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Biology

EYFP-टैग किए गए सेनपी-ए (EYFP-CENP-A) के सर्वव्यापी की पहचान करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61138
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 2, 3
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

CENP-A सर्वव्यापकता सेंट्रोमेरे में CENP-ए बयान के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है, जो सेल डिवीजन के बीच डामरीकरण के माध्यम से विरासत में मिली है, और सेल व्यवहार्यता के लिए अपरिहार्य है। यहां हम EYFP-टैग CENP-A (EYFP-CENP-A) प्रोटीन के सर्वव्यापकता की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का वर्णन करते हैं।

Abstract

संरचना और kineto काम और सेंट्रोमर की गतिशीलता का अध्ययन गुणसूत्र अस्थिरता (CIN) और कैंसर प्रगति को समझने में महत्वपूर्ण है । कैसे गुणसूत्र स्थान और एक सेंट्रोमेरे (यानी, सेंट्रोमेरे पहचान) के कार्य निर्धारित कर रहे है और सटीक गुणसूत्र अलगाव में भाग लेने के एक बुनियादी सवाल है । सेएनपी-ए को सेंट्रोमरे पहचान का गैर-डीएनए संकेतक (एपिजेनेटिक मार्क) होने का प्रस्ताव है, और सेएनपी-ए सर्वव्यापकता के लिए सेएनपी-ए बयान के लिए आवश्यक है, जो सेल डिवीजन के बीच डामरीकरण के माध्यम से विरासत में मिला है, और सेल व्यवहार्यता के लिए अपरिहार्य है।

यहां हम EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती के सर्वव्यापकता की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का वर्णन करते हैं, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि सेएनपी-ए K124R उत्परिवर्ती प्रोटीन में EYFP टैगिंग के कारण एक अलग lysine पर सर्वव्यापी प्रेरित है। LYsine 306 (K306) EYFP-CENP-A K124R में सर्वव्यापकता सफलतापूर्वक पहचान की गई थी, जो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से सेनपी-ए में लिसिन 56 (K56) से मेल खाती है। एक चेतावनी GFP/EYFP के उपयोग या एक प्रोटीन के कार्य का विश्लेषण करने के लिए एक उपकरण के रूप में उच्च आणविक वजन प्रोटीन की टैगिंग में चर्चा की है । सर्वव्यापी बैंड का पता लगाने, साइट-विशिष्ट सर्वव्यापकता (एस) की पहचान और जीवित कोशिकाओं में सर्वव्यापीता के दृश्य या पूरे सेल चक्र के दौरान एक विशिष्ट एकल कोशिका के लिए वर्तमान तकनीकी सीमा पर भी चर्चा की जाती है।

यहां प्रस्तुत मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की विधि को विभिन्न टैग और अन्य सेंट्रोमेरे-किनेटोकोर प्रोटीन के साथ मानव सेन्प-ए प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है। कई परख/विश्लेषण से युक्त इन संयोजन तरीकों की सिफारिश उन शोधकर्ताओं के लिए की जा सकती है जो सर्वव्यापकता की कार्यात्मक भूमिकाओं की पहचान करने में रुचि रखते हैं ।

Introduction

अधिकांश यूकेरियोट्स में, स्पिंडल माइक्रोट्यूबुल्स को प्रत्येक गुणसूत्र के एक ही क्षेत्र से जोड़ना चाहिए, जिन्हें सेंट्रोमेरे कहा जाता है। किनेटोकोर प्रोटीन का एक जटिल है जो सेंट्रोमेरे में स्थित है। सेंट्रोमेरे और किनेटोकोर प्रोटीन की गतिविधियों के समय और किनेटोयर और सेंट्रोमेरेस की संरचना का अध्ययन गुणसूत्र अस्थिरता (सिन) और कैंसर की प्रगति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रमुख प्रश्न यह हैं कि एक सेंट्रोमेरे (यानी, सेंट्रोमेरे पहचान) का गुणसूत्र स्थान और कार्य कैसे निर्धारित किया जाता है और वे सटीक गुणसूत्र अलगाव में कैसे भाग लेते हैं। अधिकांश प्रजातियों में, एक विशिष्ट हिमात की तरह प्रोटीन युक्त एक विशेष नाभिक की उपस्थिति CENP-A कहा जाता है सेंट्रोमेरे पहचान को परिभाषित करता है । इसलिए, यह प्रस्तावित है कि सेएनपी-ए सेंट्रोमेरे पहचान का गैर-डीएनए संकेतक (एपिजेनेटिक मार्क) है। यह कैसे CENP-A मनुष्यों में केंद्रीय पहचान को परिभाषित करता है के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

होलिडे जंक्शन रिकग्निशन प्रोटीन (एचयूआरपी) सेएनपी-ए-विशिष्ट चैपरन,है जो सेंट्रोमेरिक न्यूक्लियोसोम्स1,2,3में सेएनपी-ए जमा करता है।, हमने पहले बताया है कि CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase CENP के लिए आवश्यक है-lysine १२४ (K124) और सेंट्रोमेरे स्थानीयकरण4पर सर्वव्यापकता । इसके अलावा, हमारे परिणामों से पता चला है कि नए संश्लेषित CENP-A की केंद्रीकृत भर्ती के लिए पहले से मौजूद सर्वव्यापक CENP-A5की आवश्यकता होती है । इस प्रकार, एक मॉडल प्रदान किया गया था जिसमें यह सुझाव दिया गया था कि सेल डिवीजनों के बीच डामरीकरण के माध्यम से सीएनपी-ए सर्वव्यापकता विरासत में मिली है।

हमारे निष्कर्षों और यू एट अल के विपरीत, CENP-A और इसके केंद्रीय स्थानीयकरण के बारे में नकारात्मक परिणाम हाल ही में6प्रकाशित किए गए थे। लेख में दावा किया गया है कि CENP-lysine १२४ (K124) पर एक संशोधन मानव सेंट्रोमर की स्थापना, रखरखाव, और दीर्घकालिक समारोह के लिए अपरिहार्य हैं, उनके नकारात्मक परिणामों के आधार पर दिखा रहा है कि K124R के उत्परिवर्तन CENP-A centromere स्थानीयकरण न तो सेल व्यवहार्यता6को प्रभावित नहीं किया । हालांकि, उनके परिणामों और निष्कर्षों में बहस के लिए पर्याप्त जगह है, और हम पहले से ही बता चुके हैं कि उनके पिछले प्रकाशन7में क्या समस्या हो सकती है । ध्यान दिया जाना चाहिए कि वे CENP-A के साथ प्रोटीन जुड़े, जो अंतर्जात CENP-A के आकार की तुलना में बहुत बड़ा आणविक वजन है: उदाहरण के लिए, वे ~30 केडीए बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EYFP) ~ 16 केडीए CENP-A और विश्लेषण EYFP-CENP-A K124R संलयन प्रोटीन उनके RPE-1CENP-A-/F नॉकआउट प्रणाली में जुड़े । K124 सर्वव्यापकता को संरचनात्मक भविष्यवाणियों के आधार पर सीधे HJURP से बांधने की उम्मीद नहीं है4,हालांकि, मोनो-सर्वव्यापकता के अलावा सेनपी-ए के प्रोटीन संरचना पर प्रभाव पड़ने की भविष्यवाणी की गई है। CENP-A संरचना के प्रोटीन को एक बड़े संलयन प्रोटीन की उपस्थिति से बदला जा सकता है, और यह अनुरूप परिवर्तन सर्वव्यापी के नुकसान के कारण संरचनात्मक परिवर्तनों को मुखौटा कर सकता है। हमारा सुझाव है कि बड़े आकार के प्रोटीन का संलयन EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती में K124 के अलावा एक lysine पर सर्वव्यापी लाती है और एक और साइट पर यह सर्वव्यापकता मूल K124R एकल उत्परिवर्ती फेनोटाइप को रोकता है/मास्क । सबूत है कि सर्वव्यापकता CENP में अलग-अलग lysine पर होता है-एक K124R उत्परिवर्ती प्रोटीन एक बड़े टैग प्रोटीन (EYFP) के साथ हमारे पिछले प्रकाशन8में सूचित किया गया था । यह पाया गया कि EYFP टैगिंग EYFP-CENP-A K124R की एक और lysine साइट के सर्वव्यापकता लाती है और यह कि EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती HJURP को बांधता है । नतीजतन, एक और साइट पर यह सर्वव्यापकता मूल K124R एकल उत्परिवर्ती फेनोटाइप को रोकता है/मास्क करता है, और दोनों EYFP-CENP-एक WT और K124R म्यूटेंट ने सेंट्रोमेरे स्थानीयकरण दिखाया (हमने पीबेबे-ईई-ए डब्ल्यूटीई और K124R उत्परिवर्ती की तुलना में पीबे-ईई एफपी नियंत्रण के साथ मिलकर किया । परिणामों से पता चला है कि फ्लैग-टैग या अनटैग्ड CENP-A K124R म्यूटेंट घातक हैं, लेकिन एक मोनोफिस्टिन फ्यूजन द्वारा बचाया जा सकता है, यह सुझाव देते हुए कि CENP-A सर्वव्यापकता सेल व्यवहार्यता के लिए अपरिहार्य है।

हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों ने सेनपी-ए प्रोटीन और अन्य सेंट्रोमेरे-किनेटोकोर प्रोटीन के पोस्टट्रांसल संशोधनों (पीटीएमएस) की पहचान करने के लिए विभिन्न परख विकसित की9,10,है। हिस्टोन प्रोटीन के पीटीएमएस के अनुरूप जो क्रोमेटिन के कार्य को विनियमित करने वाला एक प्रमुख तंत्र है, सेंट्रोमेरिक क्रोमेटिन घटकों के पीटीएमएस भी सेंट्रोमर्स की समग्र संरचना और कार्य को विनियमित करने के लिए एक आवश्यक तंत्र में शामिल हैं। सेनपी-ए पीटीएम साइटों के बहुमत CENP-ए युक्त न्यूक्लियोसोम के लिए विशिष्ट हैं, हालांकि उनमें से कुछ हिस्टोन H3 में संरक्षित हैं, सुझाव है कि इन अवशेषों के संशोधन सेंट्रोमेरे विशिष्ट समारोह में योगदान करते हैं । फॉस्फोरिलेशन, एसीटिलेशन, मिथाइलेशन और सर्वव्यापकता सहित सेनपी-ए के पीटीएम को पहले9बताया गया था, जिसमें यह सुझाव दिया गया था कि सेएनपी-ए विभिन्न प्रकार के पीटीएम के अधीन है और इसके अमीनो टर्मिनस और सी-टर्मिनस हाइस्टोन-फोल्ड डोमेन पर उनके संयोजन सरणी हैं। CENP के महत्व-कई कार्यों में एक संशोधन हमारे सहित कई समूहों द्वारा पता चला था । इन कार्यों में सेंट्रोमरे, प्रोटीन स्थिरता और सीसीएन (संविलियन से जुड़े नेटवर्क)9की भर्ती में सेएनपी-ए बयान शामिल है। हालांकि, सीमित अध्ययन और CENP-A PTMs के निष्कर्षों को पहले से सूचित किया जाता है जहां तुलना विहित हिटोन में से एक के साथ की जाती है जो प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से उनके कार्य को विनियमित करती है। इन CENP-A PTMs की पहचान करने के लिए कार्यप्रणाली पर ध्यान केंद्रित तकनीकी रिपोर्ट भी सीमित हैं ।

क्योंकि सेएनपी-ए सर्वव्यापकता के लिए सेंट्रोमेरे12में सेएनपी-ए बयान के लिए आवश्यक है, जो सेल डिवीजन5के बीच डामरीकरण के माध्यम से विरासत में मिला है, और सेल व्यवहार्यता8के लिए अपरिहार्य है, भविष्य में सेंट्रोमेरे की कार्यात्मक गतिविधि, स्थिति और संरचना का अध्ययन करने के लिए CENP-A सर्वव्यापी की पहचान करने की विधि आवश्यक होगी। इसलिए, यहां हम EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती के सर्वव्यापकता की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का वर्णन करते हैं, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि EYFP टैगिंग सेनपी-ए K124R उत्परिवर्ती प्रोटीन8में एक अलग lysine पर सर्वव्यापकता लाती है । प्रमुख द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के परिणाम पर ठीक से चर्चा करने के लिए अन्य नियंत्रण परख और विश्लेषण (इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण, कॉलोनी आउटग्रोथ परख, और वीवो सर्वव्यापकता परख में) के प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किए जाते हैं।

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Protocol

1. सेल संस्कृति और pBabe-EYFP-CENP-A निर्माण के रेट्रोवायरस ट्रांसफेक्शन

नोट: EYFP-CENP-A pBabe-EYFP-CENP-A से एक समान प्रोटीन स्तर पर अंतर्जात CENP-A के लिए व्यक्त किया जाता है । कुल सेलुलर CENP-एक प्रोटीन इस EYFP-CENP-A के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है के रूप में क्रे पुनर्संयोजन द्वारा CENP-A-/F allele के व्यवधान के बाद आरपीई-1 CENP-A-/-कोशिकाओं6।-/F

  1. 293T पैकेजिंग कोशिकाओं का उपयोग करके रेट्रोवायरस युक्त सुपरनेट की तैयारी।
    1. दिन 0: 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट (१.० x १०६ कोशिकाओं/ 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ उच्च ग्लूकोज डीएमईएम में संस्कृति कोशिकाएं। 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के वातावरण मेंकोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, अनुभवजन्य रूप से सीडिंग में उपयोग करने के लिए सेल घनत्व निर्धारित करते हैं।
    2. पहला दिन: फैलने के बाद 23 घंटे के आसपास ट्रांसफेक्शन रिएक्शन तैयार करें (24 एच पॉइंट ट्रांसफैक्शन का 0 एच पॉइंट है)। प्रत्येक pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), और pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (तालिका 1देखें) के ट्रांसफेक्ट अभिव्यक्ति प्लाज्मिड ।
    3. टेबल 2 में सूचीबद्ध हेल्पर/पैकेजिंग प्लाज्मिड्स का एक संयोजन चुनें और उन्हें ऊपर सूचीबद्ध प्लाज्मिड में से एक वाली ट्यूबों में जोड़ें। हेल्पर/पैकेजिंग प्लाज्मिड्स(टेबल 2)के लिए ज्यादातर ये 3 कॉम्बिनेशन हैं । किसी भी संयोजन इन प्रयोगों में काम किया और इसी तरह के ट्रांसफैक्शन दक्षता दिखाया।
    4. कम सीरम माध्यम के 50 माइक्रोन तैयार करें और प्रत्येक पीबेबे-ईवाईएफपी (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) के 2.0 माइक्रोग्राम मिलाएं और pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (तालिका 1देखें) टेबल 2 में सूचीबद्ध हेल्पर/पैकेजिंग प्लाज्मिड्स का एक संयोजन जोड़ना (नीचे देखें)। इस मिश्रण को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यह मिश्रण समाधान ए है।
    5. कम सीरम माध्यम का एक और 50 माइक्रोन तैयार करें और क्रमशः (सामग्री की तालिका) में 1.5 माइक्रोन ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स I और IIमिलाएं। इस मिश्रण को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यह मिश्रण समाधान बी है।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, समाधान बी में ट्रांसफेक्शन रीएजेंट III (पॉलीथीलीनीमाइन [पीई]; 1.0 मिलीग्राम/एमएल) के केवल 6.0 माइक्रोन जोड़ें या समाधान बी(सामग्रीकी तालिका) में ट्रांसफेक्शन रीएजेंट्स I और II के अलावा ट्रांसफेक्शन रीएजेंट्स III के 6.0 माइक्रोन जोड़ें।
    6. समाधान ए और बी को एक साथ मिलाएं, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    7. सुसंस्कृत कोशिकाओं को एक बार पीबीएस के साथ धोने के बाद, समाधान ए और बी (यानी, डीएनए-लिपिड कॉम्प्लेक्स) का मिश्रण सीधे 6-अच्छी संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ें जिसमें 500 माइक्रोन कम सीरम माध्यम है। प्लाज्मिड की अंतिम एकाग्रता 3.3 माइक्रोग्राम/एमएल है।
    8. 4.5 घंटे के लिए 5% सीओ2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने के बाद, माध्यम को 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ उच्च ग्लूकोज डीएमईएम में बदलें। 6-कुआं कल्चर प्लेट में मीडियम चेंज के बाद कल्चर मीडियम के 2 एमएल/वेल डाल दें।
    9. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को 5% सीओ2 के वातावरण में 48 घंटे के लिए ट्रांसफेक्शन के बाद। रेट्रोवायरस युक्त सुपरनेट का उपयोग करके 3 दिन में रेट्रोवायरस संक्रमण करें।
  2. CENP-A-/FRPE-1 लक्ष्य कोशिकाओं के रेट्रोवायरस संक्रमण ।
    1. 2 दिन: संक्रमण से एक दिन पहले, CENP-A-/FRPE-1 लक्ष्य कोशिकाओं को 6 अच्छी तरह से संस्कृति में अच्छी तरह से ट्रांसफेक्ट करने के लिए फैल (२.२५ x १०५ कोशिकाओं/ डीएमईएम में संस्कृति कोशिकाएं: 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ एफ 12 माध्यम(सामग्रीकी तालिका)।
      नोट: नियंत्रण के रूप में कॉलोनी वृद्धि परख, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को फैलाएं। इष्टतम परिणामों के लिए, अनुभवजन्य रूप से सीडिंग में उपयोग करने के लिए सेल घनत्व निर्धारित करते हैं।
    2. 3 दिन (वायरस का संक्रमण दिन): 293T पैकेजिंग कोशिकाओं के ट्रांसफैक्शन के बाद 48 घंटे में, 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से वायरस और फिल्टर युक्त सुपरनैंट एकत्र करें (0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग न करें जो वायरस लिफाफा कतरनी करेगा)। पॉलीएथर्सल्फोन (पीईएस) फिल्टर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    3. वायरस के साथCENP-A-/F RPE-1 कोशिकाओं को संक्रमित करें । 6-अच्छी संस्कृति प्लेट के एक कुएं के लिए, 8 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए 1 एमएल ताजा मीडिया, 1 एमएल वायरस सुपरनेटेंट और पॉलीब्रेन जोड़ें। इनक्यूबेट CENP-A-/F RPE-1 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के वातावरण में4 दिनों के लिए 7 दिन तक ट्रांसफेक्शन के बाद ।-/F
      नोट: CENP-A-/FRPE-1 सेल विकास के लिए इनक्यूबेशन अवधि इष्टतम परिणामों के लिए विश्लेषण का पालन करके अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए ।

2. pBabe-EYFP-CENP-A युक्त कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण

  1. दिन 7: pBabe-EYFP-CENP-A निर्माण के रेट्रोवायरस संक्रमण के 4 दिन बाद, आकांक्षा द्वारा संस्कृति माध्यम को हटा दें। टीबीएस (25 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5; 125 एमएमएम एनएसीएल) के साथ एक बार कोशिकाओं को कुल्लाएं। कोशिकाओं की सतह को परेशान करने से बचने के लिए संस्कृति कुओं के किनारे टीबीएस लागू करें।
    नोट: सेल निर्धारण के लिए इष्टतम समय बिंदु अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। EYFP-CENP-A WT और K124R दोनों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस सिग्नल pBabe-EYFP-CENP-A के रेट्रोवायरस संक्रमण के कम से कम 4 दिनों बाद सेंट्रोमेरे में पता लगाने योग्य हैं, क्रे संक्रमण के बिना भी निर्माण (डेटा नहीं दिखाया गया है, क्रे संक्रमण के साथ डेटा के लिए चित्रा 1सी-ई)।
  2. मेथनॉल सेल निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस को पहले बताए गए13के रूप में करें ।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी (1:1,000 कमजोर पड़ने) और एक एंटी-सेएनपी-बी एंटीबॉडी (1:200 का कमजोर पड़ने अनुपात) का उपयोग करते हैं, जो टीबीएस में एक सेंट्रोमेरे स्थान मार्कर के लिए 4% बकरी सीरम (उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
  4. एक कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त बढ़ते माध्यम को हटा दें और अंतिम चरण में नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें।
  5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेज ऑब्जर्वेशन, अधिग्रहण, क्वांटिफिकेशन और सेंट्रोमेरे में EYFP-CENP-A के शेष संकेतों के विश्लेषण के लिए पहले वर्णित विधि13 को देखें।
  6. सॉफ्टवेयर ए या सॉफ्टवेयर्स बी 1 और बी 2 (सामग्रियों की तालिकादेखें) का उपयोग करके इमेज एक्विजिशन, क्वांटिफिकेशन और विश्लेषण सहित प्रसंस्करण करें। एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के लिए वैकल्पिक रूप से सॉफ्टवेयर C1-C3 (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
    नोट: सॉफ्टवेयर ए में उपयोग किए जाने वाले सभी आदेशों के लिए पूरक कोडिंग फ़ाइलों में 2.6.1 देखें। सॉफ्टवेयर B1 और B2 में उपयोग किए जाने वाले सभी आदेशों के लिए पूरक कोडिंग फ़ाइलों में 2.6.2 देखें।

3. कॉलोनी आगे बढ़ना परख करता है pBabe-EYFP-CENP-एक रेट्रो-क्रे वायरस संक्रमण के बाद का उपयोग कर

नोट: इस परख प्रदर्शन के लिए कारण EYFP-CENP-एक WT और K124R उत्परिवर्ती के बीच सेल व्यवहार्यता की तुलना करने के लिए CENP के व्यवधान केबाद-एक-/F allele क्रे रिकॉम्बिनेंट द्वारा (कुल सेलुलर CENP-एक प्रोटीन के प्रतिस्थापन के बाद) है ।

  1. पीबेबे-ईवाईएफपी-सेएनपी-ए का रेट्रोवायरस ट्रांसफेक्शन।
    1. धारा 1 में वर्णितCENP-A-/F RPE-1 कोशिकाओं के रेट्रोवायरस ट्रांसफेक्शन करें । डीएमईएम में संस्कृति कोशिकाएं: वायरस संक्रमण के बाद 72 घंटे के लिए 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ एफ 12 माध्यम।
    2. पीबेबे-ईवाईएफपी-सेएनपी-ए के रेट्रोवायरस संक्रमण के तीन दिन बाद (6 दिन) में, कॉलोनी आउटग्रोथ परख और नियंत्रण प्रयोगों के लिए उपयोग की जाने वाली संक्रमित कोशिकाओं वाले कुओं में ब्लास्टिसिडिन एस (10 माइक्रोग्राम/एमएल) जोड़ें। ब्लास्टिसिडिन एस की उपस्थिति में वायरस संक्रमण के कम से कम 14 दिन बाद कोशिकाएं हर 5 दिनों में ब्लास्टिसिडिन एस युक्त माध्यम को बदलें।
      नोट: यदि कोशिकाएं कॉलोनी परख (3.2.7. और 3.2.8) के लिए सीडिंग से पहले लगभग 80% संगम तक पहुंचती हैं, तो कोशिकाओं को 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में ट्राइपसिनाइजेशन और प्लेटिंग द्वारा 1:2 और 1:5 अनुपात पर पारित करें।
    3. 7 दिन पर पश्चिमी दाग के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए pBabe-EYFP-CENP-एक क्रे संक्रमण के बिना निर्माण की प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए । धारा 4 में वर्णित पश्चिमी दाग विश्लेषण करें। परिणाम चित्रा 1B (लेन 1-4) में दिखाए गए हैं ।
    4. क्रे वायरस संक्रमण के साथ कॉलोनी वृद्धि परख के लिए, ब्लास्टिसिडिन एस की उपस्थिति में वायरस संक्रमण के बाद 14 दिनों के लिए बढ़ती कोशिकाओं को रखें (यानी, यहां प्रस्तुत परिणामों के लिए 17 दिन तक ब्लास्टिसिडिन एस युक्त मध्यम में कोशिकाओं को विकसित करें)।
  2. पीबे-पुरो-क्रे का रेट्रो-क्रे वायरस संक्रमण
    नोट: चरण 0 में 0 धारा 3.1 में 13 के दिन से मेल खाती है।
    1. दिन 0 से दिन 3: CENP के रेट्रोवायरसट्रांसफेक्शन-ए-/एफ आरपीई-1 कोशिकाओं का उपयोग कर pBabe-puro-Cre (B3027) अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के रूप में प्रदर्शन (विवरण के लिए धारा 1 देखें) । सुनिश्चित करें कि ब्लास्टिसिडिन एस (10 μg/mL) संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है ।
    2. दिन 4: प्लेट से अलग करने के लिए कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें। प्लेट 500 या 5,000 कोशिकाओं में ट्रिपलिटेट में 6-अच्छी संस्कृति प्लेट। डीएमईएम में संस्कृति कोशिकाएं: 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ एफ 12 माध्यम।
    3. 5 दिन: संस्कृति माध्यम में ब्लास्टिसिडिन एस (10 μg/mL) जोड़ें । 5,000 या 500 कोशिकाओं की चढ़ाना के लिए, ब्लास्टिसिडिन एस (10 μg/ml) के साथ कोशिकाओं का चयन करें ([3.2.7 में 14 दिन तक]) या 3-28 दिन ([3.2.8] में दिन 18 तक)) के वायरस संक्रमण के बाद (pBabe-EYFP-CENP-A constructs) ।
      नोट: इस कॉलोनी में वृद्धि परख में, pBabe-puro-Cre के ट्रांसफेक्शन के साथ pBabe-EYFP-CENP-A के ट्रांसफेक्शन के साथ जोड़ा जाता है । pBabe-EYFP-CENP-A का ट्रांसफेक्शन 3.1 में किया जाता है। pBabe-puro-Cre का ट्रांसफैक्शन 3.2.1 में किया जाता है।
    4. दिन 10 (रेट्रो-क्रे वायरस संक्रमण के 7 दिन बाद): रेट्रो-क्रे वायरस संक्रमण के बाद अंतर्जात CENP-A की प्रोटीन की कमी की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करें और/या pBabe-EYFP-CENP-A की प्रोटीन अभिव्यक्ति एक ही दिन 10 पर निर्माण ।
    5. उसी दिन 10 पर धारा 4 में वर्णित पश्चिमी ब्लॉटिंग करें। परिणाम चित्रा 1B (लेन 5-7) में दिखाए गए हैं।
    6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण (ऊपर धारा 2) करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि शेष अंतर्जात सेएनपी-ए एलील की निष्क्रियता के 7 दिनों बाद EYFP-CENP-A WT और K124R दोनों को सेंट्रोमेरे के लिए स्थानीयकृत किया गया। परिणाम चित्रा 1सी-1Eमें दिखाए गए हैं ।
    7. दिन 14: 5,000 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त प्लेट के साथ कॉलोनी वृद्धि परख प्रदर्शन करें। मेथनॉल में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें और क्रिस्टल वायलेट समाधान में 10 मिनट के लिए दाग (2.3% क्रिस्टल वायलेट, 0.1% अमोनियम ऑक्सालेट, 20% इथेनॉल (चित्रा 2Bदेखें)। ओपनसीएफयू सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कालोनियों की संख्या गिनें (चित्रा 2Cदेखें)।
    8. दिन 18: 500 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त प्लेट का उपयोग करें। फिक्स और दाग कोशिकाओं के रूप में चरण 3.2.7 में वर्णित (चित्रा 2Bदेखें) । कॉलोनियों की संख्या गिनें (चित्रा 2Cदेखें)।

4. पाBabe-EYFP-CENP-A का उपयोग कर पश्चिमी दाग विश्लेषण

नोट: चित्रा 1B और चित्रा 2A और EYFP-CENP-A प्रोटीन के लिए सामग्री की तालिका में इंगित एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए पहले वर्णित विधि 13 को देखें ।13

  1. विभिन्न वायरस संक्रमण के साथ उगाई जाने वाली कोशिकाओं को lysing द्वारा प्रोटीन को अलग करें। फिर, एसडीएस पेज जेल के एक कुएं में 20 माइक्रोग्राम प्रोटीन का उपयोग करें। प्रोटीन को पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें जैसा कि पहले13वर्णित है ।
  2. प्राथमिक-माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद झिल्ली 3x धोएं। इन्फ्रारेड इमेजिंग सिस्टम और/या इम्यूनोब्लॉट डिटेक्शन के लिए केमिल्यूमिनेसेंस इमेजर के साथ झिल्ली पर प्रोटीन बैंड का पता लगाएं और विश्लेषण करें । ये परिणाम चित्रा 1B और चित्रा 2 एमें दिखाए गए हैं ।
    1. इन्फ्रारेड इमेजिंग सिस्टम के लिए प्रोटीन बैंड का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए, पूरक कोडिंग फ़ाइलोंमें चरण 4.2.1 देखें।
    2. प्रोटीन बैंड का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए केमिल्यूमिनेसेंस इमेजर का उपयोग करें, पूरक कोडिंग फ़ाइलोंमें चरण 4.2.2 देखें। इस प्रणाली के लिए, एक अति संवेदनशील संवर्धित रसायनीय (ईसीएल) सब्सट्रेट(सामग्री की तालिका) काउपयोग करें।
    3. वैकल्पिक रूप से, पीवीडीएफ झिल्ली से पूर्व-इनक्यूबेटेड एंटीबॉडी को पट्टी करने के लिए पश्चिमी दाग स्ट्रिपिंग बफर का उपयोग करें और इसे पश्चिमी विश्लेषण के अगले मोड़ के लिए विभिन्न एंटीबॉडी के साथ फिर से लें। अनुभवजन्य रूप से उपयोग करने के लिए अनुकूलित इनक्यूबेशन समय और तापमान निर्धारित करते हैं।

5. सेल कल्चर, ट्रांसफैक्शन, और वीवो सर्वव्यापकता में पीक्यूसीएक्सआईपी-ईवाईएफपी-सेएनपी-ए का उपयोग करके परखता है

नोट: पीक्यूसीएक्सआईपी-वेक्टर से व्यक्त EYFP-CENP-A का प्रोटीन स्तर अंतर्जात CENP-A प्रोटीन स्तर से ~ 10x अधिक है। इस वेक्टर के उपयोग से ईवाईएफपी-सेएनपी-ए प्रोटीन की उच्च मात्रा, EYFP-CENP-A के सर्वव्यापकता बैंड का अवलोकन, और EYFP-टैग किए गए CENP-A (EYFP-CENP-A) प्रोटीन के सर्वव्यापकता की पहचान की सुविधा है।

  1. वीवो सर्वव्यापकता में ट्रांसफैक्शन पीक्यूसीएक्सआईपी-ईवाईएफपी-सेनपी-ए का उपयोग करके परखता है।
    1. बीज 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 कोशिकाओं में एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान । 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ उच्च ग्लूकोज डीएमईएम में संस्कृति कोशिकाएं।
      नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, अनुभवजन्य रूप से सीडिंग में उपयोग किए जाने वाले सेल घनत्व को निर्धारित करते हैं। न्यूनतम 1 मिलीग्राम कुल प्रोटीन प्राप्त करने के लिए एक इम्यूनोप्रिपिटेशन (आईपी) नमूने के लिए कम से कम 2 व्यंजन तैयार करें।
    2. 18 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के वातावरण मेंकोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. सीडिंग के बाद 17 घंटे पर, ट्रांसफैक्शन रीएजेंट तैयार करें।
    4. प्रत्येक pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (B3256)(टेबल 1)के मिश्रण से समाधान एक बनाओ और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट । सभी नमूनों में पीसीएनएन-एचए-सर्वव्यापकता (B2806) के 6.7 माइक्रोन प्लाज्मिड जोड़ें।
      नोट: सभी वैक्टर तालिका 1में सूचीबद्ध हैं ।
    5. 335 माइक्रोन कम सीरम माध्यम में क्रमशः 10.1 माइक्रोन ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स I और II को मिलाकर समाधान बी बनाएं, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: एक वैकल्पिक कदम केवल 40.2 माइक्रोन ट्रांसफैक्शन रीएजेंट III (पॉलीथीलीनीमाइन [पीई]; 1.0 मिलीग्राम/एमएल) को समाधान बी में जोड़ना या समाधान बी(सामग्री की तालिका)में ट्रान्फेक्शन रीएजेंट्स I और II के अलावा 40.2 माइक्रोन ट्राइंक्शन अभिकर्मक III जोड़ना है।
    6. समाधान ए और बी को एक साथ मिलाएं, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    7. सुसंस्कृत कोशिकाओं को एक बार पीबीएस के साथ धोने के बाद, समाधान ए और बी (यानी, डीएनए-लिपिड कॉम्प्लेक्स) का मिश्रण सीधे प्रत्येक व्यक्ति 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान में जोड़ें जिसमें 3.35 एमएल माइक्रोन कम सीरम माध्यम है।
      नोट: अंतिम एकाग्रता प्लाज्मिड के 1.67 μg/
    8. कोशिकाओं को 4.5 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर इनक्यूबेट करें। 4.5 घंटे के बाद, 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ मध्यम को उच्च ग्लूकोज डीएमईएम में बदलें।
    9. ट्रांसफेक्शन के बाद 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को संस्कृति। सेल lysates तैयारी के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  2. प्रोटीन की तैयारी एक मोती विरोधी जीएफपी एंटीबॉडी के साथ बंधे।
    1. इम्यूनोप्रिपिपिटेशन (आईपी) की एक प्रतिक्रिया के लिए प्रोटीन ए मोतियों के 25 माइक्रोन (50% v/v) लें। EtOH को हटाने के लिए कम से कम 3x बफर A1(सामग्री की तालिका)के साथ धोएं, और बफर ए1 (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% नॉनइडेट पी-40; 0.5% डिऑक्सीकोटेलेट; 0.5% एसडीएस; 1 एमएम ईडीटीए; कंप्लीट ईडीटीए-फ्री प्रोटीज अवरोधक रीजेंट) के साथ 50% समाधान बनाएं।
    2. ऊपर तैयार मोतियों में एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी (एंटी#76: होममेड एंटीबॉडी) का 2.0 माइक्रोन जोड़ें और शुद्ध मोतियों की मात्रा की तुलना में बफर A1 की 10x मात्रा जोड़ें।
    3. 4-18 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एंड-टू-एंड रोटेशन करें। एंड-टू-एंड रोटेशन के लिए इष्टतम समय लंबाई इम्यूनोप्रिपिपिटेशन की दक्षता के आधार पर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए।
    4. 1 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर मोतियों को अपकेंद्रित्र करें और अनबाउंड सुपरनेट को हटा दें। मोतियों का 50% (v/v) समाधान फिर से बनाने के लिए बफर A1 जोड़ें। आईपी की एक प्रतिक्रिया के लिए इस समाधान के 25 माइक्रोन (50% v/v) का उपयोग करें।
  3. इम्यूनोप्रिपिपिटेशन (आईपी) प्रोटीन का उपयोग कर एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ बंधे एक सेफरोज मोती।
    1. Lyse कोशिकाओं को बफर A1 में 5.1.9 चरण में सोनीशन और फ्रीज-गल प्रक्रिया द्वारा प्राप्त किया गया।
    2. प्रोटीन सांद्रता को मापें और विभिन्न आईपी नमूनों के बीच प्रोटीन की मात्रा को सामान्य करें। एसडीएस-पेज में 5% इनपुट सैंपल के रूप में चलाने के लिए प्रत्येक ट्यूब से 5% सैंपल निकालें।
      नोट: 5% इनपुट नमूना तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर रखता है, अगर यह एक दिन के भीतर लोड नहीं किया जाता है।
    3. बाकी 95% प्रोटीन के साथ 95% lysate मिलाएं जो एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी से बंधे हुए एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी से बंधे हैं जो स्टेप 5.2 में तैयार किए गए थे। 4-18 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एंड-टू-एंड रोटेशन करें।
      नोट: एंड-टू-एंड रोटेशन के लिए इष्टतम समय लंबाई अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए।
    4. सेंट्रलाइज प्रोटीन 1 मिनट के लिए 100 x ग्राम के साथ प्रोटीन (यानी इम्यूनोप्रिपसिट्स) के साथ एक मोती, और सुपरनैंट को हटा दें। इम्यूनोप्रिपिट्स को बफर A1 के साथ 1 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करके धोएं। इस चरण को 4x करें।
    5. 5% इनपुट और बाकी 95% इम्यूनोप्रिपिट्स को क्रमशः 2x और 4x SDS-पेज लोडिंग बफर14के साथ मिलाएं। इन दो नमूनों को 5 मिनट के लिए उबालें और फिर उन्हें विभिन्न गलियों में इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए 10.0% डीनाटरिंग एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल पर लोड करें। इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए बड़े एसडीएस-पेज जेल (जैसे, 17 सेमी x 15 सेमी) का उपयोग करें। यदि नमूने छोटे जेल में चलाए जाते हैं, तो स्पष्ट/तेज सर्वव्यापकता बैंड का निरीक्षण करना संभव नहीं हो सकता है ।
    6. पिछली रिपोर्ट8में दर्शाए गए एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए धारा 4 में वर्णित पश्चिमी दाग विश्लेषण करें । परिणाम चित्रा 2Aमें दिखाया गया है ।
    7. पीवीडीएफ झिल्ली से पूर्व-इनक्यूबेटेड एंटीबॉडी को बाहर निकालने के लिए पश्चिमी दाग स्ट्रिपिंग बफर का उपयोग करें और पश्चिमी दाग विश्लेषण के अगले दौर के लिए विभिन्न एंटीबॉडी के साथ इसे फिर से लें।

6. मास स्पेक्ट्रोमेट्री EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती की सर्वव्यापकता साइट की पहचान करने के लिए

  1. pQCXIP-EYFP-CENP-A का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए ट्रांसफेक्शन।
    1. बीजCENP-A-/F RPE-1 कोशिकाओं में एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान । जांच करें कि सेल घनत्व प्रति डिश 36.2 x10 5 कोशिकाएं हैं। 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ उच्च ग्लूकोज डीएमईएम में संस्कृति कोशिकाएं। कम से कम 10 मिलीग्राम कुल प्रोटीन प्राप्त करने के लिए एक इम्यूनोप्रिपिटेशन (आईपी) नमूने के लिए कम से कम 20 व्यंजन तैयार करें (5.3 देखें)।
      नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, अनुभवजन्य रूप से सीडिंग में उपयोग करने के लिए सेल घनत्व निर्धारित करते हैं।
    2. 18 घंटे के लिए 5% सीओ2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स ~ 23 एच फैलने के बाद तैयार करें (24 एच पॉइंट ट्रांसफेक्शन का 0 एच पॉइंट है)।
    3. सीडिंग के बाद 17 घंटे में, ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स तैयार करें और कोशिकाओं को (4.1.3) के रूप में स्थानांतरित करें। संक्रमित कोशिकाओं में पीसीजीएन-एचए-सर्वव्यापकाइन (B2806) और pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) होता है।
    4. ट्रांसफेक्शन के बाद 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के वातावरण मेंकोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सेल लिएट के लिए सेल लीजिए।
    5. बफर A1 में Lyse कोशिकाओं और (5.2) और (5.3) के रूप में इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रदर्शन करते हैं। इन दोनों इम्यूनोप्रिपिटेशन को निम्नलिखित (6.1.6) और (6.1.7) के रूप में चलाएं।
      नोट: (6.1.6) में, मानक ट्रिस-ग्लाइसिन जैल में नमूना चलाएं। (6.1.7) में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4%-12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जैल में नमूना चलाएं। चर्चा भी देखें।
    6. EYFP-CENP-A सर्वव्यापकता की पुष्टि करने के लिए कुल इम्यूनोप्रिपिट्सेंट के 10% के लिए एक नमूना रखें और धारा 5 में वर्णित सर्वव्यापी EYFP-CENP-A की स्थिति को ठीक से निर्धारित करने के लिए। इस नमूने को मानक ट्रिस-ग्लाइसिन जैल में चलाएं। SDS-पेज और पश्चिमी दाग (५.३) के रूप में प्रदर्शन किया गया ।
    7. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए कुल इम्यूनोप्रिपिपिटेंट के 90% के लिए एक और नमूना रखें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4%-12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जैल के दो कुओं के भीतर इस नमूने को चलाएं। कूमासी ब्लू सॉल्यूशन का उपयोग करके कूमासी ब्लू धुंधला करें। उत्पाद शुल्क और 50-70 केडीए (ख्यात मोनो-यूबी-EYFP-CENP-A K124R क्षेत्र) के जेल क्षेत्र को काट दिया। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए इस जेल क्षेत्र का उपयोग करें।
  2. इन-जेल पाचन का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण।
    1. ब्याज के प्रत्येक जेल टुकड़े को छोटे टुकड़ों (1 मिमी2)में पासा करें और इसे प्रोटीन कम बाध्यकारी ट्यूबों के 0.5 एमएल में रखें।
    2. 25 m NH4HCO3,भंवर 10-15 मिनट में 100 μL 50% (v/v) एसीटोनीट्रिल के साथ धोएं, नीचे स्पिन करें, सुपरनॉट को त्यागें, 3x दोहराएं।
    3. जेल के टुकड़ों को सुखाने के लिए 30 मिनट के लिए बेंचटॉप वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके नमूना केंद्रित करें।
    4. 10 एनजी/μL अनुक्रमण ग्रेड ट्रिप्पसिन के 10 μL जोड़ें और जेल के टुकड़ों को 5 मिनट के लिए रीहाइड्रेट करने दें ।
    5. 25 एमएमएम एनएच4एचसीओ3 को जेल के टुकड़ों को कवर करने के लिए पर्याप्त जोड़ें, रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाएं।
    6. पचा सुपरनेट को एक साफ 0.65 एमएल सिलिकॉन ट्यूब में स्थानांतरित करें। 50% (v/v) एसीटोनिट्रिल/5% (v/v) फॉरमिक एसिड (30 माइक्रोन या कवर करने के लिए पर्याप्त), भंवर 10 मिनट, स्पिन और एक ही निष्कर्षण ट्यूब में स्थानांतरित जोड़ें । 3x दोहराएं।
    7. जेल के टुकड़ों में 10 माइक्रोन एसीटोनीट्रील जोड़ें, भंवर 5 मिनट, और नीचे स्पिन। सुपरनेट को उसी ट्यूब में ट्रांसफर करें।
    8. 2 माइक्रोन के लिए बेंचटॉप वैक्यूम सांद्रता का उपयोग कर नमूनों को ध्यान केंद्रित करें, 8 μL 3% (v/v) एसीटोनिट्रिल/2% (v/v) फोर्मिक एसिड को नमूने में जोड़ें, 15 मिनट के लिए भंवर, और 30 मिनट के लिए १६,००० x ग्राम पर नीचे स्पिन करें । नमूने बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए तैयार हैं ।
    9. एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण(सामग्री की तालिका) केसाथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके एलसी-एमएस/एमएसकेसाथ एमएस डेटा अधिग्रहण करें।
    10. रिवर्स चरण तरल क्रोमेटोग्राफी (आरपीएलसी) कॉलम पर पुनर्गठित नमूने के 8 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
    11. पेप्टाइड्स को 60 मिनट में सॉल्वेंट बी के 2-80% ढाल के साथ अलग करें। सुनिश्चित करें कि ढाल में सॉल्वेंट बी का बढ़ता प्रतिशत 2% से 40 मिनट में 22%, 22% से 35% सॉल्वेंट बी 12 मिनट में, फिर 4 मिनट में 80% सॉल्वेंट बी पर चढ़ना, और अंत में अंतिम 4 मिनट के लिए 80% सॉल्वेंट बी पर पकड़ना शामिल है। 300 nL/min पर प्रवाह दर स्थिर सेट करें।
      नोट: सॉल्वेंट ए में 0.1% फॉरमिक एसिड और 2% एसीटोनीट्रील, सॉल्वेंट बी में 0.1% फॉरमिक एसिड और 98% एसीटोनिट्रील होता है। सभी सांद्रता मात्रा/मात्रा के रूप में दिखाई जाती है ।
    12. डेटा-निर्भर अधिग्रहण मोड का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा एकत्र करें। संक्षेप में, 250 एमएस के लिए 350-1500 मीटर/जेड में एमएस स्पेक्ट्रा एकत्र करें। आगे विखंडन के लिए चार्ज 2-5 के साथ शीर्ष 50 तीव्र अग्रदूत का चयन करें। 100-2000 मीटर/जेड में एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा को 100 एमएस के लिए एकत्र करें, 15 एस के लिए पुनर्चयन से अग्रदूत आयनों को बाहर करें ।
    13. डेटाबेस खोज के लिए, डेस्कटॉप पर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा का विश्लेषण करने के लिए वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर (सामग्रीकी तालिका देखें) खोलें।
    14. नई सर्च करने के लिए टॉप मेन्यू पर'एलसी'बटन पर क्लिक करें। इसके बाद ओरिजनल एमएस रॉ डाटा फाइल्स अपलोड करने के लिए'ऐड'बटन पर क्लिक करें।
    15. डाटाबेस खोज विधि के रूप में"पैरागॉन विधि"में"मानव प्रोटीन आईडी"का चयन करें। यूनिप्रॉट होमो सेपियंस डेटाबेस (जिसमें 160,566 दृश्य, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640) के खिलाफ मूल एमएस रॉ डेटा फ़ाइलों को खोजें।
    16. निम्नलिखित के रूप में खोज मापदंडों को सेट करें: पाचन एंजाइम के रूप में ट्राइप्सिन का चयन करें, 3 लापता दरार, 4 संशोधनों और पेप्टाइड प्रति 2-5 शुल्कों की अनुमति दें। पहली खोज के लिए 20 पीपीएम तक बड़े पैमाने पर त्रुटि सेट करें, और खंडित आयनों के लिए 0.02 डीए। प्रोटीन, पेप्टाइड और संशोधन साइटों के लिए झूठी खोज दर (एफडीआर) थ्रेसहोल्ड 1% से कम निर्दिष्ट करें। डिफ़ॉल्ट मूल्यों के लिए सॉफ्टवेयर में अन्य सभी मापदंडों को सेट करें (बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए चित्र 3 देखें)।
    17. टॉप मेन्यू के दाईं ओर'सेव ए'बटन पर क्लिक करें, सर्चिंग रिजल्ट्स को स्टोर करने के लिए फोल्डर चुनें, सर्च नाम डालें और'सेव'बटन पर क्लिक करें।
    18. सर्चिंग शुरू करने के लिए टॉप मेन्यू के दाईं ओर'प्रोसेस'बटन पर क्लिक करें। खोज समाप्त होने के बाद, दर्ज खोज नाम वाला डेटा चयनित फ़ोल्डर में स्वचालित रूप से संग्रहीत हो जाएगा। डाटा को सॉफ्टवेयर एफ द्वारा आसानी से खोला जा सकता है।
    19. किसी भी विशिष्ट पेप्टाइड के एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए, खोज परिणामों को सॉफ्टवेयर एफ द्वारा खोलने के लिए डबल क्लिक करें। सबसे पहले मेन्यू के शीर्ष पर प्रोटीन लिस्ट में मौजूद प्रोटीन पर क्लिक करें, फिर मेन्यू के बीच पर पेप्टाइड पर क्लिक करें। इस पेप्टाइड के एमएस/एमएस को मेन्यू के नीचे दिखाया गया है ।
    20. एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा को निर्यात और सहेजने के लिए, मेनू के नीचे एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा पर सही क्लिक करें, कॉपी का चयन करें और फिर पीपीटी या डॉक्टर प्रारूप जैसे उपयुक्त फ़ाइल पर चिपकाएं ।

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Representative Results

EYFP-CENP-A K124 उत्परिवर्ती सर्वव्यापी, HJURP के साथ बातचीत से पता चलता है, और सेंट्रोमेरे स्थानीयकरण में कोई दोष न तो सेल घातकता । यहां Fachinetti एट अल द्वारा रिपोर्ट प्रणाली ( २०१७)6 फिर से गठित किया गया था: diploid मानव (RPE-1) कोशिकाओं में एक बाधित और एक ' floxed ' CENP-एक allele(CENP-A-/F),-/FEYFP-CENP-A से व्यक्त किया गया था pBabe-EYFP रेट्रोवायरस वेक्टर से व्यक्त किया गया था । इस प्रणाली में, CENP-A-/F allele से अंतर्जात CENP-A-/F की अभिव्यक्ति क्रेस रिकॉम्बिनेंट6द्वारा बाधित किया जा सकता है । EYFP-CENP-एक WT या K124R उत्परिवर्ती(चित्रा 1A),जो अंतर्जात CENP-A के नुकसान को बचाता है के जीन निर्माण, जब रेट्रोवायरल एकीकरण किया गया था स्थिर व्यक्त किया गया । सेनपी-ए-/एफ एलील से अंतर्जात सेनपी-ए-/F की शेष अभिव्यक्ति को फिर क्रे रिकॉम्बिनेंट द्वारा बाधित किया गया । क्रे रिकॉम्बिनेज(चित्रा 1 B,लेन 5-7) के शामिल होने के 7 दिन बाद अंतर्जात सेनपी-ए की अभिव्यक्ति का पता नहीं चला । दोनों EYFP-CENP-एक WT और K124R प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रारंभिक अंतर्जात CENP-एक प्रोटीन स्तर(चित्रा 1B,लेन 3, 4, 6, और 7) के लिए एक समान स्तर पर पाया गया था । दोनों EYFP-CENP-एक WT और K124R म्यूटेंट CENP-A-Aसे अंतर्जात CENP-A की शेष अभिव्यक्ति के व्यवधान के बाद 7 दिनों में सेंट्रोमेरे स्थानीयकरणदिखाया-एक-/एफ allele(चित्रा 1सी-1E)। दोनों EYFP-CENP-एक WT और K124R उत्परिवर्ती फ्लैग टैग या बिना चलने वाले CENP-A WT और K124R उत्परिवर्ती(चित्रा 2A)के मामले के विपरीत HJURP के साथ सर्वव्यापकता और बातचीत से पता चला , फ्लैग टैग या बिना टैग वाले सेनपी-ए)8के लिए नहीं दिखाया गया डेटा । शेष अंतर्जात सेनपी-ए एली(चित्रा 2बी)के व्यवधान के 14 दिन बाद कॉलोनी की वृद्धि परख का प्रदर्शन करके सेल व्यवहार्यता को भी संबोधित किया गया था । दोनों EYFP-CENP-एक WT और K124R म्यूटेंट शेष अंतर्जात CENP-एक allele(चित्रा 2B और 2C)के व्यवधान के 14 दिन बाद ' बचाया ' कालोनियों की एक समान संख्या दिखाया । इस प्रकार, हमारे परिणाम Fachinetti एट अल6द्वारा सूचित उन लोगों के साथ लाइन में हैं ।

EYFP-CENP-A K124R में lysine ३०६ (K306) में सर्वव्यापकता बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पता चला था । यह पाया गया कि दोनों EYFP-CENP-एक WT और K124R उत्परिवर्ती सर्वव्यापी और HJURP के साथ बातचीत से पता चलता है झंडा टैग या बिना टैग CENP-एक WT और K124R उत्परिवर्ती(चित्रा 2A;डेटा के लिए नहीं दिखाया गया है झंडा टैग या बिना टैग CENP-A)8के मामले के विपरीत । इन परिणामों से पता चलता है कि EYFP प्रोटीन का संलयन EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती में K124 के अलावा एक lysine पर सर्वव्यापकता लाती है, और एक और साइट पर यह सर्वव्यापकता एचयूआरपी के साथ EYFP-CENP-A K124R की बातचीत को बढ़ावा देता है । EYFP-CENP-A K124R में lysine ३०६ (K306) में सर्वव्यापकता आईपी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण(चित्रा 3A और चित्रा 3B)द्वारा CENP-A-/F कोशिकाओं में पता चला था ।-/F EYFP-CENP-A K124R में lysine ३०६ (K306) CENP-A में lysine ५६ (K56) से मेल खाती है । एक साथ लिया, हमारे परिणामों का सुझाव है कि बड़े आकार के प्रोटीन के संलयन (जैसे, EYFP टैगिंग) CENP-A में K124 के अलावा एक lysine पर सर्वव्यापकता लाती है, और एक और साइट पर यह सर्वव्यापकता रोकता है/मूल K124R एकल उत्परिवर्ती फेनोटाइप मास्क ।

Figure 1
चित्रा 1: EYFP-CENP-A K124 उत्परिवर्ती सेंट्रोमर में स्थानीयता । (क)एन टर्मिनस में ईवाईएफपी (संवर्धित पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ टैग किए गए विभिन्न सेनप-ए प्रोटीन के अभ्यावेदन। लाल अक्षर संकेत निर्माण (बाएं) में K124R अमीनो एसिड प्रतिस्थापन की स्थिति को चिह्नित करते हैं। इस अध्ययन में किए गए परख के परिणाम दिखाए गए हैं (दाएं)। (ख)पश्चिमी दाग विश्लेषण में पता लगाने योग्य अंतर्जात CENP-A की उपस्थिति नहीं दिखाई दी । इम्यूनोब्लॉट्स विश्लेषण क्रे संक्रमण से पहले और बाद में संकेतित बचाव निर्माण (सीए 45 केडीए) की अभिव्यक्ति की उपस्थिति की जांच करने के लिए। पीबेबे-EYFP-निर्माण की प्रोटीन अभिव्यक्ति क्रे संक्रमण (लेन 1-4) से पहले पुष्टि की गई थी, साथ ही क्रे संक्रमण (लेन 5-6) के बाद। अंतर्जात CENP-A प्रोटीन (सीए 15 केडीए) की अनुपस्थिति की पुष्टि क्रे संक्रमण (लेन 5-6) के 7 दिनों बाद एकत्र किए गएसेनपी-ए-/-सेल लाइनों में की गई थी । गप्पे प्रोटीन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता था। (C)EYFP-CENP-A K124 उत्परिवर्ती सेंट्रोमर में स्थानीयता । CENP-A-/F RPE-1 कोशिकाओं को संकेतित निर्माण के साथ सहसंस्रित किया गया, रेट्रो-क्रे वायरस संक्रमण के बाद 7 दिन सुसंस्कृत, और इम्यूनो दाग । DAPI (नीला), EYFP (हरा), और अंतर्जात CENP-बी (लाल), जो एक सेंट्रोमेरे स्थान नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, का दृश्य। स्केल बार, 10 माइक्रोन। (घ)में दिखाए गए स्थानीयकरण पैटर्न (सी) को हिस्टोग्राम के रूप में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है । EYFP-सकारात्मक संकेतों के साथ 200 से अधिक इंटरफेज कोशिकाओं को प्रति प्रयोग (एन 3 प्रयोग) गिना गया, और औसत प्रतिशत (± एसडी) दिखाए जाते हैं। ''अन्य (गैर-सेंटीमोनेरे) '' में ज्यादातर क्षतिग्रस्त कोशिकाओं, मृत कोशिकाओं या इंटरफेज में न्यूक्लियोलर स्थानीयकरण वाली कोशिकाओं को दर्शाया गया है, जिन्हें ट्रांसफैक्शन या अन्य उपचारों के कारण देखा गया था। कोई महत्वपूर्ण (n.s.) अंतर K124R में WT (छात्र टी परीक्षण) की तुलना में मनाया गया था । (ई)(सी) में दिखाए गए सेंट्रोमेरेस पर EYFP-व्युत्पन्न संकेतों की मात्रा निर्धारित की गई थी । संकेतों को डब्ल्यूटी के उन लोगों के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और मतलब प्रतिशत (± एसईएम) दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: EYFP-CENP-A K124 उत्परिवर्ती सर्वव्यापी है और HJURP के साथ बातचीत, और सेल व्यवहार्यता EYFP-CENP-A के K124R उत्परिवर्तन से प्रभावित नहीं था । (A)EYFP-CENP-A K124 उत्परिवर्ती सर्वव्यापी है और HJURP के साथ बातचीत करता है । वीवो सर्वव्यापकता परख में। CENP-A-/F RPE-1 कोशिकाओं को संकेतित निर्माण के साथ संक्रमित थे । एंटी-जीएफपी रैबिट पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके कुल सेल lysates (इनपुट) और इम्यूनोप्रिपिट्स (आईपी) के 5% में प्रोटीन का पता संकेत एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा लगाया गया था। ख्यात डि-यूबी-ईवाईएफपी-सेएनपी-ए (**) और ख्यात मोनो-यूबी-ईवाईएफपी-सेएनपी-ए (*) संकेत दिए गए हैं। इस आंकड़े को नीकुरा एट अल8से संशोधित किया गया है । (ख)कॉलोनी के प्रतिनिधि चित्र ईवाईएफपी-सेएनपी-ए के इंगित ट्रांसफेक्टेंट के लिए दो अलग-अलग स्थितियों ([1] और [2]) की योजना (शीर्ष) में दिखाए गए हैं। (ग)हिस्टोग्राम (बी) में प्रयोगों के कॉलोनी अस्तित्व का सारांश । 3 से अधिक स्वतंत्र प्रयोगों (एन 3) के औसत प्रतिशत (± एसईएम) को EYFP-CENP-A WT (EYFP-WT) में जीवित उपनिवेशों के प्रतिशत के साथ सामान्यीकृत किया जाता है। पी एंड एलटी; 0.0001 और * * पी एंड एलटी; 0.01 EYFP नियंत्रण (छात्र का टी-टेस्ट) के साथ तुलना में। कोई महत्वपूर्ण (n.s.) अंतर K124R में WT (छात्र टी परीक्षण) की तुलना में मनाया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सर्वव्यापी EYFP-CENP-A K124R पेप्टाइड्स के टुकड़े बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा पाए गए थे। (A)आरआईपी-1 सेनपी-ए-एफकोशिकाओं में EYFP-CENP-A K124R के lysine ३०६ (K306) में सर्वव्यापकता के सबूत । EYFP-CENP-A K124R के lysine ३०६ (K306) CENP-A में lysine ५६ (K56) से मेल खाती है । एलक्यूकेएलआरजीबेथलियर पेप्टाइड (कवरेज 95.9%, कॉन्फिडेंस 87.8%) टकराव-प्रेरित वियोजन विश्लेषण द्वारा पहचाना जाता है। विखंडन के दौरान पता चला (ए) के स्पेक्ट्रा में बी (ग्रीन) और वाई (लाल) आयनों के एम/जेड (डीए) मूल्यों को (बी) की तालिका में हरे रंग के साथ हाइलाइट किया जाता है । K306 के सर्वव्यापकता की पुष्टि बी-3 आयन (एम/जेड 753.4730) और वाई-8 आयन (एम/जेड 1350.8328) के एलआरजी मोटिफ (अपूर्ण दरार) द्वारा की जाती है। (ख)तालिका में बी (ग्रीन) और वाई (लाल) आयनों के एम/जेड (डीए) मूल्यों को (ए) के स्पेक्ट्रा में उजागर किया गया है । (बी) की तालिका में LQK[Umc]STHLLIR LQKLRGGSTHLLIR पेप्टाइड (ए) में दिखाया इंगित करता है । इन आंकड़ों को नीकुरा एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बी संख्या प्रासंगिक विशेषता (ओं) संदर्भ स्रोत
B3027 pBabe-puro-Cre नीकुरा एट अल., 2019 डॉ अमृता एश्तेकर, डॉ लॉरेंस एस किर्श्नर
B3182 pBabe-EYFP नीकुरा एट अल., 2019 -
B3161 pBabe-EYFP-CENP-एक WT नीकुरा एट अल., 2019 डॉ डेनियल फाचिनेट्टी, डॉ डॉन डब्ल्यू क्लीवलैंड
B3164 pBabe-EYFP-CENP-A K124R नीकुरा एट अल., 2019 डॉ डेनियल फाचिनेट्टी, डॉ डॉन डब्ल्यू क्लीवलैंड
B3031 पीएसपीएएक्स2 नीकुरा एट अल., 2019 डॉ जॉन थॉम्पसन, डॉ गुस्तावो डब्ल्यू लियोन
D3032 pMD2.g नीकुरा एट अल., 2019 डॉ जॉन थॉम्पसन, डॉ गुस्तावो डब्ल्यू लियोन
B3189 पीजीपी नीकुरा एट अल., 2019 डॉ केंजी तागो (जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी, जापान)
B3190 पीसीआई-वीएसवीजी नीकुरा एट अल., 2019 डॉ केंजी तागो (जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी, जापान)
B3001 पीपीएम नीकुरा एट अल., 2019 -
B3252 pQCXIP-EYFP नीकुरा एट अल., 2019 -
B3254 pQCXIP-EYFP-CENP-A WT नीकुरा एट अल., 2019 -
B3256 pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R नीकुरा एट अल., 2019 -
B2806 पीसीजीएन-एचए-सर्वव्यापी नीकुरा एट अल., 2019 -

तालिका 1: प्लाज्मिड वैक्टर इस अध्ययन में उपयोग किया जाता है।

बी संख्या हेल्पर/पैकेजिंग प्लाज्मिड वैक्टर संयोजन 1 कॉम्बिनेशन 2 संयोजन 3
B3031 psPAX2 (लेंटीविरायल गैग/पोल वेक्टर) 2μg
D3032 pMD2.g (लेंटीविरायल एनवी वेक्टर) 2μg
B3189 पीजीपी (रेट्रोवायरल गैग/पोल वेक्टर) 2μg
B3190 पीसीआई-वीएसवीजी (रेट्रोवायरल एनवी वेक्टर) 2μg
B3001 पीपीएम (एम्फोट्रोपिक हेल्पर वेक्टर एन्कोडिंग रेट्रोवायरल गैग-पोल-एनवी) 2μg

तालिका 2: हेल्पर/पैकेजिंग प्लाज्मिड वैक्टर के संयोजन (1.1.3) में उपयोग किए जाते हैं: पीबेबे-EYFP-CENP-A निर्माणों का रेट्रोवायरस ट्रांसफेक्शन।

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Discussion

यहां हमने EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती के सर्वव्यापकता की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के तरीकों का वर्णन किया, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि EYFP टैगिंग सेनपी-ए K124R उत्परिवर्ती प्रोटीन8में एक अलग lysine पर सर्वव्यापकता लाती है । हमारे परिणामों में, हमने ईवाईएफपी-सेएनपी-ए के 124आर में लिसिन 306 (K306) पर सर्वव्यापकता की सफलतापूर्वक पहचान की, जो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से से सेनपी-ए में लिसिन 56 (K56) के अनुरूप है। यहां वर्णित बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण एक नकल विधि है क्योंकि हम पहले सेन्प-ए डब्ल्यूटी-फ्लैग 12 की लिसाइन 124 (K124) सर्वव्यापकता साइट की पहचानकरतेहैं। इसलिए, इस विधि को विभिन्न टैग और अन्य सेंट्रोमेरे-किनेटोकोर प्रोटीन के साथ मानव सेन्प-ए प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है। एलसी-एमएस/एमएस पर आधारित मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण को आमतौर पर प्रोटीन के व्यापक स्पेक्ट्रम के संभावित पोस्टट्रांसलेक्शनल संशोधनों (पीटीएमएस) की पहचान करने के लिए स्वीकार किया जाता है । हमारे संयोजन कई परख से मिलकर तरीके/विश्लेषण (यानी, वीवो सर्वव्यापकता परख में, कॉलोनी वृद्धि परख, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण) शोधकर्ताओं के लिए सिफारिश की जा सकती है जो अपने लक्ष्य प्रोटीन (एस) के सर्वव्यापकता (एस) की कार्यात्मक भूमिकाओं की पहचान करने में रुचि रखते हैं ।

हालांकि, इस प्रोटोकॉल में सर्वव्यापक बैंड का पता लगाने और/या पूरे कोशिका चक्र के दौरान जीवित कोशिकाओं या एक विशिष्ट एकल कोशिका में इन प्रोटीनों की साइट-विशिष्ट सर्वव्यापकता (ओं) की पहचान को शामिल नहीं किया गया है । इन वर्षों में ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण नाटकीय रूप से विकसित किए जाते हैं और सेल-सिग्नलिंग सिस्टम के मात्रात्मक अध्ययनों पर उच्च प्रभाव डालते हैं। ऑप्टोजेनेटिक्स ने मूल रूप से ऐसे दृष्टिकोण प्रदान किए हैं जो एकल-घटक, माइक्रोबियल ऑप्सिन-आधारित प्रणालियों का उपयोग करके व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को ठीक से सक्रिय या बाधित करते हैं। वर्तमान में, अभूतपूर्व स्थानिक कीट परिशुद्धता के साथ प्रोटीन गतिविधि को प्राकृतिक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फोटोरिसेप्टर्स का शोषण करके नियंत्रित किया जा सकता है, और विभिन्न आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड उपकरण प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन15सहित कई जैविक प्रक्रियाओं के प्रकाश-नियंत्रण की अनुमति देते हैं। इसलिए, ऑप्टोजेनेटिक्स सेलुलर और पूरे जीव के स्तर पर स्पेटिओटेम्पोरल प्रोटीन किनेज सिग्नलिंग की जांच करने के लिए एक आशाजनक प्रणाली है। प्रकाश नियंत्रित प्रोटीन kinases की संख्या तेजी से विस्तार हो रहा है, हालांकि वर्तमान संख्या अभी भी सीमित है । हालांकि, प्रकाश नियंत्रित प्रोटीन सर्वव्यापकता के विकास में देरी हो रही है, और फोटोरिसेप्टर के उच्च आणविक वजन टैगिंग से डब्ल्यूटीई और उत्परिवर्ती प्रोटीन दोनों के सर्वव्यापकता बाधित हो सकती है और कार्यात्मक रूप से देशी प्रोटीन फ़ंक्शन को वनों की आपूर्ति के रूप में बदल सकता है। इसलिए, कम आणविक वजन टैगिंग या जांच तकनीक के विकास के लिए तत्काल सर्वव्यापी कल्पना और/या रहने वाले सेलुलर और पूरे जीव के स्तर पर स्थानिक प्रोटीन सर्वव्यापकता संकेत की जांच करने के लिए आवश्यक है ।

वर्तमान अध्ययन में, प्रमुख जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के परिणाम पर ठीक से चर्चा करने के लिए EYFP वेक्टर नियंत्रण नियंत्रण परख और विश्लेषण (इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण, कॉलोनी आउटग्रोथ परख, और वीवो सर्वव्यापकता परख में) के लिए आवश्यक है। EYFP-प्रोटीन के साथ गैर-विशिष्ट बातचीत अक्सर इम्यूनोप्रिपिशन प्रयोग में देखी जाती है, इस प्रकार EYFP वेक्टर नियंत्रण EYFP-फ्यूज्ड प्रोटीन (एस) की सही बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए अपरिहार्य है। हमारे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण EYFP-CENP-A K124R आरपीई-1CENP-A-/F कोशिकाओं में व्यक्त का उपयोग कर EYFP पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम में lysine साइटों पर सर्वव्यापकता नहीं दिखा था । हालांकि, अन्य अज्ञात परिस्थितियों में, यह उम्मीद की जा सकती है कि EYFP पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम में लिसिन साइट EYFP में सर्वव्यापी है- और/या उच्च आणविक वजन के अन्य टैग किए गए फ्यूजन प्रोटीन ।

कॉलोनी वृद्धि के लिए, रेट्रो-क्रे वायरस संक्रमण और पीबेबे-ईवाईएफपी-सेएनपी-ए निर्माणों की प्रोटीन अभिव्यक्ति के बाद अंतर्जात CENP-ए की प्रोटीन कमी की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने की सिफारिश की जाती है। इस तरह, हम न्याय कर सकते हैं कि कॉलोनी आउटग्रोथ फेनोटाइप वास्तव में बहिर्जात सीएनपी-ए डब्ल्यूटीई या म्यूटेंट की एकमात्र अभिव्यक्ति के कारण है। किसी भी पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए, यदि पश्चिमी दाग विश्लेषण के अगले मोड़ के लिए विभिन्न एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को फिर से बनाने के लिए अलग-अलग रूप से अलग-अलग रूप से उपयोग किया जाता है, तो किसी को विभिन्न एंटीबॉडी के साथ अगले मोड़ के दाग के लिए पिछले मोड़ के दाग के रूप में समान मात्रात्मक पहचान प्रणाली का उपयोग करना चाहिए। किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि पिछली बारी के दाग में बैंड विभिन्न एंटीबॉडी के साथ अगली बारी के दाग में झिल्ली के उद्देश्य से क्षेत्र में अज्ञेय हैं। या पिछले बारी के दाग के रूप में एक ही मात्रात्मक पता लगाने प्रणाली का उपयोग करें और जांच अगर केवल माध्यमिक पिछले बारी के दाग में इस्तेमाल एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन अलग एंटीबॉडी के साथ अगली बारी के दाग शुरू करने से पहले प्रोटीन बैंड का पता लगाने के लिए नेतृत्व नहीं करता है । वीवो सर्वव्यापकता परख के लिए, बड़ा एसडीएस-पेज जेल (जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण I या II) चलाने के लिए उपकरण का उपयोग करके बड़ा एसडीएस-पेज जेल चलाना महत्वपूर्ण है। अनुभवजन्य रूप से, बड़ा एसडीएस-पेज जेल प्रोटीन बैंड को स्पष्ट रूप से अलग करेगा और बेहोश बैंड का पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाएगा जो छोटे जेल में खराब पाया जा सकता था (यानी, प्रोटीन बैंड बड़े जेल में तेज दिखाई देते हैं)।

एक विशिष्ट प्रोटीन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएमएस) को मैप करने के लिए उचित एसडीएस-पेज जेल का चयन करना अत्यंत महत्वपूर्ण है। एसडीएस-पेज के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली जेल प्रणाली लाम्ली सिस्टम है, जो ट्राइस-ग्लाइसिन जैल का उपयोग करता है जिसमें स्टैकिंग जेल घटक और समाधान जेल घटक शामिल हैं। इस शास्त्रीय प्रणाली में, स्टैकिंग जेल (ट्राइस, पीएच 6.8) और हल जेल (ट्रिस, पीएच 8.8) में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स की पीएच और आयनिक ताकत जेल (ट्राइस, पीएच 8.3) को चलाने के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर से अलग हैं। बैंड विरूपण, संकल्प की हानि, या विरूपण साक्ष्य बैंड Laemmli प्रणाली के अत्यधिक क्षारीय ऑपरेटिंग पीएच के कारण हो सकता है। पिछली रिपोर्ट में लाम्ली सिस्टम16के साथ खराब बैंड रिजॉल्यूशन के प्रमुख कारणों का वर्णन किया गया था, जिसमें उच्च पीएच पर पॉलीएक्रीलामाइड के हाइड्रोलिसिस के कारण अस्थिरता और समाधान जेल की छोटी समाप्ति अवधि शामिल है, नमूना प्रोटीन के रासायनिक परिवर्तन, प्रोटीन के सिस्टीन अवशेषों के कम disulfides के reoxidation, और पीएच ५.२ पर Laemmli नमूना बफर में 95-100 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग के साथ प्रोटीन के Asp-Pro बांड के दरार । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4%-12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जैल बीआईएस-ट्रिस एचसीआई-बफर (पीएच 6.4) हैं और पारंपरिक ट्राइस-ग्लाइसिन जैल16के विपरीत पीएच सीए 7.0 पर संचालित हैं। Laemmli प्रणाली के साथ तुलना करने वाले कई गुण बीआईएस-ट्रिस सिस्टम16के तटस्थ ऑपरेटिंग पीएच द्वारा उत्पन्न होते हैं, जिसमें उच्च स्थिरता और समाधान जेल की लंबी समाप्ति अवधि, तटस्थ पीएच पर इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान बढ़ी हुई नमूना प्रोटीन स्थिरता शामिल है, जिससे तेज बैंड संकल्प और सटीक परिणाम होते हैं, और डिसल्फाइड की पूरी कमी और एएसपी-प्रो बांड के दरार की अनुपस्थिति होती है। इस रिपोर्ट में, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4%-12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जैल का उपयोग करके EYFP-CENP-A K124R प्रोटीन(चित्रा 3)के पीटीएमएस को सफलतापूर्वक मैप कर सकते हैं। इसलिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4%-12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जैल को इस उद्देश्य के लिए उपयोग करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।

एक विशिष्ट प्रोटीन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएमएस) के मानचित्रण के लिए, एलसी-एमएस/एमएस के साथ मिलकर लक्ष्य प्रोटीन के इन-जेल पाचन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इस अध्ययन में, हमने आत्मीयता शुद्धिकरण-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी-एमएस) रणनीति का उपयोग करके सर्वव्यापी साइटों EYFP-CENP-A K124R की पहचान करने की मांग की। इसलिए, पहला महत्वपूर्ण कदम EYFP-CENP-A K124R प्रोटीन की एक बड़ी राशि प्राप्त करने के लिए उच्च शुद्धता के साथ EYFP-CENP-A K124R ओवरएक्सप्रेपिंग कोशिकाओं से इम्यूनोप्रिपिटेशन का उपयोग कर, जो बहुत पहचान और EYFP-CENP-A K124R के सर्वव्यापकता साइटों की पुष्टि की सुविधा सकता है एलसी/एमएस द्वारा है । गैर-सर्वव्यापक EYFP-CENP-A K124R प्रोटीन के हस्तक्षेप को कम करने के लिए, एंटी-जीएफपी, एंटी-एचए (यूबी), एंटी-सर्वव्यापकता (देखें अनुभाग [6.1.6]), और कूमासी ब्लू स्टेनिंग (देखें अनुभाग [6.1.7]) के पश्चिमी धब्बे को एसडीएस-पेज जेल पर सर्वव्यापी EYFP-CENP-A K124R की स्थिति को ठीक से निर्धारित करने के लिए किया गया था। अंत में, सर्वव्यापी EYFP-CENP-A K124R युक्त जेल बैंड का केवल एक छोटा सा क्षेत्र अनुकूलित परिणाम प्राप्त करने के लिए एलसी-एमएस/एमएस के साथ मिलकर इन-जेल पाचन के लिए उत्पादित किया गया था । जब एलसी-एमएस/एमएस के संचालन से पहले सूखे पेप्टाइड्स का पुनर्गठन किया जाता है, तो पेप्टाइड्स की बेहतर घुलनशीलता और वसूली दर में मदद करने के लिए 3% (v/v) एसीटोनिट्रिल/2% (v/v) फोर्मिक एसिड का उपयोग किया गया था । कभी-कभी डेटाबेस खोज के परिणामस्वरूप पीटीएम हो सकता है जो खोज इंजन के अनुमानित असाइनमेंट एल्गोरिदम के कारण वास्तव में मौजूद नहीं है। इस प्रकार, एक और महत्वपूर्ण कदम EYFP-CENP-A K124R सर्वव्यापी साइटों की पुष्टि करने के लिए मैन्युअल रूप से सॉफ्टवेयर एफ(सामग्रीकी तालिका) की मदद से सर्वव्यापी पेप्टाइड्स के एमएस/एमएस की समीक्षा के माध्यम से है, जो डेटाबेस खोज द्वारा अनुमानित असाइनमेंट द्वारा शुरू की गई "अवास्तविक" सर्वव्यापी साइटों को समाप्त कर सकता है । संक्षेप में, इस एपी-एमएस रणनीति ने महत्वपूर्ण जैविक महत्व के साथ EYFP-CENP-A K124R सर्वव्यापी साइटों की पहचान के लिए एक कुशल और मजबूत पाइपलाइन की स्थापना की है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि विभिन्न कार्यात्मक प्रोटीन के पीटीएमएस की जांच के लिए इस पाइपलाइन को व्यापक रूप से बढ़ाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए मॉडल पशु अनुसंधान केंद्र, नानजिंग विश्वविद्यालय में चाओ-जून ली को धन्यवाद देते हैं। हम यामिनी दलाल, तात्सुओ फुकागावा, और मॉडल एनिमल रिसर्च सेंटर, नानजिंग विश्वविद्यालय और Greehey बच्चों के कैंसर अनुसंधान संस्थान में वर्तमान शोधकर्ताओं को उनके सहायक चर्चा, प्रयोगात्मक मार्गदर्शन और अभिकर्मकों के लिए धन्यवाद देते हैं। हम डॉन डब्ल्यू क्लीवलैंड, डेनिएल फाचिनेट्टी, यामिनी दलाल, मिन्ह बुई, गुस्तावो डब्ल्यू लियोन, जॉन थॉम्पसन, लॉरेंस एस किर्श्नर, अमृता एश्टेकर, बेन ई ब्लैक, ग्लेनिस ए लॉगस्डन, केंजी तागो और डॉन एस चांडलर को रिजेंट्स के उदार उपहारों के लिए धन्यवाद देते हैं । वाईएन को जियांग्सू प्रांत ' डबल-फर्स्ट क्लास ' कंस्ट्रक्शन फंड द्वारा समर्थित किया गया था, जियांग्सू प्रांत प्राकृतिक विज्ञान कोष (SBK2019021248), जियांग्सू प्रांत16 छह बड़ी प्रतिभा चोटियों कोष (टीडी-SWYY-001), जियांग्सू प्रांत "विदेशी विशेषज्ञ सौ प्रतिभा कार्यक्रम" कोष (SBK2019010048), और चीन में राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१९७०६६५) । इस अध्ययन को आंशिक रूप से एनसीआई अनुदान R21 CA205659 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes Eppendorf 022431064 For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish BIOFIL/JET, China 700224 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well culture plate
CentriVap LABCONCO - Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm Eksigent Technologies 805-00120 Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane EMD Millipore IPVH00010 For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope Leica - motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source Leica External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences 31071010 Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D Eksigent Technologies - liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher NP0335BOX The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus - Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera Hamamatsu C10600-10B CCD camera
PAP Pen Binding Site AD100.1 For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM VWR 25382-166 10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size) Junyi, China JY-SCZ6+ Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH ABCAM ab37168 Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH Invitrogen PA1987 Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody ANTI #76 (Homemade antibody) Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10) Roche 11815016001 Rat monoclonal antibody
anti-HJURP Proteintech Group 15283–1-AP Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin Bethyl Laboratories A300-317A-1 Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33996-185 Microtip for sonication
Buffer A1 - - 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11-873-580-001 Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250 BBI Life Sciences CAS 6104-59-2 Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) SigmaI-Aldrich HT90132-1L For colony staining
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
DMEM: F12 Medium ATCC 30-2006 DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000 Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol Fisher A412-4 Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Non-fat skim milk
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml Polysciences 23966–2 Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads GE Healthcare/Amersham 17-0963-03 Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific PI21059 Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin Promega V5111 For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) - - Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software Olympus - Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software Olympus - Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18 Olympus - Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 LI-COR Biosciences - Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Bio-Rad - Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System LI-COR Biosciences - Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware - - For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software Improvision/PerkinElmer - Software A
ProteinPilot Software version 4.5 AB SCIEX - Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software Bio-Rad - Software E
TripleTOF 5600+ System AB SCIEX - Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer - Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer - Software B2

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References

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जीव विज्ञान अंक 160 सेंट्रोमेरे किनेटोकोर माइटोसिस सेनपी-ए पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन पीटीएम सर्वव्यापकता मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण
EYFP-टैग किए गए सेनपी-ए (EYFP-CENP-A) के सर्वव्यापी की पहचान करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण
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Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., Li, P., Xi, Y., You, J., Guo, Y., Kitagawa, K. Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A). J. Vis. Exp. (160), e61138, doi:10.3791/61138 (2020).

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