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Neuroscience

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं का व्युत्पन्न, विस्तार, क्रायोप्रिजर्वेशन और लक्षण वर्णन

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं में अंतर करके प्राप्त मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने, विस्तार और क्रायोप्रिजर्वर करने के लिए एक अनुकूलित विधि का विवरण देता है, और एक पूर्व वीवो मॉडल में रक्त मस्तिष्क बाधा गुणों का अध्ययन करने के लिए।

Abstract

मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (बीएमईसी) को रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) समारोह का अध्ययन करने के लिए पूर्व वीवो सेलुलर मॉडल विकसित करने के लिए मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से अलग किया जा सकता है। यह संशोधित प्रोटोकॉल पिछले प्रोटोकॉलों की रिपोर्ट की तुलना में एक अलग दाता और अभिकर्मकों का उपयोग करके मानव आईपीएससी से बीएमईसी को प्राप्त करने, विस्तारित करने और क्रायोप्रिजर्व करने के लिए विस्तृत कदम प्रदान करता है। आईपीएससी को 4 दिनों के लिए आवश्यक 6 माध्यम के साथ इलाज किया जाता है, इसके बाद 2 दिनों के मानव एंडोथेलियल सीरम-मुक्त संस्कृति माध्यम को बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर, रेटिनोइक एसिड और बी 27 पूरक के साथ पूरक किया जाता है। 6 दिन में, कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए एक कोलेजन/फाइब्रोनेक्टिन मैट्रिक्स पर उप-संस्कारी होते हैं । इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, और SLC2A1 का उपयोग कर बीएमईसी मार्कर विश्लेषण के लिए 8 दिन में किया जाता है। पश्चिमी ब्लॉटिंग बीएमईसी मार्कर अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए किया जाता है, और SOX17 की अनुपस्थिति, एक एंडोडर्मल मार्कर। एंजियोजेनिक क्षमता एक अंकुरण परख के साथ प्रदर्शन किया है। ट्रांस एंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) को 7 दिन से शुरू होने वाले चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड और वोल्टोममीटर का उपयोग करके मापा जाता है। एटीपी बाध्यकारी कैसेट उपपरिवार बी सदस्य 1 और एटीपी बाध्यकारी कैसेट उपपरिवार सी सदस्य 1 के लिए Efflux ट्रांसपोर्टर गतिविधि 8 दिन में एक बहु प्लेट रीडर का उपयोग कर मापा जाता है । बीएमईसी के सफल व्युत्पन्न की पुष्टि प्रासंगिक सेल मार्कर, SOX17 के निम्न स्तर, एंजियोजेनिक क्षमता, ट्रांसपोर्टर गतिविधि और टीईईआर मूल्यों की उपस्थिति से होती है ~ 2000 Ω एक्स सेमी2। बीएमईसी का विस्तार 10 दिन तक किया जाता है, जो हौसले से लेपित कोलेजन/फाइब्रोनेक्टिन प्लेटों या क्रायोप्रेसेव पर पासिंग से पहले होता है । यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी का विस्तार किया जा सकता है और कम से कम एक बार पारित किया जा सकता है। हालांकि, क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद कम टीईईआर मूल्यों और बीएमईसी मार्कर के गरीब स्थानीयकरण को देखा गया। बीएमईसी का उपयोग मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड के संवहनी के लिए, और न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारोंमें बीबीबी रोग का अध्ययन करने के लिए, त्रि-आयामी मस्तिष्क मॉडल (अंग-चिप और हाइड्रोजेल) में अन्य सेल प्रकारों (न्यूरॉन्स, ग्लिया, पेरिसाइट्स) के साथ सह-संस्कृति प्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

रक्त-मस्तिष्क बाधा समारोह
रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) एक सीमा बनाती है जो रक्त से मस्तिष्क तक पदार्थों के आंदोलन को सीमित करती है। बीबीबी में मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (बीएमईसी) शामिल हैं जो वैक्यूलेचर को अस्तर करने वाला मोनोलेयर बनाती हैं। बीएमईसी, एस्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स, पेरिसाइट्स, माइक्रोग्लिया और एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के साथ मिलकर न्यूरोवैस्कुलर यूनिट बनाते हैं। बीएमईसी में एक कसकर विनियमित पैरासेलुलर संरचना होती है जो बीबीबी को उच्च ट्रांस-एंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) बनाए रखने की अनुमति देती है, जो निष्क्रिय प्रसार को सीमित करती है और बाधा अखंडता1,2के संकेतक के रूप में कार्य करती है। बीएमईसी में प्रोटीन भी होता है जो ट्रांससेलुलर मूवमेंट जैसे एंडोसाइटोसिस, ट्रांससाइटोसिस और ट्रांसमिग्रेशन के साथ-साथ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 3 केदौरानल्यूकोसाइट्स के अपव्यय के साथ सहायता करता है। बीएमईसी मस्तिष्क3में एक होमोस्टेटिक संतुलन बनाए रखने के लिए अपशिष्ट उत्पादों के पोषण और हटाने के लिए बाढ़ और efflux ट्रांसपोर्टरों पर भरोसा करते हैं। उदाहरण के लिए, सोल्यूट कैरियर परिवार 2 सदस्य 1 (SLC2A1) बीबीबी4में ग्लूकोज के आंदोलन के लिए जिम्मेदार एक बाढ़ ट्रांसपोर्टर है, जबकि एटीपी बाध्यकारी कैसेट सबफैमिली बी सदस्य 1 (एबीसीबी 1) और एटीपी बाध्यकारी कैसेट सबफैमिली सी सदस्य 1 (ABCC1) जैसे एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर रक्त धारा3,5,6, 7,7, 7मेंवापस सबट्रेट्स लौटाने के लिए जिम्मेदार हैं। एबीसीबी 1 सब्सट्रेट्स में मॉर्फिन, वेरापामिल4और एंटीसाइकोटिक्स जैसे ओलान्ज़ाइन और रिस्पेरिडोन8शामिल हैं, जबकि एबीसीसी 1 ट्रांसपोर्टर में सल्फेट कंजूगेट्स, विनक्रिस्टीन और ग्लूक्यूरोनाइड संजुगेट्स4सहित कई तरह के सब्सट्रेट्स हैं ।

मनोरोग विकारों में बीबीबी मॉडल का आवेदन
बीबीबी डिसफंक्शन को कई न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग विकारों में फंसाया गया है, जिसमें सिजोफ्रेनिया और बाइपोलर डिसऑर्डर9,10शामिल हैं । हाल ही में, मनोरोग विकारों के सेलुलर और आणविक आधार पर पूछताछ करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न पूर्व वीवो सेलुलर मॉडल का उपयोग किया जा रहा है, लेकिन ये मॉडल वर्तमान में न्यूरोवैस्कुलेचर11,12, 13द्वारा निभाई गई संभावित भूमिका को ध्यान में नहींरखतेहैं। यह परिकल्पना की गई है कि रक्त में घूम रहे परिधीय भड़काऊ साइटोकिन्स बीबीबी14, 15,16,17पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकतेहैं,लेकिन पैरासेलुलर18,19,20, 21केलिए भी सबूतहैं।22,ट्रांससेलुलर23,24,25,26,27,28, 29,और एक्सेसेलुलर मैट्रिक्स20, 29,30,31,32 असामान्यताओं बीबीबी रोग में योगदान देते हैं। बीबीबी के व्यवधान के परिणामस्वरूप मस्तिष्क परेन्चिमा में प्रवेश करने वाले रक्त की सामग्री हो सकती है और एस्ट्रोसाइट्स और/या माइक्रोग्लिया को प्रोइनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स जारी करने के लिए सक्रिय किया जा सकता है, जो बदले में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया३३ शुरू करता है जो मस्तिष्क३४पर हानिकारक प्रभाव डाल सकता है । बीएमईसी बीबीबी का प्राथमिक घटक है और इन कोशिकाओं की संरचना और कार्य की जांच न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग विकारों में बीबीबी रोग की समझ को बढ़ा सकता है।

वैकल्पिक बीएमईसी मॉडल
आईपीएससी1, 6,35,36से बीएमईसी प्राप्त करने के लिए कुशल प्रोटोकॉल के विकास से पहले, शोधकर्ताओं ने बीबीबी समारोह का अध्ययन करने के लिए अमरबीएमईसी 37 को नियोजित किया था। हालांकि, इनमें से कई मॉडल वांछनीय बीबीबी फेनोटाइप प्राप्त करने में विफल रहे, टीईईआर मूल्यों की ऐसी शारीरिक श्रृंखला38,39। आईपीएससी का उपयोग करने से उस व्यक्ति की आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बनाए रखने का लाभ होता है जिससे कोशिकाएं प्राप्त होती हैं। वैज्ञानिक सक्रिय रूप से आईपीएससी-व्युत्पन्न पूर्व वीवो माइक्रोएनवायरमेंट मॉडल स्थापित करने पर काम कर रहे हैं जो मानव मस्तिष्क की संरचना और कार्य को पुनः स्थापित करते हैं । शोधकर्ताओं ने बीएमईसी प्राप्त करने के तरीके विकसित किए हैं जो संरचनात्मक रूप से और शारीरिक रूप से वीवो मेंपाए जाने वाले बीएमईसी के समान हैं । आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के तरीकों के लिए पिछले कुछ वर्षों में 1 ,6, 35,36के प्रोटोकॉल के साथ कई अलग - अलग कदमों की आवश्यकता होती है। आम तौर पर, आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी को 4 दिनों के लिए आवश्यक 6 (ई6) माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है, इसके बाद मानव एंडोथेलियल सीरम-मुक्त माध्यम (एचईएफएम) में 2 दिन बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएमएफजीएफ), रेटिनोइक एसिड (आरए) और बी 27 पूरक के साथ पूरक होते हैं। कोशिकाओं को तब कोलेजन IV (COL4) और फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) मैट्रिक्स पर सुसंस्कृत किया जाता है ताकि प्राप्त किया जा सके और 90% सजातीय बीएमईसी1प्राप्त किया जा सके।

बीएमईसी की पहचान इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पुष्टि की जाती है जिसमें प्लेटलेट-एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु-1 (PECAM1), SLC2A1, और तंग जंक्शन प्रोटीन जैसे टाइट जंक्शन प्रोटीन 1 (टीजेपी1), ओक्लुडिन (ओसीएलएन), और क्लाउडिन-5 (CLDN5)6सहित बीएमईसी प्रोटीन की सह-अभिव्यक्ति दिखाई जाती है । स्प्राउटिंग परख का उपयोग आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी की एंजियोजेनिक क्षमता की पुष्टि करने के लिए किया गया है। 6 बीएमईसी की बीबीबी अखंडता का मूल्यांकन फिजियोलॉजिकल इन विट्रो टीयर वैल्यूज (~2000ω एक्स सेमी2) 37और एबीसीबी 1 और एबीसीसी1,6,36 जैसे एफफ्लक्स ट्रांसपोर्टर्स के लिए मापने योग्य गतिविधि की उपस्थिति से कियाजाताहै । लिपमैन समूह द्वारा हाल ही में किए गए पद्धतिगत अग्रिमों ने कम प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता और बढ़ी हुई प्रजनन क्षमता1के साथ आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी प्रोटोकॉल का नेतृत्व किया है। हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि क्या उनका विस्तार किया जा सकता है और उप-संस्कृति चरण से परे है। हमारे संशोधित प्रोटोकॉल का उद्देश्य 8 दिन से परे आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी को पास करके इस मुद्दे का समाधान करना और यह आकलन करना है कि क्या क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद बीबीबी संपत्तियों को बनाए रखने के लिए उन्हें और विस्तारित किया जा सकता है। हालांकि किसी भी अध्ययन में आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी के पास्डिंग का वर्णन नहीं किया गया है, लेकिन बीएमईसी क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है जो फ्रीज-गल चक्र40से गुजरने के बाद शारीरिक बीबीबी गुणों को बरकरार रखता है। हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद बीएमईसी को पारित किया जा सकता है और बीबीबी गुणों को बनाए रखा जा सकता है।

लिपमैन प्रोटोकॉल का उपयोग करके आईपीएससी से प्राप्त बीएमईसी का उपयोग हंटिंगटन रोग7जैसे न्यूरोलॉजिकल विकारों में बीबीबी व्यवधान को मॉडल करने के लिए किया गया है। इस तरह के आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी का उपयोग रक्त-सीएसएफ बैरियर और बीबीबी के व्यवधान पर नेसेरिया मेनिंगिटिडिस या ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोकस जैसे बैक्टीरियल संक्रमण के प्रभावों की जांच करने के लिए भी किया गयाहै। इसके अलावा, सिजोफ्रेनिया के साथ 22q विलोपन सिंड्रोम रोगियों से आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने इंटरसेलुलर आसंजन अणु-1 (आईसीएएम-1) में वृद्धि देखी, जो बीएमईसी में एक प्रमुख आसंजन अणु है जो मस्तिष्क४३में ल्यूकोसाइट्स की भर्ती और अतिव्यवसंकरण के साथ सहायता करता है । एक साथ लिया, इन अध्ययनों जटिल न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों में BBB व्यवधान का अध्ययन करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न BMECs की उपयोगिता का प्रदर्शन ।

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Protocol

मानव आईपीएससी को मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल और मैकलीन अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्डों द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्वस्थ दानदाताओं के फाइब्रोब्लास्ट से फिर से प्रोग्राम किया गया था, और पिछले अध्ययनों में वर्णित44,45,46।

नोट: संक्षेप में, फाइब्रोब्लास्ट को एमआरएनए-आधारित जेनेटिक रिप्रोग्रामिंग47के माध्यम से आईपीएससी में फिर से प्रोग्राम किया गया था। आईपीएससी स्टेम सेल माध्यम (एससीएम) (सामग्री सूची देखें) में बनाए रखा गया था और ~1.2 x 102 कोशिकाओं/एमसीएल के 1 एमएल के साथ एक घनत्व पर संग्रहीत, 10 माइक्रोनएम के साथ rho-संबद्ध प्रोटीन kinase अवरोधक (ROCKi) Y-27632, और 10% (v/v) डिमेथाइल सल्फाइड (DMSO), तरल नाइट्रोजन में क्रायोप्रीयर्ड शीशियों में -160 डिग्री सेल्सियस पर । नीचे दिए गए सभी निम्नलिखित प्रक्रियाएं जैवसेफ्टी कैबिनेट में की जाती हैं जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है।

1. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स कमजोर पड़ने और प्लेट कोटिंग

  1. तनु (1:50) विकास कारक ने दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में एंजेलब्रेथ-होम-झुंड ट्यूमर से फिनोल लाल के बिना तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को कम किया।
  2. कोट सेल संस्कृति प्लेटें पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (यानी, 6-अच्छी तरह से प्लेट = 1mL, 12-अच्छी तरह से थाली = 0.5 मिलीएल) की उचित मात्रा के साथ और कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इन प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

2. आईपीएससी रखरखाव

नोट: एक 6 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट में अच्छी तरह से प्रति अधिकतम योग्यता ~ 1.2 x 106 कोशिकाओं है।

  1. गल क्रायोप्रीवित आईपीएससी को सीएम में 10 माइक्रोन वाई-27632 के साथ और पतला विकास कारक कम तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ लेपित 6-अच्छी प्लेट पर प्लेट।
  2. एससीएम में आईपीएससी को 10 माइक्रोन वाई-27632 के साथ पहले 24 घंटे के लिए विगलन के बाद बनाए रखें। 24 घंटे के बाद ताजा माध्यम पर स्विच करें।
  3. एससीएम में आईपीएससी बनाए रखें जब तक कि कोशिकाएं पास होने से पहले 80-90% तक न पहुंच जाए।
    1. गणना करें कि कुएं के सतह क्षेत्र द्वारा विभेदन के लिए वांछित घनत्व (15,600 कोशिकाओं/सेमी2)को गुणा करके भेदभाव के लिए कितने आईपीएससी की आवश्यकता होगी। 6-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट के लिए, कुल 149,760 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 9.6 सेमी 2 द्वारा 15,600 कोशिकाओं/सेमी2 को गुणा करें।
  4. मार्ग के लिए, हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोएं । फिर, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गैर-एंजाइमेटिक एथिलेंडियामाइनेट्रेएक्टेटिक एसिड (ईडीटीए) (सामग्री सूची देखें) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    1. कोशिकाओं को धीरे-धीरे उठाने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। फ्रेश सीएम में सेल कलेक्ट करें।
    2. कोशिका संस्कृति प्लेटों पर प्लेट कोशिकाओं पतला SCM के साथ लेपित और कोशिकाओं को बनाए रखने के रूप में कदम २.३ में वर्णित है या उंहें ~१.२ x10 6 कोशिकाओं/एमसीएल पर स्टोर करने के लिए SCM के 1 ml में, 10 μM Y-27632, और 10% DMSO (v/v) के तापमान पर तरल नाइट्रोजन में क्रायोप्रीसे सर्व शीशियों में-C C के तापमान पर ।

3. बीएमईसी में आईपीएससी का भेदभाव

नोट: गैर-एंजाइमेटिक ईडीटीए कोशिकाओं को झुरमुटों में अलग करता है। एंजाइमेटिक EDTA (सामग्री की तालिकादेखें) कोशिकाओं को एकल कोशिका निलंबन में अलग करता है। रेटिनोइक एसिड (आरए) को प्रकाश से बचाया जाना चाहिए।

  1. दुलबेको के फॉस्फेट बफर नमकीन (डीपीबीएस) के साथ एक बार आईपीएससी धोएं। एंजाइमेटिक ईडीटीए (6-वेल प्लेट के लिए 1 एमसीए, 12-वेल प्लेट के लिए 0.5 एमएल, और 24-वेल प्लेट के लिए 0.25 एमएल) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 5 मिनट के लिए एक एकल सेल निलंबन उपज के लिए।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g (सापेक्ष अपकेंद्रित्र बल) पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र ले लीजिए। एससीएम में 10 माइक्रोएम वाई-27632 वाले सेल छर्रों को रिसालित करें।
  3. ट्राइपैन ब्लू और ऑटोमेटेड सेल काउंटर या एक हीमोसाइटोमीटर डिवाइस का उपयोग करके सेल घनत्व निर्धारित करें। 24 घंटे के लिए 10 माइक्रोएमवाई-27632 युक्त सीएम में 15,600 कोशिकाओं/सेमी 2 या 149,760 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 6-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट (9.6 सेमी2/वेलके सतह क्षेत्र के साथ) के घनत्व पर प्लेट कोशिकाएं।
  4. सीएम बदलकर ई6 मीडियम कर 24 घंटे बाद भेदभाव शुरू करें। अगले 4 दिनों के लिए दैनिक E6 मध्यम बदलें।
  5. भेदभाव के दिन 4 पर, E6 माध्यम को पतला (1:200) B27 पूरक, 20 एनजी/एमएल बीएमजीएफ, और 10 माइक्रोन आरए के साथ पूरक hESFM के साथ प्रतिस्थापित करें। अगले 48 घंटे तक इस माध्यम को न बदलें।
  6. पतला (1:200) B27 के साथ एचईएफएम के 200 एमएल तैयार करें, 50x केंद्रित बी 27 पूरक के 1 एमएल को 199 एमएल एचडीएफएम के साथ मिलाएं।
  7. 200 μg/mL स्टॉक सॉल्यूशन बनाने के लिए 250 μL ऑफ ट्राइज बफर (5 एमएम ट्रिस, पीएच 7.6, 150 एमएन एनएसीएल) में 50 μgf के पुनर्गठन करके 50 एनजी/एमएल बीडब्ल्यूएफ की तैयारी करें। एचईएफएम के 200 एमएल के साथ 200 μg/mL 5GF मिलाकर 20 एनजी/एमएल 5एफजीएफ युक्त 200 एमएल तैयार करें।
  8. पहले 100 मिलीग्राम आरए पाउडर में डीएमएसओ के 25 एमएल जोड़कर आरए स्टॉक सॉल्यूशन का 40 मिलीग्राम/एमएल बनाकर 10 माइक्रोनएम आरए तैयार करें। 10 mm स्टॉक समाधान बनाने के लिए इस एकाग्रता को 3 मिलीग्राम/एमएल तक पतला करें। 200 एमएल एचईएसएफएम में 10μm आरए के 200 माइक्रोन मिलाकर 10 माइक्रोएम आरए युक्त 200 एमएल तैयार करें।

4. आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी के शुद्धिकरण के लिए कोटिंग कोलेजन IV (COL4) और फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) मैट्रिक्स

  1. 1 मिलीग्राम/एमएल एफएन स्टॉक सॉल्यूशन बनाने के लिए 2 मिलीग्राम एफएन में 2 मिलील बाँझ पानी डालें। 1 मिलीग्राम/एमएल COL4 स्टॉक समाधान बनाने के लिए 5 मिलीग्राम COL4 में बाँझ पानी की 5 मिली लीटर जोड़ें ।
    1. एफएन को 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट और कोल 4 को कमरे के तापमान पर भंग करने की अनुमति दें।
  2. ४०० μg/mL/col4 स्टॉक समाधान की अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ पानी में तनु एफएन स्टॉक समाधान ४०० μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए ।
  3. कोट वांछित प्लेटें (6-अच्छी तरह से प्लेट = COL4/FN समाधान के 1 ml, 12-अच्छी तरह से थाली = ०.५ ml, 24-अच्छी तरह से थाली = ०.२५ मिलीएल, और 12-ट्रांसवेल फ़िल्टर प्लेट = ०.२५ एमएल) ४०० g/mL COL4 और १०० μg/mLN FLN के मिश्रण के साथ ।
  4. कम से कम 2 घंटे या रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें; ट्रांसवेल फ़िल्टर प्लेटों के लिए, न्यूनतम 4 घंटे की सिफारिश की जाती है।

5. आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी की उप-संस्कृति और शुद्धि

नोट: एंजाइमेटिक EDTA के साथ इनक्यूबेशन भेदभाव के दिन 6 पर कोशिकाओं की उदारता के आधार पर 15 मिनट से अधिक समय लग सकता है ।

  1. विभेदन के 6 दिन पर, डीपीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं। एक एकल सेल निलंबन प्राप्त होने तक कम से कम 15 मिनट के लिए एंजाइमेटिक ईडीए के 1 मिलियन ईटीए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को ले लीजिए। पतला (1:200) B27 पूरक, 20 एनजी/एमएल bFGF, और 10 μM आरए के साथ ताजा hESFM के साथ सेल छर्रों Resuspend सेल छर्रों ।
  3. ४०० μg/mL COL4 और १०० μg/mL FN. बीज कोशिकाओं के मिश्रण के साथ लेपित प्लेटों पर बीज कोशिकाओं को एक 12 अच्छी तरह से थाली के 3 कुओं के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली के 1 अच्छी तरह से अनुपात का उपयोग कर, एक 12-transwell फ़िल्टर प्लेट के 3, या एक 24 अच्छी तरह से थाली के 6 कुओं ।
  4. बीज एक ही सेल लाइन से COL4/FN लेपित 12-ट्रांसवेल फ़िल्टर प्लेट TEER विश्लेषण के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ।
  5. उप-संस्कृति के 24 घंटे के बाद, केवल B27 पूरक के साथ एचईएफएम के लिए माध्यम बदलें। इस कदम के बाद किसी मध्यम बदलाव की जरूरत नहीं है।

6. अंकुरण परख

  1. दिन 8 iPSC-व्युत्पन्न BMECs ले लीजिए और उंहें १००,००० कोशिकाओं पर बीज/अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे थाली हौसले से २०० μL के साथ लेपित/
  2. इन कोशिकाओं को पतला (1:200) B27 और 40 एनजी/एमएल के साथ पतला (1:200) के साथ इलाज करें।
  3. हर 24 घंटे में कोशिकाओं का निरीक्षण करें और हर दो दिन में माध्यम बदलें।

7. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी)

नोट: आईसीसी 24-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटों पर किया जाता है ।

  1. उप-संस्कृति (8 दिन) के 48 घंटे के बाद, डीपीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं। 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  2. डीपीबीएस के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोएं, प्रति वॉश 5 मिनट। 5% गधा सीरम और ०.३% ट्राइटन एक्स-१०० (v/v) के साथ डीपीबीएस में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्री-ब्लॉक कोशिकाएं ।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट: माउस एंटी-ह्यूमन-पेकैम 1 (1:100, स्टॉक 0.5 मिलीग्राम/एमएल), खरगोश विरोधी मानव-टीजेपी 1 (1:200, स्टॉक 0.53 मिलीग्राम/एमएल), माउस एंटी-ह्यूमन-सीएलडीएन5 (1:200, स्टॉक 0.5 मिलीग्राम/एमएल), माउस एंटी-ह्यूमन-ओसीएलएन (1:200, स्टॉक 0.5 मिलीग्राम/एमएल), और खरगोश विरोधी मानव-SLC2A1 (1:100, स्टॉक 0.2 मिलीग्राम/एमएल) डीपीबीएस में 5% गधा सीरम रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर होता है।
    1. डीपीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को कुल्ला करें और फिर डीपीबीएस के साथ प्रति वॉश 5 मिनट के लिए पांच बार धोएं।
  4. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट कोशिकाएं: गधा-विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 555 (1:200) और गधे-विरोधी माउस 488 (1:200) डीपीबीएस में 1 घंटे के लिए 5% गधा सीरम युक्त।
  5. इस इनक्यूबेशन के बाद, डीपीबीएस में 10 मिनट के लिए होचस्ट 33342 ट्राइहाइड्रोक्लोराइड ट्राइहाइड्रेट पतला (1:1000) जोड़ें।
    1. Hoechst 33342 समाधान निकालें और डीपीबीएस के साथ एक बार कुल्ला और प्रति धोने 5 मिनट के लिए DPBS के साथ चार बार धो।
  6. कोशिका निर्माताओं की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण की तलाश के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर कोशिकाओं की कल्पना करें।

8. टीईआर मापन और विश्लेषण

नोट: कॉर्निंग 12-ट्रांसवेल फ़िल्टर प्लेटें फिल्टर से लैस हैं जिनमें 1.12 सेमी2 पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट झिल्ली और 0.4 माइक्रोमीटर छिद्र शामिल हैं। टीईईआर माप तकनीकी (3 प्रति अच्छी तरह) और जैविक प्रतिकृति (सेल लाइन प्रति 3 कुओं और/या हालत) में प्राप्त किए जाते हैं ।

  1. उप-संस्कृति (दिन 7) के 24 घंटे बाद, हर 24 घंटे में चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड और एक वोल्टोममीटर का उपयोग करके टीईआर को मापें। माप प्राप्त करने पर विशिष्ट निर्देशों के लिए वोल्टोममीटर उपयोगकर्ता मैनुअल को देखें।
    1. टीईईआर को मापने के लिए, वोल्टोममीटर उपकरण को रात से पहले चार्ज करें। उन्हें सुरक्षा हुड में रखने से पहले 70% इथेनॉल के साथ उपकरण और चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड को हल्के से पोंछें।
    2. बिजली को चालू करें और निर्माता द्वारा अनुशंसित ओम मीटर को कैलिब्रेट करें।
    3. चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड में प्लग करें और डीपीबीएस के बाद 70% इथेनॉल के साथ इलेक्ट्रोड कुल्ला करें।
    4. छोटे अंत इलेक्ट्रोड को ट्रांस-वेल डालने (एपिकल चैंबर) में रखें और लंबे समय तक बेसोलेटरल कक्ष में समाप्त करें।
    5. पहले एक खाली अच्छी तरह से उपाय है कि COL4/FN के साथ ही लेपित है । इसके बाद अन्य कुओं को ताप करें।
    6. विभिन्न स्थितियों को मापने पर डीपीबीएस (यानी विभिन्न सेल लाइनों को मापने) के बाद 70% इथेनॉल के साथ चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड को जल्दी से कुल्ला करें।
  2. सभी माप (Ω में) दर्ज किए जाने के बाद, 70% इथेनॉल और फिर बाँझ पानी के साथ चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड कुल्ला। धीरे-धीरे इलेक्ट्रोड को पोंछें और इसे सुरक्षा हुड में सूखने दें।
  3. खाली अच्छी तरह से टीईईआर मूल्यों (Ω में) औसत और शर्त के अ द्वारा प्रत्येक कच्चे टीईईआर मूल्य से इस औसत मूल्य को घटाना।
    1. घटाया मूल्यों औसत और उन्हें 1.12 सेमी2 (12-ट्रांसवेल डालने की सतह क्षेत्र) से गुणा।
    2. टीईईआर माप के प्रत्येक दिन के लिए टीईईआर मूल्य और मानक त्रुटियों को दिखाने वाले ग्राफ को उत्पन्न करने के लिए चरण 6 से परिवर्तित मूल्यों का उपयोग करें।

9. एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर गतिविधि और विश्लेषण

नोट: Efflux ट्रांसपोर्टर गतिविधि परख एक 24 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट पर किया जाता है । ब्याज के Efflux ट्रांसपोर्टरों ABCB1 और ABCC1 शामिल हैं । यह सिफारिश की जाती है कि प्रत्येक स्थिति नियंत्रण कुओं (यानी संबंधित अवरोधकों के बिना खाली कुओं) के साथ ट्रिपलीकेट में की जानी चाहिए।

  1. उप-संस्कृति (दिन 8) के 48 घंटे के बाद, 10 माइक्रोन वाल्स्पोडर (एबीसीबी 1 अवरोधक) या 10 माइक्रोएम एमके571 (एबीसीसी 1 अवरोधक) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट कोशिकाएं।
    1. 10 एमएम वाल्सपोदर स्टॉक को 5 मिलीग्राम पाउडर (1214.64 ग्राम/मोल) को घोलकर 412 माइक्रोन में घोलकर तैयार करें और 10 माइक्रोन की एकाग्रता को पतला करें। उदाहरण के लिए, 10 माइक्रोन वाल्सपोदर के साथ 10 μM Valspodar के साथ एचईएफएम के 10 एमएल बनाने के लिए, 10 एमएल वाल्सपोडार स्टॉक के 10 μL को 10 एमएल के साथ मिलाएं।
    2. 931 माइक्रोन में 5 मिलीग्राम पाउडर (537.07 ग्राम/मोल) को भंग करके 10 एमएम एमके 571 स्टॉक तैयार करें और 10 माइक्रोन की एकाग्रता को पतला करें। उदाहरण के लिए, 10 माइक्रोन एमके571 के साथ एचईएफएम का 10 एमएल बनाने के लिए, 10 एमएल एमके571 स्टॉक के 10 μL को 10 मिलियन एचएम के साथ मिलाएं।
  2. 1 घंटे के बाद, 10 माइक्रोन रोडामाइन 123 (एबीसीबी 1 सब्सट्रेट) या 10 माइक्रोन 2', 7'-डाइक्लोरोइडीड्रोफ्रोफ्लोफोरेसिन डायसेटेट (एच2डीसीएफडीए, एबीसीसी1 सब्सट्रेट) के साथ या 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए अपने संबंधित अवरोधकों के बिना के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    1. 10 एमएम रोडामाइन 123 को डीएमएसओ के 875 माइक्रोन में 10 मिलीग्राम पाउडर (380.82 ग्राम/मोल) घोलकर तैयार करें और 10 माइक्रोन की एकाग्रता को पतला करें। उदाहरण के लिए, 10 माइक्रोन रोडामाइन 123 के साथ एचईएफएम के 10 एमएल बनाने के लिए, 10 एमएम रोडामाइन 123 स्टॉक के 10 μL को एचडीएफएम के 10 एमएल के साथ मिलाएं।
    2. 10 एमएम एच2डीसीडीए को डीएमएसओ के 10.26 एमएल में 50 मिलीग्राम पाउडर (487.29 ग्राम/मोल) घोलकर तैयार करें और 10 माइक्रोन की एकाग्रता को पतला करें। उदाहरण के लिए, 10 माइक्रोन रोडामाइन 123 के साथ एचईएफएम के 10 एमएल बनाने के लिए, 10 एमएम रोडामाइन 123 स्टॉक के 10 μL को एचडीएफएम के 10 एमएल के साथ मिलाएं।
  3. डीपीबीएस के 0.5 एमएल के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं और 5% ट्राइटन-एक्स (v/v) वाले डीपीबीएस का उपयोग करके lyse।
  4. मल्टी-प्लेट या माइक्रोप्लेट रीडर (सामग्री सूची देखें) का उपयोग करके लिस्ड कोशिकाओं के फ्लोरेसेंस को मापें।
    1. फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर इंस्ट्रूमेंट को 485 नैनोमीटर उत्तेजन और 530 नैनोमीटर उत्सर्जन के लिए सेट करें और इन तरंगदैर्ध्य पर फ्लोरेसेंस को मापें।
    2. ट्रांसपोर्टर परख में उपयोग नहीं किए जाने वाले कुओं के लिए, कोशिका नाभिक मात्राकरण के लिए 4% पीएफए के साथ उन्हें ठीक करने से पहले डीपीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
  5. 10 मिनट के लिए डीपीबीएस में होचस्ट 33342 ट्राइहाइड्रोक्लोराइड ट्राइहाइड्रेट पतला (1:1000) के साथ इनक्यूबेट कोशिकाएं। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके औसत सेल नाभिक की गणना करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से कई दृश्य फ़ील्ड छवि करें।
  6. फिजी का उपयोग करके नाभिक की गणना करें और इन मामलों के प्रति-सेल आधार पर फ्लोरेसेंस मूल्यों को सामान्य करें।
    1. अपने संबंधित रिक्त मूल्य से प्रत्येक स्थिति के लिए कच्चे फ्लोरेसेंस संचय मूल्य को घटाकर फ्लोरेसेंस के औसत संचय की गणना करें।
    2. प्रत्येक स्थिति के लिए औसत घटाया मूल्य।
    3. औसत सेल मायने रखता है द्वारा चरण 9.6.1 से औसत मूल्यों को विभाजित करें। प्रति-कोशिका आधार पर फ्लोरेसेंस मूल्यों को सामान्य बनाने के लिए इन मूल्यों का उपयोग करें।
    4. प्रत्येक अवरोधक स्थिति के लिए एक चित्रमय प्रतिनिधित्व उत्पन्न करने और किसी भी आवश्यक सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए सामान्यीकृत मूल्यों का उपयोग करें।

10. पासेजिंग, विस्तार, और क्रायोप्रिजर्विंग बीएमईसी

  1. ताजा hESFM पतला (1:200) B27 के साथ पूरक के साथ दिन 8 बीएमईसी संस्कृतियों की भरपाई और कोशिकाओं को COL4/FN मैट्रिक्स पर दो और दिनों के लिए विस्तार करने की अनुमति ।
  2. कोट एक नया 12-ट्रांसवेल फ़िल्टर प्लेट और ४०० μg/mL COL4 और १०० μg/mL FN और 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट के साथ एक 24 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे थाली ।
  3. 10 दिन, डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं और एक एकल सेल निलंबन प्राप्त होने तक कम से कम 15 मिनट के लिए एंजाइमेटिक ईडीटीए के 1 मिलियन ईटीए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर पकाएं।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को ले लीजिए।
    1. इन कोशिकाओं को क्रायोप्रेरिज करने के लिए, 30% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 10% डीएमएसओ के साथ ताजा एचईएसएफएम के साथ सेल छर्रों को फिर से आता है।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस पर पहले 24 घंटे के लिए एक आइसोप्रोपेनॉल कंटेनर में क्रायोप्रीवसेव्ड शीशियों में आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी स्टोर करें, फिर -160 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में रखें।
    3. इन कोशिकाओं को पारित करने के लिए, ताजा एचईएफएम के साथ सेल छर्रों को पतला (1:200) B27 के साथ पूरक किया जाता है।
  5. चरण 10.2 में तैयार लेपित प्लेटों पर बीज कोशिकाएं। बीज कोशिकाओं को एक 12-ट्रांसवेल फ़िल्टर प्लेट के 3 कुओं के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली के 1 अच्छी तरह से अनुपात का उपयोग कर और एक 24 अच्छी तरह से थाली के 6 कुओं के लिए । कोशिकाओं को 24 घंटे तक बढ़ने और विस्तारित करने दें।
  6. 11 दिन, चरण 8 में सूचीबद्ध चरणों का पालन करके टीईईआर को मापें।
  7. 12 दिन, चरण 9 में सूचीबद्ध चरणों का पालन करके आईसीसी प्रदर्शन करें ।
  8. क्रायोप्रेवरी बीएमईसी को गलने के लिए, क्रायोप्रीवरी की शीशियों को गर्म पानी या मनका स्नान में 37ओसी पर रखें। फिर गल गए बीएमईसी को पतला (1:200) B27 के साथ पूरक एचईएफएम के 5 एमएल में स्थानांतरित करें।
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को ले लीजिए। एचईएफएम में कोशिकाओं को पतला (1:200) B27, 10 μM RA और 10 μM Y-27632 के साथ पूरक फिर से खर्च करें।
    2. 24 घंटे के बाद, आरए के बिना पतला (1:200) बी 27 और 10 माइक्रोन वाई-27632 के साथ पूरक एचईएसएफएम के लिए मध्यम स्विच करें।

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Representative Results

बीएमईसी भेदभाव
इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदमों का ठीक से पालन किया जाना चाहिए(चित्र 1)। 1 दिन पर E6 मध्यम उपयोग महत्वपूर्ण है, क्योंकि इसका उपयोग अक्सर आईपीएससी से न्यूरोेक्टोडेर्म वंश प्राप्त करने के लिए किया जाता है, जो अपेक्षाकृत कम समय के भीतर कई सेल लाइनों36में प्रजनन योग्य परिणाम देता है। एक अन्य महत्वपूर्ण कदम भेदभाव के दूसरे दिन है, जहां E6 माध्यम को पतला (1:200) B27, 20 एनजी/एमएल बीएमजीएफ और 10 माइक्रोन एमआरए के साथ एचएसजीसी-व्युत्पन्न बीएमईसी का विस्तार करने के साथ एचईएफएम में बंद किया जाना चाहिए । बी 27 पूरक के अलावा सीरम मुक्त सेल संस्कृति का समर्थन करने के लिए गोजातीय सीरम के विकल्प के रूप में प्रयोग किया जाता है1,टीएफजीएफ को आईपीएससी-व्युत्पन्नबीएमईसी 6के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए जोड़ा जाता है, और आरए का उपयोग बीबीबी फेनोटाइप35के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जाता है। अंतिम महत्वपूर्ण कदम में शुद्धि चरण शामिल है, जहां दिन 6 आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी कोआईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी1, 6,35,36का चयन करने के लिए एक COL4/FN कोटेड प्लेट पर उप-संस्कारी हैं। चित्रा 2 आईपीएससी से बीएमईसी में रूपात्मक संक्रमण को दर्शाता है। ई 6 माध्यम (1 दिन) के एक दिन के बाद, सेलुलर आकृति विज्ञान आईपीएससी के समान है। E6 के दिन 4 तक, कोशिकाएं आईपीएससी से अलग दिखाई देने लगती हैं और अधिकांश अच्छी तरह से कवर करती हैं (~ 90% संकुचन)। 6 दिन तक, जबकि पतला (1:200) B27, 20 एनजी/एमएल बीएमजीएफ और 10 माइक्रोन आरए के साथ hESFM में सुसंस्कृत, सेलुलर आकृति विज्ञान के लिए एक लम्बी और कोबलस्टोन उपस्थिति शुरू होता है । 8 दिन में, प्रत्येक व्यक्ति कोशिका एक बड़े कोबलस्टोन पैटर्न में अलग है। आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी की एंजियोजेनिक क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए एक अंकुरित परख का प्रदर्शन किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप VEGFA165 उपचार(चित्रा 3)के 3 दिनों के बाद ट्यूब जैसी संरचनाएं हुईं।

Figure 1
चित्रा 1: बीएमईसी के लिए मानव आईपीएससी के भेदभाव के लिए रूपरेखा। मानव आईपीएससी को शुरू में स्टेम सेल माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था जिसमें 4 दिनों के लिए मध्यम को E6 में बदलने से पहले 24 घंटे के लिए 10 μM Y-27632 थे । 4 दिन, मध्यम (1:200) B27 पूरक, 20 एनजी/एमएल bFGF, और 10 μM आरए के साथ 2 दिनों के लिए hESFM में बदल गया था । 6 दिन पर, कोशिकाओं को उप COL4/FN लेपित प्लेटों पर सुसंस्कृत थे । 7 दिन, मध्यम bFF और आरए और TEER मापा गया था बिना B27 पूरक के साथ hESFM में बदल गया था । 8 दिन, आईसीसी और efflux ट्रांसपोर्टर गतिविधि परख प्रदर्शन किया गया । आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी को क्रमशः ट्रांस वेल प्लेट या टीयर मापन और आईसीसी विश्लेषण के लिए 24-अच्छी तरह से फ्लैट बॉटम प्लेट में जाने से पहले 10 दिन तक विस्तारित किया गया था। दिन 8 BMECs अंकुरण परख के लिए इस्तेमाल किया गया (चित्रित नहीं) । आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी की 6-वेल प्लेट के 2 कुओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर 10% DMSO और 30% एफबीएस के साथ hESFM में एकत्र और संग्रहित किया गया था और फिर -160ओसी पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में। 12 दिन, विस्तारित आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी में टीईईआर मूल्य में एक चोटी देखी गई, जिस पर आईसीसी का प्रदर्शन किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बीएमईसी के लिए आईपीएससी के भेदभाव को दर्शाती ब्राइट-फील्ड छवियां। E6 माध्यम में संस्कृति के एक दिन के बाद, आईपीएससी अपनी विशेषता आकृति विज्ञान बनाए रखते हैं । E6 माध्यम में 4 दिन, सेलुलर आकृति विज्ञान आईपीएससी से अलग दिखाई देता है। 6 दिन, सेलुलर आकृति विज्ञान एक लम्बी और कोबलस्टोन उपस्थिति में बदलता है। 8 दिन तक, कोशिकाएं बड़ी और एक कोबलस्टोन पैटर्न के साथ दिखाई देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी की एंजियोजेनिक क्षमता। शुद्ध आईपीएससी-व्युत्पन्न BMECs (1:200)B27 पूरक और 40ng/mL VEGFA165 के साथ hESFM में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर १००,० सेल/सेमी 2 पर वरीयता प्राप्त किया गया । VEGFA165 उपचार के 3 दिनों के बाद ट्यूब जैसी संरचनाएं दिखाई दीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

शुद्ध आईपीएससी-व्युत्पन्न BMECs (1:200)B27 पूरक और 40ng/mL VEGFA165 के साथ hESFM में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर १००,० सेल/सेमी 2 पर वरीयता प्राप्त किया गया । VEGFA165 उपचार के 3 दिनों के बाद ट्यूब जैसी संरचनाएं दिखाई दीं।

बीएमईसी लक्षण वर्णन सेल-विशिष्ट मार्कर के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके किया गया था। आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी का मूल्यांकन तंग जंक्शन प्रोटीन (ओसीएलएन, टीजेपी1 और सीएलडीएन 5) की उपस्थिति के लिए किया गया था, जो आमतौर पर मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं3 और फेफड़े, यकृत और गुर्दे18में एंडोथेलियल कोशिकाओं के तंग जंक्शनों में व्यक्त किए जाते हैं। PECAM1 और SLC2A1 जैसे अन्य मार्कर, पहले शुद्ध BMECs6के लिए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है । PECAM13 और SLC2A4 दोनों बीबीबी के संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी ने इनमें से सभी पांच मार्कर(चित्रा 4)को सह-व्यक्त किया।

Figure 4
चित्रा 4: आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी का मार्कर विश्लेषण। मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी को टाइट जंक्शन (ओसीएलएन, टीजेपी1, सीएलडीएन5), इनफ्लो ट्रांसपोर्टर (एसएलसी 2ए1), और ओरेन्स जंक्शन (PECAM1) प्रोटीन के लिए दाग दिया गया था। ओसीएलएन, टीजेपी1 और सीएलडीएन5 प्रोटीन मुख्य रूप से कोशिका झिल्ली में स्थानीयकृत हैं। एसएलसी 2ए1 और पेकैम 1 नाभिक और कोशिका झिल्ली दोनों में स्थानीयकृत हैं। होचस्ट 33342 ट्राइहाइड्रोक्लोराइड ट्राइहाइड्रेट का उपयोग परमाणु धुंधला करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

BMECs के BBB समारोह की विशेषता के लिए, TEER उप-संस्कृति के बाद 24 घंटे (दिन 7) मापा गया था और माध्यम को बीडब्ल्यूजीएफ और आरए के बिना पतला (1:200) B27 के साथ एचईएफएम में बदल दिया गया था। TEER माप भेदभाव के 7 दिन (टीईईआर माप के दिन 0) से शुरू होकर प्राप्त किए गए थे और 8 या 48 घंटे बाद 8 या 48 घंटे बाद~2000 Ω एक्स सेमी 2 परनुकीलाथा। ये टीईईआर मूल्य चूहे प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स37के साथ सह-संस्कारी आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी के लिए वर्णित सीमा के भीतर हैं। आईपीएससी लाइन में उनके कम टीईईआर मूल्यों के अनुसार कोई प्रत्यक्ष बीबीबी कार्य नहीं था।

Figure 5
चित्रा 5: आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी में टीईईआर माप। TEER मूल्यों COL4/FN मैट्रिक्स पर उप-culturing के एक दिन के बाद नुकीला (भेदभाव के 8 दिन पर) । टीईआर माप तकनीकी (3 उपाय प्रति अच्छी तरह) और जैविक प्रतिकृति (सेल लाइन प्रति 3 कुओं) में प्राप्त किए गए थे। एक खाली अच्छी तरह से तकनीकी औसत मूल्य कच्चे TEER मूल्यों से घटाया गया था । इन मूल्यों को प्रत्येक दिन के लिए औसत दिया गया था और 1.12 सेमी2 (12-ट्रांसवेल डालने का सतह क्षेत्र) से गुणा किया गया था। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ABCB1 और ABCC1 efflux ट्रांसपोर्टर गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए, ABCB1 और ABCC1 के लिए उठाए गए फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट की मात्रा उनके संबंधित अवरोधकों के साथ इनक्यूबेशन के बाद निर्धारित की गई थी । जैसा कि उम्मीद थी, पीएससी 833 (एबीसीबी 1 अवरोधक) या एमके-571 (एबीसीसी 1 अवरोधक) के साथ एबीसीबी 1 और एबीसीसी 1 एफ्लक्स ट्रांसपोर्टरों के अवरोध के कारण रोडामाइन 123 (R123) या 2',7'-dichlorodihydrofluorescein डायसेटेट (H2DCFDA) में वृद्धि हुई, क्रमशः(चित्रा 6)। इस साक्ष्य से पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त बीएमईसी में एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर गतिविधि है।

Figure 6
चित्रा 6: आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी में एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर गतिविधि। बीएमईसी में एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर गतिविधि रोडामाइन 123 (आर 123) या 2',7'-डाइक्लोरोडीहिड्रोफोरफोरोफोरेसिन डायसेटेट (एच2डीसीएफडीए) के संचय को निर्धारित करके निर्धारित की गई थी। PSC833 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में (एटीपी बाध्यकारी कैसेट सबफैपरी बी सदस्य 1 (एबीसीबी 1) अवरोधक) या एमके-571 (एटीपी बाध्यकारी कैसेट सबफैमिली सी सदस्य 1 (एबीसीसी 1) अवरोधक)। प्रत्येक स्थिति (एन = 1) के लिए तकनीकी ट्रिप्लिकेट किए गए थे। नियंत्रण स्थिति (यानी अवरोधकों के बिना) से फ्लोरेसेंस मूल्यों को कच्चे फ्लोरेसेंस मूल्यों से काट लिया गया था। इन फ्लोरेसेंस संचय को प्रत्येक तकनीकी दोहराने के लिए प्रति-सेल आधार पर सामान्यीकृत किया गया था। सांख्यिकीय महत्व तीन तकनीकी प्रतिकृति से छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । ABCB1 अवरोधक (टी-स्टेट = -1.66, पी = 0.11) के साथ और उसके बिना R123 के संचय के बीच कोई सांख्यिकीय महत्व नहीं देखा गया था। ABCC1 अवरोधक (टी-स्टेट =-7.23, पी = 0.04) के साथ और उसके बिना H2DCFDA के संचय के बीच सांख्यिकीय महत्व देखा गया था। * पी एंड एलटी;0.05। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पासेजिंग, विस्तार और क्रायोप्रिजर्विजिंग आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी
एक अन्य उद्देश्य यह जांच करना था कि क्या आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी को उप-संस्कृति के बाद पारित किया जा सकता है और क्रायोप्रेण किया जा सकता है । इस उद्देश्य के लिए, दिन 7 आईपीएससी-व्युत्पन्न BMECs को 10 दिन तक विस्तार करने की अनुमति दी गई थी, जो उन्हें टीईआर माप के लिए नए लेपित COL4/FN 12-transwell फ़िल्टर प्लेटों और आईसीसी विश्लेषण के लिए 24-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट(चित्रा 7)पर पास करने से पहले । इस शर्त का उपयोग करते हुए आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी ने आगे बढ़ना जारी रखा, ओसीएलएन, टीजेपी 1, सीएलडीएन 5, एससीएल 2ए1 और पेकैम 1(चित्रा 8)की अभिव्यक्ति को बनाए रखा और पासिंग(चित्रा 9)के बाद उचित टीईईआर मूल्यों (~ 2000 Ω एक्स सेमी2पर पीक) को बनाए रखना जारी रखा। क्रायोप्रिमीयरव्ड बीएमईसी को बाद में गल, विस्तारित किया गया, और फिर पारित(चित्रा 7)। बीएमईसी के टीईईआर माप विगलन के 24 घंटे बाद और उसके बाद कई दिन प्राप्त किए गए थे। हौसले से व्युत्पन्न बीएमईसी की तुलना में इन पोस्ट-गल वाले बीएमईसी के टीयर माप (केवल 800 Ω एक्स सेमी2)पर बढ़ता जा रहा था। पोस्ट गल BMECs की एक दूसरी पासेजिंग भी कम TEER मूल्यों का प्रदर्शन (केवल 200-300 Ω एक्स सेमी2)(चित्रा 9)पर बढ़ता जा रहा है और अस्तव्यस्त और/या तंग जंक्शनगठन (चित्रा 10)के पैटर्न झालरदार दिखाया । पश्चिमी दाग विश्लेषण48 से पता चला है कि आईपीएससी ने मुख्य रूप से एक एंडोडर्मल मार्कर (SOX17)49 और कुछ तंग जंक्शन मार्कर (ओसीएलएन) व्यक्त किए, लेकिन अन्य बीएमईसी से संबंधित मार्कर (टीजेपी 1, सीएलडीएन 5, और एसएलसी 2ए1)(चित्रा 11)नहीं। बीएमईसी ने मुख्य रूप से एंडोथेलियल संबंधित मार्कर (टीजेपी 1, सीएलडीएन5, ओसीएलएन और एसएलसी 2ए1) व्यक्त किए, जिसमें एंडोडर्मल मार्कर, SOX17 के निम्न स्तर थे।

Figure 7
चित्रा 7: विस्तारित और क्रायोप्रीयरेक्ट किए गए आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी की उज्ज्वल फील्ड छवियां। ए) दिन 10 (प्रारंभिक उप संस्कृति के बाद 4 दिन) कोशिकाओं अधिकतम मांग तक पहुंच गया । ख) दिन 11, 24 घंटे COL4/FN पर पासिंग के बाद 24 कुओं की थाली लेपित । ग) Day12, COL4/FN पर पासिंग के बाद ४८ घंटे 24 कुओं की थाली लेपित; पीक टीईआर मूल्यों को देखा गया और आईसीसी का प्रदर्शन किया गया । घ) ४८ घंटे के बाद गल आईपीएससी-COL4/FN लेपित 6-कुओं की थाली पर बीएमईसी व्युत्पन्न; कोशिकाओं को पहले १.२ x 102 कोशिकाओं/एमएल पर क्रायोप्रेस किया गया था । ई) 24 घंटे बाद गल आईपीएससी-व्युत्पन्न BMECs COL4/FN लेपित 6-कुओं की थाली पर पारित किया गया । एफ) ४८ घंटे बाद गल गया आईपीएससी-व्युत्पन्न BMECs पारित किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: पासेजिंग के बाद आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी की आईसीसी । BMECs पारित किया गया और 12 दिन तक COL4/FN मैट्रिक्स पर बनाए रखा, जब TEER मूल्यों नुकीला । 12 दिन पर BMECs तंग जंक्शन (OCLN, TJP1, CLDN5), बाढ़ ट्रांसपोर्टर (SLC2A1) और पालन जंक्शन (PECAM1) प्रोटीन के लिए दाग थे । अभिव्यक्ति पैटर्न और स्थानीयकरण उन परिस्थितियों में मनाया जाता है जहां पासेजिंग नहीं किया गया था, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: आईपीएससी में टीईआर मापों की तुलना करना, गैर-मार्ग वाले बीएमईसी, पारित बीएमईसी, क्रायोप्रीवित बीएमईसी, और क्रायोप्रेयर्ड और पास किए गए बीएमईसी। 1 दिन, टीईईआर मूल्यों को गैर-मार्ग और पारित बीएमईसी के लिए नुकीला किया गया, लेकिन आईपीएससी या क्रायोप्रीवित बीएमईसी नहीं। क्रायोप्रीवित बीएमईसी में 3 और 7 दिन के बीच मध्यम टीईआर मूल्य थे, जिसमें क्रायोप्रेयर और पैसेज वाले बीएमईसी के लिए भी कम टीईईआर मूल्य थे। आईपीएससी ने 0 और 9 दिन के बीच किसी भी औसत दर्जे का टीईईआर मूल्यों का प्रदर्शन नहीं किया। टीईआर माप तकनीकी (3 माप प्रति अच्छी तरह) और जैविक प्रतिकृति (3 प्रति सेल लाइन) में प्राप्त किए गए थे। एक खाली कुएं से तकनीकी औसत मूल्य कच्चे टीईईआर मूल्यों से घटाया गया था। इन मूल्यों को प्रत्येक दिन के लिए औसत दिया गया था और 1.12 सेमी2 (12-ट्रांसवेल डालने का सतह क्षेत्र) से गुणा किया गया था। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: क्रायोप्रेयरेय और पास किए गए बीएमईसी का आईसीसी। जब तक पीक टीईईआर मूल्यों को देखा जाता था तब तक बीएमईसी को कोल4/एफएन पर पारित और बनाए रखा गया था। बीएमईसी तंग जंक्शन (OCLN, TJP1, CLDN5), बाढ़ ट्रांसपोर्टर (SLC2A1) और पालन जंक्शन (PECAM1) प्रोटीन के लिए दाग थे । तंग जंक्शन मार्कर की अभिव्यक्ति पैटर्न अस्तव्यस्त और/या जब गैर-मार्ग BMECs(चित्रा 4)और पारित BMECs(चित्रा 8)की तुलना में झालरदार दिखाई दिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11: आईपीएससी का पश्चिमी दाग विश्लेषण, गैर-मार्ग वाले बीएमईसी, पारित बीएमईसी, और क्रायोप्रीवित और पारित बीएमईसी। पश्चिमी धब्बे TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5, और लोडिंग नियंत्रण (GAPDH) के स्तर दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

संशोधन और समस्या निवारण

इस प्रोटोकॉल में, हमने बीएमईसी(चित्रा 1)के व्युत्पन्न के लिए आईपीएससी संस्कृति के दौरान आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स और सेल कल्चर मीडिया का उपयोग करने में कुछ संशोधन किए। इन परिवर्तनों से लिपमैन प्रोटोकॉल1में वर्णित मानव आईपीएससी से बीएमईसी प्राप्त करने की क्षमता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा . एक अलग स्वस्थ दाता से एक आईपीएससी लाइन का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया था कि यह संशोधित प्रोटोकॉल अन्य पंक्तियों के साथ पिछले अध्ययनों के बराबर परिणाम दिखाता है1। क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, बी 27 पूरक का उपयोग 1% प्लेटलेट खराब प्लाज्मा-व्युत्पन्न सीरम (पीडीएस)40के बदले किया गया था, लेकिन बाद में इसने बीएमईसी निष्ठा को प्रभावित किया। समस्या निवारण के संबंध में, टीईईआर मूल्यों को स्थिर करने से पहले तेजी से उतार-चढ़ाव हो सकता है। इस उतार - चढ़ाव के परिणामस्वरूप तापमान में परिवर्तन हो सकता है जब प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस से कमरे का तापमान37तक ले जाया जाता है । इस मुद्दे को दूर करने के लिए, माप तेजी से, कुशलता से, और लगातार लिया जाना चाहिए । यदि आवश्यक हो, तो तापमान को सही तेयर मूल्यों को प्राप्तकरने के लिए ब्लूम एट अल द्वारा प्रदान किए गए गणितीय सूत्र का उपयोग करके तापमान प्रभाव को प्रभावित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएं

एक मजबूत बीबीबी फेनोटाइप (यानी उच्च टीईईआर मूल्य) के साथ बीएमईसी प्राप्त करने के बावजूद, इस बीबीबी संपत्ति को विस्तारित अवधि के लिए बनाए रखना एक बड़ी चुनौती बनी हुई है। जैसा कि यहां दिखाया गया है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पीक टीईईआर मूल्य (~ 2000 Ω एक्स सेमी2)पहले की रिपोर्ट किए गए पीक टीईईआर मूल्यों (~ 8000 Ω एक्स सेमी2)1की तुलना में बहुत कम थे। इस अवलोकन के बावजूद, टीईईआर मूल्य सामान्य सीमा (2000-8000 Ω एक्स सेमी2)के भीतर गिर गए, जो पहले से सूचितमूल्यों 1के थे। एक दूसरी सीमा पीक टीईईआर मूल्यों में परिवर्तनशीलता है जो विभिन्न आईपीएससी लाइनों का उपयोग करती है, जिसे इस प्रोटोकॉल36के अन्य संस्करणों में देखा गया है। विभिन्न सेल लाइनों के बीच भिन्नता प्रत्येक आईपीएससी लाइन की वृद्धि और विस्तार दर के कारण हो सकती है, जो पर्यावरणीय कारकोंसेप्रभावित होती है। एक और सीमा क्रायोप्रिजर्वेशन से संबंधित है, क्योंकि हमारे प्रोटोकॉल ने बीएमईसी निष्ठा को बनाए नहीं रखा था। यह संभव है कि 1% पीडीएस40 क्रायोप्रिजर्वेशन के दौरान बीएमईसी की अधिक स्थिरता प्रदान करता है।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व

आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी उन कोशिकाओं को प्रदान करता है जिनकी आनुवंशिक पृष्ठभूमि विशिष्ट व्यक्तियों की है, जो रोग जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करने में मूल्यवान है। अन्य पशुओं से निकाले गए पशु मॉडल या प्राथमिक बीएमईसी संस्कृतियों का उपयोग करतेसमयऐसा नहीं है । इसके अलावा, इन विट्रो प्राइमरी बीएमईसी संस्कृतियां कम टीईईआर मूल्यों (~ 100 Ω एक्स सेमी237)दिखाती हैं, जो मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी के साथ यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त की गई तुलना में बहुत कम है। यह संशोधित प्रोटोकॉल आईपीएससी से मानव बीएमईसी प्राप्त करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है, जिसमें उन्हें लंबे समय तक उपयोग के लिए विस्तार और बनाए रखने की क्षमता है। विभेदित बीएमईसी को पारित करने और स्टोर करने की क्षमता प्रयोगात्मक डिजाइन में बहुमुखी प्रतिभा और लचीलापन प्रदान कर सकती है, खासकर जब एक बार में कई सेल लाइनों का अध्ययन किया जाता है। इन परिणामों के आधार पर, प्रारंभिक उप-संस्कृति कदम(चित्र 7, चित्रा 8और चित्रा 9)के बाद आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी का विस्तार और मार्ग किया जा सकता है, लेकिन क्रायोप्रिजर्वेशन को आगे की जांच की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड के संवहनी जैसे अभिनव दृष्टिकोण विकसित करने के लिए अन्य स्टेम सेल आधारित सेलुलर मॉडलों के साथ भी किया जा सकता है। मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के वर्तमान तरीकों के परिणामस्वरूप मानव मस्तिष्क के कोशिका प्रकारों का अधूरा पुनर्गठन होता है क्योंकि उनमें एंडोथेलियल कोशिकाओं और न्यूरोवैस्कुलर इकाई के महत्वपूर्ण तत्वों की कमी होती है जिसमें बीबीबी52,53शामिल हैं । यहां वर्णित प्रोटोकॉल दो आयामी ट्रांसवेल/सह-संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करके एक पथीय और प्रजनन योग्य दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है जो 3डी मॉडल की तुलना में कम खर्चीला और लागू करना आसान है ।

इस प्रोटोकॉल के भविष्य के आवेदन

इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक प्रकार का पागलपन और द्विध्रुवी विकार जैसे न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों में न्यूरोवेस्कुलेचर और बीबीबी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जहां न्यूरोवैस्कुलेचर में घाटेको9, 10,20,54,55की भूमिका निभाने के लिए परिकल्पना की गई है। इस प्रोटोकॉल36 के पिछले संस्करणों का उपयोग हंटिंगटन रोग7 और 22q विलोपन सिंड्रोम रोगियों के साथ एक प्रकार का पागलपन43के साथ रोगियों की आईपीएससी लाइनों से बीएमईसी प्राप्त करने के लिए किया गया था। दोनोंअध्ययनों नेबीबीबी से संबंधित पैरासेलुलर और/या ट्रांससेलुलर कार्य की जांच करने के लिए इस विधि के सफल उपयोग काप्रदर्शन किया । पूर्व प्रोटोकॉल1में पशु सीरम के संभावित भ्रामक प्रभावों के बारे में कुछ चिंताएं व्यक्त की गई हैं । यहां उपयोग किया जाने वाला सीरम-मुक्त प्रोटोकॉल बीएमईसी प्राप्त करने के लिए पूर्व प्रोटोकॉल के समान परिणाम देते हुए इस चिंता को हटा देता है।

बीएमईसी में अंतर और विस्तार के लिए महत्वपूर्ण कदम

इस प्रोटोकॉल को लागू करते समय चार महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले, कुशल बीएमईसी भेदभाव के लिए इष्टतम घनत्व (यानी, ~ 15,600 कोशिकाओं/सेमी2)पर सीडिंग आईपीएससी का सीडिंग महत्वपूर्ण है। यदि कोशिका घनत्व भेदभाव के दिन 4 से बहुत अधिक या बहुत कम है, तो संस्कृतियों में सेलुलर विषमता56की अधिक दरें प्रदर्शित हो सकती हैं। एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम 1 और दिन 4 के बीच भेदभाव का शामिल होना है, जहां भेदभाव शुरू करने के लिए E6 माध्यम का उपयोग किया जाता है । ई 6 का उपयोग "अनकंडीशनल माध्यम" के स्थान पर किया जाता है जिसका उपयोग पूर्व प्रोटोकॉल6,35में किया जाता था। न केवल E6 मध्यम 13 दिनों से 8 दिनों के लिए भेदभाव समय में कटौती करता है, लेकिन यह भी तंग जंक्शन प्रोटीन (TJP1, OCLN, CLDN5) और बीएमईसी मार्कर (PECAM1 और SLC2A1)३६की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है । ई6 माध्यम के उपयोग के परिणामस्वरूप उचित टीईईआर मूल्य (चित्र 5) और एबीसीबी 1 और एबीसीसी 1 एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर गतिविधि(चित्र 6)6,35. तीसरा, सीरम मुक्त स्थिति के लिए अनुमति दी गोजातीय सीरम के बदले B27 का उपयोग, जो बीएमईसी भेदभाव1की स्थिरता और विश्वसनीयता में सुधार हुआ । अंत में, आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी के विस्तार के संदर्भ में, कोशिकाओं को ~ 100% की मंजूरी तक पहुंचने पर पारित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल के आधार पर, प्रारंभिक उप-संस्कृति चरण(चित्र 7, चित्रा 8और चित्रा 9)के बाद आईपीएससी-व्युत्पन्न बीएमईसी को और विस्तारित और पारित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को अभिनव नए वैज्ञानिकों (दिमाग) पुरस्कार R01MH113858 (आरके को), एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य पुरस्कार KL2 TR0002542 (PL) के लिए एक राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य जैव व्यवहार अनुसंधान पुरस्कार के एक राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । एक राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य नैदानिक वैज्ञानिक विकास पुरस्कार K08MH086846 (आरके के लिए), एक सिडनी आर Baer जूनियर फाउंडेशन अनुदान (पी एल) डोरिस ड्यूक चैरिटेबल फाउंडेशन नैदानिक वैज्ञानिक विकास पुरस्कार (आरके के लिए), रयान Licht गाया द्विध्रुवी फाउंडेशन (आरके के लिए), फिलिस & जेरोम Lyle Rappaport फाउंडेशन (आरके के लिए), हार्वर्ड स्टेम सेल संस्थान (आरके के लिए) और स्टीव Willis और एलिसा फ्रायड (आरके के लिए) द्वारा । हम डॉ एनी कथूरिया को पांडुलिपि पर उनके महत्वपूर्ण पठन और प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

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तंत्रिका विज्ञान अंक 165 मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं रक्त मस्तिष्क बाधा ट्रांस एंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध ट्रांसपोर्टर गतिविधि माइक्रोवैस्कुलर सिजोफ्रेनिया द्विध्रुवी विकार पासेजिंग विस्तार क्रायोप्रेरिजर्वेशन
मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं का व्युत्पन्न, विस्तार, क्रायोप्रिजर्वेशन और लक्षण वर्णन
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