Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

פרוטוקול זה מפרט שיטה מותאמת להפקה, הרחבה והקפאה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח המתקבלים על ידי הבחנה בין תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם, ולחקור תכונות מחסום מוח בדם במודל אקס ויוו.

Abstract

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMECs) ניתנים להבחנה מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (iPSCs) כדי לפתח מודלים תאיים אקס ויוו לחקר תפקוד מחסום הדם - מוח (BBB). פרוטוקול זה שהשתנה מספק שלבים מפורטים להפקה, הרחבה והקפאה של בקרי BME מ- IPSCs אנושיים באמצעות תורם ריאגנטים שונים מאלה שדווחו בפרוטוקולים קודמים. iPSCs מטופלים עם חיוני 6 בינוני במשך 4 ימים, ואחריו 2 ימים של מדיום תרבות ללא סרום אנדותל אנושי בתוספת גורם גדילה פיברובלסט בסיסי, חומצה רטינואית, ותוסף B27. ביום 6, תאים הם תת תרבית על מטריצה קולגן / פיברונקטין במשך 2 ימים. אימונוציטוכימיה מבוצעת ביום 8 לניתוח סמן BMEC באמצעות CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 ו- SLC2A1. סופג מערבי מבוצע כדי לאשר ביטוי סמן BMEC, והיעדר SOX17, סמן אנדודרמלי. פוטנציאל אנגיוגני מודגם עם מבחני נבטים. התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל (TEER) נמדדת באמצעות אלקטרודות מקלות אכילה ו voltohmmeter החל מהיום 7. פעילות טרנספורטר Efflux עבור קלטת איגוד ATP subfamily B חבר 1 ו ATP כיסוי קלטת subfamily C חבר 1 נמדד באמצעות קורא מרובה לוחות ביום 8. נגזרת מוצלחת של BMECs מאושרת על ידי נוכחות של סמני תא רלוונטיים, רמות נמוכות של SOX17, פוטנציאל אנגיוגני, פעילות טרנספורטר וערכי TEER ~ 2000 Ω x ס"מ2. BMECs מורחבים עד היום 10 לפני המעבר על לוחות קולגן / פיברונקטין מצופים טריים או cryopreserved. פרוטוקול זה מדגים שניתן להרחיב ולעבור בין בקרי BME הנגזרים מ- iPSC לפחות פעם אחת. עם זאת, ערכי TEER נמוכים יותר ולוקליזציה ירודה יותר של סמני BMEC נצפו לאחר ההקפאה. BMECs יכול להיות מנוצל בניסויים תרבית משותפת עם סוגי תאים אחרים (נוירונים, גליה, pericytes), במודלים תלת מימדיים במוח (איבר שבב הידרוג'ל), עבור כלי דם של אורגנואידים במוח, ועל לימוד תפקוד לקוי BBB בהפרעות נוירופסיכיאטריות.

Introduction

תפקוד מחסום הדם - מוח
מחסום הדם - מוח (BBB) יוצר גבול המגביל את תנועת החומרים מהדם למוח. ה- BBB מורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMECs) היוצרים מונולאייה המצפים את כלי הדם. BMECs, יחד עם אסטרוציטים, נוירונים, pericytes, microglia, ומטריצה חוץ תאית, יוצרים את היחידה neurovascular. BMECs יש מבנה paracellular מוסדר היטב המאפשר BBB לשמור על התנגדות חשמלית טרנס אנדותל גבוהה (TEER), אשר מגביל דיפוזיה פסיבית ומשמש כאינדיקטור של שלמות מחסום1,2. BMECs יש גם חלבונים המסייעים עם תנועה transcellular כגון אנדוציטוזיס, transcytosis, גלגול, כמו גם פזרנות של לויקוציטים במהלך תגובה חיסונית3. BMECs מסתמכים על מובילי זרם ופלוטות להזנה והסרה של מוצרי פסולת, על מנת לשמור על איזון הומאוסטטי במוח3. לדוגמה, משפחת נשאים מסיסים 2 חבר 1 (SLC2A1) הוא טרנספורטר זרם אחראי על התנועה של גלוקוז על פני BBB4, בעוד מובילי efflux כגון קלטת מחייבת ATP subfamily B חבר 1 (ABCB1) ואת קלטת איגוד ATP subfamily C חבר 1 (ABCC1) אחראים להחזרת מצעים בחזרה לזרם הדם3,5, 6,7. עם המצעים של ABCB1 נמנים מורפיום, וראפמיל4ואנטי-פסיכוטיים כגון אולנזאפין וריספרידון8, ואילו במשגר ABCC1 יש מגוון מצעים, כולל צירופי סולפט, וינקריסטין וגלוקורוניד4.

יישום מודלים BBB בהפרעות פסיכיאטריות
תפקוד לקוי של BBB היה מעורב במספר הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות, כולל סכיזופרניה והפרעה דוקוטבית 9,10. לאחרונה, מודלים תאיים אקס ויוו שמקורם ב- iPSC מנוצלים כדי לחקור את היסודות התאיים והמולקולריים של הפרעות פסיכיאטריות, אך מודלים אלה אינם לוקחים בחשבון את התפקיד הפוטנציאלי שמילא המוח11,12,13. השערה היא כי ציטוקינים דלקתיים היקפיים במחזור הדם יכולים להשפיע לרעה על BBB14,15,16,17, אבל יש גם ראיות paracellular18,19,20,21,2 2, טרנסצ'לרי23,24,25,26,27,28,29, ומטריצה חוץ תאית20,29,30,31,32 ליקויים התורמים לתפקוד לקוי של BBB. הפרעה של BBB יכול לגרום לתוכן הדם נכנס parenchyma המוח והפעלת אסטרוציטים ו / או microglia לשחרר ציטוקינים proinflammatory, אשר בתורו ליזום תגובה דלקתית33 זה יכול להיות השפעות מזיקות על המוח34. BMECs הם המרכיב העיקרי של BBB ובחינת המבנה והתפקוד של תאים אלה יכול לשפר את ההבנה של תפקוד לקוי BBB בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות.

מודלים חלופיים של BMEC
לפני הפיתוח של פרוטוקולים יעילים להפקת BMECs מ IPSCs1,6,35,36, חוקרים השתמשו BMECs מונצח37 ללמוד פונקציה BBB. עם זאת, רבים מהמודלים הללו לא הצליחו להשיג פנוטיפים רצויים של BBB, טווח פיזיולוגי כזה של ערכי TEER38,39. ניצול iPSCs יש את היתרון של שמירה על הרקע הגנטי של הפרט שממנו נגזרים התאים. מדענים עובדים באופן פעיל על הקמת מודלים ex vivo microenvironment שמקורם ב- iPSC, המאכלסים מחדש את המבנה והתפקוד של המוח האנושי. חוקרים פיתחו שיטות להפקת BMECs הדומים מבחינה מבנית ופיזיולוגית ל- BMECs שנמצאו ב vivo. שיטות להשגת אוכלוסיות מטוהרות של BMECs הנגזרים מ- iPSC דורשות מספר שלבים שונים עם אופטימיזציה של פרוטוקולים בשנים האחרונות1,6,35,36. בדרך כלל, BMECs נגזר iPSC מתורבת חיוני 6 (E6) בינוני במשך 4 ימים, ואחריו 2 ימים בינוני ללא סרום אנדותל אנושי (hESFM) בתוספת גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF), חומצה רטינואית (RA), ותוסף B27. לאחר מכן התאים מתרבתים על קולגן IV (COL4) ומטריצת פיברונקטין (FN) כדי להשיג >90% BMECsהומוגניים 1.

