Summary
CENP-A ubiquitylation är ett viktigt krav för CENP-A nedfall vid centromeren, ärvt genom dimerization mellan celldelning, och oumbärlig för cellens livskraft. Här beskriver vi massa spektrometri analys för att identifiera ubiquitylation av EYFP-taggade CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.
Abstract
Att studera strukturen och dynamiken i kinetochores och centromeres är viktigt för att förstå kromosomal instabilitet (CIN) och cancer progression. Hur kromosomernas placering och funktion hos en centromer (dvs. centromeridentitet) bestäms och deltar i korrekt kromosomsegregering är en grundläggande fråga. CENP-A föreslås vara icke-DNA-indikator (epigenetiska märke) av centromere identitet, och CENP-A allestädes närvarande för CENP-A nedfall vid centromeren, ärvt genom dimerization mellan celldelning, och oumbärlig för cell livskraft.
Här beskriver vi masspektrometri analys för att identifiera allestädes närvarande av EYFP-CENP-A K124R mutant tyder på att ubiquitylation vid en annan lysin induceras på grund av EYFP märkning i CENP-A K124R mutant protein. Lysin 306 (K306) allestädes närvarande i EYFP-CENP-A K124R identifierades framgångsrikt, vilket motsvarar lysin 56 (K56) i CENP-A genom masspektrometri analys. En varning diskuteras i användningen av GFP/EYFP eller märkning av protein med hög molekylvikt som ett verktyg för att analysera funktionen hos ett protein. Nuvarande tekniska gränsen diskuteras också för detektion av allestädes närvarande band, identifiering av platsspecifika allestädes närvarande och visualisering av ubiquitylation i levande celler eller en specifik enda cell under hela cellcykeln.
Den metod för masspektrometri analys presenteras här kan tillämpas på mänskliga CENP-A protein med olika taggar och andra centromere-kinetochore proteiner. Dessa kombinatoriska metoder som består av flera analyser/analyser kan rekommenderas för forskare som är intresserade av att identifiera funktionella roller för ubiquitylation.
Introduction
I de flesta eukaryoter måste spindelmikrotubuli fästa på en enda region i varje kromosom, som kallas centromere. Kinetochore är ett komplex av proteiner som ligger vid centromere. Att studera tidpunkten för centromer och kinetochoreproteinets rörelser och strukturen hos kinetochores och centromer är viktigt för att förstå kromosominstabilitet (CIN) och cancerprogression. De viktigaste frågorna är hur kromosomiseringen och funktionen hos en centromer (dvs. centromeridentitet) bestäms och hur de deltar i korrekt kromosomsegregering. I de flesta arter definierar förekomsten av en speciell nukleosom som innehåller ett specifikt histonliknande protein som kallas CENP-A centromeridentiteten. Därför föreslås att CENP-A är icke-DNA-indikatorn (epigenetiskt märke) för centromeridentitet. Det är viktigt att belysa mekanismen för hur CENP-A definierar centromeridentiteten hos människor.
Holliday junction recognition protein (HJURP) är CENP-A-specifika förkläde som deponerar CENP-A i centromeriska nukleosomer1,2,3. Vi har tidigare rapporterat att CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase krävs för CENP-A ubiquitylation på lysin 124 (K124) och centromere lokalisering4. Dessutom visade våra resultat att centromerrekrytering av nyligen syntetiserade CENP-A kräver redan existerande allestädes närvarande CENP-A5. Således tillhandahölls en modell som tyder på att CENP-A allestädes närvarande ärvs genom dimerization mellan cell divisioner.
I motsats till våra och de av Yu et al., negativa resultat om CENP-A och dess centromeric lokalisering publicerades nyligen6. I artikeln hävdades att CENP-A-modifieringar av lysin 124 (K124) kan ges ut för anläggning, underhåll och långsiktig funktion av mänskliga centromerer, baserat på deras negativa resultat som visar att mutationen av K124R inte påverkade CENP-A centromere lokalisering varken cellens lönsamhet6. Det finns dock tillräckligt med utrymme för debatt i deras resultat och slutsatser, och vi har redan beskrivit vilket problem som skulle kunna finnas i deras tidigare publikation7. Uppmärksamhet bör ägnas åt att de smält proteiner med CENP-A, som har mycket större molekylvikter än storleken på endogena CENP-A: t.ex.-/F K124 ubiquitin förväntas inte binda direkt till HJURP baserat på strukturella förutsägelser4, men tillägg av mono-ubiquitin förutspås ha en inverkan på proteinkonformation av CENP-A. Proteinet i CENP-A konformation kan ändras genom närvaron av ett stort fusionsprotein, och denna konformationsförändring kan maskera de strukturella förändringar som orsakas av förlusten av allestädes närvarande. Vi föreslår att fusion av stora protein inducerar allestädes närvarande vid en lysin än K124 i EYFP-CENP-A K124R mutant och denna ubiquitylation på en annan plats hämmar/maskerar den ursprungliga K124R enda mutant fenotyp. Bevis för att allestädes närvarande vid olika lysin i CENP-A K124R mutantprotein med en stor tagg protein (EYFP) rapporterades i vår tidigare publikation8. Det konstaterades att EYFP märkning inducerar allestädes närvarande av en annan lysin plats EYFP-CENP-A K124R och att EYFP-CENP-A K124R mutant binder till HJURP. Som ett resultat hämmar denna allestädes närvarande vid en annan plats/maskerar den ursprungliga K124R-mutantfenotypen, och både EYFP-CENP-A WT- och K124R-mutanter visade centromerlokalisering (vi använde och jämförde pBabe-EYFP-CENP-A WT och K124R mutant, tillsammans med pBabe-EYFP-kontroll.). Resultaten visade att Flag-taggade eller untagged CENP-A K124R mutanter är dödliga men kan räddas av en monoubiquitin fusion, vilket tyder på att CENP-A allestädes närvarande är oumbärlig för cellens livskraft.
Under de senaste åren har många studier utvecklat olika analyser för att identifiera posttranslationala modifieringar (PTMs) av CENP-A-protein och andra centromere-kinetochore proteiner både in vivo och in vitro9,10,11. Analogt med PTMs av histonproteiner som är en viktig mekanism som reglerar funktionen av kromatin, PTMs av centromeric kromatin komponenter är också involverade i en viktig mekanism för att reglera den övergripande strukturen och funktionen av centromeres. Majoriteten av CENP-A PTM platser är specifika för CENP-A-innehållande nukleosomer, även om några av dem bevaras i histon H3, vilket tyder på att modifiering av dessa rester bidrar till centromere-specifika funktionen. PTMs av CENP-A inklusive fosforylering, acetylation, metylering och ubiquitylation rapporterades tidigare9, vilket tyder på att CENP-A utsätts för en mängd olika PTMs och deras kombinatoriska arrayer på dess amino ändstation och C-ändstation histon-vik-domän. Betydelsen av CENP-A ändringar i flera funktioner avslöjades av många grupper, inklusive vår. Dessa funktioner omfattar CENP-A-nedfall i centromerer, proteinstabilitet och rekrytering av CCAN (konstituerande centromere-associerade nätverk)9. Begränsade studier och resultat av CENP-A PTMs är dock förformade där jämförelser görs med en av kanoniska histoner som direkt eller indirekt reglerar deras funktion. Tekniska rapporter som fokuserar på metoden för att identifiera dessa CENP-A PTMs är också begränsade.
Eftersom CENP-A ubiquitylation krävs för CENP-A nedfall vid centromere12, ärvt genom dimerization mellan celldelning5, och oumbärlig för cellens livskraft8, metoden för att identifiera CENP-A allestädes närvarande i framtiden för att studera den funktionella aktiviteten, positionering och struktur centromeren. Därför beskriver vi här masspektrometrianalys för att identifiera allestädes närvarande av EYFP-CENP-A K124R mutant vilket tyder på att EYFP-märkningen inducerar allestädes närvarande vid en annan lysin i CENP-A K124R mutantprotein8. Protokoll för andra kontrollanalyser och analyser (immunofluorescensanalys, koloniutväxtanalys och in vivo ubiquitylation-analys) presenteras också för att diskutera resultatet av större masspektrometrianalys ordentligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling och retrovirustransfsektion av pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner
OBS: EYFP-CENP-A uttrycks från pBabe-EYFP-CENP-A på en liknande proteinnivå som endogen CENP-A. Totalt cellulärt CENP-A-protein ersätts med detta EYFP-CENP-A efter störningar av CENP-A-/F-allelen av Cre recombinase som i RPE-1 CENP-A-/- celler6.
- Beredning av supernatant som innehåller retrovirus med 293T förpackningsceller.
- Dag 0: Sprid 293T förpackningsceller på 6-brunnsodlingsplattan (1,0 x 106 celler/brunn). Odlingsceller i högglukos DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin. Inkubera cellerna vid 37 °C i en atmosfär av 5% CO2 för 24 timmar.
Obs: För optimalt resultat, empiriskt bestämma celldensiteten att använda i sådd. - Dag 1: Förbered transfection reaktion runt 23 h efter spridning (24 h punkt är 0 h punkt av transfection). Transfect uttryck plasmid för varje pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) och pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (se tabell 1).
- Välj en kombination av hjälp-/förpackningsplasmider som anges i tabell 2 och lägg till dem i rör som innehåller en av de plasmider som anges ovan. Det finns mestadels dessa 3 kombinationer för hjälpare/förpackningsplasmider (tabell 2). Varje kombination arbetade i dessa experiment och visade liknande transfection effektivitet.
- Förbered 50 μL reducerat serummedium och blanda 2,0 μg av varje pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) och pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (se tabell 1) och lägga till en kombination av hjälp-/förpackningsplasmider som anges i tabell 2 (se nedan). Inkubera denna blandning i rumstemperatur i 5 min. Denna blandning är lösning A.
- Förbered ytterligare 50 μl reducerat serummedium och blanda 1,5 μl transfectionreagenser I respektive II (Tabell över material). Inkubera denna blandning i rumstemperatur i 5 min. Denna blandning är lösning B.
OBS: Tillsätt eventuellt endast 6,0 μl transfsektionsreagens III (polyetenimin [PEI]; 1,0 mg/ml) i lösning B eller tillsätt 6,0 μl transfsektionsreagens III utöver transfsektionsreagenser I och II i lösning B (Tabell över material). - Blanda lösningar A och B tillsammans och inkubera i rumstemperatur i 15 min.
- Efter tvättning av de odlade cellerna en gång med PBS, tillsätt blandningen av lösningar A och B (dvs DNA-lipidkomplex) direkt till varje brunn av 6-brunnsodlingsplattan som har 500 μL reducerat serummedium. Den slutliga koncentrationen av plasmid är 3,3 μg/ml.
- Efter inkubera cellerna vid 37 °C i en atmosfär av 5% CO2 för 4,5 h, ändra medium till högglukos DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin. Sätt 2 ml/brunn av odlingsmedium efter medelbytet i 6-brunnskulturen plattan.
- Odla cellerna vid 37 °C i en atmosfär av 5% CO2 för 48 h efter transfection. Utför retrovirusinfektion dag 3 med hjälp av supernatant som innehåller retrovirus.
- Dag 0: Sprid 293T förpackningsceller på 6-brunnsodlingsplattan (1,0 x 106 celler/brunn). Odlingsceller i högglukos DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin. Inkubera cellerna vid 37 °C i en atmosfär av 5% CO2 för 24 timmar.
- Retrovirusinfektion av CENP-A-/F RPE-1-målceller.
- Dag 2: En dag före infektion, sprida CENP-A-/F RPE-1 målceller att transfect i 6-brunnen kultur väl (2,25 x 105 celler / väl). Odlingsceller i DMEM: F12 medium (Tabell över material)med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
OBS: Sprid celler för kolonin utväxt analyser, immunofluorescens, och västra blot analys som kontroll. För optimalt resultat, empiriskt bestämma celldensitet att använda i sådd. - Dag 3 (virusets infektionsdag): Vid 48 timmar efter transinfektion av 293T förpackningsceller, samla in det supernatantinnehållande viruset och filtret genom 0,45 μm filter (använd inte ett 0,2 μm filter som kommer att skjuvvirushölje). Det rekommenderas att använda polyetersulfone (PES) filter.
- Infektera CENP-A-/F RPE-1 celler med viruset. För en brunn av 6-brunnsodlingsplattan, tillsätt 1 ml färska medier, 1 ml virussupernatant och polybrene till en slutlig koncentration på 8 μg/ml. Inkubera CENP-A-/F RPE-1 celler vid 37 °C i en atmosfär av 5% CO2 i 4 dagar fram till dag 7 efter transfection.
OBS: Inkubationstiden för CENP-A-/F RPE-1-celltillväxt måste bestämmas empiriskt genom att analysera optimala resultat.
- Dag 2: En dag före infektion, sprida CENP-A-/F RPE-1 målceller att transfect i 6-brunnen kultur väl (2,25 x 105 celler / väl). Odlingsceller i DMEM: F12 medium (Tabell över material)med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
2. Immunofluorescensanalys av celler som innehåller pBabe-EYFP-CENP-A
- Dag 7: 4 dagar efter retrovirusinfektion av pBabe-EYFP-CENP-A konstruerar, ta bort odlingsmediet genom strävan. Skölj cellerna en gång med TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 125 mM NaCl). Applicera TBS på sidan av kulturbrunnarna för att undvika att störa cellernas yta.
OBS: Den optimala tidspunkten för cellfixering måste bestämmas empiriskt. Immunofluorescenssignaler från både EYFP-CENP-A WT och K124R kan detekteras vid centromeren minst 4 dagar efter retrovirusinfektion av pBabe-EYFP-CENP-A-konstruktioner även utan Cre-infektion (data visas inte, figur 1C-E för data med Cre-infektion). - Utför metanolcellfixering och immunfluorescensfärgning enligt beskrivningen ovan13.
- Som primära antikroppar använder en anti-GFP-antikropp (1:1 000 utspädning) och en anti-CENP-B-antikropp (utspädningsförhållande på 1:200) för en centromerplatsmarkör i TBS som innehåller 4 % getserum (se Tabell över material för använda antikroppar).
- Ta bort överflödigt monteringsmedium med en pappershandduk och försegla kanterna på täckslipen med nagellack i sista steget.
- Se den tidigare beskrivna metoden13 för immunofluorescensbildsobservation, förvärv, kvantifiering och analys av återstående signaler från EYFP-CENP-A vid centromeren.
- Utför bildförvärv, bearbetning inklusive dekontrering, kvantifiering och analys med softwares A eller Softwares B1 och B2 (se Tabell över material). Använd eventuellt Softwares C1-C3 (se Tabell över material) för ett konfokalt laserscanningsmikroskop.
Se 2.6.1 i tilläggskodningsfiler för alla kommandon som används i programvara A. Se 2.6.2 i tilläggskodningsfiler för alla kommandon som används i Softwares B1 och B2.
3. Koloniuppväxt analyser med pBabe-EYFP-CENP-A efter retro-Cre virusinfektion
OBS: Anledningen till att utföra denna analys är att jämföra cellens livskraft mellan EYFP-CENP-A WT och K124R mutant efter störningar av CENP-A-/F allel av Cre rekombination (efter byte av totalt cellulärt CENP-A protein).
- Retrovirus transfection av pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner.
- Utför retrovirustransfection av CENP-A-/F RPE-1 celler som beskrivs i avsnitt 1. Odlingsceller i DMEM: F12 medium med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin för 72 h efter virusinfektion.
- Tre dagar efter retrovirusinfektion av pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner (på dag 6), tillsätt blasticidin S (10 μg/mL) i brunnar som innehåller transfected celler som ska användas för koloninsvalsanalys och kontrollexperiment. Celler odlas minst 14 dagar efter virusinfektion i närvaro av blasticidin S. Ändra mediet som innehåller blasticidin S var femte dag.
OBS: Om cellerna når ca 80% sammanflödet före sådd för kolonanalysen (3.2.7. och 3.2.8), passage cellerna på 1:2 och 1:5 förhållandet genom trypsinization och plätering i en 6 väl kultur platta. - Samla celler för västra blot på dag 7 för att bekräfta proteinuttrycket av pBabe-EYFP-CENP-A konstruerar utan Cre-infektion. Utför western blot-analys enligt beskrivningen i avsnitt 4. Resultaten visas i figur 1B (körfält 1-4).
- För koloniutväxtanalys med Cre virusinfektion, hålla cellerna växer i 14 dagar efter virusinfektion i närvaro av blasticidin S (dvs. växa celler i blasticidin S som innehåller medium fram till dag 17 för de resultat som presenteras här).
- Retro-Cre virusinfektion av pBabe-puro-Cre
Dag 0 i steg 3.2.1 motsvarar dag 13 i avsnitt 3.1.- Dag 0 till dag 3: Utför retrovirustransfinfektion av CENP-A-/F RPE-1 celler med pBabe-puro-Cre (B3027) som uttryck plasmid (se avsnitt 1 för detaljer). Se till att blasticidin S (10 μg/ml) tillsätts i odlingsmediet.
- Dag 4: Trypsinize celler för att lossa den från plattan. Platta 500 eller 5000 celler i tre exemplar i 6-brunnsodlingsplattan. Odlingsceller i DMEM: F12 medium med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
- Dag 5: Tillsätt blasticidin S (10 μg/ml) till odlingsmediet. För 5 000 eller 500 cellers plätering, välja celler med blasticidin S (10 μg/ml) 3-24 dagar (fram till dag 14 i [3.2.7]) eller 3-28 dagar (fram till dag 18 i [3.2.8]) efter virusinfektion av konstruktioner (pBabe-EYFP-CENP-A konstruerar).
OBS: I denna koloni utväxt analys, transfection av pBabe-puro-Cre läggs tillsammans med transfection av av pBabe-EYFP-CENP-A. Transfection av pBabe-EYFP-CENP-A utförs i 3.1. Transfection av pBabe-puro-Cre utförs i 3.2.1. - Dag 10 (7 dagar efter retro-Cre virusinfektion): Samla celler för västra blotting analys för att bekräfta proteinutarmning av endogena CENP-A efter retro-Cre virusinfektion och/eller protein uttryck för pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner på samma dag 10.
- Utför västra blotting enligt beskrivningen i avsnitt 4 samma dag 10. Resultaten visas i figur 1B (körfält 5-7).
- Utför immunofluorescensanalys (avsnitt 2 ovan) för att bekräfta att både EYFP-CENP-A WT och K124R lokaliserade till centromeren 7 dagar efter inaktivering av den återstående endogena CENP-A-allelen. Resultaten visas i figur 1C-1E.
- Dag 14: Utför kolonins utväxtanalys med plattan sådd med 5000 celler. Fixera celler i 10 min i metanol och bets i 10 min i en kristallviolett lösning (2,3% kristallviolett, 0,1% ammoniumoxalat, 20% etanol (se figur 2B). Räkna antalet kolonier som använder OpenCFU-programvaran (se figur 2C).
- Dag 18: Använd plattan sådd med 500 celler. Fäst- och fläckceller enligt beskrivningen i steg 3.2.7 (se figur 2B). Räkna antalet kolonier (se figur 2C).
4. Western blot analys med pBabe-EYFP-CENP-A
OBS: Se den tidigare beskrivna metoden13 för Western blot-analys med antikroppar som anges i figur 1B och figur 2A och tabell över material för EYFP-CENP-A-proteiner.
- Isolera proteiner genom att lysing cellerna odlas med olika virusinfektion. Använd sedan 20 μg protein i en brunn av SDS PAGE gel. Överför proteinerna till ett PVDF-membran enligt beskrivningen tidigare13.
- Tvätta membranet 3x efter inkubationer med primär-sekundära antikroppar. Detektera och analysera proteinbanden på membranet med det infraröda bildsystemet och/eller chemiluminescence imager för immunblotdetektering. Dessa resultat visas i figur 1B och figur 2A.
- För det infraröda bildsystemet för att upptäcka och analysera proteinbanden, se steg 4.2.1 i kompletterande kodningsfiler.
- Använd chemiluminescence imager för att upptäcka och analysera proteinband, se steg 4.2.2 i kompletterande kodning filer. För detta system, använd en extremt känslig förbättrad chemiluminescent (ECL) substrat (Tabell över material).
- Alternativt, använd västra blot strippning buffert för att ta bort förinkuberade antikroppar från PVDF membranet och reblot det med olika antikroppar för nästa tur av västerländsk analys. Empiriskt bestämma den optimerade inkubationstiden och temperaturen att använda.
5. Cellodling, transfection och in vivo ubiquitylation analyser med pQCXIP-EYFP-CENP-A
OBS: Proteinnivån hos EYFP-CENP-A uttryckt från pQCXIP-vektor är ~ 10x högre än den endogena CENP-A-proteinnivån. Användningen av denna vektor underlättar immunoprecipitation av en högre mängd EYFP-CENP-A proteiner, observation av ubiquitylation band av EYFP-CENP-A, och identifiering av ubiquitylation av EYFP-märkt CENP-A (EYFP-CENP-A) protein genom masspektrometri analys.
- Transfection för in vivo ubiquitylation analyser med pQCXIP-EYFP-CENP-A.
- Frö 36,2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 celler i en 10 cm vävnadsodlingsskål. Odlingsceller i högglukos DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
Obs: För optimalt resultat, empiriskt bestämma celldensiteten som ska användas vid sådd. Förbered minst 2 rätter för ett immunoprecipitation (IP) prov för att få minst 1 mg totalt protein. - Inkubera cellerna vid 37 °C i en atmosfär av 5% CO2 för 18 timmar.
- Vid 17 h efter sådd, förbereda transfection reagenser.
- Gör lösning A genom att blanda 6,7 μg plasmid för varje pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (tabell 1) i 335 μL reducerat serummedium, och inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Tillsätt 6,7 μg plasmid pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) till alla prover.
Obs: Alla vektorer listas i tabell 1. - Gör lösning B genom att blanda 10,1 μL transfsektionsreagenser I respektive II i 335 μL reducerat serummedium och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
OBS: Ett valfritt steg är att lägga till endast 40,2 μl transfinfektionsreagens III (polyetenimin [PEI]; 1,0 mg/ml) i lösning B eller tillsätt 40,2 μl transfectionagensreagens III utöver transfinfektionsreagenser I och II i lösning B (Tabell över material). - Blanda lösningar A och B tillsammans och inkubera i rumstemperatur i 15 min.
- Efter tvättning av de odlade cellerna en gång med PBS, tillsätt blandningen av lösningar A och B (dvs. DNA-lipidkomplex) direkt till var och en av de enskilda 10 cm vävnadsodlingsskålen som har 3,35 ml μL reducerat serummedium.
OBS: Den slutliga koncentrationen är 1,67 μg/ml plasmid. - Inkubera cellerna vid 37 °C-inkubatorn med 5% CO2 för 4,5 timmar. Efter 4,5 h, ändra medium till högglukos DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
- Odling cellerna vid 37 °C med 5% CO2 för 48 timmar efter transfection. Samla celler för cell lysates förberedelse.
- Frö 36,2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 celler i en 10 cm vävnadsodlingsskål. Odlingsceller i högglukos DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
- Beredning av protein A pärlor bundna med anti-GFP-antikroppar.
- Ta 25 μL (50% v/v) protein A-pärlor för en reaktion av immunprecipitation (IP). Tvätta med buffert A1 (Tabell över material) minst 3x för att avlägsna EtOH, och gör 50% lösning med buffert A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% deoxycholate; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; komplett EDTA-fri proteashämorreagens).
- Tillsätt 2,0 μl anti-GFP-antikropp (Anti#76: Hemlagad antikropp) till pärlorna som beretts ovan och tillsätt 10x buffertvolym A1 jämfört med nettopärlorsvolym.
- Utför end-to-end rotation vid 4 °C för 4-18 h. Den optimala tidslängden för end-to-end-rotation måste bestämmas empiriskt baserat på immunoprecipitationens effektivitet.
- Centrifugera pärlorna vid 100 x g i 1 min och ta bort det obundna supernatanten. Lägg till buffert A1 för att återskapa en 50% (v/v) lösning av pärlorna. Använd 25 μL (50% v/v) av denna lösning för en reaktion av IP.
- Immunoprecipitation (IP) med protein A sepharose pärlor bundna med anti-GFP antikroppar.
- Lyse celler som erhållits i steg 5.1.9 i buffert A1 genom ultraljudsbehandling och frysa-tina process.
- Mät proteinkoncentrationer och normalisera proteinmängder mellan olika IP-prover. Ta bort 5 % av provet från varje rör för att köras som 5 % inmatningsprov i SDS-PAGE.
OBS: 5% Insatsprovet kan frysas i flytande kväve och lagras vid -80 °C, om det inte laddas inom en dag. - Blanda resten av 95% lysate med 25 μL (50% v/v) protein A pärlor bundna till anti-GFP-antikroppar som förbereddes i steg 5.2. Utför end-to-end rotation vid 4 °C för 4-18 h.
OBS: Den optimala tidslängden för end-to-end-rotation måste bestämmas empiriskt. - Centrifugprotein A pärlor med proteinet bundet till det (dvs. immunoprecipitates) med 100 x g i 1 min, och ta bort supernatanten. Tvätta immunoprecipitates med buffert A1 genom centrifugering vid 100 x g i 1 min. Utför detta steg 4x.
- Blanda 5% Input och resten av 95% immunprecipitates med 2x och 4x SDS-PAGE lastbuffert14, respektive. Koka dessa två prover för 5 min och sedan ladda dem på en 10,0% denaturering SDS-polyakristärgel för elektrofores i olika körfält. Använd större SDS-PAGE gel (t.ex. 17 cm x 15 cm) för elektrofores. Om proverna körs i mindre gel, kanske det inte är möjligt att observera tydliga/ skarpa allestädes närvarande band.
- Utför en analys av västra blot enligt beskrivningen i avsnitt 4 med hjälp av de antikroppar som anges i föregående rapport8. Resultatet visas i figur 2A.
- Använd västra blot stripping buffert för att ta bort de förinkuberade antikropparna från PVDF membranet och reblot det med olika antikroppar för nästa omgång av västra blot analys.
6. Masspektrometri för att identifiera ubiquitylationsstället för EYFP-CENP-A K124R-mutanten
- Transfection för masspektrometrianalys med pQCXIP-EYFP-CENP-A.
- Seed CENP-A-/F RPE-1 celler i en 10 cm vävnadsodlingsskål. Kontrollera att celltätheten är 36,2 x 105 celler per maträtt. Odlingsceller i högglukos DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin. Förbered minst 20 rätter för ett immunoprecipitation (IP) prov, för att erhålla minst 10 mg totalt protein (se 5.3).
Obs: För optimalt resultat, empiriskt bestämma celldensiteten att använda i sådd. - Inkubera cellerna vid 37 °C i en atmosfär på 5% CO2 för 18 timmar. Förbered transfinfektionsreagenserna ~ 23 h efter spridning (24 h punkt är 0 h punkt av transfektionen).
- Vid 17 timmar efter sådd, förbereda transfection reagenser och transfect celler som (4.1.3). Transfected celler har pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) och pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
- Inkubera cellerna vid 37 °C i en atmosfär av 5% CO2 för 48 timmar efter transfection. Samla celler för cell lysates.
- Lyse celler i buffert A1 och utföra immunprecipitation som (5.2) och (5.3). Kör dessa två av immunoprecipitation lysates enligt följande (6.1.6) och (6.1.7).
OBS: I (6.1.6), kör provet i standardtris-glycingeler. I (6.1.7), kör provet i de kommersiellt tillgängliga 4%-12% Bis-Tris proteingeler. Se även Diskussion. - Förvara ett prov för 10% av de totala immunoprecipitantsna för att bekräfta EYFP-CENP-A ubiquitylation och för att exakt bestämma positionen för ubiquitinated EYFP-CENP-A enligt beskrivningen i avsnitt 5. Kör detta prov i standard Tris-glycine geler. SDS-PAGE och western blot utfördes som (5.3).
- Håll ett annat prov för 90% av de totala immunprecipitanterna för masspektrometrianalys. Kör detta prov inom två brunnar av de kommersiellt tillgängliga 4%-12% Bis-Tris proteingeler. Utför Coomassie blå färgning med Coomassie blå lösning. Punktskatter och skär ut gelregionen på 50-70 kDa (förmodad mono-UB-EYFP-CENP-A K124R region). Använd denna gel region för masspektrometri analys.
- Seed CENP-A-/F RPE-1 celler i en 10 cm vävnadsodlingsskål. Kontrollera att celltätheten är 36,2 x 105 celler per maträtt. Odlingsceller i högglukos DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin. Förbered minst 20 rätter för ett immunoprecipitation (IP) prov, för att erhålla minst 10 mg totalt protein (se 5.3).
- Masspektrometri analys med hjälp av in-gel matsmältningen.
- Tärna varje gelskiva av intresse i små bitar (1 mm2) och placera den i 0,5 ml proteinlåg bindningsrör.
- Tvätta med 100 μL 50% (v/v) acetonitril i 25 mM NH4HCO3,virvel 10-15 min, snurra ner, kasta supernatanten, upprepa 3x.
- Koncentrera provet med bänkskiva vakuum koncentrator i 30 min för att torka gel bitar.
- Tillsätt 10 μL 10 ng/μL sekvenseringsgrad trypsin och låt gelbitarna rehydrera i 5 min.
- Tillsätt 25 mM NH4HCO3 precis tillräckligt för att täcka gelbitarna, smält vid 37 °C över natten.
- Överför det smälta supernatanten till ett rent 0,65 ml silikonrör. Tillsätt 50 % (v/v) acetonitril/5% (v/v) myrsyra (30 μL eller tillräckligt för att täcka), virvel 10 min, snurra och överför till samma extraktionsrör. Upprepa 3x.
- Tillsätt 10 μL acetonitril till gelbitarna, virvel 5 min och snurra ner. Överför supernatanten till samma rör.
- Koncentrera proverna med bänkskiva vakuumkoncentrator till 2 μL, tillsätt 8 μL 3% (v/v) acetonitril /2% (v/v) myrsyra till provet, virvel i 15 min och snurra ner vid 16 000 x g i 30 min. Proverna är klara för masspektrometrianalys.
- Utför MS-datainsamling med LC-MS/MS med hjälp av ett flytande kromatografisystem (Tabell över material) tillsammans med ett masspektrometriinstrument ( Tabell övermaterial).
- Injicera 8 μL rekonstituerat prov på en rplc-kolonn (reverse phase liquid chromatography).
- Separera peptiderna med en 2-80% lutning av lösningsmedel B i 60 min. Se till att lutningen består av en ökande andel lösningsmedel B från 2% till 22% i 40 min, 22% till 35% lösningsmedel B i 12 min, sedan klättra till 80% lösningsmedel B i 4 min, och slutligen hålla på 80% lösningsmedel B under de senaste 4 min. Ställ in flödeskonstanten på 300 nL/min.
OBS: Lösningsmedel A innehåller 0,1% myrsyra och 2% acetonitril, lösningsmedel B innehåller 0,1% myrsyra och 98% acetonitril. Alla koncentrationer visas som volym/volym. - Samla in masspektrometridata med hjälp av databeroende insamlingsläge. Kortfattat, samla MS spectra i 350-1500 m / z för 250 ms. Välj Top 50 intensiva prekursorer med laddning 2-5 för ytterligare fragmentering. Samla MS/MS-spektra i 100–2000 m/z för 100 ms, Uteslut prekursorjoner från omväljande för 15 s.
- För databassökning öppnar du den kommersiella programvaran (se Tabell över material)för att analysera masspektrometridata på skrivbordet.
- Om du vill göra en ny sökning klickar du på knappen "LC" på den övre menyn. Klicka sedan på knappen "Lägg till"för att ladda upp de ursprungliga MS-rådatafilerna.
- Välj "Human Protein ID" i "ParagonMetoden" som databassökningsmetod. Sök i de ursprungliga MS-rådatafilerna mot UniProt Homo Sapiens-databasen (som innehåller 160 566 sekvenser, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
- Ställ in sökparametrar som följande: välj trypsin som matsmältningsenzym, tillåt upp till 3 saknade klyvningar, 4 ändringar och 2-5 laddningar per peptid. Ställ in massfel upp till 20 ppm för den första sökningen och 0,02 Da för fragmenterade joner. Ange tröskelvärden för felaktig identifieringshastighet (FDR) för protein-, peptid- och modifieringsställen som är mindre än 1 %. Ställ in alla andra parametrar i programvaran på standardvärden (se figur 3 för masspektrometrianalys).
- Klicka på knappen "Spara som" till höger på den övre menyn, välj en mapp för att lagra sökresultaten, ange söknamnet och klicka på knappen "Spara".
- Klicka på knappen "Process" till höger på den övre menyn för att starta sökningen. När sökningen är avslutad lagras data med det angivna söknamnet automatiskt i den valda mappen. Data kan enkelt öppnas av Software F.
- Om du vill hämta MS/MS-spektra för en specifik peptid dubbelklickar du på sökresultaten för att öppna den med programvara F. Klicka först på proteinet i proteinlistan högst upp på menyn och klicka sedan på peptiden i mitten av menyn. MS/MS för denna peptid visas längst ned på menyn.
- Om du vill exportera och spara MS/MS-spektra högerklickar du på MS/MS-spektra längst ned på menyn, väljer kopiera och klistrar sedan in till en lämplig fil som PPT eller doc.To export and save MS/MS spectra, right-click on the MS/MS spectra on the bottom of the menu, select copy and then paste to a suitable file such as PPT or doc. format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EYFP-CENP-A K124 mutant visar ubiquitylation, interaktion med HJURP och inga defekter i centromere lokalisering varken cell dödlighet. Här återskapades det system som rapporterats av Fachinetti et al. (2017)6: i diploida mänskliga (RPE-1) celler som bär en störd och en ''floxed'' CENP-A allel (CENP-A-/F), EYFP-CENP-A uttrycktes från pBabe-EYFP retrovirusvektor. I detta system kan uttrycket av endogen CENP-A från CENP-A-/F-allelen störas av Cre recombinase6. Gen konstruktioner av EYFP- CENP-A WT eller K124R mutant (Figur 1A), som räddar förlusten av endogena CENP-A, uttrycktes stabilt när retroviral integration utfördes. Det återstående uttrycket av endogena CENP-A från CENP-A-/F allel stördes sedan av Cre recombinase. Uttrycket av endogena CENP-A upptäcktes inte 7 dagar efter induktion av Cre recombinase (Figur 1B, körfält 5-7). Både EYFP-CENP-A WT och K124R proteiner uttryck befanns vara på en liknande nivå som den ursprungliga endogena CENP-A proteinnivå (figur 1B, körfält 3, 4, 6 och 7). Både EYFP-CENP-A WT- och K124R-mutanter visade centromerlokalisering vid 7 dagar efter störningen av det återstående uttrycket av endogena CENP-A från CENP-A-/F-allelen (figur 1C-1E). Både EYFP-CENP-A WT och K124R mutant visade allestädes närvarande och interaktion med HJURP till skillnad från fallet med Flag-taggade eller otaggade CENP-A WT och K124R mutant (Figur 2A; data som inte visas för flag-taggade eller otaggade CENP-A)8. Cellens livskraft åtgärdades också genom att utföra kolonins utväxtanalys 14 dagar efter störningen av den återstående endogena CENP-A-allelen (figur 2B). Både EYFP-CENP-A WT- och K124R-mutanter visade ett liknande antal "räddade" kolonier 14 dagar efter störningen av den återstående endogena CENP-A-allelen (figur 2B och 2C). Således är våra resultat i linje med de som rapporterats av Fachinetti et al.6.
Ubiquitylation på lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R avslöjades av masspektrometri analys. Det konstaterades att både EYFP-CENP-A WT och K124R mutant visar allestädes närvarande och interaktion med HJURP till skillnad från fallet med Flag-taggade eller otaggade CENP-A WT och K124R mutant (Figur 2A; data som inte visas för flagga-taggade eller otaggade CENP-A)8. Dessa resultat tyder på att fusion av EYFP protein inducerar allestädes närvarande vid en lysin än K124 i EYFP-CENP-A K124R mutant, och denna allestädes närvarande vid en annan plats främja samspelet mellan EYFP-CENP-A K124R med HJURP. Ubiquitylation at lysine 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R was revealed in CENP-A-/F cells by IP-mass spectrometry analysis (Figur 3A and Figure 3B). Lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R motsvarar lysin 56 (K56) i CENP-A. Sammantaget tyder våra resultat på att fusion av stora protein (t.ex. EYFP-märkning) inducerar allestädes närvarande vid en annan lysin än K124 i CENP-A, och denna allestädes närvarande vid en annan plats hämmar/maskerar den ursprungliga lysamuterad fenotypen.
Figur 1: EYFP-CENP-A K124 mutant lokaliserar i centromer. (A)Representationer av de olika CENP-A protein konstruerar taggade med EYFP (förbättrad gul fluorescerande protein) vid N ändstationen. Röda bokstäver markerar positionen för K124R aminosyra substitution i den angivna konstruktionen (vänster). Resultaten av de analyser som utförs i denna studie visas (höger). B)Western blot-analys visade inte att det var påvisbart endogent CENP-A. Immunoblots analys för att kontrollera förekomsten av uttryck för de indikerade räddningskonstruktioner (ca. 45 kDa) före och efter Cre infektion. Proteinuttrycket av pBabe-EYFP-konstruktioner bekräftades för Cre infektion (lanes 1-4), as well as after Cre infektion (lanes 5-6). Frånvaron av det endogena CENP-A-proteinet (ca. 15 kDa) bekräftades i CENP-A-/- cellinjer som samlats in 7 dagar efter Cre-infektion (körfält 5-6). GAPDH-protein användes som lastningskontroll. (C)EYFP-CENP-A K124 mutant lokaliserar vid centromer. CENP-A-/F RPE-1 celler var cotransfected med indikerade konstruktioner, odlade 7 dagar efter retro-Cre virusinfektion och immunstained. Visualisering av DAPI (blå), EYFP (grön) och endogen CENP-B (röd), som fungerade som en centromere platskontroll. Skala bar, 10 μm. (D) Lokaliseringsmönstren som visas i (C) sammanfattas som histogram. Mer än 200 interfasceller med EYFP-positiva signaler räknades per experiment (n ≥ 3 experiment) och medelprocenten (±SD) visas. ''Andra (Icke-centromere)'' skildrar mestadels skadade celler, döda celler eller celler med nukleolär lokalisering i interfas, som observerades på grund av transfection eller andra behandlingar. Ingen signifikant (n.s.) skillnad observerades i K124R jämföra med WT (Students t-test). E)EYFP-härledda signaler vid centromer som visas i (C) kvantifierades. Signaler normaliserades till WT,och medelprocent (±SEM) visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: EYFP-CENP-A K124 mutant är ubiquitylated och interagerar med HJURP och cell livskraft påverkades inte av K124R mutation av EYFP-CENP-A. (A)EYFP-CENP-A K124 mutanten är allestädes närvarande och interagerar med HJURP. In vivo ubiquitylation analys. CENP-A-/F RPE-1 celler var transfekt med de angivna konstruktioner. Proteiner i 5% av de totala celllystetter (Input) och immunoprecipitates (IP) med anti-GFP kanin polyklonala antikroppar upptäcktes av västra blot analys med hjälp av de indikerade antikropparna. Förmoda di-UB-EYFP-CENP-A (**) och förmodade mono-Ub-EYFP-CENP-A (*) anges. Denna siffra har ändrats från Niikura et al.8. b)Representativa bilder från kolonins utväxtanalys som visas i schemat (överst) av två olika förhållanden ([1] och [2]) för de angivna transfectanterna i EYFP-CENP-A. CCHistogram som sammanfattar kolonins överlevnad i (B). Medelprocenten (±SEM) för mer än 3 oberoende experiment (n ≥ 3) normaliseras med andelen överlevande kolonier i EYFP-CENP-A WT (EYFP-WT). p < 0.0001 och **p < 0.01 jämfört med EYFP-kontroll (Students t-test). Ingen signifikant (n.s.) skillnad observerades i K124R jämföra med WT (Students t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Fragment av allestädes närvarande EYFP-CENP-A K124R peptider upptäcktes genom masspektrometri analys. (A)Bevis på allestädes närvarande lysin 306 (K306) EYFP-CENP-A K124R i RPE-1 CENP-A-/F-celler. Lysin 306 (K306) av EYFP-CENP-A K124R motsvarar lysin 56 (K56) i CENP-A. LQKLRGGSTHLLIR peptid (täckning 95,9%, konfiden 87,8%) identifieras genom kollisionsinducerad dissociationsanalys visas. M/z-värdena (Da) för b -jonerna (grön) och y (röd) i spektra av (A) som detekteras under fragmentering markeras med grönt i tabellen (B). Allestädes närvarande av K306 bekräftas av LRGG-motivet (ofullständig klyvning) av b-3 jonen (m/z 753.4730) och y-8 jon (m/z 1350.8328). (B)Tabellen markerar m/z -värdena för b -jonerna (gröna) och y (röda) i spektra av (A). LQK[Umc]STHLLIR i tabellen (B) anger LQKLRGGSTHLLIR peptid som visas i (A). Dessa siffror har ändrats från Niikura et al.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| B-nummer | Relevanta egenskaper | Referens | Källkod |
| B3027 | pBabe-puro-Cre | Niikura et al., 2019 | Dr. Amruta Ashtekar, Dr. Lawrence S. Kirschner |
| B3182 (på) | pBabe-EYFP | Niikura et al., 2019 | - |
| B3161 (på) | pBabe-EYFP-CENP-A WT | Niikura et al., 2019 | Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland |
| B3164 (på) | pBabe-EYFP-CENP-A K124R | Niikura et al., 2019 | Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland |
| B3031 | psPAX2 (på andra) | Niikura et al., 2019 | Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone |
| D3032 (på) | pMD2.g | Niikura et al., 2019 | Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone |
| B3189 (på) | Pgp | Niikura et al., 2019 | Dr Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japan) |
| B3190 | pCI-VSVG | Niikura et al., 2019 | Dr Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japan) |
| B3001 | pPAM (på andra) | Niikura et al., 2019 | - |
| B3252 | pQCXIP-EYFP | Niikura et al., 2019 | - |
| B3254 (på) | pQCXIP-EYFP-CENP-A WT | Niikura et al., 2019 | - |
| B3256 (på) | pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R | Niikura et al., 2019 | - |
| B2806 (på) | pCGN-HA-Ubiquitin | Niikura et al., 2019 | - |
Tabell 1: Plasmidvektorer som används i denna studie.
| B-nummer | Hjälpare/förpackning plasmid vektorer | Kombination 1 | Kombination 2 | Kombination 3 |
| B3031 | psPAX2 (lentiviral gag/pol vektor) | 2 μg (4 μg) | ||
| D3032 (på) | pMD2.g (lentiviral env vektor) | 2 μg (4 μg) | ||
| B3189 (på) | pGP (retroviral gag/pol vektor) | 2 μg (4 μg) | ||
| B3190 | pCI-VSVG (retroviral env vektor) | 2 μg (4 μg) | ||
| B3001 | pPAM (amphotropisk hjälpvektorkodning retroviral gag-pol-env) | 2 μg (4 μg) |
Tabell 2: Kombinationer av hjälpare/förpackning plasmid vektorer som används i (1.1.3): Retrovirus transfection av pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner.
Kompletterande kodningsfiler. Klicka här för att ladda ner dessa filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrev vi metoder för masspektrometri analys för att identifiera allestädes närvarande av EYFP-CENP-A K124R mutant tyder på att EYFP märkning inducerar allestädes närvarande vid en annan lysin i CENP-A K124R mutant protein8. I våra resultat identifierade vi framgångsrikt ubiquitylation på lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R, som motsvarar lysin 56 (K56) i CENP-A genom masspektrometri analys. Masspektrometri analys som beskrivs här är en härma metod som vi tidigare identifiera lysin 124 (K124) allestädes närvarande cenp-A WT-Flag12. Därför kan denna metod appliceras på humant CENP-A-protein med olika taggar och andra centromere-kinetochoreproteiner. Masspektrometrianalysen baserad på LC-MS/MS är allmänt accepterad för att identifiera potentiella posttranslationala modifieringar (PTMs) av ett brett spektrum av proteiner. Våra kombinatoriska metoder som består av flera analyser/analyser (dvs. in vivo ubiquitylation analys, kolonin utväxt analys och masspektrometri analys) kan rekommenderas för forskare som är intresserade av att identifiera funktionella roller ubiquitylation (s) av deras mål protein (s).
Detta protokoll omfattar dock inte påvisande av allestädes närvarande band och/eller identifiering av platsspecifika allestädes närvarande av dessa proteiner i levande celler eller en specifik encellig cell under hela cellcykeln. Dessa år utvecklas optogenetiska metoder dramatiskt och ger stor inverkan på kvantitativa studier av cellsignaleringssystem. Optogenetik har ursprungligen tillhandahållit metoder som exakt aktiverar eller hämmar enskilda nervceller med hjälp av enkomponents, mikrobiella opsinbaserade system. För närvarande kan proteinaktivitet med oöverträffad spatiotemporal precision kontrolleras genom att utnyttja naturliga genetiskt kodade fotoreceptorer, och olika genetiskt kodade verktyg möjliggör ljuskontroll av många biologiska processer, inklusive proteinfosforylering15. Därför är optogenetik ett lovande system för att undersöka spatiotemporal proteinkinas signalering på cellulära och hela organismnivåer. Antalet ljusstyrda proteinkinaser ökar snabbt, även om det nuvarande antalet fortfarande är begränsat. Utvecklingen av ljusstyrd proteinubiquitylation försenas dock och hög molekylviktsmärkning av fotoreceptorer kan störa allestädes närvarande av både WT och muterade proteiner och funktionellt förändra den inhemska proteinfunktionen som tidigare underskattats. Därför är utvecklingen av lägre molekylvikt märkning eller sondering teknik snarast nödvändigt att visualisera allestädes närvarande och/eller att undersöka spatiotemporal protein allestädes närvarande signalering på levande cellulära och hela organismen nivåer.
I den aktuella studien är EYFP vektorkontroll avgörande för kontrollanalyser och analyser (immunofluorescensanalys, koloniutväxtanalys och in vivo ubiquitylationsanalys) för att diskutera resultatet av större masspektrometrianalys ordentligt. Icke-specifik interaktion med EYFP-protein observeras ofta i immunoprecipitation experimentet, vilket EYFP vektor kontroll är oumbärlig för att utvärdera den sanna interaktionen av EYFP-smält protein (s). Vår massa spektrometri analys med EYFP-CENP-A K124R uttryckt i RPE-1 CENP-A-/F celler visade inte allestädes närvarande på lysin platser i EYFP polypeptid sekvensen. Under andra okända förhållanden kan det dock förväntas att lysinplatsen i EYFP-polypeptidsekvensen är allestädes närvarande i EYFP- och/eller annat taggat fusionsprotein med hög molekylvikt.
För kolonin utväxt analyser, Det rekommenderas att samla in celler för västra blot analys för att bekräfta protein utarmning av endogena CENP-A efter retro-Cre virusinfektion och protein uttryck för pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner. På detta sätt kan vi bedöma om kolonin utväxt fenotyp är verkligen på grund av det enda uttrycket av exogena CENP-A WT eller mutanter. För alla västerländska blot analys, om strippning utförs för att reblot membranet med olika antikroppar för nästa tur av västra blot analys, bör man använda samma kvantitativa detektionssystem som en tidigare tur blot för nästa tur är blot med olika antikroppar. Man bör se till att banden i föregående svängs blott är omöjlig att upptäcka vid den avsedda regionen av membranet i nästa svängs blot med olika antikroppar. Eller använd samma kvantitativa detektionssystem som föregående svängs blot och kontrollera om inkubationen med enbart sekundär antikropp som används i föregående svängs blotta inte leder till detektion av proteinband innan nästa svängs blot med olika antikroppar. För in vivo ubiquitylation analys, är det viktigt att köra större SDS-PAGE gel med hjälp av apparaten för att köra större SDS-PAGE gel (Gel elektrofores apparat I eller II). Empiriskt, större SDS-PAGE gel skulle separera proteinband tydligt och öka känsligheten för detektion av svaga band som kunde ha upptäckts dåligt i den mindre gelen (dvs proteinband verkar skarpare i större gel).
Det är oerhört viktigt att välja rätt SDS-PAGE gel för att kartlägga post-translationella modifieringar (PTMs) av en specifik proteindid LC-MS/MS. Det mest använda gelsystemet för SDS-PAGE är Laemmli-systemet, som använder Tris-glycingeler som består av en staplingsgelkomponent och den lösa gelkomponenten. I detta klassiska system skiljer sig pH- och joniska styrkan hos de buffertar som används i staplingsgelen (Tris, pH 6.8) och lösande gel (Tris, pH 8.8) från den buffert som används för att köra gelen (Tris, pH 8.3). Banddistorsion, förlust av upplösning eller artefaktband kan orsakas av laemmli-systemets mycket alkaliska operativsystem. I den tidigare rapporten beskrevs de främsta orsakerna till dålig bandupplösning med Laemmli-systemet16, inklusive instabilitet och kort utgångsperiod för den lösande gelen på grund av hydrolys av polyakrylamid vid det höga pH-värdet. Kemiska förändringar av provproteiner, reoxidation av reducerade disulfider av cysteinrester av proteiner och klyvning av Asp-Pro-bindningar av proteiner med uppvärmning vid 95-100 °C i Laemmli provbuffert vid pH 5.2. De kommersiellt tillgängliga proteingelerna Bis-Tris är Bis-Tris HCI-buffrad (pH 6.4) och drivs vid pH ca. 7.0 till skillnad från traditionella Tris-glycine geler16. De många fördelarna jämföra med Laemmli systemet genereras av neutral drift pH av Bis-Tris system16, inklusive hög stabilitet och lång utgångsperiod av lösa gel, förbättrad prov protein stabilitet under elektrofores vid neutrala pH leder till skarpare band upplösning och korrekta resultat, och fullständig minskning av disulfides och avsaknad av klyvning av Asp-Pro obligationer. I denna rapport kan vi framgångsrikt kartlägga PTMs av EYFP-CENP-A K124R protein (figur 3) med hjälp av kommersiellt tillgängliga 4%-12% Bis-Tris protein geler. Därför rekommenderas de kommersiellt tillgängliga 4%-12% Bis-Tris proteingelerna starkt att använda för detta ändamål.
För kartläggning av post-translationella modifieringar (PTMs) av ett specifikt protein används i-gel-nedbrytning av målprotein i kombination med LC-MS/MS i stor utsträckning. I denna studie försökte vi identifiera ubiquitination platser EYFP-CENP-A K124R med affinitet rening-masspektrometri (AP-MS) strategi. Därför är det första viktiga steget att få en stor mängd ubiquitinated EYFP-CENP-A K124R protein med hög renhet med hjälp av immunprecipitation från EYFP-CENP-A K124R överuttryck celler, vilket i hög grad skulle kunna underlätta identifiering och bekräftelse av ubiquitination platser av EYFP-CENP-A K124R av LC-MS/MS. För att minska interferensen hos icke-ubiquitinerat EYFP-CENP-A K124R-protein, västra blots av anti-GFP, anti-HA (Ub), anti-Ubiquitin (se avsnitt [6.1.6]), och Coomassie blå färgning (se avsnitt [6.1.7]) utfördes för att exakt bestämma positionen för ubiquitinated EYFP-CENP-A K124R på SDS-PAGE gel. Slutligen var endast ett minimerat område av gel band som innehåller ubiquitinated EYFP-CENP-A K124R strukits för in-gel matsmältning i kombination med LC-MS/MS för att få optimerade resultat. När de torkade peptiderna rekonstitueras före drift LC-MS/MS, 3% (v / v) acetonitril / 2% (v / v) myrsyra användes för att förbättra löslighet och återvinning av peptider. Ibland kan databassökningen resultera i PTMs som inte verkligen existerar på grund av den ungefärliga tilldelningsalgoritmen för sökmotorn. Således är ett annat kritiskt steg att bekräfta EYFP-CENP-A K124R ubiquitination webbplatser via manuellt granska MS / MS av ubiquitinated peptider med hjälp av Software F (Tabell över material), som kan eliminera "overkliga" allestädes närvarande webbplatser som införts genom ungefär tilldelning genom databassökning. Sammanfattningsvis har denna AP-MS-strategi upprättat en effektiv och robust rörledning för identifiering av EYFP-CENP-A K124R-allestädes närvarande platser med avgörande biologisk betydelse. Ännu viktigare är att denna rörledning också skulle kunna utvidgas i stor utsträckning för att undersöka ptms av olika funktionella proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Chao-Jun Li vid Model Animal Research Center, Nanjing University för masspektrometri analys. Vi tackar Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa, och nuvarande forskare vid Model Animal Research Center, Nanjing University och Greehey Children's Cancer Research Institute för deras hjälpsamma diskussion, experimentell vägledning och reagenser. Vi tackar Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago och Dawn S. Chandler för deras generösa gåvor av reagenser. Y.N. stöddes av Jiangsu-provinsen ''Double- First-Class'' Construction Fund, Jiangsu-provinsen Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu-provinsen 16:e Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu-provinsen "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) och National Natural Science Foundation i Kina (31970665). Denna studie stöddes delvis av NCI-bidraget R21 CA205659.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equpiments/Tools | |||
| 0.5 ml protein low binding tubes | Eppendorf | 022431064 | For mass spectrometry analysis |
| 10cm cell culture dish | BIOFIL/JET, China | 700224 | 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63) |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well culture plate |
| CentriVap | LABCONCO | - | Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis |
| HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Oil immersion lens |
| HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Oil immersion lens |
| Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | For western blot |
| Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | - | motorized fluorescence microscope |
| Leica EL6000 compact light source | Leica | External light source for fluorescent excitation | |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
| Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | - | liquid chromatography system for mass spectrometry analysis |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher | NP0335BOX | The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | - | Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| ORCA-R2 Degital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | CCD camera |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | For a water repellant barrier in immunofluorescent staining |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm tissue culture dish |
| Vertical electrophoresis for gel running (big size) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
| Primary antibodies | |||
| Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-GFP antibody | ANTI #76 (Homemade antibody) | Rabbit polyclonal antibody | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Rat monoclonal antibody |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283–1-AP | Rabbit polyclonal antibody |
| anti-Ubiquitin | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Rabbit polyclonal antibody |
| Reagents | |||
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
| Buffer A1 | - | - | 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11-873-580-001 | Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1 |
| Coomassie brilliant blue R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis |
| Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | For colony staining |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
| DMEM: F12 Medium | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Medium |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
| High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent I for chemical transfection |
| Lipofectamin 3000, P3000 solution | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | Transfection reagent II for chemical transfection |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Fixation reagant |
| Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Non-fat skim milk |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media |
| p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
| Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
| Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
| Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | Transfection reagent III for chemical transfection |
| Protein A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | For mass spectrometry analysis |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
| Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) | - | - | Western Blot Stripping Buffer II |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
| Softwares | |||
| Acquisition FV31S-SW software | Olympus | - | Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| Analysis FV31S-DT software | Olympus | - | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus | - | Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) |
| Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | - | Software D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | - | Chemiluminescence imager for immunoblot detection |
| Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | - | Infrared imaging system for immunoblot detection |
| OpenCFU saftware | - | - | For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/) |
| Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | - | Software A |
| ProteinPilot Software version 4.5 | AB SCIEX | - | Software F for mass spectrometry analysis |
| Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | - | Software E |
| TripleTOF 5600+ System | AB SCIEX | - | Mass spectrometry instrument |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | - | Software B1 |
| Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | - | Software B2 |
References
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
- Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
- Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
- Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
- Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
- Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
- Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
- Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
- Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
- Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
- Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
- Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
