Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Härledning, expansion, kryopreservation och karakterisering av hjärnans mikrovaskulära endotelceller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

Detta protokoll beskriver en anpassad metod för att härleda, expandera och cryopreserve hjärnan mikrovaskulära endotelceller erhålls genom att differentiera mänskliga inducerade pluripotenta stamceller, och att studera blod hjärnbarriär egenskaper i en ex vivo modell.

Abstract

Hjärnans mikrovaskulära endotelceller (BMECs) kan skiljas från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) för att utveckla ex vivo cellulära modeller för att studera blod - hjärnbarriär (BBB) funktion. Detta ändrade protokoll innehåller detaljerade steg för att härleda, expandera och cryopreserve BMECs från mänskliga iPSCs med hjälp av en annan givare och reagenser än de som rapporterats i tidigare protokoll. iPSCs behandlas med väsentliga 6 medium i 4 dagar, följt av 2 dagar av mänskliga endotel serum-fri kultur medium kompletteras med grundläggande fibroblast tillväxtfaktor, retinsyra och B27 tillägg. Dag 6 är cellerna underkulturerade på en kollagen/fibronectinmatris i 2 dagar. Immunocytokemi utförs dag 8 för BMEC-marköranalys med CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 och SLC2A1. Western blotting utförs för att bekräfta BMEC markör uttryck och avsaknad av SOX17, en endodermal markör. Angiogen potential påvisas med en spirande analys. Transendotel elektrisk resistans (TEER) mäts med hjälp av ätpinnarlektroder och voltohmmeter från dag 7. Spillluxtransportöraktivitet för ATP-bindningskassettunderfamilj B-medlem 1 och ATP-bindningskassett underfamilj C-medlem 1 mäts med hjälp av en multiplåtläsare dag 8. Framgångsrik härledning av BMECs bekräftas av förekomsten av relevanta cellmarkörer, låga nivåer av SOX17, angiogen potential, transportöraktivitet och TEER-värden ~2000 Ω x cm2. BMECs utökas fram till dag 10 innan de passar på nybelagda kollagen/fibronectinplattor eller kryopreserverade. Detta protokoll visar att iPSC-härledda BMECs kan utökas och passeras minst en gång. Lägre TEER värden och sämre lokalisering av BMEC markörer observerades dock efter cryopreservation. BMECs kan användas i co-culture experiment med andra celltyper (nervceller, glia, pericytes), i tredimensionella hjärnmodeller (organ-chip och hydrogel), för vascularization av hjärnan organoider, och för att studera BBB dysfunktion i neuropsykiatriska störningar.

Introduction

Funktion för blod- hjärnbarriär
Blod- hjärnbarriären (BBB) bildar en gräns som begränsar rörelsen av ämnen från blodet till hjärnan. BBB består av hjärnmikrovaskulära endotelceller (BMECs) som bildar ett monoskikt som fodrar vaskulaturen. BMECs, tillsammans med astrocyter, nervceller, pericyter, microglia och extracellulär matris, bildar den neurovaskulära enheten. BMECs har en hårt reglerad paracellulär struktur som gör det möjligt för BBB att upprätthålla hög transendotel elektrisk resistans (TEER), som begränsar passiv diffusion och fungerar som en indikator på barriärintegritet1,2. BMECs har också proteiner som hjälper till med transcellulära rörelser såsom endocytos, transcytos och transmigration, samt extravasation av leukocyter under ett immunsvar3. BMECs förlitar sig på tillströmning och utflöde transportörer för näring och avlägsnande av avfallsprodukter, för att upprätthålla en homeostatisk balans i hjärnan3. Till exempel kan du solute carrier family 2 member 1 (SLC2A1) är en tillströmningstransportör som ansvarar för glukosförflyttningen över BBB4, medan utflödestransportörer som ATP-bindande kassettunderfamilj B-medlem 1 (ABCB1) och ATP-bindande kassettunderfamilj C-medlem 1 (ABCC1) ansvarar för att återföra substrat tillbaka till blodflödet3,5,6,7. ABCB1 substrat inkluderar morfin, verapamil4, och antipsykotika såsom olanzapin och risperidon8, medan ABCC1 transportören har en mängd olika substrat inklusive sulfat konjugat, vinkrisin och glukuronid konjugat4.

Tillämpning av BBB-modeller vid psykiatriska störningar
BBB dysfunktion har varit inblandad i ett antal neurologiska och psykiatriska störningar, inklusive schizofreni och bipolär sjukdom9,10. Nyligen används iPSC-härledda ex vivo-cellulära modeller för att förhöra de cellulära och molekylära grunderna för psykiatriska störningar, men dessa modeller tar för närvarande inte hänsyn till den potentiella rollen som neurovaskulaturen11,12,13. Det är hypotesen att perifera inflammatoriska cytokiner som cirkulerar i blodet kan påverka BBB14 , 15,16,17, men det finns också bevis för paracellulär18,19,20,21,22, transcellulär23,24,25,26,27,28,29, och extracellulärmatris 20,29,30,31,32 avvikelser som bidrar till BBB dysfunktion. Störningar av BBB kan leda till att innehållet i blodet kommer in i hjärnan parenkym och aktiverar astrocyter och/eller mikroglia för att frigöra proinflammatoriska cytokiner, som i sin tur initierar ett inflammatorisktsvar 33 som kan ha skadliga effekter på hjärnan34. BMECs är den primära komponenten i BBB och att undersöka strukturen och funktionen hos dessa celler kan öka förståelsen för BBB dysfunktion i neurologiska och psykiatriska störningar.

Alternativa BMEC-modeller
Före utvecklingen av effektiva protokoll för härledande BMECs från iPSCs1,6 ,35,36, hade forskare använt odödliga BMECs37 för att studera BBB-funktion. Många av dessa modeller misslyckades dock med att uppnå önskvärda BBB fenotyper, ett sådant fysiologiskt intervall av TEER värden38,39. Att använda iPSCs har fördelen att behålla den genetiska bakgrunden hos den individ från vilken cellerna härleds. Forskare arbetar aktivt med att etablera iPSC-härledda ex vivo mikromiljömodeller som rekapitulerar den mänskliga hjärnans struktur och funktion. Forskare har utvecklat metoder för att härleda BMECs som strukturellt och fysiologiskt liknar BMECs som finns in vivo. Metoder för att erhålla renade populationer av iPSC-härledda BMECs kräver ett antal olika steg med protokoll som optimeras under de senasteåren 1,6,35,36. I allmänhet odlas iPSC-härledda BMECs i Essential 6 (E6) medium i 4 dagar, följt av 2 dagar i humant endotel serum-fritt medium (hESFM) kompletterat med grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF), retinosyra (RA) och B27 tillägg. Cellerna odlas sedan på en kolgen IV (COL4) och fibronectin (FN) matris för att erhålla >90% homogena BMECs1.

Identiteten hos BMECs bekräftas av immunofluorescens som visar co-expression av BMEC proteiner inklusive trombocyt-endotel cell vidhäftning molekyl-1 (PECAM1), SLC2A1 och snäva junction proteiner såsom snäva junction protein 1 (TJP1), occludin (OCLN) och claudin-5 (CLDN5)6. Spirande analyser har använts för att bekräfta den angiogena potentialen hos iPSC-härledda BMECs. 6 BBB-integriteten hos BMECs utvärderas genom förekomst av fysiologiska TEER-värden in vitro (~2000Ω x cm2)37 och mätbar aktivitet för utflödestransportörer som ABCB1 och ABCC11,6,36. De senaste metodologiska framstegen från Lippmann-gruppen har lett till iPSC-härledda BMEC-protokoll med minskad experimentell variabilitet och förbättrad reproducerbarhet1. Det är dock inte känt om de kan utvidgas och passeras bortom underodlingsstadiet. Vårt ändrade protokoll syftar till att ta itu med detta problem genom att passa iPSC-härledda BMECs efter dag 8 och bedöma om de kan utökas ytterligare för att behålla BBB-egenskaper efter kryopreservation. Även om inga studier har beskrivit passaging av iPSC-härledda BMECs, finns det ett protokoll för BMEC kryopreservation som behåller fysiologiska BBB egenskaper efter att ha genomgått en frys-tina cykel40. Det är dock inte känt efter cryopreservation BMECs kan passeras och behålla BBB egenskaper.

BMECs som härrör från iPSCs med Lippmann protokollet har använts för att modellera BBB störningar i neurologiska störningar såsom Huntingtons sjukdom7. Sådana iPSC-härledda BMECs har också använts för att undersöka effekterna av bakteriell infektion såsom Neisseria meningitidis eller grupp B Streptococcus på störningar av blod-CSF-barriären respektive BBB41,42. Med hjälp av iPSC-härledda BMECs från 22q borttagning syndrom patienter med schizofreni, observerade forskare en ökning av intercellulär vidhäftning molekyl-1 (ICAM-1), en stor vidhäftningsmolekyl i BMECs som hjälper till med rekrytering och extravasation av leukocyter i hjärnan43. Sammantaget visar dessa studier nyttan av iPSC-härledda BMECs för att studera BBB störningar i komplexa neuropsykiatriska störningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mänskliga iPSCs omprogrammerades från fibroblaster av friska givare med hjälp av ett protokoll som godkänts av Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital och McLean Hospital, och karakteriserades enligt beskrivningen i tidigarestudier 44,45,46.

OBS: Kortfattat omprogrammerades fibroblaster till iPSC via mRNA-baserad genetisk omprogrammering47. IPSCs bibehölls i stamcellsmedium (SCM) (se materiallista) och lagrades med en densitet på ~1,2 x 102 celler/ml med 1 ml SCM, 10 μM med rho-associerade proteinkinashämmare (ROCKi) Y-27632 och 10% (v/v) dimetylsulfid (DMSO), i kryopreserverade injektionsflaskar i flytande kväve vid -160 °C. Alla följande procedurer nedan utförs i ett biosäkerhetsskåp om inget annat anges.

1. Utspädning av källarmembranmatris och plåtbeläggning

  1. Utspädd (1:50) tillväxtfaktor minskad källarmembranmatris renad från Engelbreth-Holm-Swarm tumör i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) utan fenolrött.
  2. Täck cellens odlingsplattor med lämplig mängd utspädd källarmembranmatris (dvs. 6-brunnsplatta = 1mL, 12-brunnsplatta = 0,5 ml) och inkubera dessa plattor vid 37 °C i minst 1 timme.

2. underhåll av iPSC

OBS: Den maximala sammanflödet per brunn i en 6-brunns platt bottenplatta är ~ 1,2 x 106 celler.

  1. Tina cryopreserved iPSCs i SCM med 10 μM Y-27632 och platta på en 6-brunnsplatta belagd med utspädd tillväxtfaktor minskad källarmembranmatris.
  2. Underhåll iPSCs i SCM med 10 μM Y-27632 under de första 24 timmarna efter upptining. Byt till färskt medium efter 24 timmar.
  3. Underhåll iPSCs i SCM tills cellerna når 80-90% sammanflöde innan de passas.
    1. Beräkna hur många iPSC som behövs för differentiering genom att multiplicera önskad densitet för differentiering (15 600 celler/cm2)med brunnens yta. För en 6-brunn platt bottenplatta multiplicerar du 15 600 celler/cm2 med 9,6 cm2 för totalt 149 760 celler/brunn.
  4. För att passera, tvätta cellerna med Hanks balanserade saltlösning (HBBS). Inkubera sedan cellerna med icke-enzymatisk etylendiamintetraacetsyra (EDTA) (se materiallista) i 5 minuter vid 37 °C.
    1. Använd en cellskrapa för att försiktigt lyfta av cellerna. Samla celler i färsk SCM.
    2. Plätera celler på cellkulturplattor belagda med utspädd SCM och behåll celler enligt beskrivningen i steg 2.3 eller lagra dem vid ~1,2 x 106 celler/ml i 1 ml SCM, 10 μM Y-27632 och 10% DMSO (v/v) i kryopreserverade injektionsflaskar i flytande kväve vid temperatur -160 °C.

3. Differentiering av iPSC till BMECs

OBS: Icke-enzymatiska EDTA separerar celler i klumpar. Enzymatisk EDTA (se Materialförteckning) separerarceller i encellig suspension. Retinsyra (RA) bör skyddas mot ljus.

  1. Tvätta iPSCs en gång med Dulbeccos fosfatbuffert saltlösning (DPBS). Inkubera med enzymatisk EDTA (1 ml för 6-brunnsplatta, 0,5 ml för 12-brunnsplatta och 0,25 ml för 24-brunnsplatta) i cirka 5 minuter vid 37 °C för att ge en enda cellfjädring.
  2. Samla celler och centrifugera vid 300 x g (relativ centrifugalkraft) i 5 minuter vid rumstemperatur. Återanvänd cellpellets i SCM innehållande 10 μM Y-27632.
  3. Bestäm celldensiteten med Trypan Blue och den automatiserade cellräknaren eller en hemocytometerenhet. Plåtceller med en densitet av 15 600 celler/cm2 eller 149 760 celler/brunn på en 6-brunns platt bottenplatta (med en yta på 9,6 cm2/brunn) i SCM som innehåller 10 μM Y-27632 i 24 timmar.
  4. Påbörja differentiering efter 24 timmar genom att byta SCM till E6 medium. Byt E6 medium dagligen under de kommande 4 dagarna.
  5. På dag 4 av differentiering, ersätt E6 medium med hESFM kompletterat med utspädd (1:200) B27 tillägg, 20 ng/mL bFGF och 10 μM RA. Ändra inte detta medium under de kommande 48 timmarna.
  6. Förbered 200 ml hESFM med utspädd (1:200) B27, blanda 1 ml 50x koncentrerad B27 tillägg till 199 ml hESFM.
  7. Förbered 20 ng/ml bFGF genom att rekonstruera 50 μg bFGF i 250 μL Tris-buffert (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) för att göra 200 μg/mL stamlösning. Förbered 200 ml hESFM som innehåller 20 ng/ml bFGF genom att blanda 20 μL 200 μg/ml bFGF med 200 ml hESFM.
  8. Förbered 10 μM RA genom att först göra en 40 mg/ml RA-stamlösning genom att tillsätta 2,5 ml DMSO till 100 mg RA-pulver. Späd denna koncentration till 3 mg/ml för att göra 10 mM stamlösning. Förbered 200 ml hESFM som innehåller 10 μM RA genom att blanda 200 μL 10μM RA i 200 ml hESFM.

4. Beläggning kollagen IV (COL4) och fibronectin (FN) Matris för rening av iPSC-härledd BMEC

  1. Tillsätt 2 ml sterilt vatten till 2 mg FN för att göra 1 mg/ml FN-stamlösning. Tillsätt 5 ml sterilt vatten till 5 mg COL4 för att göra en 1 mg/ml COL4-stamlösning.
    1. Låt FN lösas upp i minst 30 minuter vid 37 °C och KOL4 för att lösas upp vid rumstemperatur.
  2. Späd FN-stamlösningen i sterilt vatten till en slutlig koncentration på 100 μg/ml och COL4-stamlösning till en slutlig koncentration på 400 μg/ml.
  3. Täck önskade plattor (6-brunnsplatta = 1 ml COL4/FN-lösning, 12-brunnsplatta = 0,5 ml, 24-brunnsplatta= 0,25 ml och 12-transwell filtrerad platta = 0,25 ml) med blandningen 400 μg/mL COL4 och 100 μg/mL FN.
  4. Inkubera plattor i minst 2 timmar eller över natten vid 37 °C. för Transwell-filtrerade plattor rekommenderas minst 4 timmar.

5. Delkultur och rening av iPSC-härledda BMECs

OBS: Inkubation med enzymatisk EDTA kan ta längre tid än 15 minuter beroende på cellernas sammanflöde dag 6 av differentiering.

  1. På dag 6 av differentiering, tvätta celler två gånger med DPBS. Inkubera med 1 ml enzymatisk EDTA i minst 15 minuter vid 37 °C tills en enda cellfjädring erhålls.
  2. Samla celler via centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Återanvända cellpellets med färsk hESFM med utspädd (1:200) B27 tillägg, 20 ng/mL bFGF och 10 μM RA.
  3. Fröceller på tallrikar belagda med en blandning av 400 μg/ml COL4 och 100 μg/mL FN. Fröceller med ett förhållande på 1 brunn av en 6-brunnsplatta till 3 brunnar av en 12-brunnsplatta, 3 brunnar av en 12-transwell filtrerad platta, eller 6 brunnar av en 24-brunnsplatta.
  4. Frö odifferentierade iPSC från samma cellinje till COL4/FN belagd 12-transwell filtrerad platta som negativ kontroll för TEER-analys.
  5. Efter 24 timmars subodling, ändra medium till hESFM med B27 tillägg endast. Inga medelstora ändringar behövs efter detta steg.

6. Spirande analys

  1. Samla dag 8 iPSC-härledda BMECs och så dem vid 100 000 celler / väl på en 24-brunn platt bottenplatta nybelagd med 200 μL / cm2 källarmembranmatris.
  2. Behandla dessa celler med hESFM med utspädd (1:200) B27 och 40 ng/ml vaskulär endoteltillväxtfaktor A (VEGFA165).
  3. Observera cellerna var 24:e timme och byt medium varannan dag.

7. Immunocytokemi (ICC)

OBS: ICC utförs på 24-brunns plattbottnar.

  1. Efter 48 timmars subodling (dag 8), tvätta cellerna två gånger med DPBS. Fixa celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minuter.
  2. Tvätta cellerna tre gånger med DPBS, 5 minuter per tvätt. Förblockera celler i 1 timme vid rumstemperatur i DPBS med 5% åsneserum och 0,3% Triton X-100 (v/v).
  3. Inkubera med primära antikroppar: mus anti-human-PECAM1 (1:100, lager 0,5 mg/ml), kanin anti-human-TJP1 (1:200, lager 0,53 mg/mL), mus anti-human-CLDN5 (1:200, lager 0,5 mg/ml), mus anti-human-OCLN (1:200, lager 0,5 mg/ml) och kanin anti-human-SLC2A1(1:100, lager 0,2 mg/ml) i DPBS som innehåller 5% åsneserum över natten vid 4 °C.
    1. Skölj cellerna en gång med DPBS och tvätta sedan fem gånger i 5 minuter per tvätt med DPBS.
  4. Inkubera celler med sekundära antikroppar: åsne-anti-kanin Alexa Fluor 555 (1:200) och åsne-anti-mus 488 (1:200) i DPBS som innehåller 5% åsneserum i 1 timme.
  5. Efter denna inkubation, tillsätt Hoechst 33342 trihydroklorid trihydrat utspädd (1:1000) i DPBS i 10 minuter.
    1. Ta bort Hoechst 33342-lösningen och skölj en gång med DPBS och tvätta fyra gånger med DPBS i 5 minuter per tvätt.
  6. Visualisera celler på fluorescensmikroskop för att leta efter uttryck och lokalisering av celltillverkare.

8. TEER-mätning och teer-analys

OBS: Corning 12-Transwell filtrerade plattor är utrustade med filter bestående av 1,12 cm2 polyetentereftalatmembran och 0,4 mikrometer porer. TEER-mätningar erhålls i tekniska (3 per brunn) och biologiska replikat (3 brunnar per cellinje och/eller tillstånd).

  1. 24 timmar efter subodling (dag 7), mät TEER med ätpinnarlektroder och en voltohmmeter var 24:e timme. Se användarhandboken för voltohmmeter för specifika instruktioner om hur du erhåller mätningar.
    1. För att mäta TEER, ladda voltohmmeterinstrumentet kvällen innan. Torka instrumentet och ätpinnarlektroderna lätt med 70 % etanol innan du placerar dem i säkerhetshuven.
    2. Slå på strömmen och kalibrera ohm-mätaren enligt tillverkarens rekommendationer.
    3. Anslut ätpinnarlektroderna och skölj elektroderna med 70 % etanol följt av DPBS.
    4. Placera den kortare ändelektroden i transbrunnsinsatsen (apicalkammaren) och den längre änden i basolateralkammaren.
    5. Mät först en tom brunn som endast är belagd med COL4/FN. Mät sedan de andra brunnarna.
    6. Skölj snabbt ätpinnarlektroder med 70% etanol följt av DPBS vid mätning av olika förhållanden (dvs. mätning av olika cellinjer).
  2. När alla mätningar (i Ω) har registrerats, skölj ätpinnarelektroder med 70% etanol och sterilt vatten. Torka försiktigt av elektroden och låt den lufttorka i säkerhetshuven.
  3. Medelvärdet av de tredubbelt TEER-värdena (i Ω) från den tomma brunnen och subtrahera det här medelvärdet från varje rå TEER-värde efter villkor.
    1. Medelvärdet av de subtraherade värdena och multiplicera dem med 1,12 cm2 (ytan på 12-transwellinsatsen).
    2. Använd transformerade värden från steg 6 för att generera diagrammet som visar TEER-värde och standardfel för varje dag av TEER-mätning.

9. Utflöde transportör verksamhet och analys

OBS: Efflux transportör aktivitetsanalys utförs på en 24-brunn platt bottenplatta. Efflux transportörer av intresse inkluderar ABCB1 och ABCC1. Det rekommenderas att varje tillstånd utförs i tre exemplar med kontrollbrunnar (dvs. tomma brunnar utan respektive hämmare).

  1. Efter 48 timmars subodling (dag 8) inkuberar du celler med 10 μM Valspodar (ABCB1-hämmare) eller 10 μM MK571 (ABCC1-hämmare) i 1 timme vid 37 °C.
    1. Bered 10 mM Valspodarbuljong genom att lösa upp 5 mg pulver (1214,64 g/mol) i 412 μL DMSO och späd till arbetskoncentrationen på 10 μM. Om du till exempel vill göra 10 ml hESFM med 10 μM Valspodar, blanda 10 μL 10 mM Valspodar-lager med 10 ml hESFM.
    2. Bered 10 mM MK571-beståndet genom att lösa upp 5 mg pulver (537,07 g/mol) i 931 μL och späd till arbetskoncentrationen på 10 μM. Om du till exempel vill göra 10 ml hESFM med 10 μM MK571, blanda 10 μL 10 mM MK571-lager med 10 ml hESFM.
  2. Efter 1 timme, inkubera celler med 10 μM rhodamin 123 (ABCB1 substrat) eller 10 μM 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA, ABCC1 substrat) med eller utan sina respektive hämmare i 1 timme vid 37 °C.
    1. Bered 10 mM rhodamin 123 genom att lösa upp 10 mg pulver (380,82 g/mol) i 875 μL DMSO och späda till arbetskoncentration på 10 μM. Om du till exempel vill göra 10 ml hESFM med 10 μM rhodamin 123, blanda 10 μL 10 mM rhodamin 123 lager med 10 ml hESFM.
    2. Bered 10 mM H2DCFDA genom att lösa upp 50 mg pulver (487,29 g/mol) i 10,26 ml DMSO och späd till arbetskoncentrationen på 10 μM. Om du till exempel vill göra 10 ml hESFM med 10 μM rhodamin 123, blanda 10 μL 10 mM rhodamin 123 lager med 10 ml hESFM.
  3. Tvätta cellerna två gånger med 0,5 ml DPBS och lys med DPBS som innehåller 5% Triton-X (v/v).
  4. Mät lysorescensen hos de lysade cellerna med hjälp av en multiplåts- eller mikroplåtläsare (se materiallista).
    1. Ställ in fluorescerande plåtläderingsinstrument på 485 nanometer excitation och 530 nanometer utsläpp och mät fluorescens vid dessa våglängder.
    2. För brunnar som inte används i transportörtestet, tvätta cellerna två gånger med DPBS innan du fixar dem med 4% PFA för cellkärna kvantifiering.
  5. Inkubera celler med Hoechst 33342 trihydrokloridtrihydrat utspädd (1:1000) i DPBS i 10 minuter. Avbilda flera visuella fält i varje brunn för att beräkna genomsnittliga cellkärnor med hjälp av fluorescensmikroskop.
  6. Räkna atomkärnor med Fiji och normalisera fluorescensvärden per cell till dessa räkningar.
    1. Beräkna genomsnittlig ackumulering av fluorescens genom att subtrahera rå fluorescensackumuleringsvärde för varje villkor från respektive blankvärde.
    2. Genomsnittliga subtraherade värden för varje villkor.
    3. Dividera medelvärden från steg 9.6.1 efter genomsnittligt cellantal. Använd dessa värden för att normalisera fluorescensvärden per cell.
    4. Använd normaliserade värden för att generera en grafisk representation för varje hämmartillstånd och utföra nödvändiga statistiska analyser.

10. Passaging, Expanding och Cryopreserving BMECs

  1. Fyll på dag 8 BMEC kulturer med färsk hESFM kompletterad med utspädd (1:200) B27 och låt cellerna expandera i ytterligare två dagar på COL4 / FN matrisen.
  2. Täck en ny 12-Transwell filtrerad platta och en 24-brunns platt bottenplatta med 400 μg/ ml COL4 och 100 μg / mL FN och inkubera i 4 timmar.
  3. På dag 10, tvätta celler med DPBS och inkubera med 1 ml enzymatisk EDTA i minst 15 minuter vid 37 °C tills en enda cellupphängning erhålls.
  4. Samla celler via centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
    1. För att kryopreservera dessa celler, återanvänd cellpellets med färsk hESFM med 30% fetala nötkreatursserum (FBS) och 10% DMSO.
    2. Förvara iPSC-härledda BMECs i kryopreserverade injektionsflaska i en isopropanolbehållare under de första 24 timmarna vid -80 °C och placera sedan i flytande kväve för långtidslagring vid -160 °C.
    3. För att passera dessa celler, återanvänd cellpellets med färsk hESFM kompletterad med utspädd (1:200) B27.
  5. Fröceller på belagda tallrikar beredda i steg 10.2. Fröceller med ett förhållande på 1 brunn av en 6-brunnsplatta till 3 brunnar av en 12-transwell filtrerad platta och till 6 brunnar av en 24-brunnsplatta. Låt cellerna växa och expandera i 24 timmar.
  6. På dag 11 mäter du TEER genom att följa stegen i steg 8.
  7. På dag 12 utför du ICC enligt följande steg i steg 9.
  8. För att tina cryopreserved BMECs, placera de kryopreserverade injektionsflaskan i varmt vatten eller pärlbad vid 37oC. Överför sedan de tinade BMECs till 5 ml hESFM kompletterad med utspädd (1:200) B27.
    1. Samla celler via centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Återanvänd cellerna i hESFM kompletterade med utspädd (1:200) B27, 10 μM RA och 10 μM Y-27632.
    2. Efter 24 timmar, växla medium till hESFM kompletterat med utspädd (1:200) B27 och 10 μM Y-27632 utan RA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Differentiering av BMEC
Några kritiska steg i detta protokoll bör följas exakt (figur 1). E6 medium användning på dag 1 är viktigt, eftersom det ofta används för härleda neuroectoderm härstamning från iPSCs inom en relativt kort tidsperiod ger reproducerbara resultat över flera cellinjer36. Ett annat viktigt steg är dag 4 av differentiering, där E6 medium ska bytas till hESFM med utspädd (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF och 10 μM RA för att expandera iPSC-härledda BMECs. Tillsats av B27-tillägg används som ett alternativ till bovint serum för att stödja serumfri cellodling1, bFGF tillsätts för att underlätta tillväxten av iPSC-härledda BMECs6, och RA används för att underlätta utvecklingen av BBB fenotyp35. Det sista viktiga steget är reningssteget, där dag 6 iPSC-härledda BMECs är underkulturerade på en COL4/FN-belagd platta för att välja iPSC-härledda BMECs1,6,35,36. Figur 2 visar den morfologiska övergången från iPSC till BMECs. Efter en dag med E6 medium (dag 1) liknar cellulär morfologi iPSCs. Dag 4 av E6 börjar cellerna verka synligt åtskilda från iPSCs och täcker det mesta av brunnen (~ 90% konfluens). Dag 6, medan odlad i hESFM med utspädd (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF och 10 μM RA, börjar cellulär morfologi ha ett långsträckt och kullersten utseende. På dag 8 är varje enskild cell distinkt i ett stort kullerstensmönster. En spirande analys utfördes för att påvisa den angiogena potentialen hos iPSC-härledda BMECs, vilket resulterade i rörliknande strukturer efter 3 dagars VEGFA165-behandling (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Disposition för differentiering av mänskliga iPSC till BMECs. Mänskliga iPSCs odlades ursprungligen i stamcellsmedium som innehåller 10 μM Y-27632 i 24 timmar innan medium byttes till E6 i 4 dagar. Dag 4 ändrades medium till hESFM med (1:200) B27 tillägg, 20 ng/mL bFGF och 10 μM RA i 2 dagar. Dag 6 var cellerna underkulturerade på COL4/FN-belagda tallrikar. Dag 7 ändrades medium till hESFM med B27 tillägg utan bFGF och RA och TEER mättes. Dag 8 utfördes ICC och efflux transportör aktivitet analyser. IPSC-härledda BMECs utvidgades fram till dag 10 innan de fördes till en transbrunnsplatta eller en 24-brunns platt bottenplatta för TEER-mätning respektive ICC-analys. Dag 8 BMECs användes för groddanalysen (ej avbildad). 2 brunnar av en 6-brunnsplatta av iPSC-härledda BMECs samlades in och lagrades i hESFM med 10% DMSO och 30% FBS vid -80 °C och sedan i flytande kväve för långtidslagring vid -160oC. Dag 12 observerades en topp i TEER-värdet i utökade iPSC-härledda BMECs då ICC utfördes. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: Bilder med ljust fält som visar differentiering av iPSC:er till BMECs. Efter en kulturdag i E6 medium behåller iPSCs sin karakteristiska morfologi. Dag 4 i E6 medium verkar cellulär morfologi tydligt annorlunda än iPSCs. På dag 6 ändras cellulär morfologi till ett långsträckt och kullersten utseende. Dag 8 verkar cellerna stora och med ett kullerstensmönster. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Angiogen potential hos iPSC-härledda BMECs. Renade iPSC-härledda BMECs såddes vid 100,000 cell/cm2 på källarmembran matris i hESFM med (1:200) B27 tillägg och 40ng/mL VEGFA165. Rörliknande strukturer uppträdde efter 3 dagar av VEGFA165 behandling. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Renade iPSC-härledda BMECs såddes vid 100,000 cell/cm2 på källarmembran matris i hESFM med (1:200) B27 tillägg och 40ng/mL VEGFA165. Rörliknande strukturer uppträdde efter 3 dagar av VEGFA165 behandling.

BMEC karakterisering utfördes med hjälp av immunocytochemistry för cell-specifika markörer. IPSC-härledda BMECs bedömdes för förekomsten av snäva korsning proteiner (OCLN, TJP1 och CLDN5), som uttrycks ofta i de snäva korsningarna av hjärnan endotel celler3 och endotelceller i lungan, levern och njuren18. Andra markörer som PECAM1 och SLC2A1 har tidigare använts som markörer för renade BMECs6. PECAM13 och SLC2A4 uttrycks båda i kärlendotelceller i BBB. De iPSC-härledda BMECs som genereras med hjälp av detta protokoll uttryckte alla fem dessa markörer(figur 4).

Figure 4
Figur 4: Marköranalys av iPSC-härledda BMECs. Mänskliga iPSC-härledda BMECs var färgade för snäva korsning (OCLN, TJP1, CLDN5), tillströmning transportör (SLC2A1) och adherens junction (PECAM1) proteiner. OCLN-, TJP1- och CLDN5-proteiner lokaliseras främst i cellmembranet. SLC2A1 och PECAM1 är lokaliserade i både kärnan och cellmembranet. Hoechst 33342 trihydroklorid trihydrat användes för kärnfärgning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

För att karakterisera BBB-funktionen hos BMECs mättes TEER 24 timmar (dag 7) efter subodling och mediet ändrades till hESFM med utspädd (1:200) B27 utan bFGF och RA. TEER-mätningar erhölls från och med dag 7 av differentiering (dag 0 i TEER-mätningen) och nådde en topp på ~2000 Ω x cm2 dag 8 eller 48 timmar efter underkondrering av BMECs (figur 5). Dessa TEER-värden ligger inom det intervall som beskrivs för samkulturerade iPSC-härledda BMECs med råtta primära astrocyter37. IPSC-linjen hade ingen urskiljbar BBB-funktion enligt deras låga TEER-värden.

Figure 5
Figur 5: TEER-mätningar i iPSC-härledda BMECs. TEER-värdena nådde sin topp efter en dag av underodling på COL4/FN-matrisen (dag 8 av differentiering). TEER mätningar erhölls i tekniska (3 mått per brunn) och biologiska replikat (3 brunnar per cellinje). Det tekniska medelvärdet från en tom brunn subtraherades från råa TEER-värden. Dessa värden var genomsnittliga för varje dag och multiplicerades med 1,12 cm2 (ytan på 12-transwellinsatsen). Felstaplar representerar standardfel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

För att utvärdera ABCB1 och ABCC1 efflux transportör verksamhet, mängden fluorescerande substrat tas upp för ABCB1 och ABCC1 kvantifierades efter inkubation med sina respektive hämmare. Som förväntat ledde hämning av ABCB1- och ABCC1-utflödestransportörer med PSC833 (ABCB1-hämmare) eller MK-571 (ABCC1-hämmare) till en ökning av rhodamin 123 (R123) respektive 2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetat (H2DCFDA), respektive (figur 6). Dessa bevis tyder på att BMECs som härletts med hjälp av detta protokoll har efflux transportör verksamhet.

Figure 6
Figur 6: Utflödestransportöraktivitet i iPSC-härledda BMECs. Efflux transportör verksamhet i BMECs fastställdes genom kvantifiering av ackumulering av rhodamin 123 (R123) eller 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) i förekomst eller frånvaro av PSC833 (ATP-bindningskassett underfamilj B-medlem 1 (ABCB1) hämmare) eller MK-571 (ATP-bindningskassett underfamilj C-medlem 1 (ABCC1) hämmare). Tekniska tre exemplar utfördes för varje villkor (N=1). Fluorescensvärden från kontrolltillståndet (dvs. utan hämmare) drogs av från råa fluorescensvärden. Dessa fluorescens ackumulering normaliserades på per-cell basis för varje teknisk replikat. Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av studentens t-test från de tre tekniska replikaterna. Ingen statistisk signifikans observerades mellan ackumuleringen av R123 med och utan ABCB1-hämmare (t-stat= -1, 66, p=0, 11). Statistisk signifikans observerades mellan ackumulering av H2DCFDA med och utan ABCC1-hämmare (t-stat=-7, 23, p=0, 04). *p<0,05. Felstaplar representerar standardfel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Passa, expandera och Cryopreserving iPSC-härledda BMECs
Ett annat syfte var att undersöka om iPSC-härledda BMECs kunde passeras och kryopreserveras efter underodling. För detta ändamål tilläts dag 7 iPSC-härledda BMECs att expandera fram till dag 10 innan de passade dem på nybelagda COL4/FN 12-transwellfiltrerade plattor för TEER-mätning och 24-brunnsplatta med platt botten för ICC-analys (figur 7). Med hjälp av detta tillstånd fortsatte iPSC-härledda BMECs att föröka sig, behöll uttrycket av OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 och PECAM1 (figur 8), och fortsatte att upprätthålla korrekta TEER-värden (topp vid ~ 2000 Ω x cm2) efter parering (figur 9). Cryopreserved BMECs tinades senare, utvidgades och passagedes sedan (Figur 7). TEER mätningar av BMECs erhölls 24 timmar efter upptining och flera dagar efter det. TEER-mätningarna av dessa post tinade BMECs minskade (med en topp på endast 800 Ω x cm2) jämfört med nyprästna BMECs. En andra växling av post tinade BMECs uppvisade ännu lägre TEER-värden (som endast nådde en topp på 200–300 Ω x cm2) (figur 9) och visade slitna och/eller fräknade mönster för den snäva knutpunktsbildningen (figur 10). Western blot-analys48 visade att iPSCs främst uttryckte en endodermal markör (SOX17)49 och några snäva korsningsmarkörer (OCLN), men inte andra BMEC-relaterade markörer (TJP1, CLDN5 och SLC2A1) (figur 11). BMECs uttryckte främst endotel relaterade markörer (TJP1, CLDN5, OCLN och SLC2A1), med låga nivåer av endodermal markör, SOX17.

Figure 7
Bild 7: Ljusa fältbilder av expanderade och Cryopreserved iPSC-härledda BMECs. A) Dag 10 (4 dagar efter inledande underkultur) nådde maximal sammanflöde. B) Dag 11, 24 timmar efter att ha passat på COL4/FN-belagd 24-brunnsplatta. C) Dag12, 48 timmar efter att ha passat på COL4/FN-belagd 24-brunnsplatta; teer-värden observerades och ICC utfördes. D) 48 timmar efter upptinad iPSC-härledd BMEC på COL4/FN-belagd 6-brunnsplatta; celler var tidigare cryopreserved vid 1,2 x 102 celler/ml. E) 24 timmar efter efter tinade iPSC-härledda BMECs passaged på COL4/FN belagda 6-brunnar plattan. F) 48 timmar efter att post-tinade iPSC-härledda BMECs antogs. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: ICC för iPSC-härledda BMECs efter Passaging. BMECs passagedes och bibehölls på COL4/FN matris fram till dag 12, när TEER värden toppade. BMECs på dag 12 var färgade för snäva korsning (OCLN, TJP1, CLDN5), tillströmning transportör (SLC2A1) och adherens junction (PECAM1) proteiner. Uttrycksmönstret och lokaliseringen liknar dem som observerats under förhållanden där anpassning inte utfördes, vilket visas i figur 4. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 9
Figur 9: Jämförelse av TEER-mätningar i iPSC, icke-passagerade BMECs, passagerade BMECs, cryopreserved BMECs och cryopreserved & passaged BMECs. Dag 1 toppade TEER-värdena för icke-passagerade och passagerade BMECs, men inte iPSCs eller cryopreserved BMECs. Cryopreserved BMECs hade måttliga TEER-värden mellan dag 3 och 7, med ännu lägre TEER-värden för de cryopreserved och passaged BMECs. iPSCs visade inga mätbara TEER-värden mellan dag 0 och 9. TEER mätningar erhölls i tekniska (3 mätningar per brunn) och biologiska replikat (3 per cellinje). Det tekniska medelvärdet från en tom brunn subtraherades från de råa TEER-värdena. Dessa värden var genomsnittliga för varje dag och multiplicerades med 1,12 cm2 (ytan på 12-transwellinsatsen). Felstaplar representerar standardfel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 10
Figur 10: ICC för kryopreserverade och passagerade BMECs. BMECs passagedes och bibehölls på COL4/FN tills topp TEER värden observerades. BMECs var färgade för snäva korsning (OCLN, TJP1, CLDN5), tillströmning transportör (SLC2A1) och adherens korsning (PECAM1) proteiner. Uttrycksmönstret för snäva kopplingsmarkeringar föreföll slitet och/eller fräknat jämfört med icke-passagerade BMECs(figur 4)och passagerade BMECs(figur 8). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 11
Figur 11: Western blot-analys av iPSC: er, icke-passagerade BMECs, passagerade BMECs och cryopreserved & passaged BMECs. Västerländska blots som visar nivåer av TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 och lastkontroll (GAPDH). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ändringar och felsökning

I det här protokollet gjorde vi vissa ändringar i att använda en vanlig extracellulär matris och cellodlingsmedia under iPSC-härledning för härledning av BMECs(figur 1). Dessa ändringar påverkade inte förmågan att härleda BMECS från mänskliga iPSCs enligt beskrivningen i Lippmannprotokollet1. En iPSC-linje från en annan frisk donator användes för att visa att detta modifierade protokoll visar resultat som är jämförbara med tidigare studier med andra linjer1. För kryopreservation, B27 tillägg användes i stället för 1% trombocyt dålig plasma-härledda serum (PDS)40, men detta påverkade BMEC trohet i efterföljande odling. När det gäller felsökning kan TEER-värden fluktuera snabbt innan de stabiliseras. Denna fluktuation kan bero på temperaturförändringar som inträffar när plattorna flyttas från 37 °C till rumstemperatur37. För att komma till rätta med denna fråga bör mätningarna göras snabbt, effektivt och konsekvent. Vid behov kan temperatureffekter beaktas med hjälp av en matematisk formel som tillhandahålls av Blume et al. 200949 för att erhålla temperaturkorrigerade TEER-värden.

Begränsningar i detta protokoll

Trots att BMECs erhålls med en robust BBB-fenotyp (dvs. högt TEER-värde) är det fortfarande en stor utmaning att behålla denna BBB-egendom under en längre tid. Som visas här var teer-toppvärdena (~2000 Ω x cm2) med det här protokollet mycket lägre än tidigare rapporterade TEER-toppvärden (~8000 Ω x cm2)1. Trots denna iakttagelse låg TEER-värden inom det vanliga intervallet (2000-8000 Ω x cm2) av tidigare rapporterade värden1. En andra begränsning är variationen i topp TEER-värden som är resultatet av olika iPSC-linjer som används, vilket har observerats i andra versioner av detta protokoll36. Variationen mellan olika cellinjer kan bero på tillväxt- och expansionshastigheten för varje iPSC-linje, som påverkas av miljöfaktorer51. En annan begränsning är relaterad till kryopreservation, eftersom vårt protokoll inte upprätthåller BMEC-återgivning. Det är möjligt att 1% PDS40 ger större stabilitet hos BMECs under kryopreservation.

Betydelse för befintliga metoder

De iPSC-härledda BMECs ger celler som har den genetiska bakgrunden hos specifika individer, vilket är värdefullt för att använda dessa celler för studier av sjukdomsbiologi. Detta är inte fallet vid användning av djurmodeller eller primära BMEC-kulturer som utvinns från andra djur37. Dessutom visar in vitro primära BMEC kulturer låga TEER värden (~ 100 Ω x cm237), mycket lägre än de som uppnås med mänskliga iPSC-härledda BMECs med protokollet beskrivs här. Detta ändrade protokoll ger en detaljerad metod för att erhålla mänskliga BMEC från iPSCs, med potential att expandera och underhålla dem för längre användning. Förmågan att passera och lagra differentierade BMECs kan ge mångsidighet och flexibilitet i experimentell design, särskilt när man studerar flera cellinjer samtidigt. På grundval av dessa resultat kan iPSC-härledda BMECs utökas och passeras efter det inledande delodlingssteget(figur 7, figur 8 och figur 9), men kryopreservation behöver ytterligare undersökning. Detta protokoll kan också användas tillsammans med andra stamcellsbaserade cellulära modeller för att utveckla innovativa metoder såsom kärlisering av hjärnorganoider. Nuvarande metoder för att generera hjärnorganoider resulterar i en ofullständig rekonstitution av celltyper av den mänskliga hjärnan eftersom de saknar endotelceller och kritiska element i den neurovaskulära enheten som utgör BBB52,53. Protokollet som beskrivs här kan ge ett lättbegripligt och reproducerbart tillvägagångssätt med hjälp av tvådimensionella Transwell/co-culturing-system som är billigare och lättare att implementera än 3D-modeller.

Framtida tillämpningar av detta protokoll

Detta protokoll kan användas för att studera neurovaskulaturens och BBB: s roll vid neuropsykiatriska störningar som schizofreni och bipolär sjukdom, där underskott i neurovaskulaturen har hypotesen att spela en roll9,10,20,54,55. Tidigare versioner av detta protokoll36 hade använts för att härleda BMECs från iPSC linjer av patienter med Huntington sjukdom7 och 22q borttagning syndrom patienter med schizofreni43. Bådastudierna 7,43 visade framgångsrikt utnyttjande av denna metod för att undersöka paracellulära och/eller transcellulära funktion relaterade till BBB. Vissa farhågor har uttryckts om de potentiella förvirrande effekterna av animaliskt serum i tidigare protokoll1. Det serumfria protokoll som används här tar bort detta problem samtidigt som det ger liknande resultat som tidigare protokoll för härledande BMECs.

Kritiska steg för att differentiera och expandera BMECs

Det finns fyra kritiska steg när du implementerar det här protokollet. För det första är sådd av iPSCs med optimal densitet (dvs. sådd vid ~ 15 600 celler / cm2) viktigt för effektiv BMEC-differentiering. Om celltätheten är för hög eller för låg dag 4 av differentiering, kan kulturer visa större frekvenser av cellulär heterogenitet56. Ett andra viktigt steg är induktion av differentiering mellan dag 1 och dag 4, där E6 medium används för att initiera differentiering. E6 används i stället för det "okonditionerade mediet" som användes i tidigare protokoll6,35. E6 medium förkortar inte bara differentieringstiden från 13 dagar till 8 dagar, utan främjar också uttrycket av snäva kopplingsproteiner (TJP1, OCLN, CLDN5) och BMEC-markörer (PECAM1 och SLC2A1)36. Användningen av E6-medium resulterade också i korrekta TEER-värden(figur 5)och ABCB1- och ABCC1-utflödestransportverksamhet(figur 6)6,35. För det tredje tillät användningen av B27 i stället för bovint serum serum serumfritt tillstånd, vilket förbättrade konsistensen och tillförlitligheten hos differentiering av BMEC1. Slutligen, när det gäller att utöka iPSC-härledda BMECs, bör celler passeras när de når ~ 100% konfluens. På grundval av detta protokoll kan iPSC-härledda BMECs utökas ytterligare och passeras efter det inledande delodlingsstadiet(figur 7, figur 8 och figur 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH1113858 (till R.K.), en National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). ett nationellt institut för klinisk forskares utveckling av mental hälsa K08MH086846 (till R.K.), ett Sydney R Baer Jr Foundation Grant (till P.L.) Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (till R.K.), Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (till R.K.), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (till R.K.), Harvard Stem Cell Institute (till R.K.) och av Steve Willis och Elissa Freud (till R.K.). Vi tackar Dr. Annie Kathuria för hennes kritiska läsning och feedback på manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Neurovetenskap Utgåva 165 Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller hjärnmikrovaskulära endotelceller blodhjärnbarriär transendotel elektrisk resistens transportöraktivitet mikrovaskulär schizofreni bipolär sjukdom passaging expansion kryopreservation
Härledning, expansion, kryopreservation och karakterisering av hjärnans mikrovaskulära endotelceller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya,… More

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter