Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine angepasste Methode zur Ableitung, Erweiterung und Kryokonservierung mikrovaskulärer Endothelzellen des Gehirns, die durch Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, und zur Untersuchung der Eigenschaften der Bluthirnschranke in einem Ex-vivo-Modell.
Abstract
Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMECs) im Gehirn können von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unterschieden werden, um ex vivo-Zellmodelle zur Untersuchung der Funktion der Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu entwickeln. Dieses modifizierte Protokoll enthält detaillierte Schritte zum Ableiten, Erweitern und Kryokonservieren von BMECs von menschlichen iPSCs, die einen anderen Spender und Reagenzien verwenden als in früheren Protokollen. iPSCs werden mit essentiellen 6 Medium für 4 Tage behandelt, gefolgt von 2 Tagen menschlichen endothelialen Serum-freien Kulturmedium mit grundlegenden Fibroblast wachstumsfaktor, Retinsäure, und B27 Ergänzung ergänzt. An Tag 6 werden die Zellen 2 Tage lang auf eine Kollagen-Fibronectin-Matrix subkultiviert. Die Immunzytochemie wird an Tag 8 für die BMEC-Markeranalyse mit CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 und SLC2A1 durchgeführt. Western Blotting wird durchgeführt, um den BMEC-Markerausdruck und das Fehlen von SOX17, einem endodermalen Marker, zu bestätigen. Angiogenic Potenzial wird mit einem keimenden Assay demonstriert. Der transendotheliale elektrische Widerstand (TEER) wird ab Tag 7 mit Essstäbchenelektroden und Voltohmmeter gemessen. Die Efflux-Transporteraktivität für die ATP-Bindungskassette Unterfamilie B-Mitglied 1 und die ATP-Bindungskassette Unterfamilie C-Mitglied 1 wird an Tag 8 mit einem Mehrplattenleser gemessen. Die erfolgreiche Ableitung von BMECs wird durch das Vorhandensein relevanter Zellmarker, niedrige SOX17-Spiegel, angiogenes Potenzial, Transportaktivität und TEER-Werte Ω x cm2bestätigt. BMECs werden bis zum 10. Tag erweitert, bevor sie auf frisch beschichtete Kollagen-/Fibronectinplatten oder Kryopreservede übergeben werden. Dieses Protokoll zeigt, dass iPSC-abgeleitete BMECs mindestens einmal erweitert und durchlaufen werden können. Nach der Kryokonservierung wurden jedoch niedrigere TEER-Werte und eine schlechtere Lokalisierung von BMEC-Markern beobachtet. BMECs können in Co-Kultur-Experimenten mit anderen Zelltypen (Neuronen, Glia, Pericyten), in dreidimensionalen Gehirnmodellen (Organ-Chip und Hydrogel), zur Vaskularisierung von Hirnorganoiden und zur Untersuchung von BBB-Dysfunktion bei neuropsychiatrischen Störungen eingesetzt werden.
Introduction
Blut-Hirn-Barriere-Funktion
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) bildet eine Grenze, die die Bewegung von Substanzen aus dem Blut zum Gehirn einschränkt. Die BBB besteht aus mikrovaskulären Endothelzellen (BMECs) des Gehirns, die eine Monoschicht bilden, die die Vaskulatur auskundaufzen. BMECs bilden zusammen mit Astrozyten, Neuronen, Pericyten, Mikroglia und extrazellulärer Matrix die neurovaskuläre Einheit. BMECs haben eine streng regulierte parazelluläre Struktur, die es dem BBB ermöglicht, einen hohen transendotheliaalen elektrischen Widerstand (TEER) aufrechtzuerhalten, der die passive Diffusion begrenzt und als Indikator für die Barriereintegrität1,2dient. BMECs haben auch Proteine, die bei der transzellulären Bewegung wie Endozytose, Transzytose und Transmigration sowie Extravasation von Leukozyten während einer Immunantwort unterstützen3. BMECs sind auf Zustrom- und Efflux-Transporter für die Ernährung und Entfernung von Abfallprodukten angewiesen, um ein heimelatisativer Gleichgewicht im Gehirn zu halten3. So ist beispielsweise die Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1) ein Zustromtransporter, der für die Bewegung von Glukose über die BBB4verantwortlich ist, während Efflux-Transporter wie die ATP-Bindungskassette Unterfamilie B Member 1 (ABCB1) und die ATP-Bindungskassette Unterfamilie C Member 1 (ABCC1) für die Rückführung von Substraten in den Blutkreislauf verantwortlich sind3,5,6,7. ABCB1-Substrate sind Morphin, Verapamil4und Antipsychotika wie Olanzapin und Risperidon8, während der ABCC1-Transporter eine Vielzahl von Substraten hat, einschließlich Sulfatkonjugate, Vincrinin und Glucuronid-Konjugate4.
Anwendung von BBB-Modellen bei psychiatrischen Störungen
BBB Dysfunktion wurde in eine Reihe von neurologischen und psychiatrischen Störungen verwickelt, einschließlich Schizophrenie und bipolare Störung9,10. Kürzlich werden iPSC-abgeleitete ex vivo-Zellmodelle verwendet, um die zellulären und molekularen Grundlagen psychiatrischer Störungen zu hinterfragt, aber diese Modelle berücksichtigen derzeit nicht die potenzielle Rolle, die die Neurovaskulatur11,12,13spielt. Es wird vermutet, dass periphere entzündliche Zytokine, die im Blut zirkulieren, die BBB14,15,16,17, aber es gibt auch Beweise für parazelluläre18,19,20,21,22, transzellulär23,24,25,26,27,28,29und extrazelluläre Matrix20,29,30,31,32 Anomalien, die zur BBB Dysfunktion beitragen. Eine Störung des BBB kann dazu führen, dass der Inhalt des Blutes in das Blut parenchyma eintritt und aktivierte Astrozyten und/oder Mikroglia, um proinflammatorische Zytokine freizusetzen, die wiederum eine Entzündungsreaktioninitiieren 33, die schädliche Auswirkungen auf das Gehirn haben kann34. BMECs sind die primäre Komponente der BBB und die Untersuchung der Struktur und Funktion dieser Zellen kann das Verständnis der BBB Dysfunktion bei neurologischen und psychiatrischen Störungen verbessern.