זהותם של BMECs מאושרת על ידי immunofluorescence המציג את הביטוי המשותף של חלבוני BMEC כולל מולקולת הידבקות תאי טסיות דם-אנדותל-1 (PECAM1), SLC2A1 וחלבוני צומת הדוקים כגון חלבון צומת הדוק 1 (TJP1), occludin (OCLN) וקלודין-5 (CLDN5)6. מבחנים נבטים שימשו כדי לאשר את הפוטנציאל האנגיוגני של BMECs שמקורם ב- iPSC. 6 שלמות BBB של BMECs מוערכת על ידי נוכחות של ערכי TEER במבחנה פיזיולוגיים (~ 2000Ω x ס"מ2)37 ופעילות מדידה עבור מובילי קולוקס כגון ABCB1 ו- ABCC11,6,36. ההתקדמות המתודולוגית האחרונה של קבוצת ליפמן הובילה לפרוטוקולי BMEC הנגזרים מ- iPSC עם שונות ניסיונית מופחתת ושחזור משופר1. עם זאת, לא ידוע אם ניתן להרחיבם ולעבור מעבר לשלב התת-פולחן. הפרוטוקול שלנו שונה שואפת לטפל בבעיה זו על ידי העברת BMECs נגזר iPSC מעבר ליום 8 ולהעריך אם הם יכולים להיות מורחבים עוד יותר כדי לשמור על נכסי BBB לאחר cryopreservation. אמנם אין מחקרים תיארו פסיעה של BMECs שמקורם ב- iPSC, אך קיים פרוטוקול עבור cryopreservation BMEC ששומר על תכונות BBB פיזיולוגיות לאחר שעבר מחזור הפשרה בהקפאה40. עם זאת, זה לא ידוע לאחר cryopreservation BMECs ניתן להעביר ולשמור על מאפייני BBB.

BMECs נגזר iPSCs באמצעות פרוטוקול ליפמן נוצלו כדי מודל הפרעה BBB בהפרעות נוירולוגיות כגון מחלת הנטינגטון7. BMECs אלה שמקורם ב- iPSC שימשו גם כדי לחקור את ההשפעות של זיהום חיידקי כגון מנינגיטידיס Neisseria או סטרפטוקוקוס קבוצה B על שיבוש מחסום CSF בדם ו- BBB בהתאמה41,42. כמו כן, באמצעות BMECs שמקורם ב- iPSC מתסמונת מחיקה של 22q חולים עם סכיזופרניה, החוקרים הבחינו בעלייה במולקולת הידבקות בין תאית-1 (ICAM-1), מולקולת הידבקות גדולה ב- BMECs המסייעת בגיוס ופזרנות של לויקוציטים למוח43. יחד, מחקרים אלה מדגימים את התועלת של BMECs נגזר iPSC לחקר שיבוש BBB בהפרעות נוירופסיכיאטריות מורכבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

IPSCs אנושיים תכנתו מחדש מן fibroblasts של תורמים בריאים באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדות לבדיקה מוסדית של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס ומקלין החולים, ואפיינו כמתואר במחקריםקודמים 44,45,46.

הערה: בקצרה, פיברובלסטים תוכנתו מחדש ל- iPSC באמצעות תכנות גנטי מבוסס mRNA47. IPSCs נשמרו בינוני תא גזע (SCM) (ראה רשימת חומרים) ומאוחסנים בצפיפות של ~ 1.2 x 102 תאים / מ"ל עם 1 מ"ל של SCM, 10 מיקרומטר עם מעכב קינאז חלבון (ROCKi) Y-27632, ו 10% (v / v) דימתיל סולפיד (DMSO), בבקבוקונים cryopreserved בחנקן נוזלי ב -160 מעלות צלזיוס. כל ההליכים הבאים להלן מתבצעים בארון biosafety אלא אם כן צוין אחרת.

1. דילול מטריצת קרום מרתף וציפוי צלחת

  1. מדולל (1:50) גורם גדילה מופחת מטריצת קרום המרתף מטוהר מגידול Engelbreth-Holm-Swarm במדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ללא פנול אדום.
  2. מעיל צלחות תרבות התא עם הכמות המתאימה של מטריצת קרום מרתף מדולל (כלומר, צלחת 6-well = 1mL, צלחת 12-well = 0.5 מ"ל) ולהדגיר צלחות אלה ב 37 °C (6 מעלות צלזיוס לפחות 1 שעה.

2. תחזוקת IPSC

הערה: המפגש המרבי לבאר בצלחת שטוחה בת 6 בארות הוא ~ 1.2 x 106 תאים.

  1. הפשר IPSCs cryopreserved לתוך SCM עם 10 מיקרומטר Y-27632 וצלחת על צלחת 6-באר מצופה מטריצת קרום מרתף מופחתת גורם גדילה מדולל.
  2. לשמור על IPSCs ב SCM עם 10 מיקרומטר Y-27632 במשך 24 השעות הראשונות לאחר הפשרה. עבור למדיום טרי לאחר 24 שעות.
  3. שמור על IPSCs ב- SCM עד שהתאים יגיעו ל- 80-90% מפגש לפני המעבר.
    1. לחשב כמה iPSCs יהיה צורך עבור בידול על ידי הכפלת הצפיפות הרצויה עבור בידול (15,600 תאים / ס"מ2) על ידי שטח הפנים של הבאר. עבור צלחת שטוחה-תחתית 6-טוב, להכפיל 15,600 תאים / ס"מ2 על ידי 9.6 ס"מ2 עבור סך של 149,760 תאים / באר.
  4. למעבר, לשטוף את התאים עם פתרון מלח מאוזן של הנקס (HBBS). לאחר מכן, דגירה התאים עם חומצה אתילנדיאמיאנטטראאצטית לא אנזימטית (EDTA) (ראה רשימת חומרים) במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    1. השתמש מגרד תאים בעדינות להרים את התאים. לאסוף תאים SCM טרי.
    2. צלחות תאים על לוחות תרבית תאים מצופים SCM מדולל ולשמור על תאים כמתואר בשלב 2.3 או לאחסן אותם ב ~ 1.2 x 106 תאים / מ"ל ב 1 מ"ל של SCM, 10 מיקרומטר Y-27632, ו 10% DMSO (v / v) בבקבוקונים cryopreserved בחנקן נוזלי בטמפרטורה של -160 ° C.

