 et sélectionnez « Afficher tout » dans le gestionnaire de ROI.
   NOTE : Cette action se superposeront un aperçu de chaque particule sur le « ROI Manager » sur l’image et doit correspondre les bords des structures d’intérêt (Figure 1, extraction de caractéristiques).
3. Définir les mesures souhaitées en cliquant sur « Analyze | Définir des mesures ».
   Remarque : La zone, l’intensité et la densité des particules peuvent être mesurées en choisissant « zone » et « densité intégrée ». Lorsque la densité intégrée est activée, Fidji va produire deux valeurs : « Intégrés de densité » calculé comme le produit de la région et valeur de gris moyen et « Raw intégré densité » calculée comme la somme des valeurs des pixels. Densité de la protéine fluorescente dans les particules est calculée comme la somme des valeurs des pixels divisée par la superficie. Le nombre de particules généré à l’étape 5.3 indique la quantité de particules à l’intérieur du tissu que roi définie à l’étape 4.4.
4. Dans le menu Gestionnaire de ROI, choisissez « Mesure ». Les résultats sont exprimés en unités calibrées aussi longtemps que les mesures sont tirées des fichiers dérivés dans les îles Fidji le logiciel d’imagerie. Copier les résultats dans la fenêtre de résultats et coller dans le logiciel de feuille de calcul pour la compilation et autres calculs.

7. ratiométrique Quantification et analyse des données

1. Suivez les étapes 6.1 et 6.2 pour ouvrir les identificateurs de particules sur la première chaîne brute d’intérêt.
2. Définir les mesures souhaitées en cliquant sur « Analyze | Définir des mesures ».
   Remarque : L’intensité moyenne par particule peut être mesurée en choisissant « Signifie valeur de gris ».
3. Dans le gestionnaire de ROI sélectionnez « Mesure ». Copier les données de la fenêtre de résultats et collez dans le tableur.
4. Déplacer la barre de défilement « C » à la deuxième chaîne brute d’intérêt, GFP dans cet exemple (Figure 4 a) et répétez les étapes 7.2. et 7.3.
   Remarque : Les particules enregistrés à l’étape 5.3 utilise par défaut le canal et la tranche d'où il provenait. Prendre soin de s’assurer que les particules sont appliqués à la bonne chaîne d’intérêt.
5. Calculer le ratio de l’intensité d’un canal à l’intensité de la seconde pour chaque particule dans le logiciel de feuille de calcul.
6. Un diagramme de dispersion permet de visualiser et de quantifier les données ratiométrique de fluorophores qui présentent des modifications individuelles de processus biologiques sous-jacents.
   1. Générer un diagramme de dispersion dans le logiciel graphique.
      Remarque : Chaque point de données représente une structure d’intérêt où l’intensité du fluorophore première d’intérêt est la valeur « x » et l’intensité du second fluorophore est la valeur « y » mesurée de chaque particule.
   2. La valeur gating seuils pour chaque fluorophore définir les quadrants.
7. Profil de ligne permet de visualiser l’intensité fluorophore à travers une structure d’intérêt.
   1. Sélectionnez un retour sur investissement généré à l’étape 5.3 et utiliser l’outil ligne droite sur la barre d’outils pour dessiner une ligne droite par le ROI. Ajoutez la ligne ROI au ROI gestionnaire.
   2. Pour chaque canal d’intérêt, avec la ligne de retour sur investissement actif, sélectionnez « Analyze | Tracer le profil ».
      Remarque : La fonction de profil de terrain va générer une parcelle de l’histogramme et une table des valeurs de l’intensité le long de la ligne. Copiez les résultats mesurés sur chaque canal et le coller dans le logiciel de tableur pour générer un diagrammes montrant les deux canaux le long de la ligne.

Representative Results

Quantification du nombre, espace et intensité des agrégats de Htt mutants fluorescent étiquetés dans le lobe optique de drosophile

Pour étudier l’agrégation des protéines mal repliées dans le système nerveux central d’un modèle drosophile de la maladie de Huntington, DP-tag mutant Htt humaine avec un non pathologiques (SAMU-DP-hHttQ15) ou l’expansion pathologique ( UAS-RFP-hHttQ138) et la membrane GFP (SAMU-mCD8::GFP)¹¹ ont conjointement exprimé sous un pilote pan-neuronale elav-GAL4. Cerveau des mouches femelles 2 jours après l’éclosion (DAE) ont été disséqués, fixées et colorées au DAPI conformément à l’article 2 du protocole. Laser confocal, microscopie à balayage a été réalisé en se concentrant sur le lobe optique avec un 40 X huile d’immersion objectif, 1.30 ouverture numérique (NA), en utilisant une vitesse de balayage de 8,0 µs par pixel et une résolution spatiale de 1024 x 1024 pixels (12 bits par pixel). La taille de palier optimale déterminée par le logiciel d’imagerie était de 1,08 µm par tranche pour l’objectif avec la combinaison suivante de longueurs d’onde d’excitation/émission : canal 1) 488/510 pour GFP, canal 2) 543/581 pour DP et canal 3) 405/461 au DAPI. Paramètres de détecteur d’image appliquées à tous les groupes pour capturer des images appropriées pour les comparaisons, reposaient sur un spécimen de DP-Htt-Q138, qui accumule les agrégats de DP-Htt de haute intensité, plutôt que sur un échantillon de contrôle DP-Htt-Q15 non pathogènes, qui maintient faibles niveaux de diffus DP-Htt (Figure 2). Si image acquisition paramètres ont été définis afin de maximiser la plage dynamique d’un spécimen de DP-Htt-Q15, puis les agrégats de DP-Htt-Q138 seraient saturés. À titre d’exemple, une micrographie d’agrégation de la protéine dans le lobe optique de drosophile a été enregistré comme HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.

Le lobe optique entier a été photographié au cours de la microscopie et comprenait environ 15 z-tranches, mais après l’imagerie, il a été déterminé qu’analyser un seul plan z était le mieux pour résoudre les structures de l’individu qui apparaîtraient normalement qui se chevauchent dans une projection due à la haute densité dans les tissus. Pour déterminer un ROI normalisé, les corps cellulaires C2 et C3, situés entre la plaque médullaire et lobula du lobe optique¹² ont été utilisés comme un repère anatomique. Aux Fidji, l’image a été ainsi dupliqué pour tenir compte des exigences de l’analyse et a été enregistrée dans un fichier tiff, nommé HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, où z8 reflète la huitième tranche où étaient les corps cellulaires neurones, C2 et C3 plus éminent par DAPI coloration (Figure 1 a, acquisition d’images). L’outil de sélection polygone a été utilisée pour sélectionner manuellement un retour sur investissement autour du lobe optique utilisant la coloration DAPI et signal neuronal de GFP comme guide (Figure 1 a, choix du ROI, où jaune indique le retour sur investissement et rouge désigne l’image de fort grossissement indiqué pour clarté dans les panneaux suivants du flux de travail). Ensuite, un filtre Flou gaussien avec σ la valeur 1 a été appliqué au canal DP-Htt pour lisser l’image et faciliter la segmentation (Figure 1 a, prétraitement) et la performance de la segmentation en aval et extraction de caractéristiques avec et sans que cela étape de prétraitement est illustrée dans la Figure 1 a. Interactive H-bassin versant a été réalisée sur des images de la chaîne de DP-Htt avec les paramètres suivants : semences dynamique, 30 ; seuil d’intensité, 500 ; Pic des inondations (en %), 80 ; avec « autoriser fractionnement » et « masque de régions d’exportation » sélectionnée (Figure 1 a, Segmentation). Le masque binaire régions résultant a été enregistré sous HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent et utilisé pour générer des particules avec l’outil analyze de particules avec une exclusion de taille minimale de 0,4 µm² pour définir des agrégats protéiques^13,14 . Les particules résultantes ont été sauvées depuis le gestionnaire de ROI comme HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates et ont été appliqués sur le canal de DP-Htt brut (avant le prétraitement) pour extraire données d’imagerie quantitatives (Figure 1 a, extraction de caractéristiques).

Quantification du nombre d’agrégats de DP-Htt semi-automatiquement segmentés de plans focaux normalisés par le lobe optique de Drosophila révélé diffus d’expression de l’expansion de Htt-Q15 non pathogènes et l’accumulation de protéine agrégats de l’expansion de Htt-Q138 pathogènes (Figure 2 a-C). La somme de toutes les valeurs de pixels de chaque particule donnée par « Raw intégrée densité » a été utilisée pour comparer le contenu de la DP-Htt de chaque agrégat. Profils de taille et l’intensité de tous les agrégats d’un plan focal normalisé de cinq lobes optiques différentes exprimant Htt-Q138 illustrent la robustesse et la reproductibilité de ce flux de travail (Figure 2D, E). Notamment, lorsque les agrégats ont été surexposées au cours de l’acquisition d’images (Figure 3 a, B), quantification de la taille et le nombre d’agrégats sont comparables aux agrégats capturés avec exposition idéale (Figure 3, D), cependant la intensité des agrégats surexposées devient fonction de la taille pixel saturés présentent la valeur de l’intensité maximale (Figure 3E, F). Configuration des paramètres de l’exposition analyse approprié est donc essentielle d’extraire toute la gamme de composition moléculaire quantitative des agrégats de protéine.

Axée sur les ratiométrique quantification des flux de l’autophagie dans la lamina visual drosophile à l’aide d’un journaliste de Atg8a fluorescent en tandem

Afin d’évaluer les flux d’autophagie-lysosome dans le système visuel de la drosophile , journaliste mCherry-GFP-Atg8a exprimait ubiquitaire dans le contrôle ou mouches Drosophila spermine synthase (DSM) homozygote mutant (DSM^e/e) avec L’actine-GAL4 pilote. ces modules^e/e vole pièce neurodégénérescence associée à des flux autophagique avec facultés affaiblies en raison de dysfonctionnement lysosomal¹⁵. Cerveau avec limbe ci-joint des mouches femelles à 5 DAE ont été disséqués, fixe et colorées au DAPI. La lame a été photographiée par avec un 100 X huile d’immersion objectif, 1,35 ouverture numérique (NA), à une vitesse d’échantillonnage de 8,0 µs par pixel et 12 bits par pixels de résolution optique et la taille d’étape de 1,2 µm, la microscopie confocale à balayage laser.

Cette analyse a été effectuée sur une projection de z-max de sept z-tranches à travers la lame pour augmenter la puissance d’échantillonnage des structures positives Atg8 clairsemées (Figure 1 b, acquisition d’images). Le retour sur investissement standardisé a été tiré manuellement avec l’outil de sélection polygone autour de la couche de corps cellulaire révélée par DAPI et basée sur l’anatomie bien caractérisé et l’organisation cellulaire du tissu (Figure 1 b, sélection du ROI, où jaune indique la ROI et rouge désigne l’image de fort grossissement indiqué pour plus de clarté dans les panneaux suivants du flux de travail)¹⁶. Le journaliste tandem repose sur les propriétés de stabilité des portions GFP et mCherry pour marquer la progression par la voie de l’autophagie-lysosome, telle que GFP est piégée par l’acidité du lysosome où mCherry reste jusqu'à ce qu’il est dégradé. Par conséquent, le fluorophore mCherry changée servait de segmentation dans le présent protocole. Un filtre Flou gaussien avec σ valeur 1 a été appliqué à la chaîne de mCherry (Figure 1 b, prétraitement), et H-bassin Interactive a été réalisée avec les paramètres suivants : semences dynamique, 0 ; seuil d’intensité, 800 ; Pic des inondations (en %), 90 ; avec « autoriser fractionnement » et « masque de régions d’exportation » sélectionnée (Figure 1 b, Segmentation). Le masque binaire régions résultant a été utilisé pour générer des particules avec l’outil d’analyse des particules. Les particules résultantes ont été appliquées pour les canaux GFP raw et raw mCherry (avant le prétraitement) pour extraire des données quantitatives ratiométrique des compartiments de l’autophagie-lysosome (Figure 1 b, extraction de caractéristiques).

Inspection visuelle des structures mCherry-GFP-Atg8-positif indiqué enrichissement dans la région du corps cellulaire du limbe, compatible avec les rapports précédents du transport rétrograde des vésicules autophagiques vers le corps cellulaire des neurones¹⁷. Profil de terrain a été utilisé pour visualiser mCherry et l’intensité de la GFP dans plusieurs structures Atg8-positive (voir ligne ROIs dans la Figure 4 a et profils résultants d’intensité le long de la ligne dans la Figure 4 b), révélant des différences dans le recueil où élevé l’intensité de ces deux fluorophores indique autophagosomes (Figure 4 b 3), mCherry haute et basse GFP montrant fusion avec les lysosomes GFP est piégée dans ce milieu acide (Figure 4 b 1), et enfin mCherry faible reflète la dégradation au sein le lysosome (Figure 4 b 2). Un nuage de points généré à partir de l’intensité moyenne fluorophore de chaque particule de mCherry-Atg8 positive semi-automatiquement segmenté illustre le flux à travers la voie de l’autophagie-lysosome qui était alors séparée en étapes discrètes par analyse de quadrant ( Figure 4). L’intrigue a été divisé en quatre quadrants en utilisant des seuils de déclenchement de GFP = 570, mCherry = 1 800. Les seuils ont été définies en fonction du groupe de contrôle en utilisant les principes suivants : (1) la conception du reporter fluorescent en tandem et les propriétés des deux fluorophores, alors que théoriquement GFP ne devrait pas réagissent en où il n’y a aucun signal de mCherry (quadrant IV) et (2) la distribution des particules positives Atg8 reflète la répartition des compartiments axés sur la voie de l’autophagie-lysosome dans les neurones de type sauvage où autophagie basale est hautement efficace^18,19. Dans les laminas de contrôle mouches, environ 25 % des particules Atg8-positives ont été mis en cellule comme autophagosomes (quadrant j’ai), et la moitié de l’examen sont traitée au-delà de fusion autophagosome-lysosome (quadrant II et III) ; DSM^e/e laminas avaient augmenté significativement autophagosomes ou dysfonctionnels lysosomes (quadrant j’ai) et une diminution d’autolysosomes (quadrant II et III), évocateurs d’accumulation autophagosome à travers les défauts dans fusion de l’autophagosome-lysosome et/ou de la dégradation lysosomiale (Figure 4 C, D). Données quantitatives a également appuyé évidente accumulation de structures Atg8 séropositifs dans lame de mouches DSM^e/e (Figure 4E). Analyse logométrique de moyenne mCherry et le signal de la GFP a mis en évidence une différence entre le groupe contrôle et DSM^e/e (Figure 4F) mais ne pouvait pas détailler l’influence globale sur la voie, ni les mesures précises révélées par les analyse du quadrant.

Figure 1 : Flux de travail par le biais de biais-minimisé, semi-automatisées segmentation de structures subcellulaires dans le cerveau de la drosophile à l’aide de Fidji avec des exemples. (A) représentant confocal micrographies de plan focal unique à travers le lobe optique d’un cerveau adulte de Drosophila exprimant pan neuronale DP-tag mutant Htt et axés sur la membrane GFP (elav-GAL4 > SAMU-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) au DAPI coloration (acquisition d’images). DAPI et GFP ont été utilisés pour sélectionner un retour sur investissement (jaune) autour du lobe optique ; boîte rouge indique la région amplifiée par le biais de flux de travail pour plus de clarté (sélection de retour sur investissement). Panneau prétraitement montre fort grossissement de l’image brute du chenal DP-HttQ138 (en haut) et après application d’un filtre Flou gaussien, σ1 (en bas). Segmentation par bassin hydrographique interactive h-maxima, en utilisant les paramètres indiqués pour la dynamique de la graine déterminé par h-maxima (h), critères d’arrêt du bassin versant global déterminés de seuil d’intensité (T), et arrêt régional de critères déterminés par pic (inondation %) effectuées sur le DP-HttQ138 cru (en haut) et des images flou gaussien (bas) et les résultats du bassin versant de régions masque exportés du bassin hydrographique plugin et inversé pour plus de clarté. Les particules générées par analysent les particules (magenta) superposées sur les DP-HttQ138 les images raw (extraction de caractéristiques). Les flèches indiquent les agrégats qui sont trop segmentées sans prétraitement et pointes de flèches indiquent les structures qui ne parviennent pas à se séparer après filtrage. (B) représentant microscopie confocal de z-projection maximale de 7 plans focaux par le biais de la section horizontale du limbe d’un contrôle et un mutant (DSM^e/e) drosophile adulte exprimant omniprésent (GFP-mCherry-Atg8a actine-GAL4 > SAMU-GFP-mCherry-Atg8) au DAPI coloration (acquisition d’images). DAPI a été utilisé pour sélectionner un retour sur investissement (jaune) autour de la couche de corps cellulaire du limbe ; boîte rouge indique la région amplifiée par le biais de flux de travail pour plus de clarté (sélection de retour sur investissement). Panneau prétraitement montre fort grossissement du canal de mCherry avec filtre Flou gaussien, σ1 appliqué au contrôle et limbe mutant. Segmentation par bassin hydrographique interactive h-maxima effectuée sur les images filtrées mCherry avec les paramètres indiqués et bassin hydrographique résultats indiqués comme masque binaire régions inversé pour plus de clarté. Les particules générées par analysent les particules (magenta) superposées sur le mCherry brut et les images GFP (extraction de caractéristiques). Barreaux de l’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Quantification de la taille et l’intensité des agrégats de DP-Htt mutantes sont robustes et reproductibles. (A-B) Cerveaux de drosophile avec DP-hHttQ15 (A) ou une expression de DP-hHttQ138 (B) sous un pilote pan-neuronale elav-GAL4 ont été disséqués et fixés et les lobes optiques ont été photographiés par microscopie confocale à balayage laser. Echelle = 50 µm. (C) le nombre moyen d’agrégats dans chaque groupe quantifiée d’un retour sur investissement sélectionnée manuellement autour du lobe optique et axé sur une tranche-z normalisée (n = 5). (D-E) La taille (D) et l’intensité totale (E) des agrégats de DP-hHttQ138 quantifiée de normalisé des ROIs dans les lobes optiques de 5 animaux différents. Données agrégées sont tracées en échelle logarithmique. Agrégats ont été définis en tant qu’objets supérieurs à 0,4 µm² (ligne pointillée en ré). L’analyse statistique, analyse de variance unidirectionnelle, NS : non significatif ; UA : unité arbitraire s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : surexposition Image conduit à des mesures d’intensité inexactes. (A-B) Représentant confocal micrographie de la même optic lobe avec exposition idéale (A) et pseudocolored de surexposition (B) avec le LUT de HiLo à Fidji. Rouge en B indique agrégats surexposées. Echelle = 50 µm. (C) Quantification de taille globale après l’application des paramètres de bassin versant h-maxima pour générer des résultats similaires de segmentation. L’analyse statistique, échantillons indépendants t -test, NS : non significatif. Distribution de fréquences (D) de la taille totale, en images idéales et surexposées. Agrégats avec une taille de 5 à 25 µm² ont été davantage mis en cellule dans 4 groupes catégoriques. (E -F) Analyse de corrélation de l’intensité des agrégats en fonction de la taille des granulats (E). Une ligne de référence est dessiné (noir) lorsque tous les pixels ont une valeur d’intensité maximale de 4095. Boîte verte indique agrégats au-dessous de 10 µm² zone indiqué à F. b: coefficient de régression, R²: coefficient de détermination ; UA : unité arbitraire s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Quantification du tandem fluorescente GFP-mCherry-Atg8a génétiques journaliste révèle des caractéristiques distinctes de flux autophagie chez la drosophile. (A) représentant confocal micrographies de Drosophila lamina de contrôle et DSM^e/e mouches mutantes ubiquitaire exprimant mCherry-GFP-Atg8a (actine-GAL4 > GFP-mCherry-Atg8a) et colorés pour DAPI . Les zones boxed en pointillés de la couche de corps cellulaire du limbe figurent au fort grossissement (à droite). Chiffres indiquent structures représentatives de Atg8a positif tracées dans B et quantifiées dans C. Histogramme (B) parcelle de terrain de l’intensité de fluorescence en unités arbitraires (UA) le long de la ligne ROIs indiqués dans les images de grossissement élevé dans les structures d’a. (C) mCherry-GFP-Atg8 tracées par la densité moyenne de GFP en fonction de l’intensité moyenne mCherry mesurée entre contrôle et DSM^e/e limbe (mesurées à partir de 3 lamelles de chaque groupe de particules). L’intrigue a été divisé en quatre quadrants en utilisant des seuils de déclenchement de GFP = 570 et mCherry = 1800 avec le pourcentage de structures dans chaque quadrant indiquée par le génotype. ()D) Quantification des pourcentages moyens de mCherry-GFP-Atg8 classés dans chaque quadrant dans C (n = 3 lamina). ()E) Quantification du nombre de mCherry-GFP-Atg8 examen par lamina (moyenne ± S.D., n = 3 lamina). (F) analyse logométrique de structures mCherry-GFP-Atg8 observés en contrôle et limbe mouche mutante (moyenne avec IC à 95 %, n = 3 lamina). Student t-test. P < 0,05, **P < 0,01. Sscale barres = 2 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit ici peut servir à solidement et de façon reproductible quantifier les processus biologiques cellulaires visualisées par l’imagerie par fluorescence. Contexte biologique et limitations techniques doivent être examinés attentivement pour guider la conception expérimentale. Marqueurs fluorescents des structures subcellulaires d’intérêt, si immunohistochimiques, teintée ou génétiquement ils sont exprimés, doivent être distinguables au-dessus de fond par la morphologie et l’intensité. Le système UAS/GAL4 est largement utilisé pour exciter l’expression des gènes ciblés chez la drosophile. Les exemples présentés ici utilisé des lignées transgéniques porteuses de GAL4 pilotes pour activer la transcription des protéines fluorescent étiquetées sous le contrôle de l’amplificateur de SAMU pour enquêter sur l’agrégation des protéines et autophagie dans le système nerveux. Si expression simultanée d’un transgène de SAMU expérimental est nécessaire avec un transgène journaliste fluorescent, puis le groupe témoin devrait inclure également co-la surexpression d’un transgène sans conséquence au contrôle pour le dosage de GAL4, par exemple SAMU-GFP ou SAMU-lacZ. Préparation de l’échantillon standard, tel que décrit ici pour la drosophile du système nerveux central et le système visuel, de dissection, fixation, anticorps, par le biais de montage, la coloration est critique pour la quantification et l’imagerie optimale.

Bonnes pratiques qui maximisent le rapport signal-sur-bruit et une gamme dynamique d’imagerie sont nécessaires pour l’analyse semi-automatique et sont primordiaux pour des comparaisons précises entre les groupes expérimentaux. Paramètres d’acquisition image doivent être définis afin que le journaliste n’est pas saturé afin que toute la gamme d’intensité de protéine peut être extraite et quantifiée (Figure 3). Pour des comparaisons quantitatives, l’imagerie doit être effectué avec les mêmes paramètres d’acquisition et de préférence le jour même.

Sélection de ROI, traitement de l’image, fonctionnalité segmentation et extraction de caractéristiques à l’aide de la plateforme open-source ImageJ/Fidji sont application dépendante ; alors que les paramètres initiaux doivent être définies par l’utilisateur, leur application dans l’ensemble de spécimens est minimiser le biais tout en maximisant le rendement de données quantitatives. Il est essentiel de flux de travail soigneusement document et recommandé d’enregistrer une image au format tiff après que chaque étape avec les détails de nom de fichier application traitement. Cela peut être particulièrement utile lorsque vous utilisez des paramètres pour la première fois et la volonté de servir comme point de référence pour assurer la cohérence entre les groupes expérimentaux à chaque étape de traitement de l’image et l’analyse de protocole. Il convient de définir les critères de sélection de ROI à l’aide de marqueurs ou repères anatomiques d’un groupe de contrôle, mais il faut pour s’assurer que les manipulations expérimentales n’altèrent pas les marqueurs ou les points de repère d’une manière qui empêcherait une indication fiable d’un la normalisation du ROI. Une tranche unique ou une z-projection de plusieurs sections peut être choisie pour mieux répondre aux objectifs de l’analyse, où un seul plan focal peut être utile pour améliorer la séparation des structures de voisins, et une z-projection peut être utile pour l’analyse des structures localisé dans toute la masse de tissu. Le type de z-projection utilisée pour la segmentation et analyse de l’image doit être déterminé avec soin et en toute indépendance. Une projection de l’intensité maximale produira une image nette, puisque les structures sont les plus brillants dans les avions où ils sont en discussion et sont généralement bien adaptés pour la segmentation. Analyse d’image peut être acceptable sur une projection maximale, comme dans l’exemple de l’analyse de l’autophagie-lysosome ; Structures de Atg8-positives sont plus petites que la taille de palier utilisée pour l’échantillonnage, ainsi sont représentés plus précisément par l’intensité maximale du plan focal unique d'où ils ont été capturés. Toutefois, pour l’analyse des structures de plus grandes que la taille de palier, une somme de projection qui ajoute tous les pixels avec les mêmes coordonnées xy peut représenter plus précisément les informations de l’intensité de chaque structure. Alors que ce protocole est conçu pour analyser une seule tranche ou une z-projection de plusieurs tranches en 2D, le flux de travail pourrait être facilement adapté pour analyser des structures 3D d’une z-série à l’aide de plusieurs des mêmes outils. Analyse 3D serait souhaitable pour un petit échantillon des structures de forme irrégulière, où une tranche-z qui croise obliquement la structure serait fausser l’analyse.

Prétraitement d’un filtre, comme celles proposées dans le présent protocole, peut réduire le bruit tout en préservant les bords pour faciliter la détection des structures d’intérêt au cours de la segmentation ; bruit et fluorescentes inhomogénéité de marqueur fond sans lissage suffisante se traduira par segmentation excessive, tandis que les paramètres qui entraînent trop flou enlèvera détail et empêcher la détection des contours précis. Segmentation par bassin versant considère l’image comme une surface topographique avec une source d’eau à maxima locaux — pixels de haute intensité dans une image fluorescente — qui inonde jusqu'à ce qu’il rencontre les voisins des zones inondées, où un barrage, ou limite de segment, est construit le²⁰. Le bassin versant du h-maxima utilise un seuil défini par l’utilisateur (dynamique des h-maxima en SCF-MPI-CBG plugin) pour distinguer des maxima locaux significatifs pour éviter trop de segmentation des structures qui ne disposent pas d’un unique maximum local²¹. Le plugin de bassin hydrographique interactive h-maxima mis en œuvre dans ce protocole permet à l’utilisateur d’ajuster la dynamique h-maxima (h), critères d’arrêt du bassin versant global déterminés de seuil d’intensité (T) et arrêt régional critères déterminés par pic inondations (%), tandis que instantanément visualisation des résultats de bassin hydrographique sur une image de sortie pour évaluer qualitativement les performances de la segmentation. Résultats de la segmentation conviendrez étroitement avec la plupart des limites de structure, bien que fois segmentation excessive et séparation incomplète (Figure 1 a, flèches rouges en extraction de caractéristiques) peuvent se produire lorsque le marquage fluorescent est inhomogène ou le tissu est densément peuplée. L’efficacité des étapes de segmentation et analyse semi-automatique peut être utilisée pour augmenter la puissance d’échantillonnage et d’atténuer les pièges de la segmentation.

Après la segmentation et l’extraction de caractéristiques, il est simple extraire des informations morphologiques tels que l’espace, les dimensions et la circularité. En outre, si les images sont collectés adéquatement pour éviter la surexposition, information moléculaire peut également être déduite de l’analyse de l’image par mesures d’intensité. Une fois que les mesures de la pathologie de la maladie neurodégénérative sont extraites et quantifiés par cette approche, ces mesures peuvent servir à régler un certain nombre de questions importantes. Plus précisément, le protocole a démontré la possibilité d’utiliser l’analyse d’image et la quantification des agrégats de protéine pour identifier les facteurs qui influencent l’agrégation des protéines et de corrèlent la distribution, nombre, la taille et la densité des agrégats de protéine ayant un dysfonctionnement neuronal et organismique santé. Axée sur les ratiométrique quantification peut servir à informer l’interaction totale avec composants subcellulaires ou procédés au cours de la progression de la maladie. Bien que biochimique et cytométrie en flux ont été appliquées pour analyser l’interaction des agrégats et avec d’autres structures subcellulaires, lyse cellulaire peut conduire à une perte de protéines, modifiez les propriétés globales et perturber les interactions de protéine-protéine²². mCherry-GFP-Atg8 a été largement utilisé pour surveiller l’autophagie par microscopie de fluorescence, surtout dans les cellules cultivées²³, mais on manque de méthodes d’analyse quantitatives et impartiales. En outre, en vivo analyse à l’aide de la journaliste génétiquement encodé en tandem est difficile et nécessite une préparation fond et tissu génétique très contrôlée. Ce protocole décrit vérifiée méthodologie de préparation du tissu à l’imagerie des pratiques essentielles pour quantifier les compartiments de l’autophagie-lysosome. Bonnes pratiques génétiques, les approches d’analyse image y compris profils d’intensité particule Atg séropositifs et l’analyse de quadrant avec déclenchement par signaux fluorescents individuels, peut se permettre une détection puissante et comparaison entre normal et pathologique autophagie flux in vivo dans des modèles de maladies diverses.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749