Alternative BMEC-Modelle
Vor der Entwicklung effizienter Protokolle zur Ableitung von BMECs aus iPSCs1,6,35,36hatten Forscher verewigte BMECs37 eingesetzt, um die BBB-Funktion zu untersuchen. Viele dieser Modelle erreichten jedoch keine wünschenswerten BBB-Phänotypen, wie einen physiologischen Bereich von TEER-Werten38,39. Die Verwendung von iPSCs hat den Vorteil, dass der genetische Hintergrund des Individuums, aus dem die Zellen abgeleitet sind, erhalten bleibt. Wissenschaftler arbeiten aktiv an der Entwicklung von iPSC-abgeleiteten ex-vivo-Mikroumweltmodellen, die die Struktur und Funktion des menschlichen Gehirns rekapitulieren. Die Forscher haben Methoden entwickelt, um BMECs abzuleiten, die strukturell und physiologisch ähnlich wie BMECs sind,die in vivo gefunden werden. Methoden zur Gewinnung gereinigter Populationen von iPSC-abgeleiteten BMECs erfordern eine Reihe verschiedener Schritte, wobei Protokolle in den letzten Jahren optimiert wurden1,6,35,36. Im Allgemeinen werden iPSC-abgeleitete BMECs in Essential 6 (E6) Medium für 4 Tage kultiviert, gefolgt von 2 Tagen in humanen endothelialen Serum-freien Medium (hESFM) ergänzt mit grundlegenden Fibroblast wachstumsfaktor (bFGF), Retinsäure (RA), und B27 Ergänzung. Die Zellen werden dann auf einer Kollagen-IV-Matrix (COL4) und Fibronectin (FN) kultiviert, um >90% homogene BMECs1zu erhalten.
Die Identität von BMECs wird durch Immunfluoreszenz bestätigt, die die Koexpression von BMEC-Proteinen einschließlich Thrombozyten-Endothel-Zelladhäsionsmolekül-1 (PECAM1), SLC2A1 und engen Knotenproteinen wie engem Knotenprotein 1 (TJP1), Occludin (OCLN) und Claudin-5 (CLDN5)6zeigt. Sprouting-Assays wurden verwendet, um das angiogene Potenzial von iPSC-abgeleiteten BMECs zu bestätigen. 6 Die BBB-Integrität von BMECs wird durch das Vorhandensein physiologischer in vitro TEER-Werte (2000 x cm2)37 und messbare Aktivität für Efflux-Transporter wie ABCB1 und ABCC11,6,36. Jüngste methodische Fortschritte der Lippmann-Gruppe haben zu iPSC-abgeleiteten BMEC-Protokollen mit reduzierter experimenteller Variabilität und verbesserter Reproduzierbarkeit1geführt. Es ist jedoch nicht bekannt, ob sie über die Unterkultivierungsstufe hinaus erweitert und durchdrungen werden können. Unser modifiziertes Protokoll zielt darauf ab, dieses Problem zu lösen, indem iPSC-abgeleitete BMECs über Tag 8 hinaus übergeben und bewertet werden, ob sie weiter ausgebaut werden können, um BBB-Eigenschaften nach der Kryokonservierung beizubehalten. Obwohl keine Studien die Passage von iPSC-abgeleiteten BMECs beschrieben haben, existiert ein Protokoll für die BMEC-Kryokonservierung, das physiologische BBB-Eigenschaften behält, nachdem sie einen Frost-Tau-Zyklus40durchlaufen haben. Es ist jedoch nicht bekannt, dass BMECs nach der Kryokonservierung durchundlassen und BBB-Eigenschaften behalten können.
BMECs, die von iPSCs mit dem Lippmann-Protokoll abgeleitet wurden, wurden verwendet, um BBB-Störungen bei neurologischen Erkrankungen wie der Huntington-Krankheit zu modellieren7. Solche iPSC-abgeleiteten BMECs wurden auch verwendet, um die Auswirkungen von bakteriellen Infektionen wie Neisseria meningitidis oder Gruppe B Streptococcus auf Störung der Blut-CSF-Barriere und BBB bzw.41,42zu untersuchen. Auch mit iPSC-abgeleiteten BMECs von 22q-Deletion-Syndrom-Patienten mit Schizophrenie, Forscher beobachteten eine Zunahme der interzellulären AdhäsionMolekül-1 (ICAM-1), ein wichtiges Adhäsionsmolekül in BMECs, die bei der Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten in das Gehirn43helfen. Zusammengenommen zeigen diese Studien den Nutzen von iPSC-abgeleiteten BMECs für die Untersuchung von BBB-Störungen bei komplexen neuropsychiatrischen Störungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human ePSCs wurden von den Fibroblasten gesunder Spender mit einem von den Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital und McLean Hospital genehmigten Protokoll umprogrammiert und wie in früheren Studienbeschrieben 44,45,46charakterisiert.
HINWEIS: Kurz gesagt, Fibroblasten wurden über mRNA-basierte genetische Neuprogrammierung47auf iPSC umprogrammiert. Die iPSCs wurden im Stammzellmedium (SCM) (siehe Materialliste) gehalten und mit einer Dichte von 1,2 x 102 Zellen/ml mit 1 ml SCM, 10 m mit rho-assoziiertem Proteinkinase-Inhibitor (ROCKi) Y-27632 und 10% (v/v) Dimethylsulfid (DMSO) in kryopreserveden Durchstechflaschen in flüssigem Stickstoff bei -160 °C gelagert. Alle nachstehenden Verfahren werden in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
1. Kellermembranmatrixverdünnung und Plattenbeschichtung
- Verdünnter (1:50) Wachstumsfaktor reduzierte Kellermembranmatrix, die vom Engelbreth-Holm-Schwarmtumor in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Phenolrot gereinigt wurde.
- Beschichten Sie Zellkulturplatten mit der entsprechenden Menge an verdünnter Kellermembranmatrix (d.h. 6-Well-Platte = 1ml, 12-Well-Platte = 0,5 ml) und bebrüten diese Platten mindestens 1 Stunde bei 37 °C.
2. iPSC Wartung
HINWEIS: Die maximale Konfluenz pro Brunnen in einer 6-Well-Flachbodenplatte beträgt 1,2 x 106 Zellen.
- Thaw kryokonreserved iPSCs in SCM mit 10 'M Y-27632 und Platte auf eine 6-Well-Platte mit verdünntem Wachstumsfaktor reduziert Kellermembran Matrix beschichtet.
- Halten Sie iPSCs in SCM mit 10 M Y-27632 für die ersten 24 Stunden nach dem Auftauen aufrecht. Wechseln Sie nach 24 Stunden auf frisches Medium.
- Bewahren Sie iPSCs in SCM auf, bis die Zellen vor dem Passieren 80-90% Koninfluenza erreichen.
- Berechnen Sie, wie viele iPSCs für die Differenzierung benötigt werden, indem Sie die gewünschte Dichte zur Differenzierung (15.600 Zellen/cm2) mit der Oberfläche des Brunnens multiplizieren. Für eine 6-Well-Flachbodenplatte 15.600 Zellen/cm2 x 9,6 cm2 für insgesamt 149.760 Zellen/Well multiplizieren.
- Um durchzufahren, waschen Sie die Zellen mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS). Dann inkubieren Sie die Zellen mit nicht-enzymatischer Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (siehe Materialliste) für 5 Minuten bei 37 °C.
- Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen sanft zu entfernen. Sammeln Sie Zellen in frischem SCM.
- Plattenzellen auf Zellkulturplatten, die mit verdünntem SCM beschichtet sind, und halten Zellen, wie in Schritt 2.3 beschrieben, oder lagern sie bei 1,2 x 106 Zellen/ml in 1 ml SCM, 10 M Y-27632 und 10 % DMSO (v/v) in kryopservierten Durchstechflaschen in flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von -160 °C.
3. Differenzierung von iPSCs zu BMECs
HINWEIS: Nicht-enzymatische EDTA trennt Zellen in Klumpen. Enzymatische EDTA (siehe Materialtabelle) trennt Zellen in einzellige Suspension. Retinsäure (RA) sollte vor Licht geschützt werden.
- Waschen Sie iPSCs einmal mit Dulbeccophosphat Buffer Saline (DPBS). Mit enzymatischer EDTA (1 ml für 6-Well-Platte, 0,5 ml für 12-Well-Platte und 0,25 ml für 24-Well-Platte) ca. 5 Minuten bei 37 °C inkubieren, um eine Einzelzellsuspension zu ergeben.
- Sammeln Sie Zellen und Zentrifuge bei 300 x g (relative Zentrifugalkraft) für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspend Zellpellets in SCM mit 10 M Y-27632.
- Bestimmen Sie die Zelldichte mit Trypan Blue und einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer. Plattenzellen mit einer Dichte von 15.600 Zellen/cm2 oder 149.760 Zellen/Well einer 6-Well-Flachbodenplatte (mit einer Oberfläche von 9,6 cm2/well) in SCM mit 10 'M Y-27632 für 24 Stunden.
- Initiieren Sie die Differenzierung nach 24 Stunden, indem Sie SCM in E6-Medium ändern. Ändern Sie E6 medium täglich für die nächsten 4 Tage.
- Ersetzen Sie am 4. Tag der Differenzierung E6 medium durch hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27 Ergänzung, 20 ng/mL bFGF und 10 M RA. Ändern Sie dieses Medium nicht für die nächsten 48 Stunden.
- 200 ml hESFM mit verdünntem (1:200) B27 vorbereiten, 1 ml 50x konzentrierte B27-Ergänzung zu 199 ml hESFM mischen.
- Bereiten Sie 20 ng/ml bFGF vor, indem Sie 50 g bFGF in 250 l Tris-Puffer (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) rekonstituieren, um eine 200-g/ml-Stammlösung herzustellen. Bereiten Sie 200 ml hESFM mit 20 ng/mL bFGF vor, indem Sie 20 l von 200 g/ml bFGF mit 200 ml hESFM mischen.
- Bereiten Sie 10 M RA vor, indem Sie zuerst eine 40 mg/ml RA-Lagerlösung herstellen, indem Sie 2,5 ml DMSO auf 100 mg RA-Pulver hinzufügen. Verdünnen Sie diese Konzentration auf 3 mg/ml, um eine 10 mM Stofflösung herzustellen. Bereiten Sie 200 ml hESFM mit einer Menge von 10 M RA vor, indem Sie 200 l von 10 m RA in 200 ml hESFM mischen.
4. Beschichtung Kollagen IV (COL4) und Fibronectin (FN) Matrix zur Reinigung von iPSC-Derived BMEC
- Fügen Sie 2 ml steriles Wasser auf 2 mg FN hinzu, um 1 mg/ml FN-Stammlösung herzustellen. Fügen Sie 5 ml steriles Wasser auf 5 mg COL4 hinzu, um eine 1 mg/ml COL4-Stammlösung herzustellen.
- LASSEN Sie FN für mindestens 30 Minuten bei 37 °C auflösen und der COL4 bei Raumtemperatur auflösen.
- Die FN-Stammlösung in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 g/ml und COL4-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 400 g/ml verdünnt.
- Beschichten Sie die gewünschten Platten (6-Well-Platte = 1 ml COL4/FN-Lösung, 12-Well-Platte = 0,5 ml, 24-Well-Platte = 0,25 ml und 12-Transwell-gefilterte Platte = 0,25 ml) mit der Mischung aus 400 g/ml COL4 und 100 g/ml FN.
- Platten mindestens 2 Stunden oder über Nacht bei 37 °C inkubieren; für Transwell gefilterte Platten wird mindestens 4 Stunden empfohlen.
5. Unterkultur und Reinigung von iPSC-abgeleiteten BMECs
HINWEIS: Die Inkubation mit enzymatischer EDTA kann je nach Konfluenz der Zellen am 6. Tag der Differenzierung länger als 15 Minuten dauern.
- Am 6. Tag der Differenzierung, waschen Zellen zweimal mit DPBS. Mit 1 ml enzymatischer EDTA mindestens 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis eine einzellige Suspension erhalten ist.
- Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspend Zellpellets mit frischem hESFM mit verdünnten (1:200) B27 Ergänzung, 20 ng/mL bFGF, und 10 M RA.
- Samenzellen auf Platten, die mit einer Mischung aus 400 g/mL COL4 und 100 g/ml FN beschichtet sind. Samenzellen mit einem Verhältnis von 1 Brunnen einer 6-Well-Platte zu 3 Brunnen einer 12-Well-Platte, 3 Brunnen einer 12-Transwell-gefilterten Platte oder 6 Brunnen einer 24-Well-Platte.
- Saat undifferenzierte iPSCs aus der gleichen Zelllinie auf COL4/FN beschichtet12-Transwell gefilterte Platte als Negativkontrolle für die TEER-Analyse.
- Nach 24 Stunden Sub-Kultivierung, ändern Medium zu hESFM mit B27 Ergänzung nur. Nach diesem Schritt sind keine mittleren Änderungen erforderlich.
6. Sprouting Assay
- Sammeln Sie Day 8 iPSC-abgeleitete BMECs und säen Sie sie mit 100.000 Zellen/Well auf eine 24-Well-Flachbodenplatte, frisch beschichtet mit 200 l/cm2 Kellermembranmatrix.
- Behandeln Sie diese Zellen mit hESFM mit verdünntem (1:200) B27 und 40 ng/ml vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor A (VEGFA165).
- Beobachten Sie Zellen alle 24 Stunden und ändern Sie das Medium alle zwei Tage.
7. Immunzytochemie (ICC)
HINWEIS: ICC wird auf 24-Well-Flachbodenplatten durchgeführt.
- Nach 48 Stunden Subkultivierung (Tag 8) zweimal Zellen mit DPBS waschen. Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten.
- Waschen Sie Zellen dreimal mit DPBS, 5 Minuten pro Wäsche. Vorblockzellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur in DPBS mit 5% Eselserum und 0,3% Triton X-100 (v/v).
- Inkubat mit primären Antikörpern: Maus Anti-Human-PECAM1 (1:100, Lager 0,5 mg/ml), Kaninchen anti-human-TJP1 (1:200, Lager 0,53 mg/ml), Maus anti-human-CLDN5 (1:200, Lager 0,5 mg/ml), Maus-Anti-Human-OCLN (1:200, Lager 0,5 mg/ml) und Kaninchen Anti-Human-SLC2A1 (1:100, Lager 0,2 mg/ml) in DPBS mit 5% Eselserum über Nacht bei 4°C.
- Spülen Sie die Zellen einmal mit DPBS und waschen Sie dann fünfmal für 5 Minuten pro Wäsche mit DPBS.
- Inkubieren Sie Zellen mit sekundären Antikörpern: Esel-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 (1:200) und Esel-Anti-Maus 488 (1:200) in DPBS mit 5% Eselserum für 1 Stunde.
- Nach dieser Inkubation fügen Sie Hoechst 33342 Trihydrochlorid-Trihydrat verdünnt (1:1000) in DPBS für 10 Minuten hinzu.
- Entfernen Sie die Hoechst 33342 Lösung und spülen Sie sie einmal mit DPBS und waschen Sie sie viermal mit DPBS für 5 Minuten pro Wäsche.
- Visualisieren Sie Zellen auf Fluoreszenzmikroskopen, um nach Expression und Lokalisierung von Zellerstoren zu suchen.
8. TEER Messung und Analyse
HINWEIS: Corning 12-Transwell gefilterte Platten sind mit Filtern ausgestattet, die aus 1,12 cm2 Polyethylenterephthalatmembranen und 0,4 Mikrometer Poren bestehen. TEER-Messungen werden in technischen (3 pro Brunnen) und biologischen Replikationen (3 Brunnen pro Zelllinie und/oder Zustand) durchgeführt.
- Messen Sie TEER 24 Stunden nach der Subkultivierung (Tag 7) mit Essstäbchenelektroden und einem Voltohmmeter alle 24 Stunden. Spezifische Anweisungen zur Messung finden Sie im Voltohmmeter-Benutzerhandbuch.
- Um TEER zu messen, laden Sie das Voltohmmeter-Instrument am Vorabend auf. Wischen Sie das Instrument und die Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol leicht ab, bevor Sie sie in die Sicherheitshaube legen.
- Schalten Sie das Ohm-Messgerät ein und kalibrieren Sie es, wie vom Hersteller empfohlen.
- Stecken Sie die Essstäbchenelektroden ein und spülen Sie Elektroden mit 70% Ethanol gefolgt von DPBS.
- Legen Sie die kürzere Endelektrode in den Transbrunneneinsatz (die apikale Kammer) und das längere Ende in die basolaterale Kammer.
- Messen Sie zunächst einen Rohbrunnen, der nur mit COL4/FN beschichtet ist. Dann messen Sie die anderen Brunnen.
- Schnelles Spülen von Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol, gefolgt von DPBS bei der Messung verschiedener Bedingungen (d. h. Messung verschiedener Zelllinien).
- Nachdem alle Messungen (in Ω) aufgezeichnet wurden, spülen Sie Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol und dann sterilem Wasser aus. Elektrode vorsichtig abwischen und in der Sicherheitshaube die Luft trocknen lassen.
- Durchschnittliche Ausführung der teER-Werte (in Ω) aus dem leeren Brunnen, und subtrahieren Sie diesen Durchschnittswert von jedem Rohwert des TEER nach Bedingung.
- Durchschnittlich die subtrahierten Werte und multiplizieren Sie sie mit 1,12 cm2 (die Oberfläche des 12-Transwell-Einsatzes).
- Verwenden Sie transformierte Werte aus Schritt 6, um das Diagramm mit TEER-Wert und Standardfehlern für jeden Tag der TEER-Messung zu generieren.
9. Efflux Transporter Aktivität und Analyse
HINWEIS: Efflux Transporter Aktivität Assay wird auf einer 24-well-Flachbodenplatte durchgeführt. Zu den Voninteresse entoselnden Efflux-Transportern gehören ABCB1 und ABCC1. Es wird empfohlen, dass jede Bedingung in Dreifacharbeit mit Kontrollbrunnen (d. h. leerer Brunnen ohne die jeweiligen Inhibitoren) durchgeführt wird.
- Nach 48 Stunden Subkultivierung (Tag 8) brüten Zellen mit 10 M Valspodar (ABCB1-Hemmer) oder 10 M MK571 (ABCC1-Hemmer) 1 Stunde bei 37 °C.
- Bereiten Sie 10 mM Valspodar-Bestand vor, indem Sie 5 mg Pulver (1214,64 g/mol) in 412 l DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 m Valspodar herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 ml Valspodar-Bestand mit 10 ml hESFM.
- Bereiten Sie 10 mM MK571 Vorrat vor, indem Sie 5 mg Pulver (537,07 g/mol) in 931 l auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M MK571 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM MK571 Lager mit 10 ml hESFM.
- Nach 1 Stunde die Zellen mit 10 M Rhodam 123 (ABCB1-Substrat) oder 10 M 2',7'--Dichlorodihydrofluorescein-Diaacetat (H2DCFDA, ABCC1-Substrat) mit oder ohne ihre jeweiligen Inhibitoren 1 Stunde bei 37 °C inkubieren.
- Bereiten Sie 10 mM Rhodamin 123 vor, indem Sie 10 mg Pulver (380,82 g/mol) in 875 l DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M Rhodamine 123 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM Rhodamine 123 Mit 10 ml hESFM.
- Bereiten Sie 10 mM H2DCFDA vor, indem Sie 50 mg Pulver (487,29 g/mol) in 10,26 ml DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M Rhodamine 123 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM Rhodamine 123 Mit 10 ml hESFM.
- Waschen Sie Zellen zweimal mit 0,5 ml DPBS und Lyse mit DPBS, die 5% Triton-X (v/v) enthalten.
- Messen Sie die Fluoreszenz der lysierten Zellen mit einem Multi-Platten- oder Mikroplattenleser (siehe Materialliste).
- Stellen Sie das Fluoreszenzplattenleser-Instrument auf 485 Nanometer Anregung und 530 Nanometer-Emission ein und messen Sie die Fluoreszenz bei diesen Wellenlängen.
- Für Brunnen, die nicht im Transportertest verwendet werden, waschen Sie Zellen zweimal mit DPBS, bevor Sie sie mit 4% PFA für die Zellkernquantifizierung fixieren.
- Inkubieren Sie Zellen mit Hoechst 33342 Trihydrochlorid-Trihydrat verdünnt (1:1000) in DPBS für 10 Minuten. Bild mehrere visuelle Felder in jedem Brunnen, um die durchschnittliche Anzahl von Zellkernen mit Fluoreszenzmikroskopen zu berechnen.
- Zählen Sie Kerne mit Fidschi und normalisieren Sie Fluoreszenzwerte pro Zelle auf diese Zählungen.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzakkumulation, indem Sie den Rohfluoreszenzakkumulationswert für jede Bedingung von ihrem jeweiligen Rohwert subtrahieren.
- Durchschnittliche subtrahierte Werte für jede Bedingung.
- Teilen Sie Durchschnittswerte aus Schritt 9.6.1 durch die durchschnittliche Zellenanzahl. Verwenden Sie diese Werte, um Fluoreszenzwerte pro Zelle zu normalisieren.
- Verwenden Sie normalisierte Werte, um eine grafische Darstellung für jede Inhibitorbedingung zu generieren und alle erforderlichen statistischen Analysen durchzuführen.
10. Passieren, Erweitern und Kryokonservierung von BMECs
- Tag 8 BMEC-Kulturen mit frischem hESFM auffüllen, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27 und lassen Die Zellen auf der COL4/FN-Matrix noch zwei Tage expandieren.
- Beschichten Sie eine neue 12-Transwell-gefilterte Platte und eine 24-Well-Flachbodenplatte mit 400 g/mL COL4 und 100 g/mL FN und brüten 4 Stunden lang.
- Am 10. Tag die Zellen mit DPBS waschen und mit 1 ml enzymatischer EDTA mindestens 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis eine Einzelzellsuspension erhalten ist.
- Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Um diese Zellen kryokonservieren, setzen Sie Zellpellets mit frischem hESFM mit 30% Fetal Bovine Serum (FBS) und 10% DMSO wieder auf.
- IPSC-abgeleitete BMECs in kryokonservierten Fläschchen in einem Isopropanol-Behälter für die ersten 24 Stunden bei -80 °C lagern und dann in flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung bei -160 °C geben.
- Um diese Zellen zu durchleben, setzen Sie Zellpellets mit frischem hESFM, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27, wieder auf.
- Samenzellen auf beschichteten Platten, die in Schritt 10.2 hergestellt werden. Samenzellen mit einem Verhältnis von 1 Brunnen einer 6-Well-Platte zu 3 Brunnen einer 12-Transwell-gefilterten Platte und zu 6 Brunnen einer 24-Well-Platte. Lassen Sie Zellen 24 Stunden lang wachsen und erweitern.
- Messen Sie TEER am 11. Tag anhand der in Schritt 8 aufgeführten Schritte.
- Führen Sie am 12. Tag ICC aus, indem Sie die in Schritt 9 aufgeführten Schritte ausführen.
- Um kryokonservierte BMECs aufzutauen, legen Sie die kryokonservierten Fläschchen in ein warmes Wasser oder Perlenbad bei 37oC. Dann übertragen Sie die aufgetauten BMECs auf 5 ml hESFM, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27.
- Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Zellen in hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27, 10 M RA und 10 M Y-27632.
- Nach 24 Stunden schalten Sie Medium auf hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27 und 10 'M Y-27632 ohne RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BMEC-Differenzierung
Einige kritische Schritte in diesem Protokoll sollten genau befolgt werden (Abbildung 1). E6 mittlere Nutzung an Tag 1 ist wichtig, da es oft für die Ableitung von Neuroektoderm Linie von iPSCs innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums, die reproduzierbare Ergebnisse über mehrere Zelllinien36. Ein weiterer wichtiger Schritt ist der 4. Tag der Differenzierung, bei dem E6-Medium auf hESFM mit verdünnten (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF und 10 M RA umgestellt werden sollte, um iPSC-abgeleitete BMECs zu erweitern. Die Zugabe von B27 Ergänzung wird als Alternative zu Rinderserum verwendet, um serumfreie Zellkultivierung zu unterstützen1, bFGF wird hinzugefügt, um das Wachstum von iPSC-abgeleiteten BMECs6zu erleichtern, und RA wird verwendet, um die Entwicklung des BBB-Phänotyps35zu erleichtern. Der letzte wichtige Schritt betrifft die Reinigungsphase, in der tag 6 iPSC-abgeleitete BMECs auf eine COL4/FN-beschichtete Platte subkultiviert werden, um iPSC-abgeleitete BMECs1,6,35,36auszuwählen. Abbildung 2 zeigt den morphologischen Übergang von iPSCs zu BMECs. Nach einem Tag E6 medium (Tag 1) ähnelt die zelluläre Morphologie der von iPSCs. Am Tag 4 von E6 beginnen die Zellen sichtbar von iPSCs zu unterscheiden und decken den größten Teil des Brunnens ab (90 % Konfluenz). Am 6. Tag, während in hESFM mit verdünntem (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF und 10 'M RA kultiviert, beginnt die zelluläre Morphologie ein längliches und kopfsteinpflasteriges Aussehen zu haben. An Tag 8 unterscheidet sich jede einzelne Zelle in einem großen Kopfsteinpflastermuster. Ein sprossender Assay wurde durchgeführt, um das angiogene Potenzial von iPSC-abgeleiteten BMECs zu demonstrieren, die nach 3 Tagen VEGFA165-Behandlung zu röhrenähnlichen Strukturen führten (Abbildung 3).
Abbildung 1: Gliederung für die Differenzierung von humaniPSCs zu BMECs. Humane iPSCs wurden zunächst 24 Stunden lang in Einem Stammzellmedium mit 10 M Y-27632 kultiviert, bevor sie 4 Tage lang auf Medium auf E6 umgestellt wurden. Am 4. Tag wurde das Medium für 2 Tage auf hESFM mit (1:200) B27-Ergänzung, 20 ng/mL bFGF und 10 M RA umgestellt. Am 6. Tag wurden die Zellen auf COL4/FN-beschichtete Platten subkultiviert. Am Tag 7 wurde das Medium auf hESFM mit B27-Ergänzung ohne bFGF und RA und TEER geändert. Am 8. Tag wurden ICC- und Efflux-Transporter-Aktivitätstests durchgeführt. iPSC-abgeleitete BMECs wurden bis zum 10. Tag erweitert, bevor sie zur TEER-Messung bzw. ICC-Analyse auf eine Transbrunnenplatte bzw. eine 24-Well-Flachbodenplatte übertragen wurden. Tag 8 BMECs wurden für den Keimtest verwendet (nicht dargestellt). 2 Brunnen einer 6-Well-Platte mit iPSC-abgeleiteten BMECs wurden gesammelt und in hESFM mit 10% DMSO und 30% FBS bei -80 °C und dann in flüssigem Stickstoff für die Langzeitlagerung bei -160oC gelagert. Am 12. Tag wurde ein Spitzenwert des TEER-Wertes in erweiterten iPSC-abgeleiteten BMECs beobachtet, an dem ICC durchgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Hellfeldbilder, die die Differenzierung von iPSCs mit BMECs darstellen. Nach einem Kulturtag im E6-Medium behalten iPSCs ihre charakteristische Morphologie. An Tag 4 im E6-Medium scheint sich die zelluläre Morphologie deutlich von iPSCs zu unterscheiden. Am 6. Tag ändert sich die zelluläre Morphologie in ein langgestrecktes und kopfsteinpflasteriges Aussehen. Am 8. Tag erscheinen zellen groß und mit einem Kopfsteinpflastermuster. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Angiogenes Potenzial von iPSC-abgeleiteten BMECs. Gereinigte iPSC-abgeleitete BMECs wurden mit 100.000Zellen/cm2 auf Diekellermembranmatrix in hESFM mit (1:200) B27-Ergänzung und 40ng/mL VEGFA165 gesät. Röhrenartige Strukturen traten nach 3 Tagen VEGFA165 Behandlung auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Gereinigte iPSC-abgeleitete BMECs wurden mit 100.000Zellen/cm2 auf Diekellermembranmatrix in hESFM mit (1:200) B27-Ergänzung und 40ng/mL VEGFA165 gesät. Röhrenartige Strukturen traten nach 3 Tagen VEGFA165 Behandlung auf.
Die BMEC-Charakterisierung wurde mit Hilfe der Immunzytochemie für zellspezifische Marker durchgeführt. iPSC-abgeleitete BMECs wurden auf das Vorhandensein von engen Knotenproteinen (OCLN, TJP1 und CLDN5) untersucht, die häufig in den engen Verbindungen der Endothelzellen des Gehirns3 und der Endothelzellen in Lunge, Leber und Niere18exprimiert werden. Andere Marker wie PECAM1 und SLC2A1 wurden bisher als Marker für gereinigte BMECs6verwendet. PECAM13 und SLC2A4 werden beide in vaskulären Endothelzellen des BBB exprimiert. Die mit diesem Protokoll generierten iPSC-abgeleiteten BMECs haben alle fünf dieser Marker mitexprimiert (Abbildung 4).
Abbildung 4: Markeranalyse von iPSC-abgeleiteten BMECs. Menschliche iPSC-abgeleitete BMECs wurden für enge Knoten (OCLN, TJP1, CLDN5), Zuflusstransporter (SLC2A1) und Adhäkationen (PECAM1) Proteine gebeizt. OCLN-, TJP1- und CLDN5-Proteine sind in erster Linie in der Zellmembran lokalisiert. SLC2A1 und PECAM1 sind sowohl in der Kern- als auch in der Zellmembran lokalisiert. Hoechst 33342 Trihydrochlorid-Trihydrat wurde für die Kernfärbung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Um die BBB-Funktion von BMECs zu charakterisieren, wurde TEER 24 Stunden (Tag 7) nach Sub-Kultivierung gemessen und das Medium wurde auf hESFM mit verdünntem (1:200) B27 ohne bFGF und RA geändert. TEER-Messungen wurden ab Tag 7 der Differenzierung (Tag 0 der TEER-Messung) durchgeführt und erreichten am 8. Tag oder 48 Stunden nach der Subkultivierung von BMECs einen Höchststand von 2000 Ω x cm2 (Abbildung 5). Diese TEER-Werte liegen innerhalb des beschriebenen Bereichs für ko-kultivierte iPSC-abgeleitete BMECs mit Rattenprimärastrozyten37. Die iPSC-Linie hatte keine erkennbare BBB-Funktion entsprechend ihren niedrigen TEER-Werten.
Abbildung 5: TEER-Messungen in iPSC-abgeleiteten BMECs. TEER-Werte erreichten nach einem Tag der Unterkultivierung auf der COL4/FN-Matrix (am 8. Tag der Differenzierung) ihren Höhepunkt. TEER-Messungen wurden in technischen (3 Messungen pro Brunnen) und biologischen Replikationen (3 Brunnen pro Zelllinie) durchgeführt. Der technische Durchschnittswert aus einem Leerenbrunnen wurde von rohen TEER-Werten subtrahiert. Diese Werte wurden für jeden Tag gemittelt und mit 1,12 cm2 (Oberfläche des 12-Transwell-Einsatzes) multipliziert. Fehlerbalken stellen einen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Zur Bewertung der Aktivität des ABCB1- und ABCC1-Efflux-Transporters wurde die Menge an fluoreszierendem Substrat, die für ABCB1 und ABCC1 aufgenommen wurde, nach der Inkubation mit ihren jeweiligen Inhibitoren quantifiziert. Wie erwartet führte die Hemmung von ABCB1- und ABCC1-Efflux-Transportern mit PSC833 (ABCB1-Inhibitor) oder MK-571 (ABCC1-Inhibitor) zu einer Erhöhung von Rhodamin 123 (R123) bzw. 2',7'-Dichlordihydrofluorescein-Diacetat (H2DCFDA)(Abbildung 6). Diese Beweise deuten darauf hin, dass BMECs, die mit diesem Protokoll abgeleitet wurden, Efflux-Transporter-Aktivität haben.
Abbildung 6: Efflux-Transporter-Aktivität in iPSC-abgeleiteten BMECs. Die Efflux-Transporteraktivität in BMECs wurde durch Quantifizierung der Akkumulation von Rhodamin 123 (R123) oder 2',7'-Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (H2DCFDA) in Gegenwart oder Abwesenheit von PSC833 (ATP-Bindungskassette N-Wert 1 (ABCB1)-Hemmer) oder MK-571 (ATP-Bindungskassette-Unterfamilie C-Hemmer 1 (ABCC1) -Hemmer bestimmt. Für jede Bedingung wurden technische Triplicate durchgeführt (N=1). Fluoreszenzwerte aus der Kontrollbedingung (d.h. ohne Inhibitoren) wurden von Rohfluoreszenzwerten abgezogen. Diese Fluoreszenzakkumulation wurde pro Zelle für jede technische Replikation normalisiert. Die statistische Signifikanz wurde anhand des Schüler-T-Tests aus den drei technischen Replikationen ermittelt. Zwischen der Akkumulation von R123 mit und ohne ABCB1-Inhibitor (t-stat= -1,66, p=0,11) wurde keine statistische Signifikanz beobachtet. Die statistische Signifikanz wurde zwischen der Akkumulation von H2DCFDA mit und ohne ABCC1-Inhibitor beobachtet (t-stat=-7.23, p=0,04). *p<0.05. Fehlerbalken stellen einen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Passaging, Expanding und Cryopreserving iPSC-Derived BMECs
Ein weiteres Ziel war es zu untersuchen, ob iPSC-abgeleitete BMECs nach der Subkultivierung durchgehend und kryokonserviert werden können. Zu diesem Zweck durften die iPSC-abgeleiteten BMECs am Tag 7 bis zum 10. Tag expandieren, bevor sie auf neu beschichtete COL4/FN 12-Transwell-gefilterte Platten für teER-Messungen und 24-Well-Flachbodenplatten für die ICC-Analyse übergeben wurden (Abbildung 7). Unter Verwendung dieser Bedingung vermehrten sich iPSC-abgeleitete BMECs weiter, hielten die Expression von OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 und PECAM1 (Abbildung 8) aufrecht und hielten nach dem Passieren weiterhin die richtigen TEER-Werte (Spitzenwert von 2000 Ω x cm2) aufrecht (Abbildung 9). Kryokonierte BMECs wurden später aufgetaut, erweitert und dann durchgangen (Abbildung 7). TEER-Messungen von BMECs wurden 24 Stunden nach dem Auftauen und einige weitere Tage danach durchgeführt. Die TEER-Messungen dieser nachgetobten BMECs wurden im Vergleich zu frisch abgeleiteten BMECs reduziert (Spitzenwert nur bei 800 Ω x cm2). Eine zweite Passierung von post getobten BMECs zeigte noch niedrigere TEER-Werte (Spitzenwert bei nur 200-300 Ω x cm2) (Abbildung 9) und zeigte ausgefranste und/oder zerkiffte Muster der engen Kreuzungsformation (Abbildung 10). Western Blot Analysis48 ergab, dass iPSCs in erster Linie einen endodermalen Marker (SOX17)49 und einige enge Knotenmarker (OCLN) ausdrückten, jedoch keine anderen BMEC-bezogenen Marker (TJP1, CLDN5 und SLC2A1) (Abbildung 11). BMECs exprimierten in erster Linie endotheliale Marker (TJP1, CLDN5, OCLN und SLC2A1), mit niedrigen Werten des endodermalen Markers, SOX17.
Abbildung 7: Helle Feldbilder von erweiterten und cryopreserved iPSC-abgeleiteten BMECs. A) Tag 10 (4 Tage nach der ursprünglichen Subkultur) Zellen erreichten maximale Konfluenz. B) Tag 11, 24 Stunden nach der Weitergabe auf COL4/FN beschichtete 24-Wells Platte. C) Tag12, 48 Stunden nach dem Übergeben auf COL4/FN beschichtete 24-Wells-Platte; TEER-Spitzenwerte eingehalten und ICC durchgeführt. D) 48 Stunden nach dem Auftauen von iPSC-abgeleiteten BMECs auf COL4/FN-beschichteter 6-Wells-Platte; Zellen wurden zuvor mit 1,2 x 102 Zellen/ml kryokonserviert. E) 24 Stunden nach dem Auftauen von iPSC-abgeleiteten BMECs auf COL4/FN-beschichtete 6-Wells-Platte. F) 48 Stunden nach dem Abtauen von iPSC-abgeleiteten BMECs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: ICC von iPSC-derived BMECs nach Passaging. BMECs wurden bis zum 12. Tag, als die TEER-Werte ihren Höhepunkt erreichten, auf der COL4/FN-Matrix beibehalten und beibehalten. BMECs am 12. Tag wurden für enge Kreuzungen (OCLN, TJP1, CLDN5), Zuflusstransporter (SLC2A1) und Adhäkationen (PECAM1) Proteine gebeizt. Das Ausdrucksmuster und die Lokalisierung ähneln denen, die bei Bedingungen beobachtet wurden, in denen keine Passaging durchgeführt wurden, wie in Abbildung 4 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Vergleich von TEER-Messungen in iPSCs, nicht durchdrungenen BMECs, durchdrungenen BMECs, kryokonservierten BMECs und kryokonservierten und durchdreten BMECs. Am ersten Tag erreichten die TEER-Werte ihren Höhepunkt für nicht durchundlaufende BMECs, nicht jedoch für iPSCs oder kryokonservierte BMECs. Kryokonierte BMECs hatten moderate TEER-Werte zwischen Tag 3 und 7, mit noch niedrigeren TEER-Werten für die kryokonservierten und durchzogenen BMECs. iPSCs zeigten keine messbaren TEER-Werte zwischen Tag 0 und 9. TEER-Messungen wurden in technischen (3 Messungen pro Brunnen) und biologischen Replikationen (3 pro Zelllinie) durchgeführt. Der technische Mittelwert aus einem Rohbrunnen wurde von den rohen TEER-Werten subtrahiert. Diese Werte wurden für jeden Tag gemittelt und mit 1,12 cm2 (Oberfläche des 12-Transwell-Einsatzes) multipliziert. Fehlerbalken stellen einen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: ICC von kryokonservierten und durchgangenen BMECs. BMECs wurden auf COL4/FN durchlässig und beibehalten, bis TeER-Spitzenwerte beobachtet wurden. BMECs wurden für enge Knoten (OCLN, TJP1, CLDN5), Zuflusstransporter (SLC2A1) und Adhäkationen (PECAM1) Proteine gefärbt. Das Ausdrucksmuster enger Knotenmarkierungen erschien ausgefranst und/oder verworren im Vergleich zu nicht durchgangenden BMECs (Abbildung 4) und durchgangenen BMECs (Abbildung 8). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 11: Western Blot Analyse von iPSCs, nicht durchgangenen BMECs, durchgangenen BMECs und kryokonservierten und durchgangenen BMECs. Westliche Blots mit TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 und Ladesteuerung (GAPDH). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Änderungen und Fehlerbehebung
In diesem Protokoll haben wir einige Änderungen bei der Verwendung einer häufig verwendeten extrazellulären Matrix und Zellkulturmedien während der iPSC-Kultivierung für die Ableitung von BMECs vorgenommen (Abbildung 1). Diese Änderungen hatten keinen Einfluss auf die Fähigkeit, BMECS aus menschlichen iPSCs abzuleiten, wie im Lippmann-Protokoll1beschrieben. Eine iPSC-Leitung eines anderen gesunden Spenders wurde verwendet, um zu zeigen, dass dieses modifizierte Protokoll Ergebnisse zeigt, die mit früheren Studien mit anderen Zeilen1vergleichbar sind. Für die Kryokonservierung, B27 Ergänzung wurde anstelle von 1% Thrombozyten arme Plasma-abgeleitete Serum (PDS)40verwendet, aber dies wirkte sich auf BMEC-Treue in der nachfolgenden Kultivierung. In Bezug auf die Fehlerbehebung können die TEER-Werte vor der Stabilisierung schnell schwanken. Diese Fluktuation kann durch Temperaturänderungen entstehen, wenn die Platten von 37 °C auf Raumtemperatur37bewegt werden. Um dieses Problem zu lösen, sollten Messungen schnell, effizient und konsistent durchgeführt werden. Bei Bedarf können Temperatureffekte mit hilfe einer mathematischen Formel von Blume et al. 200949 berücksichtigt werden, um temperaturkorrigierte TEER-Werte zu erhalten.
Einschränkungen dieses Protokolls
Trotz der Erlangung von BMECs mit einem robusten BBB-Phänotyp (d. h. hohem TEER-Wert) stellt die Aufrechterhaltung dieser BBB-Eigenschaft über einen längeren Zeitraum weiterhin eine große Herausforderung dar. Wie hier gezeigt, lagen die TEER-Spitzenwerte (2000 Ω x cm2) mit diesem Protokoll deutlich niedriger als die zuvor gemeldeten TEER-Spitzenwerte (ca. 8000 Ω x cm2)1. Trotz dieser Beobachtung fielen die TEER-Werte innerhalb des üblichen Bereichs (2000-8000 Ω x cm2) der zuvor gemeldeten Werte1. Eine zweite Einschränkung ist die Variabilität der TEER-Spitzenwerte, die sich aus verschiedenen iPSC-Leitungen ergibt, die in anderen Versionen dieses Protokolls36beobachtet wurde. Die Unterschiede zwischen den verschiedenen Zelllinien können auf das Wachstum und die Expansionsrate jeder iPSC-Linie zurückzuführen sein, die von Umweltfaktoren beeinflusst wird51. Eine weitere Einschränkung bezieht sich auf die Kryokonservierung, da unser Protokoll die BMEC-Treue nicht beibehielt. Es ist möglich, dass 1% PDS40 eine höhere Stabilität von BMECs während der Kryokonservierung bietet.
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden
Die iPSC-abgeleiteten BMECs stellen Zellen bereit, die den genetischen Hintergrund bestimmter Individuen haben, was bei der Nutzung dieser Zellen für die Erforschung der Krankheitsbiologie wertvoll ist. Dies ist nicht der Fall, wenn Tiermodelle oder primäre BME-Kulturen verwendet werden, die aus anderen Tieren extrahiert werden37. Darüber hinaus weisen in vitro primäre BMEC-Kulturen niedrige TEER-Werte auf (100 Ω x cm237), viel niedriger als die mit menschlichen iPSC-abgeleiteten BMECs mit dem hier beschriebenen Protokoll. Dieses modifizierte Protokoll bietet eine detaillierte Methode zur Gewinnung menschlicher BMECs von iPSCs mit dem Potenzial, sie für längere Nutzung zu erweitern und zu warten. Die Möglichkeit, differenzierte BMECs zu durch- und zu speichern, kann Vielseitigkeit und Flexibilität im experimentellen Design bieten, insbesondere beim Studium mehrerer Zelllinien gleichzeitig. Basierend auf diesen Ergebnissen können iPSC-abgeleitete BMECs nach dem ersten Unterbauschritt erweitert und durchdrungen werden (Abbildung 7, Abbildung 8 und Abbildung 9), aber die Kryokonservierung muss weiter untersucht werden. Dieses Protokoll kann auch in Verbindung mit anderen Stammzell-basierten Zellmodellen verwendet werden, um innovative Ansätze wie die Vaskularisation von Hirnorganoiden zu entwickeln. Aktuelle Methoden zur Erzeugung von Hirnorganoiden führen zu einer unvollständigen Rekonstitution von Zelltypen des menschlichen Gehirns, da ihnen Endothelzellen und kritische Elemente der neurovaskulären Einheit fehlen, aus denen die BBB52,53besteht. Das hier beschriebene Protokoll kann einen beschreibbaren und reproduzierbaren Ansatz bieten, indem zweidimensionale Transwell-/Co-Culturing-Systeme verwendet werden, die kostengünstiger und einfacher zu implementieren sind als 3D-Modelle.
Zukünftige Anwendungen dieses Protokolls
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Rolle der Neurovaskulatur und BBB bei neuropsychiatrischen Störungen wie Schizophrenie und bipolare Störung zu studieren, wo Defizite in der Neurovaskulatur angenommen wurden, um eine Rolle zu spielen9,10,20,54,55. Frühere Versionen dieses Protokolls36 wurden verwendet, um BMECs aus iPSC-Linien von Patienten mit Huntington7 und 22q Deletionssyndrom abzuleiten43. Beide Studien7,43 zeigten eine erfolgreiche Anwendung dieser Methode zur Untersuchung der parazellulären und/oder transzellulären Funktion im Zusammenhang mit dem BBB. In den früheren Protokollen1wurden einige Bedenken hinsichtlich der möglichen verwirrenden Auswirkungen von Tierserum geäußert. Das hier verwendete serumfreie Protokoll beseitigt diese Bedenken und liefert ähnliche Ergebnisse wie frühere Protokolle zum Ableiten von BMECs.
Kritische Schritte zum Differenzieren und Erweitern von BMECs
Bei der Implementierung dieses Protokolls gibt es vier wichtige Schritte. Erstens ist die Aussaat von iPSCs mit einer optimalen Dichte (d. h. die Aussaat bei 15.600Zellen/cm2)wichtig für eine effiziente BMEC-Differenzierung. Wenn die Zelldichte zu hoch oder zu niedrig am Tag 4 der Differenzierung ist, können Kulturen höhere Raten der zellulären Heterogenität anzeigen56. Ein zweiter wichtiger Schritt ist die Induktion der Differenzierung zwischen Tag 1 und Tag 4, bei dem E6-Medium verwendet wird, um differenzierungzuinitiieren. E6 wird anstelle des "unkonditionierten Mediums" verwendet, das in früheren Protokollen6,35verwendet wurde. E6 medium verkürzt nicht nur die Differenzierungszeit von 13 Tagen auf 8 Tage, sondern fördert auch die Expression von engen Knotenproteinen (TJP1, OCLN, CLDN5) und BMEC-Markern (PECAM1 und SLC2A1)36. Die Verwendung von E6-Medium führte auch zu richtigen TEER-Werten (Abbildung 5) und ABCB1 und ABCC1 Efflux-Transporter-Aktivität (Abbildung 6)6,35. Drittens ermöglichte die Verwendung von B27 anstelle von Rinderserum einen serumfreien Zustand, was die Konsistenz und Zuverlässigkeit der BBM-Differenzierungverbesserte 1. Schließlich sollten Zellen im Hinblick auf die Erweiterung der iPSC-abgeleiteten BMECs durchdredbt werden, wenn sie eine Konfluenz von 100 % erreichen. Basierend auf diesem Protokoll können iPSC-abgeleitete BMECs nach der ersten Unterkultivierungsphase weiter erweitert und durchlaufen werden (Abbildung 7, Abbildung 8 und Abbildung 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (to R.K.), a National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL) unterstützt. ein National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (nach R.K.), ein Sydney R Baer Jr Foundation Grant (zu P.L.), der Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (nach R.K.), die Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (zu R.K.), die Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (zu R.K.), das Harvard Stem Cell Institute (zu R.K.) und von Steve Willis und Elissa Freud (zu R.K.). Wir danken Dr. Annie Kathuria für ihre kritische Lektüre und ihr Feedback zum Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100mL | |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A-31572 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb | Cell Signaling | 3528S | |
| CLDN5 (Claudin-5) | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma Aldrich | C5533-5mg | |
| Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 8670 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) | Corning | 353046 | |
| Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) | Corning | 353047 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) | Corning | 3460 | |
| Countess slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DMEM/F12 (without phenol red) | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-50mL | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663-10ML | |
| DPBS (+/+) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 | World Precision Instruments | N/A | |
| Essential 6 Medium (Thermo Fisher) | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-2mg | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 24020-117 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human endothelial serum-free medium | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| InCell Analyzer 6000 | General Electric | N/A | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| MK-571 | Sigma Aldrich | M7571-5MG | |
| NutriStem | Stemgent | 01-0005 | |
| Occludin | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Recombinant Human VEGF 165 | Peprotech | 100-20 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-100MG | |
| Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702-10MG | |
| SLC2A1 (GLUT-1) | ThermoFisher | PA1-21041 | |
| SOX17 | Cell Signaling | 81778S | |
| TJP-1 (ZO-1) | ThermoFisher | PA5-28869 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) | Sigma Aldrich | SML0572-5MG | |
| Versene solution | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Tocris/Thermo Fisher Scientific | 1254 |
References
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
- Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
- Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
- Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
- Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
- Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
- Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
- Pollak, T. A., et al.
- Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
- Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
- Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
- Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
- Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
- Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
- Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
- Greene, C., Hanley, N., Campbell, M.
- Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
- Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
- Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
- Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
- Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
- Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
- de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
- Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
- Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
- Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
- Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
- Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
- Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
- Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
- Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
- Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
- Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
- Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
- Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
- Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
- Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
- Warren, L., Lin, C.
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
- Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
- Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
- Pham, M. T., et al.
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
- Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
- Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
- Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).