3. בידול של IPSCs ל- BMECs

הערה: EDTA לא אנזימטי מפריד תאים לגושים. EDTA אנזימטי (ראה טבלת חומרים)מפריד תאים להשעיית תא יחיד. חומצה רטינואית (RA) צריכה להיות מוגנת מפני אור.

  1. לשטוף iPSCs פעם אחת עם מלוחים מאגר פוספט של Dulbecco (DPBS). דגירה עם EDTA אנזימטי (1 מ"ל עבור צלחת 6-well, 0.5 מ"ל עבור צלחת 12-well, ו 0.25 מ"ל עבור צלחת 24-well) במשך כ 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס להניב השעיה תא יחיד.
  2. לאסוף תאים וצנטריפוגה ב 300 x גרם (כוח צנטריפוגלי יחסית) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. כדורי תאים resuspend ב SCM המכיל 10 מיקרומטר Y-27632.
  3. קבע את צפיפות התאים באמצעות Trypan Blue ודלפק תאים אוטומטי או התקן המוציטרומטר. תאי צלחת בצפיפות של 15,600 תאים / ס"מ2 או 149,760 תאים / באר של צלחת שטוחה שטוחה 6-טוב (עם שטח פנים של 9.6 ס"מ2/ טוב) ב SCM המכיל 10 מיקרומטר Y-27632 במשך 24 שעות.
  4. ליזום בידול לאחר 24 שעות על ידי שינוי SCM ל E6 בינוני. שינוי E6 בינוני מדי יום במשך 4 הימים הבאים.
  5. ביום 4 של בידול, להחליף E6 בינוני עם hESFM בתוספת מדולל (1:200) B27 תוספת, 20 ng/mL bFGF, ו 10 מיקרומטר RA. אל תשנה מדיום זה במשך 48 השעות הבאות.
  6. הכן 200 מ"ל של hESFM עם B27 מדולל (1:200), לערבב 1 מ"ל של 50x מרוכז B27 תוספת ל 199 מ"ל של hESFM.
  7. הכן 20 ng/mL של bFGF על ידי שחזור 50 מיקרוגרם של bFGF ב 250 μL של מאגר Tris (5 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl) כדי להפוך 200 מיקרוגרם / מ"ל פתרון מלאי. הכן 200 מ"ל של hESFM המכיל 20 ng/mL bFGF על ידי ערבוב 20 μL של 200 מיקרוגרם / מ"ל bFGF עם 200 מ"ל של hESFM.
  8. הכן 10 מיקרומטר RA על ידי ביצוע הראשון 40 מ"ג / מ"ל של פתרון מלאי RA על ידי הוספת 2.5 מ"ל של DMSO ל 100 מ"ג של אבקת RA. לדלל את הריכוז הזה ל 3 מ"ג / מ"ל כדי להפוך 10 מ"מ פתרון מלאי. הכן 200 מ"ל של hESFM המכיל 10 מיקרומטר RA על ידי ערבוב 200 μL של 10μM RA ב 200 מ"ל hESFM.

4. ציפוי קולגן IV (COL4) ומטריצת פיברונקטין (FN) לטיהור BMEC שמקורו ב- iPSC

  1. הוסף 2 מ"ל של מים סטריליים ל 2 מ"ג של FN כדי להפוך 1 מ"ג / מ"ל FN פתרון מלאי. הוסף 5 מ"ל של מים סטריליים ל 5 מ"ג של COL4 כדי להפוך 1 מ"ג / מ"ל COL4 פתרון מלאי.
    1. אפשר FN להתמוסס לפחות 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו COL4 להתמוסס בטמפרטורת החדר.
  2. לדלל את פתרון מניית FN במים סטריליים לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ו COL4 פתרון מלאי לריכוז סופי של 400 מיקרוגרם / מ"ל.
  3. מעיל הצלחות הרצויות (צלחת 6-well = 1 מ"ל של פתרון COL4/FN, צלחת 12-well = 0.5 מ"ל, צלחת 24-well = 0.25 מ"ל, ו 12-transwell צלחת מסוננת = 0.25 מ"ל) עם תערובת של 400 מיקרוגרם / מ"ל COL4 ו 100 מיקרוגרם / מ"ל FN.
  4. צלחות דגירה במשך מינימום של 2 שעות או לילה ב 37 °C (69 °F); עבור לוחות מסוננים Transwell, מינימום של 4 שעות מומלץ.

5. תת-תרבות וטיהור של BMECs שמקורם ב- iPSC

הערה: דגירה עם EDTA אנזימטי עשוי להימשך יותר מ 15 דקות בהתאם המפגש של התאים ביום 6 של בידול.

  1. ביום 6 של בידול, לשטוף תאים פעמיים עם DPBS. דגירה עם 1 מ"ל של EDTA אנזימטי לפחות 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד השעיה תא יחיד מתקבל.
  2. לאסוף תאים באמצעות צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. גלולות תא resuspend עם hESFM טרי עם תוסף B27 מדולל (1:200), 20 ng/mL bFGF, ו 10 מיקרומטר RA.
  3. תאי זרעים על צלחות מצופות בתערובת של 400 מיקרוגרם / מ"ל COL4 ו 100 מיקרוגרם / מ"ל FN. תאי זרעים באמצעות יחס של 1 באר של צלחת 6 באר ל 3 בארות של צלחת 12 באר, 3 בארות של צלחת מסוננת 12-transwelled, או 6 בארות של צלחת 24-well.
  4. סנן IPSCs לא מובחן מאותו קו תא ללוח מסונן מצופה 12-transwell מצופה COL4/FN כפקד שלילי עבור ניתוח TEER.
  5. לאחר 24 שעות של תת-culturing, לשנות בינוני hESFM עם תוספת B27 בלבד. אין צורך בשינויים בינוניים לאחר שלב זה.

6. נבטת מבחנים

  1. לאסוף יום 8 IPSC נגזר BMECs ולזרע אותם ב 100,000 תאים / גם על צלחת שטוחה 24-טוב התחתון מצופה טרי עם 200 μL / cm2 של מטריצת קרום המרתף.
  2. לטפל בתאים אלה עם hESFM עם מדולל (1:200) B27 ו 40 ng/mL של גורם הגדילה אנדותל כלי הדם A (VEGFA165).
  3. שימו לב לתאים כל 24 שעות ושנו את המדיום כל יומיים.

7. אימונוציטוכימיה (ICC)

הערה: ICC מתבצע על 24 באר שטוח התחתון צלחות.

  1. לאחר 48 שעות של תת-פולחן (יום 8), יש לשטוף תאים פעמיים עם DPBS. לתקן תאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 20 דקות.
  2. לשטוף תאים שלוש פעמים עם DPBS, 5 דקות לכל לשטוף. תאים טרום חסימה במשך שעה בטמפרטורת החדר ב DPBS עם 5% סרום חמור ו 0.3% טריטון X-100 (v / v).
  3. דגירה עם נוגדנים עיקריים: עכבר אנטי אדם-PECAM1 (1:100, מלאי 0.5 מ"ג / מ"ל), ארנב אנטי אנושי-TJP1 (1:200, מלאי 0.53 מ"ג / מ"ל), עכבר אנטי אדם CLDN5 (1:200, מלאי 0.5 מ"ג/מ"ל), עכבר אנטי-אנושי-OCLN (1:200, מלאי 0.5 מ"ג/מ"ל), וארנב אנטי-אנושי-SLC2A1(1:100, מלאי 0.2 מ"ג/מ"ל) ב- DPBS המכיל 5% סרום חמור לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    1. יש לשטוף את התאים פעם אחת באמצעות DPBS ולאחר מכן לשטוף חמש פעמים למשך 5 דקות לכל שטיפה באמצעות DPBS.
  4. דגירה תאים עם נוגדנים משניים: חמור נגד ארנב אלקסה פלואור 555 (1:200) וחמור נגד עכבר 488 (1:200) ב DPBS המכיל 5% סרום חמור במשך שעה אחת.
  5. בעקבות דגירה זו, להוסיף Hoechst 33342 טריהידרוכלוריד טריהידראט מדולל (1:1000) ב DPBS במשך 10 דקות.
    1. הסר Hoechst 33342 פתרון ולשטוף פעם אחת עם DPBS ולשטוף ארבע פעמים עם DPBS במשך 5 דקות לכל לשטוף.
  6. דמיין תאים במיקרוסקופים של פלואורסצנטיות כדי לחפש ביטוי ולוקליזציה של יוצרי תאים.

8. מדידה וניתוח TEER

הערה: לוחות מסוננים 12-Transwell קורנינג מצוידים במסננים המורכבים 1.12 ס"מ2 קרום פוליאתילן טרפתאלאט ו 0.4 נקבוביות מיקרומטר. מדידות TEER מתקבלות בשכפולים טכניים (3 לבאר) וביולוגיים (3 בארות לכל קו תא ו/או מצב).

  1. 24 שעות לאחר תת-פולחן (יום 7), למדוד TEER באמצעות אלקטרודות מקלות אכילה ו voltohmmeter כל 24 שעות. עיין במדריך למשתמש של Voltohmmeter לקבלת הוראות ספציפיות לגבי קבלת מדידות.
    1. כדי למדוד TEER, טען את מכשיר הוולטומטר בלילה הקודם. לנגב קלות את המכשיר ואת אלקטרודות צ'ופסטיק עם 70% אתנול לפני הצבתם מכסה המנוע הבטיחות.
    2. הפעל את המתח וכייל את מד ה-ohm כפי שהמליץ היצרן.
    3. חבר את אלקטרודות מקל האכילה ולשטוף אלקטרודות עם 70% אתנול ואחריו DPBS.
    4. מניחים את האלקטרודה הקצרה יותר לתוך הכנס טרנס-באר (התא apical) ואת הקצה הארוך יותר לתוך התא הבסיסי.
    5. תחילה מדוד באר ריקה מצופה COL4/FN בלבד. ואז למדוד את בארות אחרות.
    6. לשטוף במהירות אלקטרודות מקלות אכילה עם 70% אתנול ואחריו DPBS בעת מדידת תנאים שונים (כלומר מדידת קווי תאים שונים).
  2. לאחר כל המדידות (Ω) נרשמו, לשטוף אלקטרודות מקלות אכילה עם 70% אתנול ולאחר מכן מים סטריליים. יש לנגב בעדינות את האלקטרודה ולתת לה להתייבש במכסה המנוע הבטיחותי.
  3. חישוב ממוצע של ערכי TEER משולשים (Ω) מהבאר הריקה והחסר ערך ממוצע זה מכל ערך TEER גולמי לפי תנאי.
    1. תעמיד ממוצע של הערכים המוחסרים והכפל אותם ב- 1.12 ס"מ2 (שטח הפנים של תוסף 12-transwell).
    2. השתמש בערכים שעברו המרה משלב 6 כדי ליצור את הגרף המציג ערך TEER ושגיאות סטנדרטיות עבור כל יום של מדידת TEER.

9. פעילות וניתוח טרנספורטר של Efflux

הערה: מעקב פעילות טרנספורטר Efflux מבוצע על צלחת שטוחה 24-טוב התחתון. מובילי Efflux בעלי עניין כוללים את ABCB1 ו- ABCC1. מומלץ כי כל תנאי צריך להתבצע משולש עם בארות שליטה (כלומר בארות ריקות ללא מעכבים בהתאמה).

  1. לאחר 48 שעות של sub-culturing (יום 8), תאי דגירה עם 10 μM Valspodar (מעכב ABCB1) או 10 μM MK571 (מעכב ABCC1) במשך שעה אחת ב 37 °C (69 °F).
    1. הכן 10 מ"מ Valspodar מלאי על ידי המסת 5 מ"ג של אבקה (1214.64 גרם / מול) ב 412 μL של DMSO לדלל לריכוז עבודה של 10 מיקרומטר. לדוגמה, כדי להפוך 10 מ"ל של hESFM עם 10 μM Valspodar, לערבב 10 μL של 10 mM Valspodar מלאי עם 10 מ"ל של hESFM.
    2. הכן 10 מ"מ MK571 מלאי על ידי המסת 5 אבקת מ"ג (537.07 גרם / מול) ב 931 μL לדלל לריכוז עבודה של 10 מיקרומטר. לדוגמה, כדי להפוך 10 מ"ל של hESFM עם 10 מיקרומטר MK571, לערבב 10 μL של 10 mM MK571 מניות עם 10 מ"ל של hESFM.
  2. לאחר שעה אחת, תאי דגירה עם 10 μM רודמין 123 (מצע ABCB1) או 10 μM 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA, ABCC1 מצע) עם או בלי מעכבים בהתאמה שלהם במשך 1 שעה ב 37 °C (69 °F).
    1. הכן 10 mM רודמין 123 על ידי המסת 10 מ"ג של אבקה (380.82 גרם / מול) ב 875 μL של DMSO לדלל לריכוז עבודה של 10 מיקרומטר. לדוגמה, כדי להפוך 10 מ"ל של hESFM עם 10 μM רודמין 123, לערבב 10 μL של 10 מ"מ רודמין 123 מניות עם 10 מ"ל של hESFM.
    2. הכן 10 מ"מ H2DCFDA על ידי המסת 50 מ"ג אבקה (487.29 גרם / מול) ב 10.26 מ"ל של DMSO לדלל לריכוז עבודה של 10 מיקרומטר. לדוגמה, כדי להפוך 10 מ"ל של hESFM עם 10 μM רודמין 123, לערבב 10 μL של 10 מ"מ רודמין 123 מניות עם 10 מ"ל של hESFM.
  3. לשטוף תאים פעמיים עם 0.5 מ"ל של DPBS ו lyse באמצעות DPBS המכיל 5% טריטון-X (v / v).
  4. מדידת פלואורסצנטיות של התאים בעלי lysed באמצעות קורא מרובה לוחות או מיקרופלטה (ראה רשימת חומרים).
    1. הגדר מכשיר קורא צלחת פלואורסצנטית ל 485 עירור ננומטר ופליטת ננומטר 530 ולמדוד פלואורסצנטיות באורכי גל אלה.
    2. עבור בארות לא בשימוש ב assay טרנספורטר, לשטוף תאים פעמיים עם DPBS לפני תיקון אותם עם 4% PFA עבור כימות גרעיני התא.
  5. דגירה תאים עם Hoechst 33342 trihydrochloride טריהידראט מדולל (1:1000) ב DPBS במשך 10 דקות. צלם שדות חזותיים מרובים בכל באר כדי לחשב ספירת גרעיני תאים ממוצעת באמצעות מיקרוסקופים של פלואורסצנטיות.
  6. ספור גרעינים באמצעות פיג'י ונרמל ערכי פלואורסצנטיות על בסיס לכל תא לספירות אלה.
    1. חשב הצטברות ממוצעת של פלואורסצנטיות על-ידי חיסור ערך הצטברות פלואורסצנטיות גולמי עבור כל תנאי מהערך הריק המתאים לו.
    2. ממוצע ערכים מופחתים עבור כל תנאי.
    3. חלק את הערכים הממוצעים משלב 9.6.1 לפי ספירת התאים הממוצעת. השתמש בערכים אלה כדי לנרמל ערכי פלואורסצנטיות על בסיס כל תא.
    4. השתמש בערכים מנורמלים כדי ליצור ייצוג גרפי עבור כל מצב מעכב ולבצע כל ניתוח סטטיסטי נחוץ.

