Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Massespektrometrianalyse for å identifisere Ubiquitylation av EYFP-merket CENP-A (EYFP-CENP-A)

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61138
Automatic Translation
*1, *2, *3, 1, 1, 1, 2, 3
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio
* These authors contributed equally

Summary

CENP-A ubiquitylation er et viktig krav for CENP-A deponering ved centromere, arvet gjennom dimerisering mellom celledeling, og uunnværlig for celle levedyktighet. Her beskriver vi massespektrometrianalyse for å identifisere ubiquitylation av EYFP-merket CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Abstract

Å studere strukturen og dynamikken i kinetokore og centromeres er viktig for å forstå kromosomusustabilitet (CIN) og kreftprogresjon. Hvordan kromosomplasseringen og funksjonen til en centromere (dvs. centromere identitet) bestemmes og delta i nøyaktig kromosomsegregering er et grunnleggende spørsmål. CENP-A foreslås å være ikke-DNA-indikatoren (epigenetisk merke) av centromere identitet, og CENP-A ubiquitylation er nødvendig for CENP-A deponering på centromere, arvet gjennom dimerisering mellom celledeling, og uunnværlig for celle levedyktighet.

Her beskriver vi massespektrometrianalyse for å identifisere ubiquitylation av EYFP-CENP-A K124R mutant som tyder på at ubiquitylation ved en annen lysin induseres på grunn av EYFP-merking i CENP-A K124R mutert protein. Lysin 306 (K306) ubiquitylation i EYFP-CENP-A K124R ble identifisert, noe som tilsvarer lysin 56 (K56) i CENP-A gjennom massespektrometrianalyse. En påminnelse diskuteres ved bruk av GFP/EYFP eller merking av protein med høy molekylvekt som et verktøy for å analysere funksjonen til et protein. Gjeldende tekniske grense er også diskutert for påvisning av ubiquitylated band, identifisering av stedsspesifikke ubiquitylation(s), og visualisering av ubiquitylation i levende celler eller en bestemt enkeltcelle under hele cellesyklusen.

Metoden for massespektrometrianalyse presentert her kan brukes på menneskelig CENP-A protein med forskjellige koder og andre centromere-kinetochore proteiner. Disse kombinatoriske metodene bestående av flere analyser/analyser kan anbefales for forskere som er interessert i å identifisere funksjonelle roller i ubiquitylation.

Introduction

I de fleste eukaryoter må spindelmikrobuler festes til en enkelt region av hvert kromosom, betegnet som centromere. Kinetochore er et kompleks av proteiner som ligger på centromere. Å studere tidspunktet for centromere og kinetochore protein bevegelser og strukturen av kinetokores og centromeres er viktig for å forstå kromosom ustabilitet (CIN) og kreftprogresjon. De viktigste spørsmålene er hvordan kromosomplasseringen og funksjonen til en centromere (dvs. centromere identitet) bestemmes og hvordan de deltar i nøyaktig kromosomsegregering. I de fleste arter definerer tilstedeværelsen av et spesielt nukleosom som inneholder et bestemt histonelignende protein kalt CENP-A centromere-identiteten. Derfor er det foreslått at CENP-A er ikke-DNA-indikatoren (epigenetisk merke) av centromere identitet. Det er viktig å belyse mekanismen for hvordan CENP-A definerer centromere identitet hos mennesker.

Holliday junction recognition protein (HJURP) er CENP-A-spesifikk chaperon som deponerer CENP-A i centromeriske nukleosomer1,2,3. Vi har tidligere rapportert at CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase er nødvendig for CENP-A ubiquitylation på lysin 124 (K124) og centromere lokalisering4. Våre resultater viste også at centromere rekruttering av nylig syntetisert CENP-A krever pre-eksisterende ubiquitylated CENP-A5. Dermed ble det gitt en modell som tyder på at CENP-A ubiquitylation er arvet gjennom dimerisering mellom celledelinger.

I motsetning til våre funn og de av Yu et al., negative resultater om CENP-A og dens centromeric lokalisering ble nylig publisert6. Artikkelen hevdet at CENP-A modifikasjoner på lysin 124 (K124) er unnværlig for etablering, vedlikehold, og langsiktig funksjon av menneskelige centromeres, basert på deres negative resultater som viser at mutasjonen av K124R ikke påvirket CENP-A centromere lokalisering verken celle levedyktighet6. Det er imidlertid nok plass til debatt i sine resultater og konklusjoner, og vi har allerede beskrevet hvilket problem det kan være i deres tidligere publikasjon7. Det bør tas hensyn til at de smeltet sammen proteiner med CENP-A, som har mye større molekylvekter enn størrelsen på endogene CENP-A: f.eks, smeltet de ~ 30 kDa forbedret gult fluorescerende protein (EYFP) til ~ 16 kDa CENP-A og analysert EYFP-CENP-A K124R fusjonsprotein i deres RPE-1 CENP-A-/F knockout system. K124 ubiquitin forventes ikke å binde direkte til HJURP basert på strukturelle spådommer4,men tillegg av mono-ubiquitin er spådd å ha en innvirkning på proteinkonformasjon av CENP-A. Proteinet av CENP-A-konformasjon kan endres ved tilstedeværelse av et stort fusjonsprotein, og denne konformasjonsendringen kan maskere de strukturelle endringene forårsaket av tap av ubiquitylation. Vi foreslår at fusjonen av store proteiner induserer ubiquitylation ved en annen lysin enn K124 i EYFP-CENP-A K124R mutant og denne ubiquitylation på et annet sted hemmer / masker den opprinnelige K124R enkelt mutert fenotype. Bevis for at ubiquitylation forekommer ved forskjellige lysin i CENP-A K124R mutert protein med et stort tag protein (EYFP) ble rapportert i vår forrige publikasjon8. Det ble funnet at EYFP-merking induserer ubiquitination av et annet lysin sted av EYFP-CENP-A K124R og at EYFP-CENP-A K124R mutant binder seg til HJURP. Som et resultat hemmer denne ubiquitylasjonen på et annet sted centromere lokalisering (vi brukte og sammenlignet pBabe-EYFP-CENP-A WT og K124R mutant, sammen med pbaba-EYFP-kontroll.). Resultatene viste at Flagg-merket eller ukodet CENP-A K124R mutanter er dødelige, men kan reddes av en monoubiquitin fusjon, noe som tyder på at CENP-A ubiquitylation er uunnværlig for celle levedyktighet.

I de senere årene har mange studier utviklet forskjellige analyser for å identifisere posttranslational modifikasjoner (PTMs) av CENP-A protein og andre centromere-kinetochore proteiner både in vivo og in vitro9,10,11. Analog med PTMs av histone proteiner som er en viktig mekanisme som regulerer funksjonen av kromatin, PTMs av centromeric kromatin komponenter er også involvert i en viktig mekanisme for å regulere den generelle strukturen og funksjonen til centromeres. De fleste CENP-A PTM-nettsteder er spesifikke for CENP-A-inneholdende nukleosomer, selv om noen av dem er bevart i histone H3, noe som tyder på at endring av disse rester bidrar til centromere-spesifikk funksjon. PTMs av CENP-A inkludert fosforylering, acetylering, metylering og ubiquitylation ble tidligere rapportert9, noe som tyder på at CENP-A er utsatt for en rekke PTMs og deres kombinatoriske arrays på sin aminoterminus og C-terminus histone-fold domene. Betydningen av CENP-A-modifikasjoner i flere funksjoner ble avslørt av mange grupper, inkludert vår. Disse funksjonene innebærer CENP-A deponering ved centromeres, proteinstabilitet og rekruttering av CCAN (konstitutiv centromere-assosiert nettverk)9. Imidlertid er begrensede studier og funn av CENP-A PTMer forhåndsformet hvor sammenligninger er gjort med en av kanoniske histoner som direkte eller indirekte regulerer deres funksjon. Tekniske rapporter som fokuserer på metodikken for å identifisere disse CENP-A PTMer er også begrenset.

Fordi CENP-A ubiquitylation er nødvendig for CENP-A deponering på centromere12, arvet gjennom dimerisering mellom celledeling5, og uunnværlig for celle levedyktighet8, metoden for å identifisere CENP-A ubiquitylation ville være avgjørende i fremtiden for å studere funksjonell aktivitet, posisjonering, og struktur av centromere. Derfor beskriver vi massespektrometrianalyse for å identifisere ubiquitylation av EYFP-CENP-A K124R mutant som tyder på at EYFP-merkingen induserer ubiquitylation ved en annen lysin i CENP-A K124R mutert protein8. Protokoller for andre kontrollanalyser og analyser (immunofluorescensanalyse, koloniutvekstanalyse og in vivo ubiquitylation analyse) presenteres også for å diskutere utfallet av store massespektrometrianalyse riktig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur og retrovirustransfeksjon av pBabe-EYFP-CENP-A konstruksjoner

MERK: EYFP-CENP-A uttrykkes fra pBabe-EYFP-CENP-A på et lignende proteinnivå til endogene CENP-A. Totalt cellulærT CENP-A-protein erstattes med dette EYFP-CENP-A etter forstyrrelsen av CENP-A-/F allele av Cre recombinase som i RPE-1 CENP-A-/- celler6.

  1. Tilberedning av supernatant som inneholder retrovirus ved hjelp av 293T emballasjeceller.
    1. Dag 0: Spre 293T emballasjeceller på 6-brønns kulturplate (1,0 x 106 celler / brønn). Kulturceller i høyglukose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Inkuber cellene ved 37 °C i en atmosfære på 5 % CO2 i 24 timer.
      MERK: For optimale resultater, må du empirisk bestemme celletettheten som skal brukes i såing.
    2. Dag 1: Klargjør transfeksjonsreaksjonen rundt 23 timer etter spredning (24 timer punkt er 0 t punkt av transfeksjon). Transfect uttrykk plasmid av hver pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) og pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (se tabell 1).
    3. Velg en kombinasjon av hjelper/emballasjeplasmider oppført i tabell 2 og legg dem til rør som inneholder en av plasmidene som er nevnt ovenfor. Det er for det meste disse 3 kombinasjonene for hjelper/ emballasje plasmider (Tabell 2). Enhver kombinasjon fungerte i disse eksperimentene og viste lignende transfection effektivitet.
    4. Forbered 50 μL redusert serummedium og bland 2,0 μg av hver pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B316 1) og pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (se tabell 1) som legger til en kombinasjon av hjelper/emballasjeplasmider oppført i tabell 2 (se nedenfor). Inkuber denne blandingen ved romtemperatur i 5 min. Denne blandingen er løsning A.
    5. Forbered ytterligere 50 μL redusert serum medium og bland 1,5 μL transfeksjon reagenser I og II, henholdsvis (Tabell over materialer). Inkuber denne blandingen ved romtemperatur i 5 min. Denne blandingen er løsning B.
      MERK: Du kan eventuelt bare tilsette 6,0 μL transfektreagens III (polyetylenimine [PEI]; 1,0 mg/ml) i oppløsning B eller tilsett 6,0 μL transfektreagens III i tillegg til transfektreagenser I og II i oppløsning B (Tabell over materialer).
    6. Bland løsninger A og B sammen, og inkuber ved romtemperatur i 15 min.
    7. Etter å ha vasket de kultiverte cellene en gang med PBS, tilsett blandingen av løsninger A og B (dvs. DNA-lipidkompleks) direkte til hver brønn av 6-brønnkulturplaten som har 500 μL redusert serummedium. Den endelige konsentrasjonen av plasmid er 3,3 μg/ml.
    8. Etter inkubering av cellene ved 37 °C i en atmosfære på 5 % CO2 i 4,5 timer, endre medium til høyglukose DMEM med 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin. Sett 2 ml/brønn av kulturmedium etter den middels endringen i 6-brønnkulturplaten.
    9. Kultur cellene ved 37 °C i en atmosfære på 5% CO2 for 48 timer etter transfeksjon. Utfør retrovirusinfeksjon på dag 3 ved hjelp av supernatanten som inneholder retrovirus.
  2. Retrovirusinfeksjon av CENP-A-/F RPE-1-målceller.
    1. Dag 2: En dag før infeksjon, spre CENP-A-/F RPE-1 målceller for å transfisere i 6-brønnkulturbrønnen (2,25 x 105 celler / brønn). Kulturceller i DMEM: F12 medium (Tabell over materialer) med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
      MERK: Spre celler for koloni utvekstanalyser, immunfluorescens og vestlig blot analyse som kontroll. For optimale resultater, metaforisk bestemme celletettheten som skal brukes i seeding.
    2. Dag 3 (infeksjonsdag av viruset): Ved 48 timer etter transfeksjon av 293T emballasjeceller, samle supernatanten som inneholder virus og filtrere gjennom 0,45 μm filter (ikke bruk et 0,2 μm filter som skal skjære viruskonvolutt). Det anbefales å bruke polyethersulfon (PES) filtre.
    3. Infisere CENP-A-/F RPE-1-celler med viruset. For en brønn av 6-brønnkulturplaten, tilsett 1 ml friske medier, 1 ml virus supernatant og polyøbri til en endelig konsentrasjon på 8 μg/ml. Inkuber CENP-A-/F RPE-1-celler ved 37 °C i en atmosfære på 5 % CO2 i 4 dager frem til dag 7 etter transfeksjon.
      MERK: Inkubasjonsperioden for CENP-A-/F RPE-1-cellevekst må bestemmes empirisk ved å følge analyser for optimale resultater.

2. Immunofluorescensanalyse av celler som inneholder pBabe-EYFP-CENP-A

  1. Dag 7: 4 dager etter retrovirusinfeksjon av pBabe-EYFP-CENP-A konstruksjoner, fjern kulturmediet ved aspirasjon. Skyll cellene én gang med TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 125 mM NaCl). Påfør TBS på siden av kulturbrønnene for å unngå å forstyrre overflaten av celler.
    MERK: Det optimale tidspunktet for cellefiksering må bestemmes empirisk. Immunofluorescenssignaler fra både EYFP-CENP-A WT og K124R kan påvises ved centromere minst 4 dager etter retrovirusinfeksjon av pBabe-EYFP-CENP-A-konstruksjoner selv uten Cre-infeksjon (data ikke vist, figur 1C-E for data med Cre-infeksjon).
  2. Utfør metanolcellefiksering og immunofluorescensfarging som beskrevet tidligere13.
  3. Som primære antistoffer bruker et anti-GFP antistoff (1:1,000 fortynning) og en anti-CENP-B antistoff (fortynningsforhold på 1:200) for en centromere plassering markør i TBS som inneholder 4% geit serum (se Tabell over materialer for antistoffer som brukes).
  4. Fjern overflødig monteringsmedium med et papirhåndkle og forsegle kantene på dekkslippen med neglelakk i siste trinn.
  5. Se den tidligere beskrevne metoden13 for immunofluorescensbildeobservasjon, oppkjøp, kvantifisering og analyse av gjenværende signaler fra EYFP-CENP-A ved centromere.
  6. Utfør bildeanskaffelse, behandling inkludert dekonvolutasjon, kvantifisering og analyse ved hjelp av programvare A eller programvare B1 og B2 (se Tabell over materialer). Du kan eventuelt bruke programvare C1-C3 (se materialtabell)for et konfidenselt mikroskop for laserskanning.
    MERK: Se 2.6.1 i supplerende kodefiler for alle kommandoer som brukes i programvare A. Se 2.6.2 i supplerende kodefiler for alle kommandoer som brukes i Softwares B1 og B2.

3. Koloni utvekst analyser ved hjelp av pBabe-EYFP-CENP-A etter retro-Cre virusinfeksjon

MERK: Årsaken til at denne analysen er å sammenligne celleleverbarheten mellom EYFP-CENP-A WT og K124R-mutert etter forstyrrelsen av CENP-A-/F-allelet med Cre recombinase (etter utskifting av totalt cellulært CENP-A-protein).

  1. Retrovirustransfeksjon av pBabe-EYFP-CENP-A konstruksjoner.
    1. Utfør retrovirustransfeksjon av CENP-A-/F RPE-1-celler som beskrevet i avsnitt 1. Kulturceller i DMEM: F12 medium med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i 72 timer etter virusinfeksjonen.
    2. Tre dager etter retrovirusinfeksjon av pBabe-EYFP-CENP-A-konstruksjoner (på dag 6), tilsett blasticidin S (10 μg/ml) i brønner som inneholder transfiserte celler som skal brukes til kolonivekstanalyse og kontrolleksperimenter. Celler dyrkes minst 14 dager etter virusinfeksjon i nærvær av blasticidin S. Endre mediet som inneholder blasticidin S hver 5.
      MERK: Hvis cellene når ca 80% samløpet før seeding for kolonianalysen (3.2.7. og 3.2.8), passer cellene på 1:2 og 1:5 ratio ved trypsinisering og plating i en 6 brønnkultur plate.
    3. Samle celler for vestlig blot på dag 7 for å bekrefte proteinuttrykket av pBabe-EYFP-CENP-A konstruksjoner uten Cre-infeksjon. Utfør vestlig blotanalyse som beskrevet i avsnitt 4. Resultatene vises i figur 1B (kjørefelt 1-4).
    4. For koloni utvekstanalyse med Cre virusinfeksjon, hold cellene vokser i 14 dager etter virusinfeksjonen i nærvær av blasticidin S (dvs. vokse celler i blasticidin S som inneholder medium til dag 17 for resultatene som presenteres her).
  2. Retro-Cre virus infeksjon av pBabe-puro-Cre
    MERK: Dag 0 i trinn 3.2.1 tilsvarer dag 13 i avsnitt 3.1.
    1. Dag 0 til dag 3: Utfør retrovirustransfeksjon av CENP-A-/F RPE-1-celler ved hjelp av pBabe-puro-Cre (B3027) som uttrykk plasmid (se avsnitt 1 for detaljer). Sørg for at blasticidin S (10 μg/ml) tilsettes i kulturmediet.
    2. Dag 4: Trypsinisere celler for å løsne den fra platen. Plate 500 eller 5000 celler i triplicate i 6-brønns kulturplate. Kulturceller i DMEM: F12 medium med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
    3. Dag 5: Tilsett blasticidin S (10 μg/ml) i kulturmediet. For 5000 eller 500 cellers plating, velg celler med blasticidin S (10 μg/ml) 3-24 dager (inntil dag 14 i [3,2,7]) eller 3-28 dager (til dag 18 i [3.2.8]) etter virusinfeksjon av konstruksjoner (pBabe-EYFP-CENP-A konstruksjoner).
      MERK: I denne koloniens utvekstanalyse tilsettes transfeksjonen av pBabe-puro-Cre sammen med transfeksjon av pBabe-EYFP-CENP-A. Transfeksjonen av pBabe-EYFP-CENP-A utføres i 3.1. Transfeksjonen av pBabe-puro-Cre utføres i 3.2.1.
    4. Dag 10 (7 dager etter retro-Cre virusinfeksjon): Samle celler for vestlig oppblåst analyse for å bekrefte protein uttømming av endogene CENP-A etter retro-Cre virusinfeksjon og / eller protein uttrykk for pBabe-EYFP-CENP-A konstruksjoner på samme dag 10.
    5. Utfør vestlig blotting som beskrevet i avsnitt 4 på samme dag 10. Resultatene vises i figur 1B (kjørefelt 5-7).
    6. Utfør immunofluorescensanalyse (avsnitt 2 ovenfor) for å bekrefte at både EYFP-CENP-A WT og K124R lokalisert til centromere 7 dager etter inaktivering av gjenværende endogene CENP-A allele. Resultatene vises i figur 1C-1E.
    7. Dag 14: Utfør koloniens utvekstanalyse med platen seeded med 5000 celler. Fiks celler i 10 min i metanol og flekk i 10 min i en krystallfiolett oppløsning (2,3% krystallfiolett, 0,1% ammoniumoksalat, 20% etanol (se figur 2B). Telle antall kolonier ved hjelp av OpenCFU-programvaren (se figur 2C).
    8. Dag 18: Bruk platen seeded med 500 celler. Fest og flekkceller som beskrevet i trinn 3.2.7 (se figur 2B). Telle antall kolonier (se figur 2C).

4. Vestlig blotanalyse ved bruk av pBabe-EYFP-CENP-A

MERK: Se den tidligere beskrevne metoden13 for vestlig blotanalyse ved hjelp av antistoffer som er angitt i figur 1B og figur 2A og tabell over materialer for EYFP-CENP-A-proteiner.

  1. Isoler proteiner ved å lyse cellene dyrket med forskjellig virusinfeksjon. Deretter bruker du 20 μg protein i en brønn av SDS PAGE gel. Overfør proteinene til en PVDF-membran som beskrevet tidligere13.
  2. Vask membranen 3x etter inkubasjoner med primære sekundære antistoffer. Oppdag og analyser proteinbåndene på membranen med det infrarøde bildesystemet og/eller chemiluminescence imager for immunoblot deteksjon. Disse resultatene er vist i figur 1B og figur 2A.
    1. For at det infrarøde bildesystemet skal oppdage og analysere proteinbåndene, se trinn 4.2.1 i supplerende kodefiler.
    2. Bruk chemiluminescence imager til å oppdage og analysere proteinbåndene, se trinn 4.2.2 i supplerende kodefiler. For dette systemet, bruk et ultrafølsomt forbedret chemiluminescent (ECL) substrat (Tabell over materialer).
    3. Du kan eventuelt bruke vestlig blot stripping buffer for å fjerne pre-inkuberte antistoffer fra PVDF-membranen og reblot den med forskjellige antistoffer for neste sving av vestlig analyse. Avgjør empirisk den optimaliserte inkubasjonstiden og temperaturen som skal brukes.

5. Cellekultur, transfeksjon og in vivo ubiquitylation-analyser ved hjelp av pQCXIP-EYFP-CENP-A

MERK: Proteinnivået til EYFP-CENP-A uttrykt fra pQCXIP-vektoren er ~ 10x høyere enn det endogene CENP-A-proteinnivået. Bruken av denne vektoren forenkler immunoprecipitasjon av en høyere mengde EYFP-CENP-A-proteiner, observasjon av ubiquitylation band av EYFP-CENP-A, og identifisering av ubiquitylation av EYFP-merket CENP-A (EYFP-CENP-A) protein gjennom massespektrometrianalyse.

  1. Transfeksjon for in vivo ubiquitylation-analyser ved bruk av pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Frø 36,2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 celler i en 10 cm vev kultur parabolen. Kulturceller i høyglukose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
      MERK: For optimale resultater, må du empirisk bestemme celletettheten som skal brukes i såing. Forbered minst 2 retter for en immunforeskeligelse (IP) prøve for å oppnå minst 1 mg totalt protein.
    2. Inkuber cellene ved 37 °C i en atmosfære på 5 % CO2 i 18 timer.
    3. Ved 17 timer etter såing, klargjør transfeksjonsreagensene.
    4. Gjør oppløsning A ved å blande 6,7 μg plasmid av hver pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Tabell 1) i 335 μL redusert serummedium, medium, og inkuber ved romtemperatur i 5 min. Tilsett 6,7 μg plasmid pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) i alle prøver.
      MERK: Alle vektorene er oppført i tabell 1.
    5. Gjør oppløsning B ved å blande 10,1 μL transfeksjonsreagenser I og II, henholdsvis i 335 μL redusert serummedium og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
      MERK: Et valgfritt trinn er å legge til bare 40,2 μL transfeksjonsreagens III (polyetylengenimine [PEI]; 1,0 mg/ml) i oppløsning B eller tilsett 40,2 μL transfeksjonsreagens iii i tillegg til transfektreagenser I og II i oppløsning B (Tabell over materialer).
    6. Bland løsninger A og B sammen, og inkuber ved romtemperatur i 15 min.
    7. Etter å ha vasket de kultiverte cellene en gang med PBS, tilsett blandingen av løsninger A og B (dvs. DNA-lipidkompleks) direkte til hver av de individuelle 10 cm vevskulturretten som har 3,35 ml μL redusert serummedium.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen er 1,67 μg/ml plasmid.
    8. Inkuber cellene ved 37 °C inkubator med 5 % CO2 i 4,5 timer. Etter 4,5 timer, endre medium til høy glukose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
    9. Kultur cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 48 timer etter transfeksjon. Samle celler for celle lysates forberedelse.
  2. Fremstilling av protein A perler bundet med anti-GFP antistoff.
    1. Ta 25 μL (50 % v/v) protein A perler for én reaksjon av immunforklaring (IP). Vask med buffer A1 (Tabell over materialer) minst 3x for å fjerne EtOH, og gjør 50% løsning med buffer A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% deoxycholate; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; komplett EDTA-fri proteasehemmer reagens).
    2. Tilsett 2,0 μL anti-GFP antistoff (Anti # 76: Hjemmelaget antistoff) til perlene forberedt ovenfor og tilsett 10x volum buffer A1 sammenligne med netto perler volum.
    3. Utfør ende-til-ende rotasjon ved 4 °C i 4-18 timer. Den optimale tidslengden for ende-til-ende-rotasjon må bestemmes empirisk basert på effektiviteten av immunforklaringen.
    4. Sentrifuger perlene ved 100 x g i 1 min og fjern den ubundet supernatanten. Legg til buffer A1 for å lage en 50 % (v/v) løsning av perlene. Bruk 25 μL (50 % v/v) av denne oppløsningen til én reaksjon av IP.
  3. Immunutsyrende (IP) ved bruk av protein En sepharose perler bundet med anti-GFP antistoff.
    1. Lyseceller oppnådd i trinn 5.1.9 i buffer A1 ved sonikering og fryse-tineprosess.
    2. Mål proteinkonsentrasjoner og normalisere proteinmengder blant forskjellige IP-prøver. Fjern 5 % av prøven fra hvert rør for å kjøre som 5 % inndataprøve på SDS-PAGE.
      MERK: 5% Inndataprøven kan fryses i flytende nitrogen og fylles ved -80 °C, hvis den ikke lastes i løpet av en dag.
    3. Bland resten av 95% lysate med 25 μL (50% v / v) protein A perler bundet til anti-GFP antistoff som ble utarbeidet i trinn 5.2. Utfør ende-til-ende rotasjon ved 4 °C i 4-18 timer.
      MERK: Den optimale tidslengden for ende-til-ende-rotasjon må bestemmes empirisk.
    4. Sentrifugeprotein En perler med proteinet bundet til det (dvs. immunoprecipitat) med 100 x g i 1 min, og fjern supernatanten. Vask immunforutsugende med buffer A1 ved sentrifuging ved 100 x g i 1 min. Utfør dette trinn 4x.
    5. Bland 5% Input og resten av 95% immunforutsende med 2x og 4x SDS-PAGE lasting buffer14,henholdsvis. Kok disse to prøvene i 5 min og legg dem deretter på en 10,0% denaturing SDS-polyakrylamid gel for elektroforese i forskjellige baner. Bruk større SDS-PAGE gel (f.eks. 17 cm x 15 cm) til elektroforese. Hvis prøvene kjøres i mindre gel, kan det hende at det ikke er mulig å observere klare/skarpe ubiquitylation-bånd.
    6. Utfør vestlig blotanalyse som beskrevet i avsnitt 4 ved hjelp av antistoffene som er angitt i forrige rapport8. Resultatet vises i figur 2A.
    7. Bruk western blot stripping buffer for å fjerne pre-inkubert antistoffer fra PVDF membran og reblot den med forskjellige antistoffer for neste runde av vestlige blot analyse.

6. Massespektrometri for å identifisere ubiquitylation-området til EYFP-CENP-A K124R-mutert

  1. Transfeksjon for massespektrometrianalyse ved bruk av pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Frø CENP-A-/F RPE-1 celler i en 10 cm vev kultur parabolen. Kontroller at celletettheten er 36,2 x 105 celler per fat. Kulturceller i høyglukose DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Forbered minst 20 retter for en immunforklaringsprøve (IP), for å oppnå minst 10 mg totalt protein (se 5.3).
      MERK: For optimale resultater, må du empirisk bestemme celletettheten som skal brukes i såing.
    2. Inkuber cellene ved 37 °C i en atmosfære på 5 % CO2 i 18 timer. Klargjør transfeksjonsreagensene ~ 23 timer etter spredning (24 timer punkt er 0 t transfeksjon).
    3. Ved 17 timer etter såing, klargjør transfeksjonsreagensene og transfektecellene som (4.1.3). Transfiserte celler har pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) og pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Inkuber cellene ved 37 °C i en atmosfære på 5 % CO2 i 48 timer etter transfeksjon. Samle celler for cellelysater.
    5. Lyseceller i buffer A1 og utfør immunforutsendelse som (5.2) og (5.3). Kjør disse to av immunforklaring lysater som følgende (6.1.6) og (6.1.7).
      MERK: I (6.1.6) kjører du prøven i standard Tris-glycingeler. I (6.1.7) kjører du prøven i de kommersielt tilgjengelige 4%-12% Bis-Tris proteingeler. Se også Redaktøransvar.
    6. Hold ett utvalg for 10 % av de totale immunforklaringsstoffene for å bekrefte EYFP-CENP-A ubiquitylation og nøyaktig bestemme posisjonen til ubiquitinated EYFP-CENP-A som beskrevet i avsnitt 5. Kjør denne prøven i standard Tris-glycine geler. SDS-PAGE og western blot ble utført som (5.3).
    7. Hold en annen prøve for 90% av totale immunforklaringsmidler for massespektrometrianalyse. Kjør denne prøven innenfor to brønner av kommersielt tilgjengelige 4%-12% Bis-Tris protein geler. Utfør Coomassie blå farging ved hjelp av Coomassie blå oppløsning. Avgiftsdirektoratet og kutt ut gelregionen på 50-70 kDa (antatt mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R-regionen). Bruk denne gelregionen for massespektrometrianalyse.
  2. Massespektrometrianalyse ved hjelp av in-gel fordøyelse.
    1. Terninger hver gel skive av interesse i små biter (1 mm2) og plassere den i 0,5 ml protein lav bindende rør.
    2. Vask med 100 μL 50% (v / v) acetonitrile i 25 mM NH4HCO3, vortex 10-15 min, spin ned, kast supernatanten, gjenta 3x.
    3. Konsentrer prøven ved hjelp av benkepumpekonsentrator i 30 minutter for å tørke gelbitene.
    4. Tilsett 10 μL av 10 ng / μL sekvensering grade trypsin og la gelbitene å rehydrere i 5 min.
    5. Tilsett 25 mM NH4HCO3 akkurat nok til å dekke gelbitene, fordøye ved 37 °C over natten.
    6. Overfør det fordøyde supernatanten til et rent 0,65 ml silikonrør. Tilsett 50 % (v/v) acetonitrile/5 % (v/v) maursyre (30 μL eller nok til å dekke), vortex 10 min, spinn og overfør til samme ekstraksjonsrør. Gjenta 3x.
    7. Tilsett 10 μL acetonitrile til gelbitene, vortex 5 min, og spinn ned. Overfør supernatanten til samme rør.
    8. Konsentrat prøvene ved hjelp av benkepumpekonsentrator til 2 μL, tilsett 8 μL 3% (v / v) acetonitrile / 2% (v / v) maursyre til prøven, vortex i 15 min, og spinn ned ved 16.000 x g i 30 min. Prøver er klare for massespektrometrianalyse.
    9. Utfør MS-datainnsamling med LC-MS/MS ved hjelp av et flytende kromatografisystem (Tabell over materialer) kombinert med et massespektrometriinstrument ( Tabell overmaterialer).
    10. Injiser 8 μL rekonstituert prøve på en rpmakromatografi (RPLC) i omvendt fase.
    11. Skill peptidene med en 2-80% gradient av løsemiddel B i 60 min. Sørg for at gradienten består av en økende prosentandel av løsningsmiddel B fra 2% til 22% i 40 min, 22% til 35% løsningsmiddel B i 12 min, deretter klatring til 80% løsningsmiddel B i 4 min, og til slutt holder på 80% løsningsmiddel B for de siste 4 min. Sett strømningshastigheten konstant ved 300 nL / min.
      MERK: Løsemiddel A inneholder 0,1 % maursyre og 2 % acetonitril, oppløsningsvæske B inneholder 0,1 % maursyre og 98 % acetonitril. Alle konsentrasjoner vises som volum/volum.
    12. Samle inn massespektrometridata ved hjelp av dataavhengig anskaffelsesmodus. Kort, samle MS spectra i 350-1500 m / z for 250 ms. Velg de 50 beste intense forløperne med lading 2-5 for ytterligere fragmentering. Samle MS / MS spektra i 100-2000 m / z for 100 ms, Ekskluder forløper ioner fra gjenvalg for 15 s.
    13. For databasesøk, åpne den kommersielle programvaren (se Tabell over materialer) for å analysere massespektrometridata på skrivebordet.
    14. For å gjøre et nytt søk, klikk på"LC"-knappen på toppmenyen. Klikk deretter på"Legg til"-knappen for å laste opp de opprinnelige MS raw-datafilene.
    15. Velg "Human Protein ID" i "Paragon Method" som database søkemetode. Søk i de opprinnelige MS-rå datafilene mot UniProt Homo Sapiens-databasen (som inneholder 160 566 sekvenser, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Angi søkeparametere som følgende: Velg trypsin som fordøyelsesenzym, tillat opptil 3 manglende spaltninger, 4 modifikasjoner og 2-5 gebyrer per peptid. Sett massefeil opptil 20 ppm for det første søket, og 0,02 Da for fragmenterte ioner. Angi terskler for falsk oppdagelsesfrekvens (FDR) for protein-, peptid- og modifikasjonsområder mindre enn 1 %. Sett alle de andre parameterne i programvaren til standardverdier (se figur 3 for massespektrometrianalyse).
    17. Klikk på"Lagre som"-knappen til høyre for den øverste menyen, velg en mappe for lagring av søkeresultatene, skriv inn søkenavnet og klikk på"Lagre"-knappen.
    18. Klikk på"Process"-knappen til høyre for toppmenyen for å starte søket. Når søket er avsluttet, lagres data med det angitte søkenavnet automatisk i den valgte mappen. Dataene kan enkelt åpnes av Software F.
    19. For å få MS/MS spektra av et bestemt peptid, dobbeltklikker du på søkeresultatene for å åpne den etter programvare F. Først klikker du på proteinet i proteinlisten øverst i menyen, og deretter klikker du på peptidet på midten av menyen. MS/MS for dette peptidet vises nederst i menyen.
    20. Hvis du vil eksportere og lagre MS/MS-spektra, høyreklikker du på MS/MS-spektra nederst på menyen, velger kopier og limer deretter inn i en passende fil, for eksempel PPT eller doc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EYFP-CENP-A K124 mutant viser ubiquitylation, interaksjon med HJURP, og ingen feil i centromere lokalisering verken celle dødelighet. Her ble systemet rapportert av Fachinetti et al. (2017)6 ombygd: i diploid menneskelige (RPE-1) celler som bærer en forstyrret og en ''floxed'' CENP-A allele (CENP-A-/F), EYFP-CENP-A ble uttrykt fra pBabe-EYFP retro vectorvirus. I dette systemet kan uttrykket av endogene CENP-A fra CENP-A-/F allele bli forstyrret av Cre recombinase6. Genkonstruksjoner av EYFP- CENP-A WT eller K124R mutant (Figur 1A), som redder tapet av endogene CENP-A, ble stabilt uttrykt når retroviral integrasjon ble utført. Det gjenværende uttrykket for endogene CENP-A fra CENP-A-/F allele ble deretter forstyrret av Cre recombinase. Uttrykket av endogene CENP-A ble ikke oppdaget 7 dager etter induksjon av Cre recombinase (Figur 1B, kjørefelt 5-7). Både EYFP-CENP-A WT og K124R proteiner uttrykket ble funnet å være på samme nivå som den første endogene CENP-A proteinnivå (Figur 1B, kjørefelt 3, 4, 6 og 7). Både EYFP-CENP-A WT og K124R mutanter viste centromere lokalisering på 7 dager etter forstyrrelsen av det gjenværende uttrykket av endogene CENP-A fra CENP-A-/F allele (Figur 1C-1E). Både EYFP-CENP-A WT og K124R-muteringen viste ubiquitylation og interaksjon med HJURP i motsetning til tilfellet med Flagg-merket eller ukodet CENP-A WT og K124R mutant (Figur 2A; data som ikke vises for Flagg-merket eller ukodet CENP-A)8. Celle levedyktighet ble også adressert ved å utføre kolonien utvekst analyse 14 dager etter forstyrrelsen av de resterende endogene CENP-A allele (Figur 2B). Både EYFP-CENP-A WT og K124R mutanter viste et lignende antall "reddet"' kolonier 14 dager etter forstyrrelsen av de resterende endogene CENP-A allele (Figur 2B og 2C). Dermed er våre resultater i tråd med de som rapporteres av Fachinetti et al.6.

Ubiquitylation at lysine 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R ble avslørt av massespektrometrianalyse. Det ble funnet at både EYFP-CENP-A WT og K124R mutant viser ubiquitylation og interaksjon med HJURP i motsetning til tilfelle av Flagg-merket eller ukodet CENP-A WT og K124R mutant (Figur 2A; data som ikke vises for Flagg-merket eller utagget CENP-A)8. Disse resultatene tyder på at fusjonen av EYFP protein induserer ubiquitylation på en lysin annet enn K124 i EYFP-CENP-A K124R mutant, og denne ubiquitylation på et annet sted fremme samspillet mellom EYFP-CENP-A K124R med HJURP. Ubiquitylation at lysine 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R ble avslørt i CENP-A-/F-celler ved IP-massespektrometrianalyse (figur 3A og figur 3B). Lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R tilsvarer lysin 56 (K56) i CENP-A. Samlet sett tyder resultatene på at fusjonen av protein i stor størrelse (f.eks. EYFP-merking) induserer ubiquitylation ved en annen lysin enn K124 i CENP-A, og denne ubiquitylasjonen på et annet sted hemmer/maskerer den opprinnelige K124R enkeltmutert fenotypen.

Figure 1
Figur 1: EYFP-CENP-A K124 mutant lokaliserer på centromeres. (A)Representasjoner av de forskjellige CENP-A-proteinkonstruksjonene merket med EYFP (forbedret gult fluorescerende protein) ved N-terminus. Røde bokstaver markerer posisjonen til K124R aminosyresubstitusjon i den angitte konstruksjonen (venstre). Resultatene av analysene som utføres i denne studien er vist (høyre). (B)Vestlig blotanalyse viste ikke tilstedeværelsen av påviselig endogene CENP-A. Immunoblots analyse for å se etter tilstedeværelse av uttrykk for de angitte redningskonstruksjoner (ca. 45 kDa) før og etter Cre infeksjon. Proteinuttrykket til pBabe-EYFP-konstruksjoner ble bekreftet før Cre-infeksjon (kjørefelt 1-4), samt etter Cre-infeksjon (kjørefelt 5-6). Fraværet av det endogene CENP-A-proteinet (ca. 15 kDa) ble bekreftet i CENP-A-/- cellelinjene samlet 7 dager etter Cre-infeksjon (kjørefelt 5-6). GAPDH-protein ble brukt som lastekontroll. (C) EYFP-CENP-A K124 mutant lokaliserer på centromeres. CENP-A-/F RPE-1-celler ble kotransmittert med indikerte konstruksjoner, kultivert 7 dager etter retro-Cre-virusinfeksjon og immunosert. Visualisering av DAPI (blå), EYFP (grønn) og endogene CENP-B (rød), som fungerte som en centromere plasseringskontroll. Vektlinje, 10 μm. (D) Lokaliseringsmønstrene vist i (C) oppsummert som histogrammer. Mer enn 200 interfaseceller med EYFP-positive signaler ble talt per eksperiment (n ≥ 3 eksperimenter), og gjennomsnittlig prosentandel (±SD) vises. ''Andre (Ikke-centromere)'' viser for det meste skadede celler, døde celler eller celler med nukleolær lokalisering i interphase, som ble observert på grunn av transfeksjon eller andre behandlinger. Ingen signifikant (n.s.) forskjell ble observert i K124R sammenlignet med WT (Studentens t-test). (E) EYFP-avledede signaler ved centromere vist i (C) ble kvantifisert. Signalene ble normalisert for WT, og gjennomsnittsprosentene (±SEM) er vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: EYFP-CENP-A K124-mutert er ubiquitylated og interagerer med HJURP, og celleleveevne ble ikke påvirket av K124R mutasjon av EYFP-CENP-A. (A) EYFP-CENP-A K124 mutert er ubiquitylated og samhandler med HJURP. In vivo ubiquitylation analyse. CENP-A-/F RPE-1-celler ble transdisert med de angitte konstruksjonene. Proteiner i 5 % av de totale cellelysater (Input) og immunoprecipitatene (IP) ved hjelp av anti-GFP kaninpolyklonalt antistoff ble påvist av vestlig blotanalyse ved hjelp av de indikerte antistoffene. Putative di-Ub-EYFP-CENP-A (**) og putative mono-Ub-EYFP-CENP-A (*) er angitt. Dette tallet er endret fra Niikura et al.8. (B) Representative bilder fra koloniens utvekstanalyse som vist i ordningen (øverst) av to forskjellige forhold ([1] og [2]) for de angitte transfektene til EYFP-CENP-A. (C)Histogrammer som oppsummerer kolonioverlevelse av eksperimentene i (B). Gjennomsnittlig prosentandel (±SEM) på mer enn 3 uavhengige eksperimenter (n ≥ 3) normaliseres med prosentandelen av overlevende kolonier i EYFP-CENP-A WT (EYFP-WT). p < 0,0001 og **p < 0,01 sammenlignet med EYFP-kontroll (Studentens t-test). Ingen signifikant (n.s.) forskjell ble observert i K124R sammenlignet med WT (Studentens t-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Fragmenter av ubiquitylated EYFP-CENP-A K124R peptider ble oppdaget i av massespektrometrianalyse. (A) Bevis for ubiquitylation ved lysin 306 (K306) av EYFP-CENP-A K124R i RPE-1 CENP-A-/F-celler. Lysin 306 (K306) av EYFP-CENP-A K124R tilsvarer lysin 56 (K56) i CENP-A. LQKLRGGSTHLLIR peptid (dekning 95,9%, tillit 87,8%) identifisert av kollisjonsindusert dissosiasjonsanalyse vises. M/z (Da)-verdiene for b (grønne) og y (røde) ioner i spektra av (A) som oppdages under fragmentering, er uthevet med grønt i tabellen (B). Ubiquitylation av K306 er bekreftet av LRGG motiv (ufullstendig spalting) av b-3 ion (m / z 753.4730) og y-8 ion (m / z 1350.8328). (B) Tabellen fremhever m/z (Da)-verdiene for b (grønne) og y (røde) ioner i spektra (A). LQK[Umc]STHLLIR i tabellen (B) indikerer LQKLRGGSTHLLIR peptid vist i (A). Disse tallene er endret fra Niikura et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

B-nummer Relevante karakteristikker(er) Referanse Kilde
B3027 (andre) PBabe-puro-Cre Niikura et al., 2019 Dr. Amruta Ashtekar, Dr. Lawrence S. Kirschner
B3182 (andre) PBabe-EYFP (andre) Niikura et al., 2019 -
B3161 (andre) PBabe-EYFP-CENP-A WT Niikura et al., 2019 Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3164 (andre) PBabe-EYFP-CENP-A K124R Niikura et al., 2019 Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3031 B3031 (andre) pspax2 (andre) Niikura et al., 2019 Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
D3032 (andre) PMD2.g Niikura et al., 2019 Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
B3189 (andre) Pgp Niikura et al., 2019 Dr. Kenji Tago (Jichi Medisinsk Univeristy, Japan)
B3190 (andre) PCI-VSVG (andre) Niikura et al., 2019 Dr. Kenji Tago (Jichi Medisinsk Univeristy, Japan)
B3001 B3001 (andre) PPAM (andre) Niikura et al., 2019 -
B3252 (andre) PQCXIP-EYFP (andre) Niikura et al., 2019 -
B3254 (andre) pQCXIP-EYFP-CENP-A WT Niikura et al., 2019 -
B3256 (andre) PQCXIP-EYFP-CENP-A K124R Niikura et al., 2019 -
B2806 (andre) PCGN-HA-Ubiquitin Niikura et al., 2019 -

Tabell 1: Plasmidvektorer som brukes i denne studien.

B-nummer Hjelper/emballasje plasmid vektorer Kombinasjon 1 Kombinasjon 2 Kombinasjon 3
B3031 B3031 (andre) psPAX2 (lentiviral gag/pol vektor) 2 μg
D3032 (andre) pMD2.g (lentiviral env vektor) 2 μg
B3189 (andre) pGP (retroviral gag/pol vektor) 2 μg
B3190 (andre) pCI-VSVG (retroviral env vektor) 2 μg
B3001 B3001 (andre) pPAM (amphotropisk hjelpevektor koding retroviral gag-pol-env) 2 μg

Tabell 2: Kombinasjoner av plasmidvektorer for hjelper/emballasje som brukes i (1.1.3): Retrovirustransfeksjon av pBabe-EYFP-CENP-A-konstruksjoner.

Supplerende kodingsfiler. Vennligst klikk her for å laste ned disse filene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrev vi metoder for massespektrometrianalyse for å identifisere ubiquitylation av EYFP-CENP-A K124R mutant som tyder på at EYFP-merkingen induserer ubiquitylation ved en annen lysin i CENP-A K124R mutert protein8. I våre resultater identifiserte vi vellykket ubiquitylation på lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R, som tilsvarer lysin 56 (K56) i CENP-A gjennom massespektrometrianalyse. Massespektrometrianalysen som er beskrevet her, er en etterligningsmetode som vi tidligere identifiserer lysin 124 (K124) ubiquitylation-området for CENP-A WT-Flag12. Derfor kan denne metoden brukes på menneskelig CENP-A protein med forskjellige koder og andre centromere-kinetochore proteiner. Massespektrometrianalysen basert på LC-MS/MS er allment akseptert for å identifisere potensielle posttranslational modifikasjoner (PTMer) av et bredt spekter av proteiner. Våre kombinatoriske metoder bestående av flere analyser/analyser (dvs. in vivo ubiquitylation assay, koloni utvekstanalyse og massespektrometrianalyse) kan anbefales for forskere som er interessert i å identifisere funksjonelle roller ubiquitylation(s) av deres målprotein(er).

Denne protokollen dekker imidlertid ikke påvisning av ubiquitylated band og/eller identifisering av stedsspesifikke ubiquitylation(s) av disse proteinene i levende celler eller en bestemt enkeltcelle under hele cellesyklusen. Disse årene optogenetiske tilnærminger utvikles dramatisk og gir stor innvirkning på kvantitative studier av cellesignalsystemer. Optogenetikk har opprinnelig gitt tilnærminger som nettopp aktiverer eller hemmer individuelle nevroner ved hjelp av enkeltkomponenter, mikrobielle opsinbaserte systemer. For tiden kan proteinaktivitet med enestående spatiotemporal presisjon kontrolleres ved å utnytte naturlige genetisk kodede fotoreseptorer, og ulike genetisk kodede verktøy tillater lyskontroll av mange biologiske prosesser, inkludert proteinfosforylering15. Derfor er optogenetikk et lovende system for å undersøke spatiotemporal protein kinase signalering på cellulære og hele organismenivåer. Antall lyskontrollerte proteinkinaser er raskt økende, selv om dagens antall er fortsatt begrenset. Imidlertid er utviklingen av lyskontrollert protein ubiquitylation forsinket, og høy molekylvektmerking av fotoreseptorer kan forstyrre ubiquitylation av både WT og muterte proteiner og funksjonelt endre den innfødte proteinfunksjonen som aforestated. Derfor er utviklingen av lavere molekylvektmerking eller sonderingsteknikk raskt nødvendig for å visualisere ubiquitylation og /eller for å undersøke leverotemporal protein ubiquitylation signalering på levende cellulære og hele organismenivåer.

I den foreliggende studien er EYFP vektorkontroll avgjørende for kontrollanalyser og analyser (immunfluorescensanalyse, koloniutvekstanalyse og in vivo ubiquitylation analyse) for å diskutere utfallet av store massespektrometrianalyse riktig. Ikke-spesifikk interaksjon med EYFP-protein observeres ofte i immunforeskningseksperimentet, og EYFP vektorkontroll er derfor uunnværlig for å evaluere den sanne interaksjonen mellom EYFP-smeltet protein(er). Vår massespektrometrianalyse ved hjelp av EYFP-CENP-A K124R uttrykt i RPE-1 CENP-A-/F-cellene viste ikke ubiquitylation på lysinsteder i EYFP polypeptidsekvensen. I andre ukjente tilstander kan det imidlertid forventes at lysinstedet i EYFP-polypeptidsekvensen er ubiquitylated i EYFP- og/eller annet merket fusjonsprotein med høy molekylvekt.

For koloniutvekstanalyser anbefales det å samle inn celler for vestlig blotanalyse for å bekrefte proteinuttømming av endogene CENP-A etter retro-Cre-virusinfeksjon og proteinuttrykk av pBabe-EYFP-CENP-A-konstruksjoner. På denne måten kan vi bedømme om kolonien utvekst fenotype er virkelig på grunn av det eneste uttrykket av eksogene CENP-A WT eller mutanter. For enhver vestlig blot analyse, hvis stripping utføres for å reblot membranen med forskjellige antistoffer for neste sving av vestlig blot analyse, bør man bruke samme kvantitative deteksjonssystem som en tidligere sving blot for neste sving blot med forskjellige antistoffer. Man bør sørge for at båndene i forrige svings blot ikke kan oppdages i membranens rette region i neste sving med forskjellige antistoffer. Eller bruk det samme kvantitative deteksjonssystemet som forrige svings blot og kontroller om inkubasjonen med det bare sekundære antistoffet som brukes i forrige svings blot, ikke fører til påvisning av proteinbånd før du starter neste svings blot med forskjellige antistoffer. For in vivo ubiquitylation analyse, er det viktig å kjøre større SDS-PAGE gel ved hjelp av apparatet for å kjøre større SDS-PAGE gel (Gel elektroforese apparater I eller II). Empirisk, større SDS-PAGE gel ville skille proteinbånd tydelig og forbedre følsomheten av påvisning av svake bånd som kunne ha vært dårlig oppdaget i mindre gel (dvs. proteinbånd vises skarpere i større gel).

Det er svært viktig å velge riktig SDS-PAGE gel for å kartlegge post-translasjonelle modifikasjoner (PTMer) av et bestemt protein grundig LC-MS / MS. Det mest brukte gelsystemet for SDS-PAGE er Laemmli-systemet, som bruker Tris-glycine geler som består av en stabling gel komponent og løse gel komponent. I dette klassiske systemet er pH og ionisk styrke av bufferne som brukes i stabling gel (Tris, pH 6.8) og løse gel (Tris, pH 8.8) forskjellig fra bufferen som brukes for å kjøre gel (Tris, pH 8.3). Båndforvrengning, tap av oppløsning eller artefaktbånd kan skyldes den svært alkaliske driften av PH-systemet i Laemmli-systemet. Den forrige rapporten beskrev hovedårsakene til dårlig båndoppløsning med Laemmli-systemet16,inkludert ustabilitet og kort utløpsperiode for oppløsningsgelen på grunn av hydrolyse av polyakrylamid ved høy pH, kjemiske endringer av prøveproteiner, reoksidasjon av reduserte disulfider av cysteinrester av proteiner, og spalting av Asp-Pro-bindinger av proteiner med oppvarming ved 95-100 °C i Laemmli prøvebuffer ved pH 5.2. De kommersielt tilgjengelige 4%-12% Bis-Tris protein geler er Bis-Tris HCI-bufret (pH 6.4) og drives på pH ca. 7.0 i motsetning til tradisjonelle Tris-glycine geler16. De mange fordelene som sammenligner med Laemmli-systemet genereres av den nøytrale driftspH-en til Bis-Tris-systemene16,inkludert høy stabilitet og lang utløpsperiode for løsegelen, forbedret prøveproteinstabilitet under elektroforese ved nøytral pH som fører til skarpere båndoppløsning og nøyaktige resultater, og fullstendig reduksjon av disulfider og fravær av spalting av Asp-Pro-bindinger. I denne rapporten kunne vi med hell kartlegge PTMer av EYFP-CENP-A K124R protein(Figur 3)ved hjelp av kommersielt tilgjengelige 4%-12% Bis-Tris protein geler. Derfor anbefales de kommersielt tilgjengelige 4%-12% Bis-Tris proteingeler å bruke til dette formålet.

For kartlegging etter oversettelsesmodifikasjoner (PTMer) av et bestemt protein, er in-gel fordøyelse av målprotein kombinert med LC-MS / MS mye brukt. I denne studien forsøkte vi å identifisere ubiquitination nettsteder EYFP-CENP-A K124R ved hjelp av affinitet rensing-masse spektrometri (AP-MS) strategi. Derfor er det første viktige trinnet å få en stor mengde ubiquitinated EYFP-CENP-A K124R protein med høy renhet ved hjelp av immunforutsyring fra EYFP-CENP-A K124R overexpressing celler, noe som i stor grad kan lette identifisering og bekreftelse av ubiquitination nettsteder av EYFP-CENP-A K124R av LC-MS/MS. For å redusere interferensen av ikke-ubiquitinated EYFP-CENP-A K124R protein, vestlige flekker av anti-GFP, anti-HA (Ub), anti-Ubiquitin (se avsnitt [6.1.6]) og Coomassie blå farging (se avsnitt [6.1.7]) ble utført for å nøyaktig bestemme plasseringen av ubiquitinated EYFP-CENP-A K124R på SDS-PAGE gel. Til slutt ble bare et minimert område av gelbånd som inneholder ubiquitinated EYFP-CENP-A K124R ekscisert for in-gel fordøyelse kombinert med LC-MS / MS for å få optimaliserte resultater. Når de tørkede peptidene rekonstitueres før bruk av LC-MS/MS, ble 3 % (v/v) acetonitrile /2 % (v/v) maursyre brukt til å bidra til bedre løselighet og utvinningshastighet av peptider. Noen ganger kan databasesøk føre til PTMer som ikke virkelig eksisterer på grunn av den omtrentlige tildelingsalgoritmen til søkemotoren. Dermed er et annet kritisk skritt å bekrefte EYFP-CENP-A K124R ubiquitination nettsteder via manuelt gjennomgang MS / MS av ubiquitinated peptider ved hjelp av Software F (Tabell av materialer), som kan eliminere "uvirkelig" ubiquitination nettsteder introdusert av omtrentlig tildeling av databasesøk. Oppsummert har denne AP-MS-strategien etablert en effektiv og robust rørledning for identifisering av EYFP-CENP-A K124R ubiquitination nettsteder med avgjørende biologisk betydning. Enda viktigere, denne rørledningen kan også bli mye utvidet for å undersøke PTMs av ulike funksjonelle proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Chao-Jun Li ved Model Animal Research Center, Nanjing University for massespektrometrianalyse. Vi takker Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa og nåværende forskere ved Model Animal Research Center, Nanjing University og Greehey Children's Cancer Research Institute for deres nyttige diskusjon, eksperimentell veiledning og reagenser. Vi takker Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago og Dawn S. Chandler for sine sjenerøse gaver av reagenser. Y.N. ble støttet av Jiangsu-provinsen ''Double- First-Class'' Construction Fund, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu-provinsen16 th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu-provinsen "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) og National Natural Science Foundation i Kina (31970665). Denne studien ble delvis støttet av NCI-stipendet R21 CA205659.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes Eppendorf 022431064 For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish BIOFIL/JET, China 700224 10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster Fisher/Corning Incorporated 07-200-83 6-well culture plate
CentriVap LABCONCO - Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm Eksigent Technologies 805-00120 Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE 100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens Leica LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS 63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane EMD Millipore IPVH00010 For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope Leica - motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source Leica External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) Surgipath 105 Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences 31071010 Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D Eksigent Technologies - liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher NP0335BOX The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus - Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera Hamamatsu C10600-10B CCD camera
PAP Pen Binding Site AD100.1 For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM VWR 25382-166 10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size) Junyi, China JY-SCZ6+ Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted VWR International 48312-013 Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody Stressgen/Enzo Life Sciences KAM-CC006 Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody Novus Biologicals H00001059-B01P Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH ABCAM ab37168 Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH Invitrogen PA1987 Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody ANTI #76 (Homemade antibody) Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10) Roche 11815016001 Rat monoclonal antibody
anti-HJURP Proteintech Group 15283–1-AP Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin Bethyl Laboratories A300-317A-1 Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450 Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33995-325 Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm VWR Scientific Products Inc. 33996-185 Microtip for sonication
Buffer A1 - - 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11-873-580-001 Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250 BBI Life Sciences CAS 6104-59-2 Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol) SigmaI-Aldrich HT90132-1L For colony staining
DAPI SIGMA-SLDRICH D9542 For nuclear staining
DMEM: F12 Medium ATCC 30-2006 DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin Life Technologies/Gibco 10082 FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) Life Technologies/BioWhittaker 12-604 high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000 Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution Life Technologies/Invitrogen L3000 Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol Fisher A412-4 Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) Fisher Scientific NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) Non-fat skim milk
Opti-MEM I Life Technologies/Invitrogen 31985 Reduced serum media
p-phenylenediamine SIGMA-SLDRICH P6001 For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid Fisher/Gibco 15-140 Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION SIGMA-SLDRICH P 8920 Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml Polysciences 23966–2 Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads GE Healthcare/Amersham 17-0963-03 Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific PI21059 Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin Promega V5111 For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo 34095 Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco 10977 Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol) - - Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/Invitrogen A11008 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life Technologies/Invitrogen A11005 fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software Olympus - Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software Olympus - Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18 Olympus - Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 LI-COR Biosciences - Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System Bio-Rad - Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System LI-COR Biosciences - Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware - - For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software Improvision/PerkinElmer - Software A
ProteinPilot Software version 4.5 AB SCIEX - Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software Bio-Rad - Software E
TripleTOF 5600+ System AB SCIEX - Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) PerkinElmer - Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) PerkinElmer - Software B2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Tags

Biologi utgave 160 centromere kinetokore mitose CENP-A etter oversettelsesmodifisering PTM ubiquitylation massespektrometrianalyse
Massespektrometrianalyse for å identifisere Ubiquitylation av EYFP-merket CENP-A (EYFP-CENP-A)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., … More

Niikura, Y., Fang, L., Kitagawa, R., Li, P., Xi, Y., You, J., Guo, Y., Kitagawa, K. Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A). J. Vis. Exp. (160), e61138, doi:10.3791/61138 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter