Summary
该协议详细介绍了一种经过调整的方法，用于提取、扩展和冷冻保存通过区分人类诱导的多能干细胞而获得的大脑微血管内皮细胞，并研究 前体内 的血脑屏障特性。
Abstract
脑微血管内皮细胞（BMECs）可以与人类诱导的多能干细胞（iPSCs）分化，以开发用于研究血脑屏障（BBB）功能 的前体内 细胞模型。此修改的协议提供了详细步骤，使用与先前协议中报告的不同供体和试剂从人类 iPSC 中提取、扩展和低温保存 BMEC。iPSC用必需的6种介质治疗4天，然后用2天人类无内皮血清培养基补充基本成纤维细胞生长因子、视网膜酸和B27补充剂。在第6天，细胞被分培养到胶原蛋白/纤维素基质上2天。免疫细胞化学在第8天进行，使用CLDN5、OCLN、TJP1、PECAM1和SLC2A1进行BMEC标记分析。执行西方印迹以确认 BMEC 标记表达，以及缺少 SOX17，这是一种内皮标记。血管生成潜力通过发芽检测进行证明。从第 7 天开始使用筷子电极和伏托姆计测量跨内皮电阻 （TEER）。ATP 绑定盒式子家庭 B 成员 1 和 ATP 绑定盒式子家庭 C 成员 1 的 Efflux 运输器活动在第 8 天使用多板读取器进行测量。BMEC 的成功衍生通过相关细胞标记的存在、SOX17 的低水平、血管生成潜力、运输器活性和 TEER 值 ~2000 Ω x cm2来证实。BMEC 被扩展至第 10 天，然后传递到新涂层的胶原蛋白/纤维素板或低温保存。该协议表明，iPSC 衍生的 BMEC 至少可以扩展和通过一次。然而，在低温保存后，观察到低TEER值较低，BMEC标记的本地化较差。BMEC可用于与其他细胞类型（神经元、胶质、心室）的共培养实验， 用于三维大脑模型（器官芯片和水凝胶），用于脑器官的血管化，以及神经精神病中的BBB功能障碍研究。
Introduction
血脑屏障功能
血脑屏障（BBB）形成了一个边界，限制物质从血液向大脑的移动。BBB由大脑微血管内皮细胞（BMECs）组成，形成血管内单层。BMEC与星形细胞、神经元、近层细胞、微胶质和细胞外基质一起形成神经血管单元。BMEC具有一个严格监管的半细胞结构，允许BBB保持高跨内皮电阻（TEER），这限制了被动扩散，并作为屏障完整性的指标1，2。BMEC还含有蛋白质，有助于细胞外运动，如内分泌、转细胞增多症和移位，以及白细胞在免疫反应3期间的外流。BMEC依靠流入和排泄运输机来滋养和清除废物，以维持大脑的平衡。例如， 溶质载体家庭 2 成员 1 （SLC2A1） 是负责葡萄糖在 BBB4中移动的涌入运输机，而 EFFLUX 运输器（如 ATP 绑定盒式子家庭 B 成员 1 （ABCB1） 和 ATP 绑定盒式子家庭 C 成员 1 （ABCC1） 负责将基板返回血流 3、5、6、7。ABCB1基质包括吗啡、紫杉醇4和抗精神病药，如奥兰沙平和利司酮8，而ABCC1运输机有各种基质，包括硫酸盐结合体、葡萄糖氨酸和葡萄糖苷结合物4。
BBB模型在精神疾病中的应用
BBB功能障碍已牵连到一些神经和精神疾病，包括精神分裂症和双相情感障碍9，10。最近，iPSC衍生的外体细胞模型被用来询问精神疾病的细胞和分子基础，但这些模型目前没有考虑到神经血管11，12，13所发挥的潜在作用。据推测，血液中循环的外周炎症细胞因子会对BBB14、15、16、17产生不利影响，但也有证据表明，准细胞18、19、20、21、22、转细胞23、24、25、26、27、28、29和细胞外矩阵20、29、30、31、32异常导致BBB功能障碍。BBB的破坏可能导致血液进入脑膜瘤和激活星形细胞和/或微胶质释放前炎细胞因子，这反过来启动炎症反应33，可以对大脑34产生有害影响。BMEC 是 BBB 的主要成分，检查这些细胞的结构和功能可以增进对神经和精神疾病中 BBB 功能障碍的理解。
替代 BMEC 型号
在制定从 iPSC1 、6 、35、36中推导 BMEC 的有效协议之前，研究人员曾使用不朽的 BMEC37来研究 BBB 功能。然而，许多这些模型未能达到理想的BBB表型，这种生理范围的TER值38，39。利用iPSC具有保留细胞从中提取个体的遗传背景的优点。科学家们正在积极研究建立iPSC衍生的外生微环境模型，这些模型可以重述人脑的结构和功能。研究人员已经开发出一些方法来推导结构和生理上与体内发现的BMEC相似的生物元。获得iPSC衍生BMEC纯化种群的方法需要采取一些不同的步骤，在过去几年中优化了协议1、6、35、36。一般来说，iPSC衍生的 BMECs 在基本 6 （E6） 介质中培养 4 天，然后在人类无皮血清介质 （hESFM） 中培养 2 天，辅以基本的成纤维细胞生长因子 （bFGF）、转氨酸 （RA） 和 B27 补充剂。然后，这些细胞在胶原蛋白 IV （COL4） 和纤维素 （FN） 基质上培养，以获得 + 90% 均匀的 BMECs1。
BMEC的身份通过免疫荧光得到确认，显示BMEC蛋白的共同表达，包括血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM1）、SLC2A1和紧密结蛋白，如紧密结蛋白1（TJP1）、奥克鲁丁（OCLN）和克劳丁-5（CLDN5）6。发芽检测已用于确认 iPSC 衍生 BMEC 的血管生成潜力。6 BMEC 的 BBB 完整性由体外TEER 值 （+2000Ω x cm2）37的存在和 ABCB1 和 ABCC11、6、36等流体运输机的可测量活性进行评估。利普曼小组最近的方法进展导致iPSC衍生的BMEC协议，减少了实验变异性和增强了可重复性1。然而，不知道它们是否可以扩展到和通过超越子培养阶段。我们修改后的协议旨在通过第 8 天之后通过 iPSC 衍生的 BMEC 并评估它们是否可以进一步扩大以保留低温保存后的 BBB 属性来解决这个问题。虽然没有研究描述iPSC衍生的BMEC的传递，但BMEC冷冻保存存在一个协议，该协议在经历冻结-结冰周期40后保留生理BBB特性。但是，尚不清楚低温后保存 BMEC 是否可以通过并保留 BBB 属性。
利用利普曼协议从iPSC中提取的BMEC已被用于模拟BBB在神经紊乱中的紊乱，如亨廷顿舞蹈症7。这些由 iPSC 衍生的 BMEC 也被用来研究细菌感染的影响，如奈塞里亚脑膜炎或B 组链球菌对血液-CSF 屏障和 BBB 的破坏分别41，42。此外，研究人员利用来自22q删除综合征精神分裂症患者的iPSC衍生的BMECs，观察到细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的增加，这是BMEC中一种主要的粘附分子，有助于白细胞进入大脑43。综合起来，这些研究表明，iPSC衍生的BMECs对于研究复杂神经精神病的BBB干扰有用。
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Protocol
人类iPSC是根据马萨诸塞州总医院和麦克莱恩医院机构审查委员会批准的协议从健康捐赠者的成纤维细胞中重新编程的，其特征在先前的研究中被描述为44、45、46。
注：简言之，成纤维细胞通过基于mRNA的基因再编程47重新编程到iPSC。iPSC 保存在干细胞介质 （SCM） （见材料列表）中，并储存在 ±1.2 x 102 细胞/mL 的密度中，具有 1 mL 的 SCM， 10 μM 与 rho 相关的蛋白激酶抑制剂 （ROCKi） Y-27632 和 10% （v/v） 二甲基硫化物 （DMSO）， 在低温小瓶液氮在 -160 °C. 除非另有说明，否则以下所有程序均在生物安全柜中执行。
1. 地下室膜矩阵稀释和板涂层
- 稀释 （1：50） 生长因子减少地下室膜基质纯化从恩格尔布雷斯 - 霍尔姆 - 温暖肿瘤在杜尔贝科的改性鹰介质 （DMEM） 没有酚红色。
- 涂层细胞培养板与适当数量的稀释地下室膜矩阵（即6井板=1mL，12井板=0.5 mL），并在37°C孵育这些板至少1小时。
2. iPSC 维护
注：6井平底板中每口井的最大汇合量为~1.2 x 106 单元。
- 用 10 μM Y-27632 将冷冻保存的 iPSC 解冻到 SCM 中，并将板板涂在涂有稀释生长因子的 6 井板上，减少地下室膜矩阵。
- 解冻后的前 24 小时内，在 SCM 中以 10 μM Y-27632 维护 iPSC。24小时后切换到新鲜介质。
- 在 SCM 中保持 iPSC，直到细胞在通过之前达到 80-90% 的汇合度。
- 通过将期望的分化密度乘以井的表面积（15，600 个单元/cm2），计算分化所需的 iPSC 数量。对于 6 井平底板，将 15，600 个单元/厘米2 乘以 9.6 厘米2， 共 149，760 个单元/井。
- 要通过，用汉克斯的平衡盐溶液（HBBS）清洗细胞。然后，在37°C下用非酶乙烯二胺酯酸（EDTA）（见材料列表）孵育细胞5分钟。
- 使用细胞刮刀轻轻地从细胞上抬起来。收集新鲜 SCM 中的细胞。
- 将细胞板涂在涂有稀释的 SCM 的细胞培养板上，并保持步骤 2.3 中描述的细胞，或将其存储在 +1.2 x 106 细胞/mL 中，在 1 mL 的 SCM 中，10 μM Y-27632 和 10% DMSO （v/v） 在 -160 °C 的低温小瓶中储存在液氮中。
3. iPSC 与 BMEC 的区分
注：非酶EDTA将细胞分离成团块。酶EDTA（见 材料表）将细胞分离成单细胞悬浮。视网膜酸（RA）应受到保护，免受光线照射。
- 用杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐 （DPBS） 清洗 iPSC 一次。用酶EDTA孵化（6井板1 mL，12井板0.5 mL，24井板0.25mL）约5分钟，在37°C产生单细胞悬架。
- 在室温下以300 x g（相对离心力）收集细胞和离心机5分钟。SCM 中含有 10μM Y-27632 的重新悬念细胞颗粒。
- 使用 Trypan Blue 和自动细胞计数器或血细胞计设备确定细胞密度。SCM 中密度为 15，600 细胞/cm2 或 149，760 细胞/井的 6 井平底板（表面积为 9.6 厘米2/井），24 小时含有 10 μM Y-27632。
- 通过将 SCM 更改为 E6 介质，在 24 小时后开始分化。在接下来的4天里每天更换E6介质。
- 在分化的第 4 天，用稀释 （1：200） B27 补充剂、20 ng/mL bFGF 和 10 μM RA 补充的 hESFM 取代 E6 介质。在接下来的 48 小时内，不要更改此介质。
- 准备 200 mL 的 hESFM 与稀释 （1：200） B27， 混合 1 mL 的 50 倍浓缩 B27 补充到 199 mL 的 hESFM.
- 通过在 250μL 的特里斯缓冲区（5 mM 特里斯、pH 7.6、150 mM NaCl） 中重组 50 μg bFGF，准备 20 ng/mL 的 bFGF，以制作 200μg/mL 库存解决方案。通过将 200μg/mL bFGF 的 20 μL 与 200 mL 的 hESFM 混合，准备 200 mL 的 hESFM，包含 20 ng/mL bFGF。
- 通过将 2.5 mL 的 DMSO 添加到 100 毫克 RA 粉末中，首先制作 40 毫克/mL 的 RA 库存解决方案，从而准备 10 μM RA。将此浓度稀释为 3 毫克/mL，以制作 10 mM 库存解决方案。通过在 200 mL hESFM 中混合 200μL 的 10μM RA，准备 200 mL 包含 10 μM RA 的 hESFM。
4. 涂层胶原蛋白 IV （COL4） 和纤维素 （FN） 矩阵，用于净化 iPSC 衍生的 BMEC
- 将 2 毫升无菌水添加到 2 毫克 FN 中，使 1 毫克/mL FN 库存溶液。将 5 mL 的无菌水添加到 5 毫克 COL4 中，以制作 1 毫克/mL COL4 库存溶液。
- 允许 FN 在 37 °C 下溶解至少 30 分钟，并在室温下溶解 COL4。
- 将无菌水中的 FN 库存溶液稀释至最终浓度为 100μg/mL 和 COL4 库存溶液，最终浓度为 400μg/mL。
- 涂上所需的板材（6 井板 = 1 mL 的 COL4/FN 溶液，12 井板 = 0.5 mL，24 井板 = 0.25 mL，以及 12 变井过滤板 = 0.25 mL），混合物为 400 gμ/mL COL4 和 100 μ/mL FN。
- 在37°C下孵化板至少2小时或过夜;对于透水井过滤板，建议至少4小时。
5. iPSC 衍生 BMEC 的亚培养和净化
注：根据分化第6天细胞的结合情况，用酶EDTA孵化可能需要超过15分钟的时间。
- 在分化的第6天，用DPBS清洗电池两次。在37°C下用1mL的酶EDTA孵育至少15分钟，直到获得单个细胞悬浮。
- 在室温下，在300 x g下通过离心收集细胞5分钟。用稀释 （1：200） B27 补充剂、20 ng/mL bFGF 和 10 μM RA 重新悬生细胞颗粒。
- 种子细胞涂在400μg/mL COL4和100μg/mL FN的混合物板上。种子细胞使用1口6井板与3口12井板、3口12井过滤板或6口24井板的油井的比例。
- 种子无差别 iPSC 从同一细胞线到 COL4/FN 涂层 12 跨井过滤板作为 TEER 分析的负控制。
- 经过24小时的分培养后，仅用B27补充剂将介质改为hESFM。在此步骤之后，无需进行介质更改。
6. 发芽检测
- 收集第 8 天 iPSC 衍生的 BMEC，并在 100，000 个细胞/井上播种到 24 口平底板上，新涂有 200 μL/cm2 的地下室膜矩阵。
- 用稀释 （1：200） B27 和 40 ng/mL 血管内皮生长因子 A （VEGFA165） 治疗这些细胞。
- 每24小时观察一次细胞，每两天更换一次介质。
7. 免疫细胞化学（ICC）
注：ICC在24口井平底板上进行。
- 经过48小时的分培养（第8天），用DPBS洗两次电池。用4%的甲醛（PFA）修复细胞20分钟。
- 用 DPBS 清洗电池三次，每次洗涤 5 分钟。在 DPBS 的室温下用 5% 驴血清和 0.3% 三顿 X-100 （v/v） 预块细胞 1 小时。
- 与主要抗体孵化：小鼠抗人类PECAM1（1：100，库存0.5毫克/mL），兔子抗人-TJP1（1：200，库存0.53毫克/mL），小鼠抗人-CLDN5（1：200， 库存 0.5 毫克/毫升），小鼠反人-OCLN （1：200， 库存 0.5 毫克/毫升）， 和兔子反人-SLC2A1 （1：100， 库存 0.2 毫克/毫升） 在 DPBS 含有 5% 驴血清过夜在 4°C.
- 用 DPBS 冲洗一次细胞，然后每次用 DPBS 洗 5 次 5 分钟。
- 培养具有二次抗体的细胞：驴抗兔亚历克萨氟555（1：200）和驴抗鼠488（1：200）在DPBS中含有5%的驴血清1小时。
- 孵化后，在 DPBS 中加入 Hoechst 33342 三氢三氢稀释 （1：1000）， 10 分钟。
- 取出 Hoechst 33342 溶液，用 DPBS 冲洗一次，每次用 DPBS 清洗 4 次，每次洗涤 5 分钟。
- 在荧光显微镜上可视化细胞，以寻找细胞制造商的表达和定位。
8. TEER 测量和分析
注：康宁12-Transwell过滤板配有由1.12厘米2 聚乙烯四甲酸酯膜和0.4微米孔隙组成的过滤器。TEER 测量是在技术（每口井 3 口）和生物复制（每细胞系 3 口井和/或条件）中获得的。
- 分培养后24小时（第7天），每24小时使用筷子电极和伏托毫米测量TEER。有关获取测量的具体说明，请参阅伏地仪用户手册。
- 要测量 TEER，请在前一天晚上为伏托姆仪充电。将仪器和筷子电极用 70% 乙醇轻轻擦拭，然后放入安全罩中。
- 按制造商的建议打开电源并校准欧米。
- 插入筷子电极，用 70% 的乙醇冲洗电极，然后是 DPBS。
- 将较短的末端电极放入跨井插入（顶点腔室），将较长的端放置到基底室中。
- 首先测量仅涂有 COL4/FN 的空白井。然后测量其他油井。
- 在测量不同条件（即测量不同的细胞系）时，用 70% 的乙醇快速冲洗筷子电极，然后是 DPBS。
- 在记录了所有测量（Ω）后，用70%的乙醇冲洗筷子电极，然后用无菌水冲洗。轻轻擦拭电极，使其在安全罩中晾干。
- 平均从空白井中将 TEER 值（Ω）三倍，并按条件从每个原始 TEER 值中减去此平均值。
- 平均减去值并乘以 1.12 厘米2（12 转井插入的表面积）。
- 使用从第 6 步转换的值来生成显示 TEER 值和 TEER 测量日标准误差的图形。
9. Efflux 运输机活动和分析
注：Efflux 运输器活动检测在 24 井平底板上执行。感兴趣的埃夫勒克斯运输商包括 ABCB1 和 ABCC1。建议每个条件应与控制井（即没有相应抑制剂的空白井）一起进行三重处理。
- 经过48小时的亚培养（第8天），在37°C下用10μM Valspodar（ABCB1抑制剂）或10μM MK571（ABCC1抑制剂）孵育细胞1小时。
- 通过在 DMSO 的 412 μL 中溶解 5 毫克粉末（1214.64 克/摩尔），并稀释到 10 μM 的工作浓度，准备 10 mM Valspodar 库存。例如，要使 10 mL 的 hESFM 与 10 μM 瓦尔斯波达尔，混合 10 μL 的 10 mm 瓦尔斯波达尔股票与 10 mL 的 hESFM。
- 通过在 931 μL 中溶解 5 毫克粉末（537.07 克/摩尔）并稀释到 10 μM 的工作浓度，准备 10 mm MK571 库存。例如，要使 10 mL 的 hESFM 与 10 μM MK571 混合 10 μL 的 10 mm MK571 股票与 10 mL 的 hESFM。
- 1小时后，用10微米罗达明123（ABCB1基板）或10 μM 2'，7'-二氯二氢氟二甲酸酯（H2DCFDA，ABCC1基板）孵育细胞，在37°C时，有或没有各自的抑制剂1小时。
- 通过在 875 μL 的 DMSO 中溶解 10 毫克粉末（380.82 克/摩尔），并稀释到 10 μM 的工作浓度，准备 10 mM 罗达明 123。例如，要使 10 mL 的 hESFM 与 10 μM 罗达明 123，混合 10 μL 的 10 m M 罗达明 123 股票与 10 mL 的 hESFM。
- 通过在 10.26 mL 的 DMSO 中溶解 50 毫克粉末（487.29 克/摩尔），并稀释到 10 μM 的工作浓度，准备 10 mM H2DCFDA。例如，要使 10 mL 的 hESFM 与 10 μM 罗达明 123，混合 10 μL 的 10 m M 罗达明 123 股票与 10 mL 的 hESFM。
- 使用含有 5% 三元 X （v/v） 的 DPBS 用 0.5 mL 的 DPBS 和 lyse 清洗电池两次。
- 使用多板或微板读取器测量解解细胞的荧光（见材料列表）。
- 将荧光板读取器设置为 485 纳米激发和 530 纳米发射，并测量这些波长的荧光。
- 对于运输机检测中未使用的油井，在用 4% PFA 固定电池以进行细胞核定量之前，先用 DPBS 清洗两次。
- 在 DPBS 中用 Hoechst 33342 三氢三氢稀释 （1：1000） 孵化细胞 10 分钟。使用荧光显微镜在每个井中映像多个视觉场，以计算平均细胞核计数。
- 使用斐济计算核，并在每个细胞的基础上使荧光值正常化。
- 通过从各自的空白值中减去每个条件的原始荧光累积值来计算荧光的平均积累值。
- 每个条件的平均减去值。
- 将平均值与步骤 9.6.1 除以平均细胞计数。使用这些值使每个细胞的荧光值正常化。
- 使用规范化值为每个抑制条件生成图形表示，并执行任何必要的统计分析。
10. 通过、扩展和冷冻保存 BMEC
- 补充第8天BMEC培养物与新鲜的hESFM补充稀释（1：200）B27，并允许细胞在COL4/FN矩阵上再扩展两天。
- 涂上新的 12-Transwell 过滤板和 24 井平底板，带 400μg/mL COL4 和 100 μg/mL FN，孵育 4 小时。
- 第10天，用DPBS清洗细胞，在37°C下用1mL酶EDTA孵育至少15分钟，直到获得单个细胞悬浮液。
- 在室温下，在300 x g下通过离心收集细胞5分钟。
- 为了冷冻保存这些细胞，用新鲜的 hESFM 与 30% 胎儿牛血清 （FBS） 和 10% DMSO 重新悬浮细胞颗粒。
- 将 iPSC 衍生的 BMEC 储存在低温保存小瓶中，在 -80 °C 的前 24 小时内存放在异丙醇容器中，然后放在液氮中，以 -160 °C 进行长期存储。
- 要通过这些细胞，重新悬生细胞颗粒与新鲜的hESFM补充稀释（1：200）B27。
- 种子细胞到第10.2步准备的涂层板上。种子细胞使用 6 井板的 1 口井与 12 口透水井过滤板的 3 口井和 24 口井板的 6 口井的比例。允许细胞生长和膨胀24小时。
- 第 11 天，通过步骤 8 中列出的步骤测量 TEER。
- 第 12 天，通过步骤 9 中列出的步骤执行 ICC。
- 要解冻冷冻保存的 BMEC，可在 37摄氏度时将冷冻保存小瓶放在温水中或珠子浴中。然后将解冻的 BMEC 转移到 5 mL 的 hESFM，并辅以稀释 （1：200） B27。
- 在室温下，在300 x g下通过离心收集细胞5分钟。以稀释 （1：200） B27、10 μM RA 和 10 μM Y-27632 补充的 hESFM 中的细胞重新悬索。
- 24 小时后，将介质切换到 hESFM，并辅以稀释 （1：200） B27 和 10 μM Y-27632，无需 RA。
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Representative Results
BMEC 差异化
应精确遵循此协议中的几个关键步骤（图1）。第 1 天的 E6 介质使用很重要，因为它通常用于在相对较短的时间内从 iPSC 中提取神经直肠系，从而在多个细胞系36中产生可重复的结果。另一个重要步骤是在差异化的第 4 天，其中 E6 介质应切换到带有稀释 （1：200） B27、20 ng/mL bFGF 和 10 μM RA 以扩展 iPSC 衍生的 BMEC 的 hESFM。增加B27补充剂用作牛血清的替代品，以支持无血清细胞培养1，bFGF被添加，以促进iPSC衍生的BMECs6的生长，和RA用于促进BBB表型35的发展。最后一个重要步骤涉及净化阶段，其中第 6 天 iPSC 衍生的 BMEC 被分培养到 COL4/FN 涂层板上，以选择 iPSC 衍生的 BMECs 1、6、35、36。图 2演示了从 iPSC 到 BMEC 的形态转换。经过一天的E6介质（第1天），细胞形态学类似于iPSC。到 E6 的第 4 天，细胞开始明显地与 iPSC 不同，并覆盖了大部分油井（约 90% 的汇合度）。到第 6 天，当在 hESFM 中培养稀释 （1：200） B27、20 ng/mL bFGF 和 10 μM RA 时，细胞形态开始出现拉伸和鹅卵石外观。在第8天，每个细胞在一个大的鹅卵石图案中是不同的。进行了发芽检测，以证明iPSC衍生的BMEC的血管生成潜力，在经过3天的VEGFA165治疗后，产生了类似管状结构（图3）。
图1：人类iPSC与BMEC的分化大纲。人类 iPSC 最初在含有 10 μM Y-27632 的干细胞介质中培养 24 小时，然后将介质更改为 E6 4 天。第 4 天，介质改为 hESFM（1：200） B27 补充剂、20 ng/mL bFGF 和 10 μM RA 2 天。第6天，细胞被分培养到COL4/FN涂层板上。在第7天，媒体被更改为hESFM与B27补充没有bfFGF和RA和TEER测量。第8天，ICC和埃弗勒克运输机进行了活动检测。iPSC 衍生的 BMEC 被扩展至第 10 天，然后分别传递到跨井板或 24 井平底板，用于 TEER 测量和 ICC 分析。第 8 天 BMEC 用于发芽检测（未描述）。收集并储存在 hESFM 中的 2 口 6 井板 iPSC 衍生 BMEC 中，在 -80 °C 下使用 10% 的 DMSO 和 30% FBS，然后储存在液氮中，在 -160oC 进行长期存储。第 12 天，在执行 ICC 的扩展 iPSC 衍生 BMEC 中观察到 TEER 值的峰值。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：描绘iPSC与BMEC差异化的亮场图像。在E6介质中经过一天的培养后，iPSC保留了其特有的形态。在 E6 介质的第 4 天，细胞形态学与 iPSC 明显不同。第6天，细胞形态改变为拉长和鹅卵石的外观。到第8天，细胞出现大，并具有鹅卵石图案。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：iPSC衍生生物电因的血管生成潜力。 纯化的 iPSC 衍生 BMEC 以 100，000 细胞/cm2 种子到 hESFM 的地下室膜基质上，配以 （1：200） B27 补充剂和 40ng/mL VEGFA165。经过3天的VEGFA165治疗后，出现了类似管状的结构。 请点击这里查看此数字的较大版本。
纯化的 iPSC 衍生 BMEC 以 100，000 细胞/cm2 种子到 hESFM 的地下室膜基质上，配以 （1：200） B27 补充剂和 40ng/mL VEGFA165。经过3天的VEGFA165治疗后，出现了类似管状的结构。
BMEC 特征化是使用免疫细胞化学对细胞特异性标记进行的。iPSC衍生的BMECs被评估为紧结蛋白（OCLN，TJP1和CLDN5）的存在，这些蛋白通常表现在脑内皮细胞3和肺、肝和肾18的内皮细胞的紧密结合中。其他标记，如PECAM1和SLC2A1，以前曾被用作纯化BMEC6的标记。PECAM13和 SLC2A4均表示在 BBB 的血管内皮细胞中。使用此协议生成的 iPSC 衍生 BMEC 共同表示所有这些标记的所有五个标记（图 4）。
图4：iPSC衍生 BMEC 的标记分析。人类 iPSC 衍生的 BMEC 被染色为紧密路口（OCLN、TJP1、CLDN5）、流入运输机 （SLC2A1） 和粘附路口 （PECAM1） 蛋白质。OCLN、TJP1和CLDN5蛋白主要在细胞膜中局部化。SLC2A1 和 PECAM1 在核膜和细胞膜中都进行了本地化。霍奇斯特33342三氢三氢用于核染色。 请点击这里查看此数字的较大版本。
为了描述 BMEC 的 BBB 功能，TEER 在子培养后 24 小时（第 7 天）进行测量，并将介质更改为带稀释 （1：200） B27 且无 bFGF 和 RA 的 hESFM。TEER 测量从分化的第 7 天（TEER 测量的第 0 天）开始，在分培养 BMEC（图 5）后的第 8 天或 48 小时内达到 2000 Ω x cm2的峰值。这些TER值在描述的范围为共同培养的iPSC衍生的BMECs与大鼠原星形细胞37。iPSC 线根据其低 TEER 值没有任何可识别的 BBB 功能。
图 5：iPSC 衍生 BMEC 中的 TEER 测量。在 COL4/FN 矩阵上进行一天的子培养（分化的第 8 天），TEER 值达到峰值。TEER测量是在技术（每口井3个测量）和生物复制（每条细胞线3口井）中获得的。从原始 TEER 值中减去空白井的技术平均值。这些值平均每天乘以 1.12 厘米2（12 转井插入的表面积）。错误条表示标准错误。 请点击这里查看此数字的较大版本。
为了评估 ABCB1 和 ABCC1 efflux 运输器活动，在用各自的抑制剂孵化后，对 ABCB1 和 ABCC1 的荧光基板量进行了量化。不出所料，用PSC833（ABCB1抑制剂）或MK-571（ABCC1抑制剂）抑制ABCB1和ABCC1排泄物运输机，分别导致罗达明123（R123）或2'，7'二氯二氟瑞辛二甲酸酯（H2DCFDA）的增加（图6）。这一证据表明，使用此协议衍生的 BMEC 具有 efflux 运输器活动。
图 6：iPSC 衍生 BMEC 中的 Efflux 运输器活动。BMEC 中的 Efflux 运输器活性通过量化二氯二甲酸酯 （H2DCFDA） 中罗达明 123 （R123） 或 2'，7'-二氯二氟化物（H2DCFDA） 的积累来确定 PSC833（ATP绑定盒式子家庭B成员1（ABCB1）抑制剂）或MK-571（ATP绑定盒式子家庭C成员1（ABCC1）抑制剂）的存在或不存在。每个条件（N=1）都进行了技术三重测试。从控制条件（即无抑制剂）中扣除荧光值。每次技术复制，这些荧光积累在每个细胞的基础上规范化。统计学意义是利用学生T测试从三个技术副本确定的。在有 ABCB1 抑制剂和没有 ABCB1 抑制剂的 R123 积累之间未观察到任何统计意义（t-stat= -1.66，p=0.11）。观察到H2DCFDA的积累与没有ABPC1抑制剂（t-统计=-7.23，p=0.04）之间的统计意义。*p_0.05。错误条表示标准错误。 请点击这里查看此数字的较大版本。
通过、扩展和冷冻保存 iPSC 衍生的 BMEC
另一个目标是调查iPSC衍生的BMEC是否可以在亚培养后通过和冷冻保存。为此，允许第 7 天 iPSC 衍生的 BMEC 扩展至第 10 天，然后将其传递到新涂层的 COL4/FN 12 跨井过滤板上，用于 TEER 测量，24 口井平底板用于 ICC 分析（图 7）。利用此条件，iPSC 衍生的 BMEC 继续增殖，保持 OCLN、TJP1、CLDN5、SCL2A1 和 PECAM1（图 8）的表达，并在通过后继续维持适当的 TEER 值（峰值为 2000 Ω x cm2）。冷冻保存的 BMEC 后来解冻、扩展，然后通过（图 7）。在解冻24小时后和之后的几天内，对BMEC进行了TEER测量。与新鲜衍生的 BMEC 相比，这些后发制 BMEC 的 TEER 测量量减少了（峰值仅为 800 Ω xcm 2）。解冻后BMEC的第二次传递显示更低的TEER值（峰值只有200-300 Ω×厘米2）（图9），并显示出紧密交汇点形成的磨损和/或斑点模式（图10）。西方污点分析48显示，iPSC主要表示皮内标记（SOX17）49和一些紧密的结点标记（OCLN），但不是其他BMEC相关标记（TJP1，CLDN5和SLC2A1）（图11）。BMEC 主要表示内皮相关标记（TJP1、CLDN5、OCLN 和 SLC2A1），皮内皮标记物 SOX17 水平较低。
图7：扩展和冷冻保存的iPSC衍生的BMEC的明亮场图像。A） 第10天（初始亚培养后4天）细胞达到最大汇合量。B） 第11天，24小时后通过COL4/FN涂层24井板。C） 第12天，48小时后通过COL4/FN涂层24井板：观察到峰值TER值，并执行了ICC。D） COL4/FN 涂层 6 井板上的 48 小时后 iPSC 衍生 BMEC;细胞以前在1.2 x 102 细胞/mL下冷冻保存。E） 24 小时后，后 thaed iPSC 衍生的 BMEC 被传递到 COL4/FN 涂层的 6 井板上。F） 在通过后 48 小时后， ipsc 衍生的 Bmec 被通过。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图8：通过后iPSC衍生生物中心ICC。BMEC 在 COL4/FN 矩阵上经过并维护，直到 TEER 值达到峰值的第 12 天。第 12 天的 BMEC 因紧密路口（OCLN、TJP1、CLDN5）、流入运输机 （SLC2A1） 和粘附路口 （PECAM1） 蛋白质而染色。表达模式和定位类似于未执行传递的条件下观察到的表达模式和定位，如图 4 所示。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图9：比较 iPSC 中的 TEER 测量、未通过的 BMEC、通过的 BMEC、冷冻保存的 BMEC 以及低温保存和通过的 BMEC。在第 1 天，非通过和通过的 BMEC 的 TEER 值达到峰值，但非 iPSC 或冷冻保存的 BMEC。冷冻保存的 BMEC 在第 3 天到第 7 天之间具有中等的 TEER 值，冷冻保存和通过的 BMEC 的 TEER 值甚至更低。iPSC 没有在 0 天到 9 天之间显示任何可衡量的 TEER 值。TEER 测量是在技术（每口井 3 次测量）和生物复制（每条细胞系 3 次）中获得的。从原始 TEER 值中减去空白井的技术平均值。这些值平均每天乘以 1.12 厘米2（12 转井插入的表面积）。错误条表示标准错误。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图10：冷冻保存和通过的BMEC的ICC。在 COL4/FN 上通过并维护 BMEC，直到观察到 TER 值峰值。BMEC 被染色为紧密路口（OCLN、TJP1、CLDN5）、流入运输机 （SLC2A1） 和粘附路口 （PECAM1） 蛋白质。与未通过的 BMEC （图 4）和通过的 BMEC （图8）相比，紧密路口标记的表达模式出现磨损和/或雀斑。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图11：西方对iPSC、非通过的BMEC、通过的BMEC以及冷冻保存和通过的BMEC的污点分析。显示 TJP1、OCLN、SOX17、SLC2A1、CLDN5 和负载控制 （GAPDH） 水平的西方污点。 请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
修改和故障排除
在此协议中，我们在 iPSC 培养过程中使用常用的细胞外矩阵和细胞培养介质进行一些修改，以获取 BMEC（图1）。这些变化并没有影响从人类iPSC中提取BMECS的能力，如利普曼协议1所述。来自不同健康捐赠者的 iPSC 线用于证明此修改的协议显示的结果可与其他行1的先前研究相媲美。对于冷冻保存，B27补充剂用于代替1%血小板差血浆衍生血清（PDS）40，但这影响了BMEC保真在随后的栽培。在故障排除方面，TEER 值在稳定之前可能会快速波动。这种波动可能是由于当板块从37°C移动到室温37时发生的温度变化造成的。为了克服这一问题，应迅速、高效和一致地进行测量。如有必要，可以通过使用 Blume 等人提供的数学公式（200949）来计算温度影响，以获得经温度校正的 TEER 值。
本议定书的限制
尽管获得具有强大 BBB 表型（即高 TEER 值）的 BMEC，但长时间维护此 BBB 属性仍然是一项重大挑战。如图所示，使用此协议的峰值 TEER 值 （约 2000 Ω x cm2）比之前报告的峰值 TEER 值 （约 8000 Ω x cm2）1要低得多。尽管有这种观察，TEER值仍属于先前报告值1的通常范围（2000-8000 Ω x cm2）。第二个限制是峰值 TEER 值的变异性，该变量值由所使用的不同 iPSC 行产生，此协议36的其他版本已观察到这些线。不同细胞系之间的差异可能是由于每个iPSC线的生长和膨胀速度，这受到环境因素51的影响。另一个限制与低温保存有关，因为我们的协议没有保持 BMEC 保真度。1% PDS40可能在低温保存期间提供更大的 BMEC 稳定性。
关于现有方法的意义
iPSC衍生的BMEC提供具有特定个体遗传背景的细胞，这对利用这些细胞研究疾病生物学很有价值。当使用从其他动物中提取的动物模型或主要的BMEC培养物时，情况并非如此。此外，体外原发性 BMEC 培养物的 TEER 值较低（约 100 Ω x cm237），远远低于此处描述的人类 iPSC 衍生 BMEC 所实现的特值。此修改的协议为从 iPSC 获取人类 BMEC 提供了详细的方法，并有可能扩展和维护它们以供长期使用。通过和存储差异化 BMEC 的能力可以在实验设计中提供多功能性和灵活性，尤其是在同时研究多个细胞系时。基于这些结果，iPSC衍生的BMEC可以在初始子培养步骤（图7、图8和图9）后进行扩展和通过，但冷冻保存需要进一步研究。该协议还可与其他基于干细胞的细胞模型一起用于开发创新方法，如脑器官的血管化。目前产生脑器官的方法导致人类大脑细胞类型的重组不完整，因为它们缺乏内皮细胞和神经血管单元的关键元素，包括BBB52，53。此处描述的协议可以使用比 3D 模型更便宜、更易于实现的二维 Transwell/联合培养系统提供可处理且可重复的方法。
本议定书的未来应用
该方案可用于研究神经血管和BBB在神经精神病，如精神分裂症和双相情感障碍中的作用，其中神经血管缺陷已被假定为发挥作用9，10，20，54，55。本协议36的先前版本已用于从亨廷顿舞蹈症7和22q删除综合征患者43的iPSC线中提取BMEC。这两项研究7，43证明成功地利用这种方法来研究与BBB相关的半细胞和/或转细胞功能。在先前的协议1中，有人对动物血清的潜在混淆效应提出了一些担忧。此处使用的无血清协议消除了此问题，同时产生了与先前衍生 BMEC 的协议类似的结果。
区分和扩展 BMEC 的关键步骤
实施此协议时有四个关键步骤。首先，以最佳密度播种iPSC（即播种在+15，600细胞/cm2）对于高效的BMEC分化非常重要。如果细胞密度过高或过低的差异化第4天，培养物可能会显示更大的细胞异质性56的比率。第二个重要步骤是第 1 天和第 4 天之间的分化诱导，其中 E6 介质用于启动分化。E6被用于取代"无条件介质"，这是在以前的协议6，35使用。E6介质不仅将分化时间从13天缩短到8天，而且还促进紧密结蛋白（TJP1、OCLN、CLDN5）和BMEC标记（PECAM1和SLC2A1）36的表达。使用E6介质也导致适当的TEER值（图5）和ABCB1和ABCC1流水运输器活动（图6）6，35。第三，使用B27代替牛血清允许无血清的条件，这提高了BMEC分化1的一致性和可靠性。最后，在扩展 iPSC 衍生的 BMEC 方面，当细胞达到~100% 的汇合度时，应通过它们。基于此协议，iPSC 衍生的 BMEC 可在初始子培养阶段（图 7、图 8和图 9）之后进一步扩大和通过。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家精神卫生研究所创新新科学家生物行为研究奖（BRAINS）奖R01MH113858（R.K.），国家卫生研究院奖KL2 TR002542（PL）的支持。国家精神卫生研究所临床科学家发展奖K08MH086846（R.K.），悉尼R Baer Jr基金会赠款（给P.L.）多丽丝杜克慈善基金会临床科学家发展奖（给R.K.），瑞安·利希特桑双极基金会（给R.K.），菲利斯和 杰罗姆·莱尔·拉帕波特基金会（R.K.）、哈佛干细胞研究所（R.K.）和史蒂夫·威利斯和伊莉莎·弗洛伊德（R.K.）。我们感谢安妮·卡图里亚博士对手稿的批判性阅读和反馈。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100mL | |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A-31572 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb | Cell Signaling | 3528S | |
| CLDN5 (Claudin-5) | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma Aldrich | C5533-5mg | |
| Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 8670 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) | Corning | 353046 | |
| Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) | Corning | 353047 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) | Corning | 3460 | |
| Countess slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DMEM/F12 (without phenol red) | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-50mL | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663-10ML | |
| DPBS (+/+) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 | World Precision Instruments | N/A | |
| Essential 6 Medium (Thermo Fisher) | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-2mg | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 24020-117 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human endothelial serum-free medium | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| InCell Analyzer 6000 | General Electric | N/A | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| MK-571 | Sigma Aldrich | M7571-5MG | |
| NutriStem | Stemgent | 01-0005 | |
| Occludin | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Recombinant Human VEGF 165 | Peprotech | 100-20 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-100MG | |
| Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702-10MG | |
| SLC2A1 (GLUT-1) | ThermoFisher | PA1-21041 | |
| SOX17 | Cell Signaling | 81778S | |
| TJP-1 (ZO-1) | ThermoFisher | PA5-28869 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) | Sigma Aldrich | SML0572-5MG | |
| Versene solution | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Tocris/Thermo Fisher Scientific | 1254 |
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