Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives d’études biologiques de fluorescence dotés d’imagerie cellulaire d’agrégation des protéines et du flux autophagie dans le système nerveux central de Drosophila modèles de neurodégénérescence.
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Article de méthode
Biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de ImageJ
Dans cet article
Résumé
Résumé
Avec l’augmentation de la prévalence des maladies neurodégénératives, c’est de plus en plus important de comprendre la physiopathologie sous-jacente qui mène à la perte et la dysfonction neuronale. Technologies et outils d’imagerie par fluorescence permettent une analyse inédite des processus neurobiologiques subcellulaires, mais il n’y a toujours un besoin d’approches non biaisées, reproductibles et accessibles permettant d’extraire des données quantifiables des études d’imagerie . Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives de basés sur la fluorescence des études d’imagerie utilisant des modèles de drosophile de la neurodégénérescence. Plus précisément, les auteurs décrivent une approche facile à suivre, semi-automatique à l’aide de Fidji/ImageJ pour analyser deux processus cellulaires : tout d’abord, nous quantifier la teneur totale en protéines et profil dans le lobe optique de drosophile à l’aide de mutant fluorescentes-tag protéines de la huntingtine ; et en second lieu, nous évaluons le flux de l’autophagie-lysosome dans le système visuel de drosophile avec quantification ratiométrique-basé d’un reporter fluorescent en tandem de l’autophagie. Ce qui est important, le protocole décrit ici comprend une étape de segmentation semi-automatique pour s’assurer que toutes les structures fluorescents sont analysées afin de minimiser les biais de sélection et d’augmenter la résolution des comparaisons subtiles. Cette approche peut être étendue pour l’analyse des autres structures biologiques cellulaires et processus impliqués dans la neurodégénérescence, tels que punctums protéiques (granules de stress et complexes synaptiques), compartiments ainsi que membranaires (mitochondries et trafic des vésicules membranaires). Cette méthode fournit un standard, pourtant référence adaptable point pour l’analyse d’images et de la quantification et pourrait faciliter la fiabilité et la reproductibilité dans le champ et finalement renforcer l’interprétation mécaniste de la neurodégénérescence.
Introduction
Maladies neurodégénératives touchent des millions de personnes chaque année et l’incidence augmente avec un vieillissement de la population1. Alors que chaque maladie neurodégénérative a une étiologie unique, agrégation de protéines mal repliées et ventilation du réseau protéostasie caractérisent commune pathologique d’un grand nombre de ces maladies. Élucider comment les perturbations de ces processus fondamentaux et interdépendants se dérègle pour contribuer à la mort neuronale de la dysfonction et de cellules est essentiel pour comprendre les maladies neurodégénératives, en plus de guider les interventions thérapeutiques. Imagerie par fluore....
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Protocole
1. considérations et préparations pour la conception de l’expérience de l’analyse d’Image
- Prédéterminer cellulaire anatomique, adapté, ou marqueurs subcellulaires pour servir de points de repère pour standardiser une région d’intérêt (ROI) dans les trois échantillons différents, par exemple 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), marqueurs membranaires, fluorescentes localisée protéines, etc.
- Sélectionnez un marqueur fluorescent qui peut délimiter examen discret au-delà des niveaux de fond pour la structure d’intérêt.
Remarque : Ce protocole est optimisé pour des structures protéiques (p. ex., agrégats de protéines mal repliées....
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Résultats
Quantification du nombre, espace et intensité des agrégats de Htt mutants fluorescent étiquetés dans le lobe optique de drosophile
Pour étudier l’agrégation des protéines mal repliées dans le système nerveux central d’un modèle drosophile de la maladie de Huntington, DP-tag mutant Htt humaine avec un non pathologiques (SAMU-DP-hHttQ15) ou l’expansion pathologique ( UAS-RFP-hHttQ138) et la membran.......
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Discussion
Le protocole décrit ici peut servir à solidement et de façon reproductible quantifier les processus biologiques cellulaires visualisées par l’imagerie par fluorescence. Contexte biologique et limitations techniques doivent être examinés attentivement pour guider la conception expérimentale. Marqueurs fluorescents des structures subcellulaires d’intérêt, si immunohistochimiques, teintée ou génétiquement ils sont exprimés, doivent être distinguables au-dessus de fond par la morphologie et l’intensité. Le système UAS/GA.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail est soutenu par la Sheila et David Fuente Neuropathic Pain Research Programme Graduate Fellowship (à J.M.B.), les Lois Pope LIFE Fellows Program (à C.L., Y.Z. et J.M.B.), la bourse prédoctorale de Snyder-Robinson Foundation (à C.L.), le Dr John T . La Fondation Macdonald (à C.L.), contrats, subventions du National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 et R56NS095893 (pour R.G.Z.) et par projet d’érudit Taishan (Province du Shandong, République populaire de Chine) (de R.G.Z.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| SYLGARD(R) 184 Kit d’élastomère de silicone | Dow Corning Corporation | PF184250 | Plat de dissection |
| Falcon 35 mm Non traité TC Easy-Grip Style Boîte de Petri bactériologique | Corning | 351008 | Plat de dissection |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Outil de dissection |
| Chlorure de sodium | Sigma | S3014 | Solution |
| PBSPhosphate de sodium dibasique | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Phosphate de potassium monobasique | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton ; X-100 | Sigma | T9284 | Solution de lavage et d’incuba d’anticorps. |
| 37 % Formaldéhyde | VWR | 10790-710 | |
| Fixation Tubes à microcentrifuger jetables (0.5mL, bleu) | VWR | 89000-022 | Fixation, lavage et incuba d’anticorps. ; |
| Micro-lames unies et givrées (25&fois ; 75mm) | VWR | 48312-004 | Lames pour imagerie confocale |
| Micro Cover Glasses, rectangulaires (22× ; 40mm) | VWR | 48393-172 | Lames pour l’imagerie confocale |
| Caoutchouc Ciment | Slime | 1051-A | Montage |
| VECTASHIELD Antifade Montage Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Montage |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm× ; 25.4m) | 3M Company | 810 | Montage |
| Sérum de chèvre normal | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Incubaton |
| d’anticorps DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate) ; | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Coloration aux acides nucléiques. Dissoudre dans de l’eau désionisée pour obtenir une solution mère de 5 mg/mL et conserver à -80°C. Diluer à une concentration de travail de 10-20 &mu ; g/mL dans PBTx. |
| 3.5x-90x stéréo zoom inspection microscope industriel | amscope | sm-1bnz | . Équipé d’un double illuminateur LED à col de cygne 6W |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | Avec SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Microscope à balayage confocal-laser | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
Références
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-imag....
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Réimpressions et autorisations