10. מעבר, הרחבה והקפאה של בקרי BME

  1. לחדש את היום 8 תרבויות BMEC עם hESFM טרי בתוספת מדולל (1:200) B27 ולאפשר לתאים להתרחב במשך יומיים נוספים על מטריצת COL4/FN.
  2. מצפים צלחת מסוננת חדשה 12-Transwell וצלחת שטוחה 24-טוב התחתון עם 400 מיקרוגרם / מ"ל COL4 ו 100 מיקרוגרם / מ"ל FN ודגרת במשך 4 שעות.
  3. ביום 10, לשטוף תאים עם DPBS ודגרת עם 1 מ"ל של EDTA אנזימטי לפחות 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד השעיה תא יחיד מתקבל.
  4. לאסוף תאים באמצעות צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    1. כדי להקריא תאים אלה, יש לוותר מחדש על כדורי תאים עם hESFM טרי עם 30% סרום שור עוברי (FBS) ו-10% DMSO.
    2. אחסן BMECs שמקורם ב- iPSC בבקבוקונים קריאופושמורים במיכל איזופרופנול במשך 24 השעות הראשונות ב- -80 °C (60 °F), ולאחר מכן מקום חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך ב -160 °C (60 °F).
    3. כדי לעבור תאים אלה, resuspend כדורי תא עם hESFM טרי בתוספת מדולל (1:200) B27.
  5. תאי זרעים על לוחות מצופים שהוכנו בשלב 10.2. תאי זרעים באמצעות יחס של 1 באר של צלחת 6 באר ל 3 בארות של צלחת מסוננת 12-transwell ו 6 בארות של צלחת 24-באר. אפשר לתאים לגדול ולהתרחב במשך 24 שעות.
  6. ביום 11, מדוד את TEER על-ידי ביצוע השלבים המפורטים בשלב 8.
  7. ביום 12, בצע את ICC על-ידי ביצוע השלבים המפורטים בשלב 9.
  8. כדי להפשיר BMECs cryopreserved, למקם את בקבוקונים cryopreserved במים חמים או אמבט חרוזים ב 37oC. לאחר מכן העבירו את ה-BMECs המופשרים ל-5 מ"ל של hESFM בתוספת B27 מדולל (1:200).
    1. לאסוף תאים באמצעות צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. התחדשו בתאים ב- hESFM בתוספת B27 מדולל (1:200), 10 מיקרומטר RA ו- 10 מיקרומטר Y-27632.
    2. לאחר 24 שעות, עבור בינוני ל- hESFM בתוספת B27 מדולל (1:200) ו- 10 מיקרומטר Y-27632 ללא RA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בידול BMEC
יש לבצע במדויק כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה (איור 1). E6 שימוש בינוני ביום 1 חשוב, שכן הוא משמש לעתים קרובות להפקת שושלת נוירוקטודרם מ iPSCs בתוך פרק זמן קצר יחסית של זמן מניב תוצאות לשחזור על פני שורות תאים מרובים36. צעד חשוב נוסף הוא ביום 4 של בידול, שבו E6 בינוני צריך להיות מועבר hESFM עם מדולל (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF ו 10 μM RA כדי להרחיב את BMECs נגזר iPSC. התוספת של תוספת B27 משמש כחלופה סרום שור כדי לתמוך תא ללא סרום culturing1, bFGF מתווסף כדי להקל על הצמיחה של BMECs נגזר iPSC6, ו RA משמש כדי להקל על הפיתוח של פנוטיפ BBB35. השלב החשוב האחרון כרוך בשלב הטיהור, שבו יום 6 BMECs נגזר iPSC הם תת תרבית על צלחת מצופה COL4/FN כדי לבחור BMECs נגזר iPSC1,6,35,36. איור 2 מדגים את המעבר המורפולוגי מ- iPSCs ל- BMECs. לאחר יום אחד של E6 בינוני (יום 1), מורפולוגיה הסלולר דומה לזה של iPSCs. ביום 4 של E6, תאים מתחילים להופיע נבדלים בעליל מ- iPSCs ומכסים את רוב הבאר (~ 90% confluency). ביום 6, בעוד מתורבת hESFM עם מדולל (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF ו 10 מיקרומטר RA, מורפולוגיה הסלולר מתחיל להיות בעל מראה מוארך ומרוצף. ביום 8, כל תא בודד נבדל בתבנית מרוצפת אבן גדולה. בדיקה נבטת בוצעה כדי להדגים את הפוטנציאל האנגיוגני של BMECs שמקורם ב- iPSC, אשר הביא מבנים דמויי צינור לאחר 3 ימים של טיפול VEGFA165 (איור 3).

Figure 1
איור 1: מיתאר לבידול של IPSCs אנושיים ל- BMECs. IPSCs אנושיים היו בתחילה תרבית בינוני תא גזע המכיל 10 מיקרומטר Y-27632 במשך 24 שעות לפני שינוי בינוני E6 במשך 4 ימים. ביום 4, בינוני השתנה hESFM עם (1:200) תוספת B27, 20 ng/mL bFGF, ו 10 מיקרומטר RA במשך 2 ימים. ביום השישי, התאים היו תת-תרבותיים על לוחות מצופים COL4/FN. ביום 7, המדיום השתנה hESFM עם תוספת B27 ללא bFGF ו RA ו- TEER נמדד. ביום 8, ICC ו efflux טרנספורטר פעילות מבחנים בוצעו. BMECs הנגזרים מ- iPSC הורחבו עד יום 10 לפני שהועברו ללוח באר טרנס או ללוח תחתון שטוח של 24 באר למדידת TEER וניתוח ICC, בהתאמה. יום 8 BMECs שימשו עבור ההסמכה הנבטת (לא מתואר). 2 בארות של צלחת 6 באר של BMECs iPSC נגזר נאספו ואחסנו hESFM עם 10% DMSO ו 30% FBS ב -80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך ב -160oC. ביום 12, שיא בערך TEER נצפתה ב- BMECs מורחבים הנגזרים מ- iPSC ובנקודה זו בוצע ICC. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות שדה בהיר המתארות בידול של IPSCs ל- BMECs. לאחר יום אחד של תרבות במדיום E6, IPSCs לשמור על המורפולוגיה האופיינית שלהם. ביום 4 במדיום E6, מורפולוגיה תאית נראית שונה באופן מובהק מ- iPSCs. ביום 6, מורפולוגיה תאית משתנה למראה מוארך ומרוצף. ביום 8, התאים נראים גדולים עם דפוס מרוצף אבן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פוטנציאל אנגיוגני של BMECs שמקורם ב-IPSC. BMECs מטוהרים שמקורם ב- iPSC נזרעו ב- 100,000 תאים / ס"מ2 למטריצת קרום מרתף ב- hESFM עם (1:200) תוספת B27 ו- VEGFA165 40ng/mL. מבנים דמויי צינור הופיעו לאחר 3 ימים של טיפול VEGFA165. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

BMECs מטוהרים שמקורם ב- iPSC נזרעו ב- 100,000 תאים / ס"מ2 למטריצת קרום מרתף ב- hESFM עם (1:200) תוספת B27 ו- VEGFA165 40ng/mL. מבנים דמויי צינור הופיעו לאחר 3 ימים של טיפול VEGFA165.

אפיון BMEC בוצע באמצעות אימונוציטוכימיה עבור סמנים ספציפיים לתאים. BMECs שמקורם ב- iPSC הוערכו לנוכחותם של חלבוני צומת הדוקים (OCLN, TJP1 ו- CLDN5), המתבטאים בדרך כלל בצמתים ההדוקים של תאי אנדותל במוח3 ותאי אנדותל בריאה, בכבד ובכליות18. סמנים אחרים כגון PECAM1 ו- SLC2A1, שימשו בעבר כסמנים עבור BMECs מטוהרים6. PECAM13 ו SLC2A4 שניהם באים לידי ביטוי בתאי אנדותל כלי הדם של BBB. ה- BMECs הנגזרים מ- iPSC שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה הביעו במשותף את כל חמשת הסמנים הללו (איור 4).

Figure 4
איור 4: ניתוח סמן של BMECs שמקורם ב- iPSC. BMECs אנושיים שמקורם ב- iPSC הוכתמו עבור חלבונים בצומת הדוק (OCLN, TJP1, CLDN5), טרנספורטר זרם (SLC2A1) וחלבוני צומת דבקים (PECAM1). חלבוני OCLN, TJP1 ו- CLDN5 מותאמים בעיקר לקרום התא. SLC2A1 ו PECAM1 הם מקומיים הן גרעינים קרום התא. הוכסט 33342 טריהידרוכלוריד טריהידראט שימש לכתמים גרעיניים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לאפיין את פונקציית BBB של BMECs, TEER נמדד 24 שעות (יום 7) לאחר sub-culturing ואת המדיום השתנה hESFM עם מדולל (1:200) B27 ללא bFGF ו RA. מדידות TEER התקבלו החל מהיום השביעי של הבידול (היום 0 של מדידת TEER) והגיעו לשיא של ~ 2000 Ω x ס"מ2 ביום 8 או 48 שעות לאחר BMECs sub-culturing (איור 5). ערכי TEER אלה נמצאים בטווח המתואר עבור BMECs הנגזרים מ- iPSC במשותף עם אסטרוציטים ראשיים שלעכברושים 37. לקו iPSC לא הייתה פונקציית BBB ניכרת בהתאם לערכי TEER הנמוכים שלהם.

Figure 5
איור 5: מדידות TEER ב- BMECs הנגזרים מ- IPSC. ערכי TEER הגיעו לשיאם לאחר יום אחד של תתי-פולחן במטריצת COL4/FN (ביום 8 של בידול). מדידות TEER התקבלו ב טכני (3 מדדים לבאר) ושכפולים ביולוגיים (3 בארות לקו התא). הערך הממוצע הטכני מבאר ריקה הופטר מערכי TEER גולמיים. ערכים אלה היו ממוצעים עבור כל יום והוכפלו ב- 1.12 ס"מ2 (שטח הפנים של הכנס 12-transwell). קווי שגיאה מייצגים שגיאה רגילה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כדי להעריך את פעילות המשגר של ABCB1 ו- ABCC1 efflux, כמות המצע הפלואורסצנטי שנלקח עבור ABCB1 ו- ABCC1 כוסמו בעקבות הדגירה עם המעכבים המתאימים שלהם. כצפוי, עיכוב של מובילי קולוקס ABCB1 ו- ABCC1 עם PSC833 (מעכב ABCB1) או MK-571 (מעכב ABCC1) הוביל לעלייה ברודמין 123 (R123) או 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA), בהתאמה (איור 6). עדות זו מצביעה על כך של- BMECs הנגזרים באמצעות פרוטוקול זה יש פעילות של טרנספורטר efflux.

Figure 6
איור 6: פעילות טרנספורטר של Efflux ב- BMECs שמקורם ב- IPSC. פעילות טרנספורטר Efflux ב- BMECs נקבעה על ידי כימות הצטברות של רודמין 123 (R123) או 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DC) או 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) בנוכחות או בהיעדר PSC833 (ATP מחייב קלטת subfamily B חבר 1 (ABCB1) מעכב) או MK-571 (ATP מחייב קלטת subfamily C חבר 1 (ABCC1) מעכב). טריפלים טכניים בוצעו עבור כל תנאי (N = 1). ערכי פלואורסצנטיות ממצב הבקרה (כלומר ללא מעכבים) נוכו מערכי פלואורסצנטיות גולמיים. הצטברות פלואורסצנטיות זו מנורמלת על בסיס כל תא עבור כל שכפול טכני. מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן T של תלמיד משלושת השכפולים הטכניים. לא נצפתה מובהקות סטטיסטית בין הצטברות של R123 עם ובלי מעכב ABCB1 (t-stat = -1.66, p = 0.11). מובהקות סטטיסטית נצפתה בין הצטברות של H2DCFDA עם ובלי מעכב ABCC1 (t-stat = -7.23, p = 0.04). *p<0.05. קווי שגיאה מייצגים שגיאה רגילה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

העברת BMECs, הרחבה והקפאה של בקרי BME המופקים מ- iPSC
מטרה נוספת הייתה לחקור אם ניתן להעביר BMECs שמקורם ב-iPSC ולהקריא אותם לאחר תת-פולחן. לשם כך, 7 BMECs שמקורם ב- iPSC הורשו להתרחב עד יום 10 לפני העברתם ללוחות מסוננים מצופים חדשים של COL4/FN 12-transwell למדידת TEER ולוח שטוח-תחתון של 24 באר לניתוח ICC (איור 7). באמצעות מצב זה BMECs שמקורם ב- iPSC המשיכו להתרבות, שמרו על הביטוי של OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 ו- PECAM1 (איור 8), והמשיכו לשמור על ערכי TEER נאותים (שיא של ~ 2000 Ω x ס"מ2) לאחר המעבר (איור 9). BMECs קריאופרד הופשרו מאוחר יותר, הורחבו ולאחר מכן עברו (איור 7). מדידות TEER של BMECs הושגו 24 שעות לאחר הפשרה ועוד כמה ימים לאחר מכן. מדידות TEER של בקרי BME אלה לאחר הפשרה הופחתו (והגיעו לשיא של 800 Ω xס"מ 2בלבד ) בהשוואה ל- BMECs שמקורם זה עתה. מעבר שני של BMECs מופשרים הציג ערכי TEER נמוכים עוד יותר (שהגיעו לשיא של 200-300 Ω xס"מ2בלבד ) והראה דפוסים פרוקים ו/או מנומשים של היווצרות הצומת ההדוק (איור 10). ניתוח כתם מערבי48 גילה כי iPSCs הביעו בעיקר סמן אנדודרמלי (SOX17)49 וכמה סמני צומת הדוקים (OCLN), אך לא סמנים אחרים הקשורים ל- BMEC (TJP1, CLDN5 ו- SLC2A1) (איור 11). BMECs ביטאו בעיקר סמנים הקשורים לאנדוטל (TJP1, CLDN5, OCLN ו- SLC2A1), עם רמות נמוכות של הסמן האנדודרמלי, SOX17.

Figure 7
איור 7: תמונות שדה בהיר של BMECs מורחבים וקריפטושמורים שמקורם ב- IPSC. A) יום 10 (4 יום לאחר תת התרבות הראשונית) תאים הגיעו המפגש המרבי. ב) יום 11, 24 שעות לאחר המעבר על צלחת COL4/FN מצופה 24 בארות. ג) Day12, 48 שעות לאחר המעבר על צלחת COL4/FN מצופה 24 בארות; ערכי TEER שיא נצפו ו- ICC בוצע. D) 48 שעות לאחר הפשרת BMECs שמקורם ב-IPSC בצלחת 6 בארות מצופה COL4/FN; תאים היו cryopreserved בעבר ב 1.2 x 102 תאים / מ"ל. ה) 24 שעות לאחר BMECs שמקורם ב- iPSC לאחר הפשרה הועברו לצלחת 6 בארות מצופה COL4/FN. ו) 48 שעות לאחר העברת BMECs שמקורם ב-IPSC. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: ICC של BMECs שמקורם ב- iPSC לאחר המעבר. BMECs הועברו ונשמרו במטריצת COL4/FN עד יום 12, כאשר ערכי TEER הגיעו לשיאם. BMECs ביום 12 הוכתמו עבור צומת הדוק (OCLN, TJP1, CLDN5), טרנספורטר זרם (SLC2A1) וחלבונים צומת חסידים (PECAM1). תבנית הביטוי והלוקליזציה דומות לאלה שנצפו בתנאים שבהם לא בוצעה העברה, כפי שמוצג באיור 4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: השוואת מדידות TEER ב- IPSCs, בקרי BME שאינם מעברים, בקרי BMEC עם מעברים, בקרי BME שמורים לקריפטה ו- BMECs עם מעברים. ביום הראשון, ערכי TEER הגיעו לשיאם עבור בקרי BME שאינם מועברים ומועברים, אך לא IPSCs או בקרי BME שמורים. ל- BMECs ההקפאה היו ערכי TEER מתונים בין היום השלישי ל- 7, עם ערכי TEER נמוכים עוד יותר עבור בקרי ה- BME ההקפאה והמעברים. IPSCs לא הפגינו ערכי TEER מדידים בין היום 0 ל- 9. מדידות TEER התקבלו בנתונים טכניים (3 מדידות לבאר) ובשכפולים ביולוגיים (3 לכל קו תא). הערך הממוצע הטכני מבאר ריקה הופטר מערכי TEER הגולמיים. ערכים אלה היו ממוצעים עבור כל יום והוכפלו ב- 1.12 ס"מ2 (שטח הפנים של הכנס 12-transwell). קווי שגיאה מייצגים שגיאה רגילה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: בית הדין הפלילי הבינלאומי של BMECs ההקפאה והעברה. BMECs הועברו ונשמרו ב- COL4/FN עד שנצפו ערכי TEER שיא. BMECs הוכתמו עבור צומת הדוק (OCLN, TJP1, CLDN5), טרנספורטר זרם (SLC2A1) וחלבונים צומת דבקים (PECAM1). תבנית הביטוי של סמני צומת הדוקים נראתה מרופטים ו/או מנומשים בהשוואה ל- BMECs שאינם מועברים (איור 4) ו- BMECs מעבריים (איור 8). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11: ניתוח כתמים מערביים של IPSCs, BMECs שאינם מעברים, BMECs מעבריים ו- BMECs הקפאה ומעבר. כתמים מערביים המציגים רמות של TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 ובקרת טעינה (GAPDH). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שינויים ופתרון בעיות

בפרוטוקול זה, ביצענו כמה שינויים בשימוש במטריצה חוץ-תאית נפוצה ובמדיה של תרבות תאים במהלך פולחן iPSC להפקת BMECs (איור 1). שינויים אלה לא השפיעו על היכולת להפיק BMECS מ- IPSCs אנושי כמתואר בפרוטוקול ליפמן1. קו iPSC מתורם בריא אחר שימש כדי להוכיח כי פרוטוקול זה שונה מראה תוצאות דומות מחקרים קודמים עם קווים אחרים1. עבור cryopreservation, תוספת B27 שימש במקום 1% טסיות פלזמה עניים נגזר סרום (PDS)40, אבל זה השפיע על נאמנות BMEC ב culturing הבאים. לגבי פתרון בעיות, ערכי TEER עשויים להשתנות במהירות לפני התייצבות. תנודה זו עשויה לנבוע משינויי טמפרטורה המתרחשים כאשר הצלחות מועברות מ 37 °C (60 °F) לטמפרטורת החדר37. כדי להתגבר על בעיה זו, יש לבצע מדידות במהירות, ביעילות ובעקביות. במידת הצורך, ניתן לקחת בחשבון השפעות טמפרטורה באמצעות נוסחה מתמטית המסופקת על ידי Blume et al. 200949 כדי להשיג ערכי TEER מתוקנים בטמפרטורה.

מגבלות פרוטוקול זה

למרות קבלת BMECs עם פנוטיפ BBB חזק (כלומר ערך TEER גבוה), שמירה על נכס BBB זה לתקופה ממושכת של זמן ממשיכה להיות אתגר גדול. כפי שמוצג כאן, ערכי השיא של TEER (~ 2000 Ω x ס"מ2) באמצעות פרוטוקול זה היו נמוכים בהרבה מערכי השיא של TEER שדווחו קודם לכן (~ 8000 Ω x ס"מ2)1. למרות תצפית זו, ערכי TEER נפלו בטווח הרגיל (2000-8000 Ω x ס"מ2) של ערכים שדווחו בעבר1. מגבלה שנייה היא השונות בערכי TEER שיא הנובעת מקווי iPSC שונים בהם נעשה שימוש, אשר נצפתה בגירסאות אחרות של פרוטוקולזה 36. השונות בין קווי תאים שונים עשויה לנבע מקצב הצמיחה וההתרחבות של כל קו iPSC, המושפע מגורמים סביבתיים51. מגבלה נוספת קשורה להקפאה, שכן הפרוטוקול שלנו לא שמר על נאמנות BMEC. ייתכן ש- 1% PDS40 מספק יציבות רבה יותר של בקרי BME במהלך ההקפאה.

משמעות ביחס לשיטות קיימות

ה- BMECs הנגזרים מ- iPSC מספקים תאים בעלי רקע גנטי של אנשים ספציפיים, אשר יש ערך בניצול תאים אלה לחקר ביולוגיה של מחלות. זה לא המקרה בעת שימוש במודלים של בעלי חיים או תרבויות BMEC ראשוניות שחולצו מבעלי חיים אחרים37. יתר על כן, תרבויות BMEC ראשיות במבחנה מראות ערכי TEER נמוכים (~ 100 Ω x ס"מ237), נמוך בהרבה מאלה שהושגו עם BMECs אנושיים שמקורם ב- iPSC עם הפרוטוקול המתואר כאן. פרוטוקול זה שהשתנה מספק שיטה מפורטת להשגת BMECs אנושיים מ- iPSCs, עם פוטנציאל להרחיב ולתחזק אותם לשימוש ארוך יותר. היכולת לעבור ולאחסן בקרי BME מבודלים יכולה לספק רב-תכליתיות וגמישות בעיצוב ניסיוני, במיוחד כאשר לומדים קווי תאים מרובים בו-זמנית. בהתבסס על תוצאות אלה, ניתן להרחיב ולעבור BMECs הנגזרים מ-iPSC לאחר שלב התת-פולחן הראשוני(איור 7, איור 8 ואיור 9),אך ההקפאה זקוקה לחקירה נוספת. פרוטוקול זה יכול לשמש גם בשילוב עם מודלים תאיים מבוססי תאי גזע אחרים כדי לפתח גישות חדשניות כגון כלי דם של אורגנואידים במוח. השיטות הנוכחיות ליצירת אורגנואידים במוח גורמות לשיקוי לא שלם של סוגי התאים במוח האנושי מכיוון שהם חסרים תאי אנדותל ואלמנטים קריטיים של היחידה העצבית המרכיבים את BBB52,53. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לספק גישה ניתנת להעברה ושחזור באמצעות מערכות טרנסוול/שיתוף-פולחן דו-ממדיות, זולות יותר וקלות יותר ליישום מאשר דגמי תלת-ממד.

יישומים עתידיים של פרוטוקול זה

פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי ללמוד את התפקיד של neurovasculature ו BBB בהפרעות נוירופסיכיאטריות כגון סכיזופרניה והפרעה דו קוטבית, שם ליקויים neurovasculature כבר שיערו לשחק תפקיד9,10,20,54,55. גרסאות קודמות של פרוטוקול זה36 שימשו כדי להפיק BMECs מקווי iPSC של חולים עם מחלת הנטינגטון7 ו 22q מחיקת חולים עם סכיזופרניה43. שני המחקרים7,43 הראו ניצול מוצלח של שיטה זו כדי לחקור פונקציה paracellular ו / או transcellular הקשורים BBB. כמה חששות הועלו לגבי ההשפעות המבלבלות הפוטנציאליות של סרום בעלי חיים בפרוטוקוליםקודמים 1. הפרוטוקול ללא סרום המשמש כאן מסיר דאגה זו תוך הפקת תוצאות דומות לפרוטוקולים קודמים להפקת BMECs.

שלבים קריטיים לבידול והרחבת בקרי BME

קיימים ארבעה שלבים קריטיים בעת יישום פרוטוקול זה. ראשית, זריעת iPSCs בצפיפות אופטימלית (כלומר, זריעה ב ~ 15,600 תאים / ס"מ2) חשוב עבור בידול BMEC יעיל. אם צפיפות התא גבוהה מדי או נמוכה מדי ביום 4 של בידול, תרבויות עשויות להציג שיעורים גבוהים יותר של הטרוגניות הסלולר56. צעד חשוב שני הוא אינדוקציה של הבחנה בין היום 1 ליום 4, שבו E6 בינוני משמש ליזום בידול. E6 מנוצל במקום "מדיום ללא תנאים" אשר שימש בפרוטוקוליםקודמים 6,35. לא רק E6 בינוני לצמצם את זמן הבידול מ 13 ימים ל 8 ימים, אבל זה גם מקדם את הביטוי של חלבונים צומת הדוק (TJP1, OCLN, CLDN5) ו BMEC סמנים (PECAM1 ו SLC2A1)36. השימוש במדיום E6 הביא גם לערכי TEER נאותים (איור 5) ולפעילות טרנספורטר קולוקס ABCB1 ו- ABCC1 (איור 6)6,35. שלישית, השימוש ב- B27 במקום סרום שור מותר עבור מצב ללא סרום, אשר שיפר את העקביות והאמינות של בידול BMEC1. לבסוף, במונחים של הרחבת BMECs הנגזרים על-ידי iPSC, יש להעביר תאים כאשר הם מגיעים ~ 100% מפגש. בהתבסס על פרוטוקול זה, ניתן להרחיב ולעבור עוד יותר את ה-BMECs הנגזרים מ-iPSC לאחר שלב התת-פולחן הראשוני(איור 7, איור 8 ואיור 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות הנפש Biobehavioral פרסי מחקר למדענים חדשים חדשניים (BRAINS) פרס R01MH113858 (כדי R.K.), המכון הלאומי לבריאות פרס KL2 TR002542 (PL). פרס המכון הלאומי לפיתוח מדענים קליניים של המכון לבריאות הנפש K08MH086846 (ל-R.K.), מענק קרן סידני R בר ג'וניור (לפי.אל) פרס פיתוח המדען הקליני של קרן הצדקה דוריס דיוק (ל-R.K.), קרן ריאן ליכט סאנג דו-קוטבית (ל-R.K.), פיליס & קרן ג'רום לייל רפפורט (ל אר.קיי), מכון תאי הגזע של הרווארד (ל-R.K. ) ועל ידי סטיב ויליס ואליסה פרויד (ל אר.קיי). אנו מודים לד"ר אנני קת'וריה על הקריאה הביקורתית והמשוב על כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

מדעי המוח גיליון 165 תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מחסום מוח בדם התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל פעילות טרנספורטר מיקרו-וסקולרי סכיזופרניה הפרעה דו-קוטבית פסיעה התרחבות cryopreservation
נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya,… More

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter