Här presenterar vi en metod för att visualisera upptaget av 3 kDa Texas Rödmärkt dextran i auditiva hårceller med funktionella mechanotransduction kanaler. Dessutom kan dextrans av 3-10 kDa användas för att studera endocytos i hår och stödjande celler i organet i Corti.
Hårcellmechanotransduktion (MET) kanal spelar en viktig roll i hörseln. Den molekylära identiteten och den strukturella informationen i marknadsekonomisk status är dock fortfarande okänd. Elektrofysiologiska studier av hårceller visade att MET kanalen har en stor ledning och är genomsläpplig för relativt stora fluorescerande katjoniska molekyler, inklusive vissa styrylfärgämnen och Texas Röd-märkta aminoglykosid antibiotika. I detta protokoll beskriver vi en metod för att visualisera och utvärdera upptaget av fluorescerande dextrans i hårceller i organet i Kortti-utväxter som kan användas för att analysera funktionella MET-kanaler. Vi fann att 3 kDa Texas Rödmärkta dextran specifikt etiketter funktionella auditiva hårceller efter 1-2 h inkubation. I synnerhet etiketter 3 kDa dextran de två kortare stereociliaraderna och ackumuleras i cellkroppen i ett diffust mönster när funktionella MET-kanaler finns. Ytterligare vesicle-liknande mönster av märkning observerades i cellkroppen av hårceller och omgivande stödjande celler. Våra data tyder på att 3 kDa Texas-Red dextran kan användas för att visualisera och studera två vägar för cellulära färgning upptag; en hårcellspecifik ingångsväg genom funktionella MET-kanaler och endocytos, ett mönster som också finns tillgängligt för större dextran.
Innerörats hårceller är de sensoriska celler som detekterar ljud och döljer mekaniskt stimuli i elektriska signaler, som i slutändan tolkas av vår hjärna. Dessa celler har en trappa-formad bunt av tre rader av aktin-baserade glödtrådar, känd som stereocilia, som sticker ut från deras apical region1,2. Den mekaniska stimuli avleda stereocilia filament mot den längsta raden och utlösa öppnandet av mechanotransduction (MET) kanaler3. Öppnandet av MET kanaler leder till en tillströmning av katjoner som depolariserar cellen och följaktligen signalerar utsläpp av synaps blåsor i den basala regionen i hårcellen.
De biofysiska egenskaperna hos MET-kanalen som är nödvändig för hörseln har i stor utsträckning karakteriserats. Dessa kanaler är bland annat katjoniskt selektiva och har en relativt stor kontring (150–300 pS i låg Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Anmärkningsvärt, stora fluorescerande molekyler som FM1-43 och Texas Rödmärkta aminoglykosider är permeant blockerare av MET kanalen, vilket resulterar i deras ackumulering i hårcellen kroppen som kan visualiseras med fluorescensmikroskopi11,12,13,14. Omvänt har den molekylära identiteten och strukturen hos MET-kanalen och dess genommektväg förblivit svårfångad. Ökande experimentella bevis tyder på att transmembrane-liknande kanal protein 1 (TMC1) är en komponent i MET kanalen i mogna hårceller15,16,17,18,19. Mutationer i transmembrane-liknande kanal 1 (TMC1) ändra MET kanal egenskaper19,20,21,22 och orsaka dövhet. Dessutom lokaliserar TMC1 till platsen för MET-kanalen18,23 och interagerar med den spets-länk som ansvarar för att överföra den mekaniska kraften till MET-kanalen24,25. Dessutom har den senaste bioinformatikanalysen identifierat TMC-proteinerna som evolutionära relaterade till de mechanokänsliga kanalerna TMEM63/OSCA-proteiner och TMEM16-proteinerna, en familj av kalciumaktiverade kloridkanaler och lipidförvrängningar26,27,28. En strukturell modell av TMC1 baserat på förhållandet mellan dessa proteiner visade förekomsten av en stor hålighet vid protein-lipid gränssnitt27. Detta hålighet hyser de två TMC1 mutationer som orsakar autosomal atypiska dominerande hörselnedsättning (DFNA36)27,29,30,31,32, och selektiv modifiering av cystein mutanter för rester i hålrummet ändra MET kanal egenskaper28, vilket tyder på att det kan fungera som permeation väg MET kanalen. Den stora storleken på denna förutspådde hålighet i TMC proteiner kan förklara förmågan hos stora molekyler att genomsyra MET kanalen. För att testa förutsägelsen att MET-kanalen innehåller en ovanligt stor permeationsväg och för att tänja på gränserna för storleken på håligheten som observerats i TMC1, utvecklade vi ett protokoll för att utföra upptag experiment i organet i Korti explants med en större molekyl, 3 kDa dextran fluorescerande märkt med Texas Red.
Dextran är en komplex grenade polysackarider bestående av många D-glukosmolekyler bundna av alfa-1,6 glykosidiska kopplingar. Dess höga löslighet i vatten, låg celltoxicitet och bioinertitet gör det till ett mångsidigt verktyg för att studera flera cellulära processer. Dessutom finns dextran i ett brett spektrum av storlekar och fluorescerande märkta med fluorofforer av flera färger. Fluorescerande märkta dextrans används ofta i cell och vävnad permeabilitet forskning33,34, att studera endocytos i flera cellulära system35,36, och för neural spårning37,38. Inom hörselfältet har dextranmolekyler också använts för att bedöma störningarna i cellcellkorsningen och förlusten av hörselsensorisksensorisk tjusateletintegritet efter exponering för intensivt buller i chinchillaorganet i Corti39,40.
I detta arbete utnyttjade vi egenskaperna hos några av de minsta (3 och 10 kDa) fluorescerande dextrans att utföra upptag experiment i murine innerörat hårceller och utforska storleken på permeation vägen för innerörat hårcell MET kanal. Dessutom använde vi en laser-scanning confocal mikroskop (LSM) 880 utrustad med en Airyscan detektor för att visualisera och lokalisera fluorescerande dextran på stereocilien och cellkroppen av auditiva hårceller.
Detta protokoll beskriver hur man utför upptag experiment i murine organ Corti explants med 3 kDa dextran Texas Red. Målet med denna metod är att testa om molekyler större än andra tidigare testats också kunde specifikt märka hörselhårceller och genomsyra genom MET-kanalen. Liknande experimentella protokoll har tidigare använts för att utvärdera permeabiliteten hos hårceller till andra fluorescerande färgämnen som FM1-43 (0,56 kDa)12,19,…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Vincent Schram från NICHD mikroskopi och bildbehandling kärna för att bistå i confocal bild förvärv, och Tsg-Hui Chang för ovärderlig hjälp med koloni förvaltning och möss vård. Denna forskning stöddes av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, Bethesda, MD, till K.J.S. A.B. stöddes av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, och av en Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship från intramural forskningsprogram av NIDCD.
#1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |