Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

اشتقاق، توسعة، المحافظة على التبريد وتوصيف خلايا الدماغ البطانية الدقيقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مكيفة لاشتقاق, توسيع, و cryopreserve خلايا البطانية الأوعية الدموية المجهرية التي تم الحصول عليها عن طريق التمييز بين الخلايا الجذعية متعددة القدرات الناجمة عن النشاط البشري, ودراسة خصائص حاجز الدم في الدماغ في نموذج الجسم الحي السابق.

Abstract

يمكن تمييز الخلايا البطاخلية الدقيقة في الدماغ (BMECs) عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريًا (iPSCs) لتطوير نماذج خلوية سابقة للدماغ (BBB) لدراسة حاجز الدم في الدماغ. ويوفر هذا البروتوكول المعدل خطوات تفصيلية لاشتقاق وتوسيع وتكرير BMECs من مراكز iPSCs البشرية باستخدام متبرع وكاشفات مختلفة عن تلك التي تم الإبلاغ عنها في البروتوكولات السابقة. يتم التعامل مع iPSCs مع الأساسية 6 المتوسطة لمدة 4 أيام، تليها 2 أيام من endothelial الإنسان خالية من المصل المتوسطة المتوسطة تكملها عامل النمو الليفي الأساسي، حمض الريتينويك، وتكملة B27. في اليوم 6، الخلايا هي تحت-مثقف على مصفوفة الكولاجين/فيبرومينكتين لمدة 2 أيام. يتم إجراء الكيمياء المناعية في اليوم 8 لتحليل علامة BMEC باستخدام CLDN5 و OCLN و TJP1 و PECAM1 و SLC2A1. يتم تنفيذ النشاف الغربي لتأكيد تعبير علامة BMEC ، وغياب SOX17 ، وهي علامة ادمرمة. ويتضح احتمال أنجيوجينيك مع فحص تنبت. يتم قياس المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم (TEER) باستخدام أقطاب عيدان الطعام ومقياس الفولث بدءاً من اليوم السابع. يتم قياس نشاط النقل Efflux لـ ATP ربط كاسيت subfamily B عضو 1 ATP ربط كاسيت subfamily عضو C 1 باستخدام قارئ لوحة متعددة في اليوم 8. ويؤكد الاشتقاق الناجح لـ BMECs وجود علامات الخلية ذات الصلة، وانخفاض مستويات SOX17، وإمكانية التشغية، ونشاط الناقل، وقيم TEER ~ 2000 Ω × سم2. يتم توسيع BMECs حتى اليوم 10 قبل تمرير على لوحات الكولاجين المطلية حديثا / فيبرومينكين أو cryopreserved. يوضح هذا البروتوكول أنه يمكن توسيع BMECs المشتقة من iPSC و تمريرها مرة واحدة على الأقل. ومع ذلك، فقد لوحظت قيم أقل من TEER وتعريب أقل لعلامات BMEC بعد الحفظ بالتبريد. يمكن استخدام BMECs في تجارب الثقافة المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى (الخلايا العصبية ، glia ، pericytes)، في نماذج الدماغ ثلاثية الأبعاد (رقاقة الجهاز والهيدروجيل) ، لإضفاء الطابع الوعائي على الأعضاء في الدماغ ، ولدراسة الخلل في خلل BBB في الاضطرابات النفسية العصبية.

Introduction

وظيفة حاجز الدم في الدماغ
يشكل حاجز الدم في الدماغ (BBB) حدًا يحد من حركة المواد من الدم إلى الدماغ. وBBB يتكون من خلايا البطاخلية الدقيقة في الدماغ (BMECs) التي تشكل أحادية الطبقة بطانة الأوعية الدموية. BMECs، جنبا إلى جنب مع الخلايا الفلكية، والخلايا العصبية، وال بيريكيتس، microglia، ومصفوفة خارج الخلية، تشكل وحدة الأوعية العصبية. BMECs لديها هيكل شبه الخلايا المنظمة بإحكام يسمح BBB للحفاظ على مقاومة كهربائية عالية عبر ال endothelial (TEER) ، مما يحد من الانتشار السلبي ويعمل كمؤشر على سلامة الحاجز1،2. BMECs أيضا البروتينات التي تساعد في الحركة عبر الخلية مثل الاندوس، transcytosis، والهجرة، فضلا عن البذخ من الكريات البيض خلال استجابة مناعية3. تعتمد BMECs على تدفق و efflux الناقلين للتغذية وإزالة النفايات المنتجات، من أجل الحفاظ على التوازن المثلي في الدماغ3. على سبيل المثال، المنقول الناقل الأسرة 2 عضو 1 (SLC2A1) هو ناقل تدفق المسؤولة عن حركة الجلوكوز عبر BBB4، في حين أن الناقلين efflux مثل ATP ربط الكاسيت B عضو 1 (ABCB1) و ATP ربط الكاسيت الفرعي C عضو 1 (ABCC1) هي المسؤولة عن العودة الركائز مرة أخرى إلى مجرى الدم3،5،6،7. ABCB1 ركائز تشمل المورفين, فيراباميل4, ومضادات الذهان مثل olanzapine وrisperidone8, في حين أن الناقل ABCC1 لديه مجموعة متنوعة من ركائز بما في ذلك المتقارنات كبريتات, vincristine, وglucuronide conjugates4.

تطبيق نماذج BBB في الاضطرابات النفسية
وقد تورط الخلل BBB في عدد من الاضطرابات العصبية والنفسية, بما في ذلك الفصام والاضطراب ثنائي القطب9,10. في الآونة الأخيرة ، iPSC المستمدة من النماذج الخلوية السابقة vivo تستخدم لاستجواب الأسس الخلوية والجزيئية من الاضطرابات النفسية ، ولكن هذه النماذج حاليا لا تأخذ في الاعتبار الدور المحتمل الذي تضطلع به neurovasculature11،12،13. هو افتراض أن السيتوكينات الالتهابية الطرفية المتداولة في الدم يمكن أن تؤثر سلبا على BBB14،15،16،17، ولكن هناك أيضا أدلة على18شبه الخلية،19،20،21،2122,عبر الخلية23,24,25,26,27,28,29, ومصفوفة خارج الخلية20,29,30,31,32 تشوهات تساهم في خلل BBB. يمكن أن يؤدي تعطيل BBB إلى دخول محتويات الدم إلى الدماغ وproenchyma وتفعيل الخلايا الفلكية و /أو microglia لإطلاق السيتوكينات البروينفلورية ، والتي بدورها تبدأ استجابة التهابية33 التي يمكن أن يكون لها آثار ضارة على الدماغ34. BMECs هي المكون الرئيسي لBBB ودراسة هيكل ووظيفة هذه الخلايا يمكن أن تعزز فهم الخلل BBB في الاضطرابات العصبية والنفسية.

نماذج BMEC البديلة
قبل تطوير بروتوكولات فعالة لاشتقاق BMECs من iPSCs1,6,35,36, كان الباحثون قد استخدموا BMECs37 الخالدة لدراسة وظيفة BBB. ومع ذلك، فشل العديد من هذه النماذج لتحقيق المرغوب فيه BBB الظاهريات، مثل هذا النطاق الفسيولوجية من القيم38،39. 2- والاستفادة من مراكز الـ iPSCs هي ميزة الاحتفاظ بالخلفية الوراثية للفرد الذي تُستمد منه الخلايا. يعمل العلماء بنشاط على إنشاء نماذج البيئة الدقيقة المستمدة من iPSC التي تُخص بنية ووظيفة الدماغ البشري. وقد طور الباحثون أساليب لاشتقاق BMECs التي تشبه هيكليا وفسيولوجيا BMECs الموجودة في الجسم الحي. تتطلب طرق الحصول على مجموعات منقّاة من BMECs المشتقة من iPSC عددًا من الخطوات المختلفة مع بروتوكولات يتم تحسينها في السنوات القليلة الماضية1و6و35و36. عموما, iPSC المشتقة من BMECs هي مثقف في الأساسية 6 (E6) المتوسطة لمدة 4 أيام, تليها 2 أيام في الإنسان endothelial المصل خالية من المتوسطة (hESFM) تكمل مع عامل النمو الليفي الأساسي (bFGF), حمض الريتينيك (RA), و B27 الملحق. ثم يتم استزراع الخلايا على الكولاجين الرابع (COL4) ومصفوفة فيبرومينيكتان (FN) للحصول على > 90٪ BMECs متجانسة1.

يتم تأكيد هوية BMECs عن طريق الفلوروس المغناطيسية التي تظهر التعبير المشترك لبروتينات BMEC بما في ذلك جزيء التصاق الخلايا البطانية الصفائح الدموية -1 (PECAM1) وSLC2A1 والبروتينات الضيقة مثل وصلة الوصل الضيقة البروتين 1 (TJP1) ، occludin (OCLN) ، وكلاودن -5 (CLDN5)6. وقد استخدمت مقايسات النتـر للتأكد من الإمكانات الـ أوعية للـ iPSC المشتقة من BMECs. 6 يتم تقييم سلامة BBB من BMECs من خلال وجود قيم فيزيولوجية في المختبر TEER (~20000Ω × سم2)37 ونشاط قابل للقياس لنقل efflux مثل ABCB1 وBCC11،6،36. وقد أدت التطورات المنهجية الأخيرة من قبل مجموعة ليبمان إلى بروتوكولات BMEC المشتقة من iPSC مع تقليل التغير التجريبي وتعزيز قابلية التكاثر1. ومع ذلك، لا يُعرف ما إذا كان من الممكن توسيعها وتجاوزها إلى ما بعد مرحلة الاستزراع الفرعي. يهدف بروتوكولنا المعدل إلى معالجة هذه المشكلة عن طريق تمرير BMECs المشتقة من iPSC إلى ما بعد اليوم الثامن وتقييم ما إذا كان يمكن توسيعها بشكل أكبر للاحتفاظ بخصائص BBB بعد الحفظ بالتبريد. في حين لم تصف أي دراسات تمرير BMECs المشتقة من iPSC ، يوجد بروتوكول للحفظ بالتبريد BMEC الذي يحتفظ بخصائص BBB الفسيولوجية بعد خضوعه لدورة التجميد40. ومع ذلك، فإنه غير معروف BMECs ما بعد التبريد يمكن أن يكون ممر والاحتفاظ بخصائص BBB.

BMECs المستمدة من iPSCs باستخدام بروتوكول ليبمان وقد استخدمت لنموذج اضطراب BBB في الاضطرابات العصبية مثل مرض هنتنغتون7. وقد استخدمت هذه BMECs مشتقة من iPSC أيضا للتحقيق في آثار العدوى البكتيرية مثل التهاب السحايا Neisseria أو المجموعة B العقدية على تعطيل حاجز CSF الدم وBBB على التوالي41,42. أيضا، باستخدام BMECs المشتقة من iPSC من مرضى متلازمة الحذف 22q الذين يعانون من الفصام، لاحظ الباحثون زيادة في جزيء التصاق بين الخلايا-1 (ICAM-1)، وهو جزيء التصاق كبير في BMECs التي تساعد في التوظيف والبذخ من الكريات البيض في الدماغ43. هذه الدراسات مجتمعة، تثبت فائدة BMECs المشتقة من iPSC لدراسة اضطراب BBB في الاضطرابات العصبية والنفسية المعقدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت إعادة برمجة iPSCs الإنسان من الخلايا الليفية من المتبرعين الأصحاء باستخدام بروتوكول وافق عليه المجلسين مراجعة المؤسسات من مستشفى ماساتشوستس العام ومستشفى ماكلين, وتتميز كما وصف في الدراسات السابقة44,45,46.

ملاحظة: باختصار، تم إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى iPSC عبر إعادة برمجة البرمجة الجينية القائمة على مرنا47. تم الاحتفاظ iPSCs في الخلايا الجذعية المتوسطة (SCM) (انظر قائمة المواد) وتخزينها في كثافة ~ 1.2 × 102 خلايا / مل مع 1 مل من SCM، 10 ميكرومتر مع مثبط كيناز البروتين المرتبط بالرخو (ROCKi) Y-27632، و10٪ (v/v) كبريتيد ثنائي الفينيل (DMSO)، في قارورة المبردة في النيتروجين السائل عند -160 درجة مئوية. 10- تُنفذ جميع الإجراءات التالية أدناه في خزانة للسلامة الأحيائية ما لم يُذكر خلاف ذلك.

1. الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة التخفيف وطلاء لوحة

  1. المخفف (1:50) عامل النمو خفض غشاء الطابق السفلي مصفوفة تنقية من ورم Engelbreth-Holm-Swarm في Dulbecco 'sعدل النسر المتوسط (DMEM) دون الفينول الأحمر.
  2. معطف لوحات ثقافة الخلية مع كمية مناسبة من مصفوفة غشاء الطابق السفلي المخفف (أي، 6-جيدا لوحة = 1mL، 12-جيدا لوحة = 0.5 مل) واحتضان هذه اللوحات في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.

2. صيانة iPSC

ملاحظة: الحد الأقصى للالتقاء في البئر في لوحة 6-جيدا مسطحة القاع هو ~ 1.2 × 106 الخلايا.

  1. ذوبان iPSCs cryopreserved في SCM مع 10 μM Y-27632 ولوحة على لوحة 6-well المغلفة مع عامل النمو المخفف مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
  2. الحفاظ على iPSCs في SCM مع 10 ميكرومتر Y-27632 لأول 24 ساعة بعد ذوبان الجليد. التبديل إلى المتوسط الطازج بعد 24 ساعة.
  3. الحفاظ على iPSCs في SCM حتى الخلايا تصل إلى 80-90٪ التقاء قبل passaging.
    1. احسب عدد الـ iPSCs التي ستكون هناك حاجة للتمايز عن طريق ضرب الكثافة المطلوبة للتمايز (15,600 خلية/سم2)على مساحة سطح البئر. لطبقة مسطحة القاع 6 جيدا، مضاعفة 15600 خلية / سم2 في 9.6 سم2 لمجموع 149760 الخلايا / جيدا.
  4. للمرور، اغسل الخلايا بمحلول الملح المتوازن من هانكس (HBBS). ثم، احتضان الخلايا مع حمض الإثيلين غير الأنزيمية (EDTA) (انظر قائمة المواد) لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
    1. استخدم مكشطة الخلايا لرفع بلطف قبالة الخلايا. جمع الخلايا في SCM جديدة.
    2. خلايا لوحة على لوحات ثقافة الخلية المغلفة مع SCM المخفف والحفاظ على الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.3 أو تخزينها في ~ 1.2 × 106 الخلايا / مل في 1 مل من SCM، 10 μM Y-27632، و 10٪ DMSO (الخامس / الخامس) في قارورات المبردة في النيتروجين السائل في درجة حرارة -160 درجة مئوية.

3- تمييز مراكز iPSCs إلى BMECs

ملاحظة: EDTA غير انزيمية يفصل الخلايا إلى كتل. إنزيمية EDTA (انظر جدول المواد) يفصل الخلايا في تعليق خلية واحدة. حمض الريتينويك (RA) يجب أن تكون محمية من الضوء.

  1. غسل iPSCs مرة واحدة مع محلول الفوسفات العازلة في دولبيككو (DPBS). احتضان مع EDTA الأنزيمية (1 مل لطبقة 6-جيدا، 0.5 مل ل12-جيدا لوحة، و 0.25 مل ل24-جيدا لوحة) لمدة 5 دقائق تقريبا في 37 درجة مئوية لتحقيق تعليق خلية واحدة.
  2. جمع الخلايا والطرد المركزي في 300 × ز (قوة الطرد المركزي النسبية) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الكريات خلية resuspend في SCM تحتوي على 10 μM Y-27632.
  3. تحديد كثافة الخلايا باستخدام عداد الخلايا تريبان الأزرق والآلي أو جهاز قياس الهيموسيت. خلايا الصفيحة بكثافة 15,600 خلية/سم2 أو 149,760 خلية/بئر من لوحة مسطحة القاع 6 جيدا (مع مساحة سطح 9.6 سم2/well) في SCM تحتوي على 10 ميكرومتر-Y-27632 لمدة 24 ساعة.
  4. بدء التمايز بعد 24 ساعة عن طريق تغيير SCM إلى E6 المتوسطة. تغيير E6 المتوسطة يوميا لمدة 4 أيام المقبلة.
  5. في اليوم 4 من التمايز، استبدال E6 المتوسطة مع hESFM تستكمل مع المخفف (1:200) B27 الملحق، 20 نانوغرام / مل bFGF، و 10 ميكرومتر RA. لا تقم بتغيير هذه الوسيلة للـ 48 ساعة القادمة.
  6. إعداد 200 مل من hESFM مع المخفف (1:200) B27، مزيج 1 مل من 50x الملحق B27 المركزة إلى 199 مل من hESFM.
  7. إعداد 20 نانوغرام / مل من bFGF عن طريق إعادة تشكيل 50 ميكروغرام من bFGF في 250 ميكرولتر من تريس العازلة (5 mM تريس، 7.6، 150 mM NaCl) لجعل 200 ميكروغرام / مل حل الأسهم. إعداد 200 مل من hESFM تحتوي على 20 نانوغرام / مل bFGF عن طريق خلط 20 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل bFGF مع 200 مل من hESFM.
  8. إعداد 10 μM RA عن طريق إجراء أول 40 ملغ / مل من حل الأسهم RA بإضافة 2.5 مل من DMSO إلى 100 ملغ من مسحوق RA. تمييع هذا التركيز إلى 3 ملغ / مل لجعل 10 mM حل الأسهم. إعداد 200 مل من hESFM تحتوي على 10 ميكرومتر RA عن طريق خلط 200 ميكرولتر من 10μM RA في 200 مل hESFM.

4. طلاء الكولاجين الرابع (COL4) ومصفوفة فيبرومينيكين (FN) لتنقية BMEC المشتقة من iPSC

  1. إضافة 2 مل من الماء المعقم إلى 2 ملغ من FN لجعل 1 ملغ / مل FN حل الأسهم. إضافة 5 مل من الماء المعقم إلى 5 ملغ من COL4 لجعل 1 ملغم / مل COL4 حل الأسهم.
    1. السماح FN للذوبان لمدة 30 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية و COL4 لتذوب في درجة حرارة الغرفة.
  2. تخفيف FN حل المخزون في المياه المعقمة إلى تركيز نهائي من 100 ميكروغرام / مل وCOL4 حل المخزون إلى تركيز النهائي من 400 ميكروغرام / مل.
  3. معطف لوحات المطلوب (6-جيدا لوحة = 1 مل من حل COL4 /FN، 12-جيدا لوحة = 0.5 مل، 24-جيدا لوحة = 0.25 مل، و 12-transwell لوحة مرشحة = 0.25 مل) مع خليط من 400 ميكروغرام / مل COL4 و 100 μg / mL FN.
  4. ألواح احتضان لمدة لا تقل عن ساعتين أو بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية؛ للوحات ترانسويل المصفاة، ينصح بحد أدنى من 4 ساعات.

5- الاستزراع الفرعي وتنقية مراكز BMEC المشتقة من iPSC

ملاحظة: قد يستغرق الاحتضان مع EDTA الأنزيمية أكثر من 15 دقيقة اعتمادًا على التقاء الخلايا في اليوم السادس من التمييز.

  1. في اليوم السادس من التمايز، يغسل الخلايا مرتين مع DPBS. احتضان مع 1 مل من EDTA الأنزيمية لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة.
  2. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الكريات خلية ريسوسينيد مع hESFM الطازجة مع المخفف (1:200) ملحق B27, 20 نانوغرام/ مل bFGF, و 10 μM RA.
  3. خلايا البذور على لوحات مغلفة بمزيج من 400 ميكروغرام/مل COL4 و100 ميكروغرام/مل FN. خلايا البذور باستخدام نسبة 1 بئر من لوحة 6-جيدا إلى 3 آبار من لوحة 12 جيدا، 3 آبار من لوحة 12 ترانسويل المصفاة، أو 6 آبار من لوحة 24 جيدا.
  4. بذور iPSCs غير متمايزة من نفس خط الخلية على COL4/FN المغلفة 12-transwell لوحة المصفاة كتحكم سلبي لتحليل TEER.
  5. بعد 24 ساعة من زراعة دون، تغيير المتوسطة إلى hESFM مع ملحق B27 فقط. لا توجد تغييرات متوسطة مطلوبة بعد هذه الخطوة.

6. فحص براعم

  1. جمع اليوم 8 iPSC المستمدة BMECs وبذرتها في 100،000 خلية / جيدا على لوحة مسطحة القاع 24 جيدا المغلفة حديثا مع 200 ميكرولتر / سم2 من مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
  2. علاج هذه الخلايا مع hESFM مع المخفف (1:200) B27 و 40 نانوغرام / مل من عامل النمو البطانية الوعائية A (VEGFA165).
  3. مراقبة الخلايا كل 24 ساعة وتغيير المتوسطة كل يومين.

7. الكيمياء المناعية (ICC)

ملاحظة: يتم تنفيذ ICC على لوحات مسطحة القاع 24-جيدا.

  1. بعد 48 ساعة من زراعة فرعية (اليوم 8) ، وغسل الخلايا مرتين مع DPBS. قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ شبه شكلي (PFA) لمدة 20 دقيقة.
  2. غسل الخلايا ثلاث مرات مع DPBS، 5 دقائق لكل غسل. خلايا ما قبل الكتلة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في DPBS مع مصل حمار 5٪ و 0.3٪ تريتون X-100 (v/v).
  3. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية: الماوس المضادة للإنسان-PECAM1 (1:100، الأسهم 0.5 ملغ /مل)، أرنب المضادة للإنسان-TJP1 (1:200، الأسهم 0.53 ملغ/مل)، الماوس المضادة للإنسان CLDN5 (1:200، الأسهم 0.5 ملغ / مل), الماوس المضادة للإنسان-OCLN (1:200, الأسهم 0.5 ملغ /مل), والأرانب المضادة للإنسان-SLC2A1 (1:100, الأسهم 0.2 ملغ/مل) في DPBS تحتوي على 5٪ مصل الحمير بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    1. شطف الخلايا مرة واحدة مع DPBS ثم يغسل خمس مرات لمدة 5 دقائق لكل غسل مع DPBS.
  4. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية: حمار المضادة للأرانب اليكسا فلور 555 (1:200) والحمار المضادة للماوس 488 (1:200) في DPBS تحتوي على 5٪ مصل حمار لمدة 1 ساعة.
  5. بعد هذا الحضانة، إضافة Hoechst 33342 ثلاثي هيدروكلوريد ثلاثي هيدروهيد المخفف (1:1000) في DPBS لمدة 10 دقائق.
    1. إزالة حل Hoechst 33342 وشطف مرة واحدة مع DPBS وغسل أربع مرات مع DPBS لمدة 5 دقائق لكل غسل.
  6. تصور الخلايا على المجاهر fluorescence للبحث عن التعبير وتوطين صانعي الخلايا.

8. TEER القياس والتحليل

ملاحظة: تم تجهيز الألواح المصفاة من 12-Transwell من كورنينج بمرشحات تتكون من أغشية بولي إيثيلين تيريفثاليت 1.12 سم2 و 0.4 ميكرومتر. ويتم الحصول على قياسات الـ TEER بالتقنية (3 لكل بئر) والمضاعفة البيولوجية (3 آبار لكل خط خلية و/أو حالة).

  1. بعد 24 ساعة من زراعة فرعية (اليوم 7)، وقياس TEER باستخدام أقطاب عيدان الطعام ومقياس فولتوهممتر كل 24 ساعة. الرجوع إلى دليل المستخدم voltohmmeter للحصول على تعليمات محددة بشأن الحصول على القياسات.
    1. لقياس TEER، قم بشحن جهاز القياس في الليلة السابقة. مسح طفيفة الصك وأقطاب عيدان الطعام مع 70٪ الإيثانول قبل وضعها في غطاء محرك السيارة السلامة.
    2. قم بتشغيل الطاقة ومعايرة مقياس أوم كما أوصت به الشركة المصنعة.
    3. سد في أقطاب عيدان الطعام وشطف أقطاب مع 70٪ الإيثانول تليها DPBS.
    4. ضع القطب الطرفي الأقصر في إدراج البئر العابر (الغرفة الزهية) والنهاية الأطول في الغرفة القاعدية.
    5. قياس أولاً بئر فارغة التي يتم المغلفة مع COL4/FN فقط. ثم قياس الآبار الأخرى.
    6. شطف بسرعة أقطاب عيدان الطعام مع 70٪ الإيثانول تليها DPBS عند قياس ظروف مختلفة (أي قياس خطوط الخلايا المختلفة).
  2. بعد أن تم تسجيل جميع القياسات (في Ω) ، شطف أقطاب عيدان الطعام مع 70 ٪ من الإيثانول ثم الماء العقيم. قم بمسح القطب برفق واتركه جافًا في غطاء محرك السيارة الآمن.
  3. متوسط قيم TEER ثلاثية الليكات (في Ω) من البئر الفارغ وطرح قيمة المتوسط هذه من كل قيمة من قيمة TEER الأولية حسب الحالة.
    1. متوسط القيم المطروحة وضربها بـ 1.12 سم2 (المساحة السطحية لإدراج 12-transwell).
    2. استخدم القيم المحولة من الخطوة 6 لإنشاء الرسم البياني الذي يظهر قيمة TEER والأخطاء القياسية لكل يوم من قياس TEER.

9. نشاط وتحليل الناقل إيفلوكس

ملاحظة: يتم إجراء مقايسة نشاط النقل Efflux على لوحة مسطحة القاع 24-جيدا. وتشمل ناقلات إيفلوكس ذات الاهتمام ABCB1 وABCC1. ويوصى بأن يتم تنفيذ كل حالة في ثلاث 33 مع آبار التحكم (أي آبار فارغة دون مثبطات كل منها).

  1. بعد 48 ساعة من الاستزراع الفرعي (اليوم 8)، احتضان الخلايا مع 10 ميكرومتر فالسبودار (مثبط ABCB1) أو 10 μM MK571 (مثبطات ABCC1) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    1. إعداد 10 mM فالسبودار المخزون عن طريق حل 5 ملغ من مسحوق (1214.64 ز /مول) في 412 ميكرولتر من DMSO وتمييع لتركيز العمل من 10 μM. على سبيل المثال، لجعل 10 مل من hESFM مع 10 μM Valspodar، مزيج 10 ميكرولتر من 10 mM فالسبودار الأسهم مع 10 مل من hESFM.
    2. إعداد 10 mM MK571 المخزون عن طريق حل 5 ملغ مسحوق (537.07 غرام / مول) في 931 ميكرولتر وتمييع لتركيز العمل من 10 μM. على سبيل المثال، لجعل 10 مل من hESFM مع 10 μM MK571، مزيج 10 ميكرولتر من 10 mM MK571 الأسهم مع 10 مل من hESFM.
  2. بعد 1 ساعة، واحتضان الخلايا مع 10 ميكرومتر رودامين 123 (الركيزة ABCB1) أو 10 μM 2'، 7'-dichlorhydroflucecein diacetate (H2DCFDA، الركيزة ABCC1) مع أو بدون مثبطات كل منها لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
    1. إعداد 10 mM rhodamine 123 عن طريق حل 10 ملغ من مسحوق (380.82 غرام /مول) في 875 ميكرولتر من DMSO وتمييع لتركيز العمل من 10 ميكرومتر. على سبيل المثال، لجعل 10 مل من hESFM مع 10 ميكرومتر رودامين 123، مزيج 10 ميكرولتر من 10 mM rhodamine 123 الأسهم مع 10 مل من hESFM.
    2. إعداد 10 mM H2DCFDA عن طريق حل 50 ملغ من مسحوق (487.29 غرام /مول) في 10.26 مل من DMSO وتمييع لتركيز العمل من 10 μM. على سبيل المثال، لجعل 10 مل من hESFM مع 10 ميكرومتر رودامين 123، مزيج 10 ميكرولتر من 10 mM rhodamine 123 الأسهم مع 10 مل من hESFM.
  3. غسل الخلايا مرتين مع 0.5 مل من DPBS وlyse باستخدام DPBS تحتوي على 5٪ تريتون X (v/v).
  4. قياس الفلورية للخلايا lysed باستخدام قارئ لوحة متعددة أو microplate (انظر قائمة المواد).
    1. تعيين أداة قارئ لوحة الفلورسنت إلى 485 نانمتر الإثارة و 530 نانومتر الانبعاثات وقياس الفلورينس في هذه الأطوال الموجية.
    2. بالنسبة للآبار غير المستخدمة في مقايسة الناقل، قم بغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS قبل تحديدها بنسبة 4٪ PFA للحصول على كمية نواة الخلية.
  5. تحتضن الخلايا مع Hoechst 33342 ثلاثي هيدروكلوريد ثلاثي هيدروكلوريد المخفف (1:1000) في DPBS لمدة 10 دقائق. صورة حقول بصرية متعددة في كل بئر لحساب متوسط تعداد نوات الخلايا باستخدام المجاهر الفلوريسانس.
  6. عد النوى باستخدام فيجي وتطبيع قيم الفلوريسنس على أساس كل خلية لهذه التهم.
    1. حساب متوسط تراكم الفلورس عن طريق طرح قيمة تراكم الفلورسين الخام لكل شرط من قيمته الفارغة الخاصة به.
    2. متوسط القيم المطروحة لكل شرط.
    3. تقسيم متوسط القيم من الخطوة 9.6.1 على متوسط عدد الخلايا. استخدم هذه القيم لتطبيع قيم الفلوريسنس على أساس كل خلية.
    4. استخدم القيم المُطَرَّتة لتوليد تمثيل رسومي لكل حالة من حالات المثبطات وإجراء أي تحليل إحصائي ضروري.

10. Passaging ، والتوسع ، والتبريد حجز BMECs

  1. تجديد الثقافات 8 BMEC مع hESFM الطازجة تستكمل مع المخفف (1:200) B27 والسماح للخلايا لتوسيع لمدة يومين أكثر على مصفوفة COL4/FN.
  2. معطف لوحة جديدة 12-Transwell تصفية و 24-جيدا لوحة مسطحة القاع مع 400 ميكروغرام / مل COL4 و 100 ميكروغرام / مل FN واحتضان لمدة 4 ساعات.
  3. في اليوم 10، وغسل الخلايا مع DPBS واحتضان مع 1 مل من EDTA الأنزيمية لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة.
  4. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    1. للتبريد هذه الخلايا, الكريات خلية ريسوسينيد مع hESFM الطازجة مع 30٪ مصل البقرة الجنين (FBS) و 10٪ DMSO.
    2. تخزين BMECs المشتقة من iPSC في قوارير مبردة في حاوية isopropanol لأول 24 ساعة عند -80 درجة مئوية ، ثم ضعها في النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل عند -160 درجة مئوية.
    3. لتمرير هذه الخلايا، الكريات الخلية resuspend مع hESFM الطازجة تستكمل مع المخفف (1:200) B27.
  5. خلايا البذور على لوحات مغلفة أعدت في الخطوة 10.2. خلايا البذور باستخدام نسبة 1 بئر من لوحة 6-جيدا إلى 3 آبار من لوحة 12 ترانسويل المصفاة وإلى 6 آبار من لوحة 24 جيدا. السماح للخلايا بالنمو والتوسع لمدة 24 ساعة.
  6. في يوم 11، قياس TEER باتباع الخطوات المذكورة في الخطوة 8.
  7. في اليوم 12، قم بإجراء ICC باتباع الخطوات المذكورة في الخطوة 9.
  8. لذوبان BMECs المبردة، ضع قوارير التبريد في ماء دافئ أو حمام حبة في 37سC. ثم نقل BMECs المذاب إلى 5 مل من hESFM تكملها مع المخفف (1:200) B27.
    1. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. Resuspend الخلايا في hESFM تكملها مع المخفف (1:200) B27، 10 μM RA و 10 μM Y-27632.
    2. بعد 24 ساعة، التبديل المتوسطة إلى hESFM تكملها مع المخفف (1:200) B27 و 10 μM Y-27632 دون RA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تمايز BMEC
وينبغي اتباع بعض الخطوات الهامة في هذا البروتوكول بدقة(الشكل 1). E6 متوسطة الاستخدام في اليوم 1 مهم، لأنه غالبا ما يستخدم لاشتقاق نسب العصبية من iPSCs خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن تسفر عن نتائج استنساخ عبر خطوط الخلايا المتعددة36. وثمة خطوة هامة أخرى هي في اليوم 4 من التمايز، حيث ينبغي تحويل متوسط E6 إلى hESFM مع تخفيف (1:200) B27، 20 نانوغرام/مل bFGF و 10 ميكرومتر RA لتوسيع BMECs المشتقة من iPSC. يتم استخدام إضافة ملحق B27 كبديل لمصل البقر لدعم المصل خالية من زراعة الخلايا1, bFGF يضاف إلى تسهيل نمو BMECs المشتقة من iPSC6, ويستخدم RA لتسهيل تطوير النمط الظاهري BBB35. الخطوة الهامة الأخيرة تنطوي على مرحلة تنقية، حيث اليوم 6 iPSC المشتقة BMECs هي sub-cultured على لوحة مغلفة COL4/FN لتحديد BMECs المشتقة من iPSC1،6،35،36. ويبين الشكل 2 الانتقال المورفولوجي من مراكز الملوثات الـ iPSCs إلى مراكز BMECs. بعد يوم واحد من E6 المتوسطة (اليوم 1)، مورفولوجيا الخلوية مماثلة لتلك التي من iPSCs. في اليوم 4 من E6، تبدأ الخلايا في الظهور بشكل واضح من iPSCs وتغطي معظم البئر (~ 90٪ التقاء). في اليوم 6، في حين مثقف في hESFM مع المخفف (1:200) B27، 20 نانوغرام / مل bFGF و 10 μM RA،رفولوجيا الخلوية يبدأ أن يكون لها مظهر ممدود والحصى. في اليوم 8، كل خلية فردية متميزة في نمط حصى كبير. تم إجراء فحص انبتُر لإثبات الإمكانية الوعائية لـ BMECs المشتقة من iPSC ، مما أدى إلى هياكل تشبه الأنبوب بعد 3 أيام من العلاج VEGFA165 (الشكل 3).

Figure 1
الشكل 1: مخطط تفصيلي لتمايز مراكز iPSCs البشرية إلى BMECs. تم استزراع iPSCs في الخلايا الجذعية في البداية في وسط الخلايا الجذعية التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 لمدة 24 ساعة قبل تغيير الوسيط إلى E6 لمدة 4 أيام. في اليوم 4، تم تغيير المتوسطة إلى hESFM مع (1:200) ملحق B27، 20 نانوغرام/ مل bFGF، و 10 μM RA لمدة 2 أيام. في اليوم 6، كانت الخلايا تحت الثقافة على لوحات مغلفة COL4/FN. في اليوم 7، تم تغيير المتوسطة إلى hESFM مع ملحق B27 دون bFGF و RA وTEER تم قياس. في اليوم 8، تم إجراء الجنائية الدولية ومقايسات نشاط النقل efflux. تم توسيع BMECs المشتقة من iPSC حتى اليوم العاشر قبل المرور إلى لوحة بئر مغايرة أو لوحة مسطحة 24 بئرًا لقياس TEER وتحليل ICC ، على التوالي. تم استخدام اليوم 8 BMECs للملايس تنبت (لا يصور). تم جمع 2 بئر من لوحة 6 آبار من BMECs المشتقة من iPSC وتخزينها في hESFM مع 10٪ DMSO و 30٪ FBS عند -80 درجة مئوية ثم في النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل عند -160oC. في اليوم 12، لوحظت ذروة في قيمة TEER في BMECs المشتقة من iPSC والتي تم فيها تنفيذ ICC. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور المجال الساطع التي تصور تمايز مراكز iPSCs إلى BMECs. بعد يوم واحد من الثقافة في E6 المتوسطة، iPSCs الاحتفاظ مورفولوجيا مميزة. في اليوم 4 في E6 المتوسطة، يبدو مورفولوجيا الخلوية مختلفة بشكل واضح عن iPSCs. في اليوم السادس، يتغير مورفولوجيا الخلايا إلى مظهر ممدود ومحصر. في اليوم الثامن، تظهر الخلايا كبيرة وبنمط حصى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الإمكانات الجيوجينية لـ BMEC المشتقة من iPSC. تم زرع BMECs المشتقة من iPSC المنقية في 100,000 خلية/سم2 على مصفوفة غشاء الطابق السفلي في hESFM مع (1:200) B27 ملحق و40ng/ml VEGFA165. ظهرت هياكل تشبه الأنبوب بعد 3 أيام من العلاج VEGFA165. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم زرع BMECs المشتقة من iPSC المنقية في 100,000 خلية/سم2 على مصفوفة غشاء الطابق السفلي في hESFM مع (1:200) B27 ملحق و40ng/ml VEGFA165. ظهرت هياكل تشبه الأنبوب بعد 3 أيام من العلاج VEGFA165.

تم تنفيذ توصيف BMEC باستخدام الكيمياء المناعية لعلامات الخلية المحددة. تم تقييم BMECs المشتقة من iPSC لوجود بروتينات الوصلات الضيقة (OCLN و TJP1 و CLDN5) ، والتي يتم التعبير عنها عادة في الوصلات الضيقة للخلايا البطانية في الدماغ3 والخلايا البطانية في الرئة والكبد والكلى18. علامات أخرى مثل PECAM1 و SLC2A1، وقد استخدمت سابقا كعلامات لBMECsتنقية 6. PECAM13 و SLC2A4 على حد سواء في الخلايا البطانية الوعائية من BBB. وقد عبرت المراكز الفرعية الناشئة عن الملوثات الفرعية (BMECs) المشتقة من iPSC التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول عن جميع هذه العلامات الخمسة(الشكل 4).

Figure 4
الشكل 4: تحليل مؤشر BMECs المشتق من iPSC. كانت BMECs المشتقة من iPSC البشرية ملطخة بوصلات ضيقة (OCLN ، TJP1 ، CLDN5) ، ناقل التدفق (SLC2A1) ، وبروات تقاطع الـ (PECAM1). يتم توطين بروتينات OCLN و TJP1 و CLDN5 في غشاء الخلية في المقام الأول. يتم ترجمة SLC2A1 وPECAM1 في كل من غشاء الخلايا والنيات. تم استخدام هويشست 33342 ثلاثي هيدروكلوريد ثلاثية الهيدريد في التلطيخ النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ولتوصيف وظيفة BBB من BMECs، تم قياس TEER 24 ساعة (اليوم 7) بعد زراعة الاستزراع الفرعي وتم تغيير الوسيط إلى hESFM مع تخفيف B27 (1:200) بدون bFGF و RA. تم الحصول على قياسات TEER ابتداء من اليوم 7 من التمايز (اليوم 0 من قياس TEER) وبلغت ذروتها في ~ 2000 Ω × سم2 في اليوم 8 أو 48 ساعة بعد bMECs(الشكل 5). هذه القيم TEER هي ضمن النطاق الموصوف لـ BMECs المشتقة من iPSC ذات الجرذان الأولية37. لم يكن خط iPSC أي دالة BBB ملحوظ وفقا لقيمها TEER منخفضة.

Figure 5
الشكل 5: قياسات TEER في BMECs المشتقة من iPSC. بلغت قيم TEER ذروتها بعد يوم واحد من الاستزراع الفرعي على مصفوفة COL4/FN (في اليوم 8 من التمايز). وتم الحصول على قياسات الـ TEER بالتقنية (3 مقاييس لكل بئر) والمضاعفة البيولوجية (3 آبار لكل خط خلية). تم طرح متوسط القيمة الفنية من بئر فارغ من قيم TEER الأولية. وقد تم حساب متوسط هذه القيم لكل يوم وضربها في 1.12 سم2 (مساحة السطح من 12-transwell إدراج). تمثل أشرطة الخطأ خطأً قياسياً. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لتقييم ABCB1 وBCC1 efflux نشاط الناقل ، وكمية الركيزة الفلورية التي تناولها لBCB1 وBCC1 تم تحديد كميا بعد الحضانة مع مثبطات كل منها. كما هو متوقع، تثبيط ABCB1 وAfflux ABCC1 الناقلين مع PSC833 (مثبطات ABCB1) أو MK-571 (مثبطات ABCC1) أدى إلى زيادة في رودامين 123 (R123) أو 2'، 7'ديكلوروديهودروبوروفلوريسين DIACETATE (H2DCFDDA)، على التوالي(الشكل 6). وتشير هذه الأدلة إلى أن BMECs المشتقة باستخدام هذا البروتوكول لها نشاط نقل efflux.

Figure 6
الشكل 6: نشاط الناقل Efflux في BMECs المشتقة من iPSC. تم تحديد نشاط نقل Efflux في BMECs من خلال تحديد كمي لتراكم رودامين 123 (R123) أو 2'، 7'dichlorodihydrofluscein diacetate (H2DCFDA ) في وجود أو غياب PSC833 (ATP ربط الكاسيت subfamily B عضو 1 (ABCB1) المانع) أو MK-571 (ATP ربط كاسيت دون ذكر عضو C 1 (ABCC1) المانع). تم تنفيذ ثلاثيات التقنية لكل حالة (N = 1). تم خصم قيم الفلوريسنس من حالة التحكم (أي بدون مثبطات) من قيم الفلورسنسي الخام. وقد تم تطبيع هذه التراكمات الفلورية على أساس كل خلية لكل تكرار تقني. تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام الطالب t-test من النسخ المتماثلة التقنية الثلاثة. لم يلاحظ أي دلالة إحصائية بين تراكم R123 مع وبدون مثبطات ABCB1 (t-stat= -1.66، p= 0.11). ولوحظت أهمية إحصائية بين تراكم H2DCFDA مع و بدون مثبطات ABCC1 (t-stat= -7.23، p= 0.04). *p<0.05. تمثل أشرطة الخطأ خطأً قياسياً. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تمرير، وتوسيع وباكوب حجز BMECs مشتقة من iPSC
وكان هناك هدف آخر هو التحقق مما إذا كان يمكن تمرير مراكز BMECs المستمدة من iPSC وpreopreserved بعد زراعة فرعية. لهذا الغرض، سمح لليوم 7 iPSC المشتقة BMECs لتوسيع حتى اليوم 10 قبل تمرير لهم على المغلفة حديثا COL4/FN 12-transwell لوحات المصفاة لقياس TEER و 24 جيدا لوحة مسطحة القاع لتحليل ICC(الشكل 7). وباستخدام هذه الحالة، استمر استخدام BMECs المشتقة من iPSC في الانتشار، وحافظ على تعبير OCLN و TJP1 و CLDN5 و SCL2A1 و PECAM1(الشكل 8)واستمر في الحفاظ على قيم TEER المناسبة (ذروة عند ~2000 Ω x سم2)بعد تمرير(الشكل 9). تم ذوبان BMECs المبردة في وقت لاحق ، وتوسيعها ، ثم تم تمريرها (الشكل 7). وقد تم الحصول على قياسات تير للبلدان المتطايرة للبلدان الأمريكية الناشئة بعد 24 ساعة من ذوبان الجليد وبعد ذلك بعد عدة أيام أخرى. وقد انخفضت قياسات الـ TEER لهذه الكميات المذابة من BMECs (وبلغت ذروتها عند 800 Ω × سم2) عند مقارنتها باللجان BMECs المشتقة حديثاً. وأظهرت تمريرة ثانية من BMECs بعد ذاب حتى أقل قيم TEER (بلغت ذروتها في 200-300 فقط Ω × سم2)(الشكل 9)وأظهرت أنماط مهترئة و / أو منمش من تشكيل تقاطع ضيق(الشكل 10). كشف تحليل البقعة الغربية48 أن iPSCs أعرب في المقام الأول عن علامة اندمرمال (SOX17)49 وبعض علامات تقاطع ضيق (OCLN) ، ولكن ليس غيرها من علامات BMEC ذات الصلة (TJP1 ، CLDN5 ، وSLC2A1) (الشكل 11). BMECs أعرب في المقام الأول علامات ذات الصلة البطانية (TJP1، CLDN5، OCLN وSLC2A1)، مع مستويات منخفضة من علامة بطانة الدم، SOX17.

Figure 7
الشكل 7: صور حقل ساطعة من BMEC المشتقة من iPSC الموسعة والمكونة من Cryopreserved. أ) اليوم 10 (4 أيام بعد الثقافة الفرعية الأولية) الخلايا وصلت إلى أقصى حد التقاء. ب) يوم 11، 24 ساعة بعد تمرير على COL4/FN المغلفة لوحة 24-آبار. ج) Day12، بعد 48 ساعة من تمرير على COL4/FN المغلفة 24-آبار لوحة؛ وقد لوحظت قيم ذروة TEER وتم تنفيذ ICC. د) 48 ساعة بعد ذوبان iPSC المشتقة BMECs على COL4 / الجبهة الوطنية المغلفة 6-آبار لوحة؛ كانت الخلايا في السابق cryopreserved في 1.2 × 102 الخلايا / مل. هـ) بعد 24 ساعة من ذوبان iPSC المشتقة من BMECs تم تمريرها إلى لوحة COL4/FN المغلفة 6 آبار. و) بعد 48 ساعة من ذوبان iPSC المشتقة من BMECs تم تمريرها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: ICC من BMECs المشتقة من iPSC بعد التزحلق على ال Passaging. تم تمرير BMECs والحفاظ عليها على مصفوفة COL4/FN حتى اليوم 12، عندما بلغت قيم TEER ذروتها. كانت BMECs في اليوم 12 ملطخة لتقاطع ضيق (OCLN، TJP1، CLDN5)، ناقل تدفق (SLC2A1) وتقاطع التمسك (PECAM1) البروتينات. نمط التعبير والتعريب يشبهان النقشين الملاحظين في ظروف لم يتم فيها إجراء عملية نقل التمرير، كما هو موضح في الشكل 4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: مقارنة قياسات TEER في مراكز iPSCs، و BMECs غير العابرة، و BMECs التي تم تمريرها، و BMECs المبردة، و BMECs المبردة والم بمرورها. في اليوم الأول، بلغت قيم TEER ذروتها بالنسبة لـ BMECs غير الممرة والممرة، ولكن ليس iPSCs أو BMECs التي يتم تقديمها بالتبريد. وكان BMECs المبردة قيم TEER معتدلة بين اليوم 3 و 7، مع قيم أقل من TEER لBMECs المشفرة والممرة. لم توضح iPSCs أي قيم TEER قابلة للقياس بين اليومين 0 و 9. وقد تم الحصول على قياسات تُجر في شكل تقني (3 قياسات في البئر) و 3 قياسات بيولوجية (3 لكل خط خلية). تم طرح متوسط القيمة الفنية من بئر فارغ من قيم TEER الأولية. وقد تم حساب متوسط هذه القيم لكل يوم وضربها في 1.12 سم2 (مساحة السطح من 12-transwell إدراج). تمثل أشرطة الخطأ خطأً قياسياً. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: ICC من BMECs المبردة والممرة. تم تمرير BMECs وصيانتها على COL4/FN حتى تم ملاحظة قيم TEER الذروة. كانت BMECs ملطخة لتقاطع ضيق (OCLN، TJP1، CLDN5)، ناقل التدفق (SLC2A1) وتقاطع الالتقاء (PECAM1) البروتينات. نمط التعبير من علامات تقاطع ضيق ظهرت مهترئة و / أو منمش بالمقارنة مع BMECs غير مرور (الشكل 4) وBMECs مرورها (الشكل 8). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: تحليل البقعة الغربية لـ iPSCs، و BMECs غير المُمرّرة، و BMECs التي تم تمريرها، وBMECs التي تم تناولها بالتبريد والمُرْرَزة. البقع الغربية التي تظهر مستويات TJP1، OCLN، SOX17، SLC2A1، CLDN5، والتحكم في التحميل (GAPDH). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

في هذا البروتوكول، قمنا بإجراء بعض التعديلات في استخدام مصفوفة خارج الخلية شائعة الاستخدام والخلايا وسائل الإعلام ثقافة خلال زراعة iPSC لاشتقاق BMECs(الشكل 1). لم تؤثر هذه التغييرات على القدرة على اشتقاق BMECS من iPSCs البشرية كما هو موضح في بروتوكول Lippmann1. تم استخدام خط iPSC من متبرع سليم مختلف لإثبات أن هذا البروتوكول المعدل يظهر نتائج مماثلة للدراسات السابقة مع خطوط أخرى1. للتبريد، تم استخدام ملحق B27 بدلا من 1٪ الصفائح الدموية سوء البلازما المشتقة مصل (PDS)40، ولكن هذا يؤثر على BMEC الإخلاص في زراعة لاحقة. فيما يتعلق باستكشاف الأخطاء وإصلاحها، قد تتقلب قيم TEER بسرعة قبل الاستقرار. قد ينتج هذا التقلب عن التغيرات في درجة الحرارة التي تحدث عند نقل اللوحات من 37 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة37. وللتغلب على هذه المسألة، ينبغي أن تؤخذ القياسات بسرعة وكفاءة وبشكل متسق. ويمكن، إذا لزم الأمر، أخذ آثار درجة الحرارة في الحسابات باستخدام صيغة رياضية مقدمة من Blume et al. 200949 للحصول على قيم TEER المصححة لدرجة الحرارة.

قيود هذا البروتوكول

على الرغم من الحصول على BMECs مع نمط ظاهري BBB قوية (أي قيمة TEER عالية)، والحفاظ على هذه الخاصية BBB لفترة طويلة من الزمن لا يزال يشكل تحديا كبيرا. كما هو موضح هنا، قيم TEER الذروة (~2000 Ω س سم2)باستخدام هذا البروتوكول كانت أقل بكثير من قيم ذروة TEER التي تم الإبلاغ عنها سابقاً (~ 8000 Ω × سم2)1. وعلى الرغم من هذه الملاحظة، فإن قيم TEER تقع ضمن النطاق المعتاد (2000-8000 Ω × سم2)من القيم التي تم الإبلاغ عنها سابقاً1. القيد الثاني هو التباين في قيم TEER الذروة التي تنتج عن خطوط iPSC مختلفة المستخدمة، والتي تمت ملاحظتها في إصدارات أخرى من هذا البروتوكول36. قد يكون الاختلاف بين خطوط الخلايا المختلفة بسبب معدل النمو والتوسع في كل خط iPSC ، والذي يتأثر بالعوامل البيئية51. وهناك قيد آخر يتعلق بالحفظ بالتبريد، حيث أن بروتوكولنا لم يحافظ على الإخلاص في BMEC. فمن الممكن أن 1٪ PDS40 يوفر قدرا أكبر من الاستقرار من BMECs أثناء الحفظ بالتبريد.

أهمية فيما يتعلق بالطرق الحالية

وتوفر مراكز التحليل البيولوجي البيولوجي المستمدة من iPSC خلايا لها الخلفية الوراثية لأفراد محددين، وهو أمر قيم في استخدام هذه الخلايا لدراسة بيولوجيا الأمراض. ليس هذا هو الحال عند استخدام نماذج حيوانية أو الثقافات BMEC الأساسية المستخرجة من الحيوانات الأخرى37. وعلاوة على ذلك، في المختبر الثقافات BMEC الأولية تظهر قيم TEER منخفضة (~ 100 Ω × سم237)، أقل بكثير من تلك التي تحققت مع BMECs المشتقة من iPSC الإنسان مع بروتوكول موضح هنا. ويوفر هذا البروتوكول المعدل طريقة مفصلة للحصول على BMECs الإنسان من iPSCs، مع إمكانية توسيعها وصيانتها للاستخدام لفترة أطول. القدرة على المرور وتخزين BMECs متباينة يمكن أن توفر براعة ومرونة في التصميم التجريبي، وخاصة عند دراسة خطوط الخلايا المتعددة في وقت واحد. وبناء على هذه النتائج، يمكن توسيع BMECs المشتقة من iPSC والمرور بعد الخطوة الأولية دون الاستزراع(الشكل 7والشكل 8 والشكل 9) ، ولكن يحتاج الحفظ بالتبريد إلى مزيد من التحقيق. ويمكن استخدام هذا البروتوكول أيضاً بالاقتران مع نماذج خلوية أخرى تعتمد على الخلايا الجذعية لتطوير أساليب مبتكرة مثل تصنيع الأوعية الدموية في الدماغ. الأساليب الحالية لتوليد الأعضاء في الدماغ يؤدي إلى إعادة تشكيل غير مكتملة من أنواع الخلايا من الدماغ البشري لأنها تفتقر إلى الخلايا البطانية والعناصر الحرجة من الوحدة العصبية الوعائية التي تشكل BBB52,53. ويمكن أن يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا قابلا للتكرار وقابلا للتكرار باستخدام نظم ترانسويل/الاستزراع المشترك ثنائية الأبعاد التي هي أقل تكلفة وأسهل في التنفيذ من النماذج ثلاثية الأبعاد.

التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول

يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة دور الجهاز العصبي والاعصاب BBB في الاضطرابات العصبية والنفسية مثل الفصام والاضطراب ثنائي القطب، حيث تم افتراض العجز في الأوعية العصبية للعب دور9,10,20,54,55. وقد استخدمت الإصدارات السابقة من هذا البروتوكول36 لاشتقاق BMECs من خطوط iPSC للمرضى الذين يعانون من مرض هنتنغتون7 و 22q مرضى متلازمة الحذف مع انفصام الشخصية43. وقد أظهرت كلتا الدراستين7و43 الاستخدام الناجح لهذه الطريقة للتحقيق في الوظائف شبه الخلوية و/أو عبر الخلايا المتعلقة بـ BBB. وقد أثيرت بعض المخاوف حول الآثار المحيرة المحتملة لمصل الحيوانات في البروتوكولات السابقة1. البروتوكول الخالي من المصل المستخدم هنا يزيل هذا القلق مع تحقيق نتائج مماثلة للبروتوكولات السابقة لاشتقاق BMECs.

خطوات هامة للتمييز والتوسع في BMECs

هناك أربع خطوات هامة عند تنفيذ هذا البروتوكول. أولاً، إن وضع الـ iPSCs في كثافة مثلى (أي البذر في ~ 15600 خلية /سم2)مهم للتمييز BMEC الفعال. إذا كانت كثافة الخلية مرتفعة جداً أو منخفضة جداً باليوم 4 من التمايز، قد تظهر الثقافات معدلات أكبر من عدم تجانسالخلوية 56. الخطوة الثانية الهامة هي التعريفي من التمييز بين اليوم 1 واليوم 4، حيث يتم استخدام E6 المتوسطة لبدء التمايز. يتم استخدام E6 بدلا من "الوسط غير مشروط" التي استخدمت في البروتوكولات السابقة6،35. ليس فقط E6 متوسطة خفض الوقت التمايز من 13 يوما إلى 8 أيام، ولكنه يعزز أيضا التعبير عن البروتينات تقاطع ضيق (TJP1، OCLN، CLDN5) وعلامات BMEC (PECAM1 وSLC2A1)36. كما أدى استخدام E6 المتوسطة في قيم TEER المناسبة (الشكل 5) وABCB1 و ABCC1 efflux نقل النشاط (الشكل 6)6,35. ثالثاً، استخدام B27 بدلاً من مصل الأبقار المسموح به لحالة خالية من المصل، مما أدى إلى تحسين الاتساق والموثوقية لتمايز BMEC1. وأخيراً، من حيث توسيع BMECs المشتقة من iPSC، يجب أن يتم تمرير الخلايا عندما تصل إلى ~ 100٪ التقاء. واستناداً إلى هذا البروتوكول، يمكن زيادة توسيع مراكز BMECs المشتقة من iPSC والمرور بعد مرحلة الاستزراع الفرعي الأولية(الشكل 7والشكل 8 والشكل 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة العقلية جوائز البحوث السلوكية البيولوجية للعلماء الجدد المبتكرين (BRAINS) جائزة R01MH113858 (إلى R.K.) ، وهي المعاهد الوطنية للصحة جائزة KL2 TR002542 (PL). A المعهد الوطني للصحة العقلية جائزة تطوير العلماء السريرية K08MH086846 (لR.K.) ، وسيدني R Baer الابن منحة مؤسسة (ل. ل) دوريس الخيرية جائزة تطوير العلماء السريرية (لR.K.) ، وريان ليخت سانج ثنائية القطب مؤسسة (إلى R.K.) ، وفيليس & مؤسسة جيروم لايل رابابورت (إلى R.K.)، ومعهد هارفارد للخلايا الجذعية (إلى R.K.) وستيف ويليس وإليسا فرويد (إلى R.K.). نشكر الدكتورة آني كاثروريا على قراءتها النقدية وردود الفعل على المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

علم الأعصاب، العدد 165، الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا، خلايا البطانية الدقيقة في الدماغ، حاجز الدم في الدماغ، المقاومة الكهربائية عبر البطانية، نشاط الناقل، microvascular، الفصام، اضطراب ثنائي القطب، passaging، التوسع، الحفظ المبرد
اشتقاق، توسعة، المحافظة على التبريد وتوصيف خلايا الدماغ البطانية الدقيقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya,… More

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter