Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Avledning, utvidelse, kryopreservasjon og karakterisering av mikrovaskulære endotelceller fra humane induserte pluripotente stamceller

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

Denne protokollen beskriver en tilpasset metode for å utlede, utvide og kryopreserve hjernen mikrovaskulære endotelceller oppnådd ved differensiere menneskelige induserte pluripotente stamceller, og å studere blod hjernebarriere egenskaper i en ex vivo modell.

Abstract

Mikrovaskulære hjerneceller (BMECer) kan differensieres fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCer) for å utvikle ex vivo cellulære modeller for å studere blod-hjernebarriere (BBB) funksjon. Denne modifiserte protokollen gir detaljerte trinn for å utlede, utvide og kryoreserve BMV-er fra menneskelige iPSCer ved hjelp av en annen donor og reagenser enn de som er rapportert i tidligere protokoller. iPSCer behandles med essensielle 6 medium i 4 dager, etterfulgt av 2 dager med humant endoteltumfritt kulturmedium supplert med grunnleggende fibroblastvekstfaktor, retinsyre og B27-supplement. På dag 6 blir celler subkulturert på en kollagen / fibronectin matrise i 2 dager. Immunocytochemistry utføres på dag 8 for BMEC markøranalyse ved hjelp av CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 og SLC2A1. Vestlig blotting utføres for å bekrefte BMEC-markøruttrykk, og fravær av SOX17, en endodermal markør. Angiogent potensial er demonstrert med en spirende analyse. Trans-endotel elektrisk motstand (TEER) måles ved hjelp av spisepinneelektroder og voltohmmeter fra dag 7. Efflux transporter aktivitet for ATP bindende kassett subfamily B medlem 1 og ATP bindekassett subfamily C medlem 1 måles ved hjelp av en multi-plate leser på dag 8. Vellykket avledning av BMV-er bekreftes av tilstedeværelsen av relevante cellemarkører, lave nivåer av SOX17, angiogent potensial, transportøraktivitet og TEER-verdier ~ 2000 Ω x cm2. BMV-er utvides til dag 10 før de går over på nybelagte kollagen/fibronectinplater eller kryopreservert. Denne protokollen viser at iPSC-avledede BMV-er kan utvides og passeres minst én gang. Lavere TEER-verdier og dårligere lokalisering av BMEC-markører ble imidlertid observert etter kryopreservasjon. BMECs kan benyttes i co-kultur eksperimenter med andre celletyper (nevroner, glia, pericytes), i tredimensjonale hjernemodeller (organ-chip og hydrogel), for vaskularisering av hjerneorganoider, og for å studere BBB dysfunksjon i nevropsykiatriske lidelser.

Introduction

Blod-hjerne barriere funksjon
Blod-hjernebarrieren (BBB) danner en grense som begrenser bevegelsen av stoffer fra blodet til hjernen. BBB består av mikrovaskulære hjerneceller (BMECer) som danner en monolayer som fôrer vaskulaturen. BMECs, sammen med astrocytter, nevroner, pericytter, microglia og ekstracellulær matrise, danner den nevrovaskulære enheten. BMECs har en tett regulert paracellulær struktur som gjør at BBB kan opprettholde høy trans-endotel elektrisk motstand (TEER), som begrenser passiv diffusjon og fungerer som en indikator på barriereintegritet1,2. BMECs har også proteiner som hjelper med transcellulær bevegelse som endocytose, transcytose og transmigrasjon, samt ekstravasasjon av leukocytter under en immunrespons3. BMECs stole på tilstrømning og efflux transportører for næring og fjerning av avfallsprodukter, for å opprettholde en homeostatisk balanse i hjernen3. For eksempel, solute carrier family 2 medlem 1 (SLC2A1) er en tilstrømning transportør ansvarlig for bevegelse av glukose over BBB4,mens efflux transportører som ATP bindende kassett underfamilie B medlem 1 (ABCB1) og ATP bindende kassett underfamilie C medlem 1 (ABCC1) er ansvarlig for å returnere substrater tilbake i blodet3,5,6,7. ABCB1-substrater inkluderer morfin, verapamil4og antipsykotika som olanzapin og risperidon8,mens ABCC1-transportøren har en rekke substrater, inkludert sulfatkonjugater, vincristine og glukuronidkonjugater4.

Anvendelse av BBB-modeller i psykiatriske lidelser
BBB dysfunksjon har vært innblandet i en rekke nevrologiske og psykiatriske lidelser, inkludert schizofreni og bipolarlidelse 9,10. Nylig blir iPSC-avledede ex vivo cellulære modeller brukt til å avhøre cellulære og molekylære underlag av psykiatriske lidelser, men disse modellene tar for tiden ikke hensyn til den potensielle rollen som nevrovaskulaturen11,12,13. Det er hypotetisk at perifere inflammatoriske cytokiner som sirkulerer i blodet kan påvirke BBB14,15 ,16,17, men det er også bevis for paracellulære18,19,20,21,22, transcellulær23,24,25,26,27,28,29og ekstracellulær matrise20,29,30,31,32 abnormiteter som bidrar til BBB dysfunksjon. Forstyrrelse av BBB kan resultere i at innholdet i blodet kommer inn i hjernen parenchyma og aktiverer astrocytter og / eller microglia for å frigjøre proinflammatoriske cytokiner, som igjen initierer en inflammatoriskrespons 33 som kan ha skadelige effekter på hjernen34. BMECs er den primære komponenten i BBB og undersøke strukturen og funksjonen til disse cellene kan forbedre forståelsen av BBB dysfunksjon i nevrologiske og psykiatriske lidelser.

Alternative BMEC-modeller
Før utviklingen av effektive protokoller for utleding av BMECer fra iPSCs1,6,35,36, hadde forskere ansatt udødeliggjortE BMECs37 for å studere BBB-funksjon. Men mange av disse modellene klarte ikke å oppnå ønskeligE BBB fenotyper, et slikt fysiologisk utvalg av TEER-verdier38,39. Bruk av iPSCer har fordelen av å beholde den genetiske bakgrunnen til individet som cellene er avledet fra. Forskere arbeider aktivt med å etablere iPSC-avledede ex vivo mikromiljømodeller som rekafulerer strukturen og funksjonen til den menneskelige hjernen. Forskere har utviklet metoder for å utlede BMV-er som er strukturelt og fysiologisk lik BMECs funnet in vivo. Metoder for å skaffe rensede populasjoner av iPSC-avledede BMECer krever en rekke forskjellige trinn med protokoller som optimaliseres de siste årene1,6,35,36. Generelt er iPSC-avledede BMECer dyrket i Essential 6 (E6) medium i 4 dager, etterfulgt av 2 dager i humant endotelterumfritt medium (hESFM) supplert med grunnleggende fibroblastvekstfaktor (bFGF), retinsyre (RA) og B27-tillegg. Cellene blir deretter dyrket på en kollagen IV (COL4) og fibronectin (FN) matrise for å oppnå > 90% homogene BMECs1.

Identiteten til BMB er bekreftet ved immunofluorescence som viser kouttrykket av BMEC proteiner inkludert blodplate-endotelcelleadhesjon molekyl-1 (PECAM1), SLC2A1, og tette koblingsproteiner som tett kobling protein 1 (TJP1), okkludin (OCLN), og claudin-5 (CLDN5)6. Spirende analyser har blitt brukt til å bekrefte det angiogene potensialet til iPSC-avledede BMECer. 6 BBB-integriteten til BMV-er evalueres av tilstedeværelsen av fysiologiske in vitro TEER-verdier (~2000Ω x cm2)37 og målbar aktivitet for efflukstransportører som ABCB1 og ABCC11,6,36. Nylige metodiske fremskritt fra Lippmann-gruppen har ført til iPSC-avledede BMEC-protokoller med redusert eksperimentell variasjon og forbedret reproduserbarhet1. Det er imidlertid ikke kjent om de kan utvides og passeres utover sub-culturing scenen. Vår modifiserte protokoll tar sikte på å løse dette problemet ved å passere iPSC-avledede BMV-er utover dag 8 og vurdere om de kan utvides ytterligere for å beholde BBB-egenskaper etter kryopreservation. Selv om ingen studier har beskrevet passaging av iPSC-avledede BMECer, finnes det en protokoll for BMEC kryopreservation som beholder fysiologiske BBB egenskaper etter å ha gjennomgått en fryse-tinesyklus 40. Det er imidlertid ikke kjent etter-cryopreservation BMV kan passeres og beholde BBB egenskaper.

BMECs avledet fra iPSCer ved hjelp av Lippmann-protokollen har blitt brukt til å modellere BBB-forstyrrelser i nevrologiske lidelser som Huntington sykdom7. Slike iPSC-avledede BMECer har også blitt brukt til å undersøke effekten av bakteriell infeksjon som Neisseria meningitidis eller gruppe B Streptococcus på forstyrrelse av henholdsvis blod-CSF barriere og BBBhenholdsvis 41,42. Også ved hjelp av iPSC-avledede BMECer fra 22q sletting syndrom pasienter med schizofreni, forskere observert en økning i intercellulære vedheft molekyl-1 (ICAM-1), et stort vedheft molekyl i BMECs som bistår med rekruttering og ekstravasasjon av leukocytter inn i hjernen43. Samlet viser disse studiene nytten av iPSC-avledede BMECer for å studere BBB-forstyrrelser i komplekse nevropsykiatriske lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menneskelige iPSCer ble omprogrammert fra fibroblastene til friske givere ved hjelp av en protokoll godkjent av Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital og McLean Hospital, og karakterisert som beskrevet i tidligerestudier 44,45,46.

MERK: Kort tid ble fibroblaster omprogrammert til iPSC via mRNA-basert genetisk omprogrammering47. IPSCene ble opprettholdt i stamcellemedium (SCM) (se materialliste) og lagret med en tetthet på ~1,2 x 102 celler/ml med 1 ml SCM, 10 μM med rho-assosiert protein kinasehemmer (ROCKi) Y-27632, og 10% (v / v) dimetylsulfid (DMSO), i kryopreserverte hetteglass i flytende nitrogen ved -160 °C. Alle følgende prosedyrer nedenfor utføres i et biosikkerhetskabinett med mindre annet er oppgitt.

1. Kjeller membran matrise fortynning og plate belegg

  1. Fortynn (1:50) vekstfaktor redusert kjeller membran matrise renset fra Engelbreth-Holm-Swarm svulst i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uten fenol rød.
  2. Coat celle kultur plater med riktig mengde fortynnet kjeller membran matrise (det vil vil at 6-brønns plate = 1ml, 12-brønnplate = 0,5 ml) og inkubere disse platene ved 37 ° C i minst 1 time.

2. vedlikehold av iPSC

MERK: Maksimal samløpet per brønn i en 6-brønns flatbunnsplate er ~1,2 x 106 celler.

  1. Tin kryopreserverte iPSCer i SCM med 10 μM Y-27632 og plate på en 6-brønns plate belagt med fortynnet vekstfaktor redusert kjellermembranmatrise.
  2. Oppretthold iPSCer i SCM med 10 μM Y-27632 de første 24 timene etter tining. Bytt til friskt medium etter 24 timer.
  3. Oppretthold iPSC-er i SCM til cellene når 80-90% samløpet før passaging.
    1. Beregn hvor mange iPSCer som trengs for differensiering ved å multiplisere ønsket tetthet for differensiering (15 600 celler/ cm2) ved overflaten av brønnen. For en 6-brønns flat bunnplate multipliserer du 15 600 celler/cm2 med 9,6 cm2 for totalt 149 760 celler/brønn.
  4. For å passere, vask cellene med Hanks' balanserte saltløsning (HBBS). Deretter inkubere cellene med ikke-enzymatisk etylendiamintesteratisk syre (EDTA) (se materialliste) i 5 minutter ved 37 °C.
    1. Bruk en celleskraper til å løfte av cellene forsiktig. Samle celler i fersk SCM.
    2. Plateceller på cellekulturplater belagt med fortynnet SCM og vedlikehold celler som beskrevet i trinn 2.3 eller lagre dem på ~ 1,2 x 106 celler / ml i 1 ml SCM, 10 μM Y-27632 og 10% DMSO (v / v) i kryopreserverte hetteglass i flytende nitrogen ved temperatur på -160 ° C.

3. Differensiering av iPSCer til BMECer

MERK: Ikke-enzymatisk EDTA skiller celler i klumper. Enzymatisk EDTA (se Materialtabell)skiller celler i encellede suspensjon. Retinsyre (RA) skal beskyttes mot lys.

  1. Vask iPSC-en én gang med Dulbeccos fosfatbuffersvann (DPBS). Inkuber med enzymatisk EDTA (1 ml for 6-brønnsplate, 0,5 ml for 12-brønnsplate og 0,25 ml for 24-brønnsplate) i ca. 5 minutter ved 37 °C for å gi en enkelt cellefjæring.
  2. Samle celler og sentrifuge på 300 x g (relativ sentrifugal kraft) i 5 minutter ved romtemperatur. Gjenbruk cellepellets i SCM som inneholder 10 μM Y-27632.
  3. Bestem celletettheten ved hjelp av Trypan Blue og automatisert celleteller eller en hemocytometerenhet. Plateceller med en tetthet på 15 600 celler/cm2 eller 149 760 celler/brønn av en 6-brønns flat bunnplate (med et overflateareal på 9,6 cm2/well) i SCM som inneholder 10 μM Y-27632 i 24 timer.
  4. Start differensiering etter 24 timer ved å endre SCM til E6 medium. Bytt E6 daglig de neste 4 dagene.
  5. På dag 4 differensiering, erstatte E6 medium med hESFM supplert med fortynnet (1:200) B27 supplement, 20 ng /ml bFGF, og 10 μM RA. Ikke endre dette mediet de neste 48 timene.
  6. Forbered 200 ml hESFM med fortynnet (1:200) B27, bland 1 ml 50x konsentrert B27-tillegg til 199 ml hESFM.
  7. Forbered 20 ng/ml bFGF ved å rekonstituere 50 μg bFGF i 250 μL Tris buffer (5 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl) for å lage 200 μg / ml lagerløsning. Klargjør 200 ml hESFM som inneholder 20 ng/ml bFGF ved å blande 20 μL på 200 μg/ml bFGF med 200 ml hESFM.
  8. Forbered 10 μM RA ved først å lage en 40 mg/ml RA-lagerløsning ved å tilsette 2,5 ml DMSO til 100 mg RA pulver. Fortynn denne konsentrasjonen til 3 mg/ml for å lage 10 mM lageroppløsning. Forbered 200 ml hESFM som inneholder 10 μM RA ved å blande 200 μL på 10μM RA i 200 ml hESFM.

4. Belegg kollagen IV (COL4) og fibronectin (FN) Matrix for rensing av iPSC-avledet BMEC

  1. Tilsett 2 ml sterilt vann til 2 mg FN for å lage 1 mg/ ml FN lagerløsning. Tilsett 5 ml sterilt vann til 5 mg COL4 for å lage en 1 mg/ml COL4-lagerløsning.
    1. La FN oppløses i minst 30 minutter ved 37 °C og COL4 oppløses ved romtemperatur.
  2. Fortynn FN-lagerløsningen i sterilt vann til en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml og COL4-lagerløsning til en endelig konsentrasjon på 400 μg/ml.
  3. Coat de ønskede platene (6-brønnsplate = 1 ml COL4/FN-oppløsning, 12-brønnsplate = 0,5 ml, 24-brønnsplate= 0,25 ml og 12-transwell filtrert plate = 0,25 ml) med blandingen av 400 μg/ml COL4 og 100 μg/ml FN.
  4. Inkuber plater i minst 2 timer eller over natten ved 37 °C; for Transwell-filtrerte plater, anbefales det minst 4 timer.

5. Underkultur og rensing av iPSC-avledede BMECer

MERK: Inkubasjon med enzymatisk EDTA kan ta mer enn 15 minutter, avhengig av sammenføyningen av cellene på dag 6 av differensiering.

  1. På dag 6 differensiering, vask celler to ganger med DPBS. Inkuber med 1 ml enzymatisk EDTA i minst 15 minutter ved 37 °C til en enkeltcellesuspensjon oppnås.
  2. Samle celler via sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspend celle pellets med fersk hESFM med fortynnet (1:200) B27 supplement, 20 ng / ml bFGF, og 10 μM RA.
  3. Frøceller på plater belagt med en blanding av 400 μg/ml COL4 og 100 μg/ml FN. Frøceller med et forhold på 1 brønn av en 6-brønnsplate til 3 brønner av en 12-brønnsplate, 3 brønner av en 12-transwell filtrert plate, eller 6 brønner av en 24-brønns plate.
  4. Frø udifferensiert iPSCer fra samme cellelinje til COL4 / FN belagt 12-transwell filtrert plate som negativ kontroll for TEER analyse.
  5. Etter 24 timer med sub-culturing, endre medium til hESFM med B27 supplement bare. Ingen middels endringer er nødvendig etter dette trinnet.

6. Spirende analyse

  1. Samle dag 8 iPSC-avledede BMB-er og frø dem på 100.000 celler / godt på en 24-brønn flat bunnplate nybelagt med 200 μL / cm2 av kjeller membran matrise.
  2. Behandle disse cellene med hESFM med fortynnet (1:200) B27 og 40 ng/ml vaskulær endotelvekstfaktor A (VEGFA165).
  3. Observer celler hver 24.

7. Immunocytochemistry (ICC)

MERK: ICC utføres på 24-brønns flatbunnsplater.

  1. Etter 48 timer med sub-culturing (dag 8), vaske celler to ganger med DPBS. Fest celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter.
  2. Vask celler tre ganger med DPBS, 5 minutter per vask. Pre-blokk celler i 1 time ved romtemperatur i DPBS med 5% esel serum og 0,3% Triton X-100 (v / v).
  3. Inkuber med primære antistoffer: mus anti-human-PECAM1 (1:100, lager 0,5 mg/ml), kanin anti-human-TJP1 (1:200, lager 0.53 mg/ml), mus anti-human-CLDN5 (01:200, lager 0,5 mg/ml), mus anti-human-OCLN (1:200, lager 0,5 mg/ml) og kanin anti-human-SLC2A1 (1:100, lager 0,2 mg/ml) i DPBS som inneholder 5% esel serum over natten ved 4 °C.
    1. Skyll celler en gang med DPBS og vask deretter fem ganger i 5 minutter per vask med DPBS.
  4. Inkuber celler med sekundære antistoffer: esel-anti-kanin Alexa Fluor 555 (1:200) og esel-anti-mus 488 (1:200) i DPBS som inneholder 5% esel serum i 1 time.
  5. Etter denne inkubasjonen, tilsett Hoechst 33342 trihydroklorid trihydrat fortynnet (1:1000) i DPBS i 10 minutter.
    1. Fjern Hoechst 33342 oppløsning og skyll en gang med DPBS og vask fire ganger med DPBS i 5 minutter per vask.
  6. Visualiser celler på fluorescensmikroskoper for å se etter uttrykk og lokalisering av cellebeslutningstakere.

8. TEER-måling og analyse

MERK: Corning 12-Transwell filtrerte plater er utstyrt med filtre bestående av 1,12 cm2 polyetylenterephthalate membraner og 0,4 mikrometerporer. TEER-målinger oppnås i tekniske (3 per brønn) og biologiske replikeringer (3 brønner per cellelinje og/eller tilstand).

  1. 24 timer etter sub-culturing (dag 7), måle TEER ved hjelp av spisepinne elektroder og en voltohmmeter hver 24 timer. Se brukerhåndboken voltohmmeter for spesifikke instruksjoner om hvordan du oppnår målinger.
    1. For å måle TEER, lad voltohmmeterinstrumentet kvelden før. Tørk lett av instrumentet og spisepinneelektrodene med 70 % etanol før du plasserer dem i sikkerhetshetten.
    2. Slå på strømmen og kalibrer ohmmåleren som anbefalt av produsenten.
    3. Plugg inn spisepinneelektrodene og skyll elektrodene med 70% etanol etterfulgt av DPBS.
    4. Plasser den kortere endeelektroden i transbrønninnsatsen (det apikale kammeret) og den lengre enden inn i basolateralkammeret.
    5. Mål først en tom brønn som bare er belagt med COL4/FN. Deretter måler du de andre brønnene.
    6. Skyll spisepinneelektroder raskt med 70 % etanol etterfulgt av DPBS ved måling av ulike forhold (f.eks. måling av forskjellige cellelinjer).
  2. Etter at alle målinger (Ω) er registrert, skyll spisepinneelektroder med 70% etanol og deretter sterilt vann. Tørk elektroden forsiktig og la den lufttørke i sikkerhetshetten.
  3. Gjennomsnittlig triplicate TEER-verdier (i Ω) fra den tomme brønnen og trekk denne gjennomsnittsverdien fra hver rå TEER-verdi etter betingelse.
    1. Gjennomsnittlig de frasporede verdiene og multipliser dem med 1,12 cm2 (overflatearealet på 12-transwell innsatsen).
    2. Bruk transformerte verdier fra trinn 6 til å generere grafen som viser TEER-verdi og standardfeil for hver dag med TEER-måling.

9. Efflux Transporter Aktivitet og analyse

MERK: Efflux transporter aktivitetsanalyse utføres på en 24-brønns flat bunnplate. Efflux transportører av interesse inkluderer ABCB1 og ABCC1. Det anbefales at hver tilstand skal utføres i triplikate med kontrollbrønner (det vil si tomme brønner uten de respektive hemmerne).

  1. Etter 48 timer med sub-culturing (dag 8), inkubere celler med 10 μM Valspodar (ABCB1 hemmer) eller 10 μM MK571 (ABCC1 hemmer) i 1 time ved 37 °C.
    1. Forbered 10 mM Valspodar lager ved å oppløse 5 mg pulver (1214,64 g/mol) i 412 μL DMSO og fortynne til arbeidskonsentrasjon på 10 μM. For eksempel, for å lage 10 ml hESFM med 10 μM Valspodar, bland 10 μL av 10 mM Valspodar lager med 10 ml hESFM.
    2. Forbered 10 mM MK571 lager ved å oppløse 5 mg pulver (537,07 g/mol) i 931 μL og fortynne til arbeidskonsentrasjon på 10 μM. For eksempel, for å lage 10 ml hESFM med 10 μM MK571, bland 10 μL av 10 mM MK571 lager med 10 ml hESFM.
  2. Etter 1 time inkubere celler med 10 μM rhodamin 123 (ABCB1 substrat) eller 10 μM 2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate (H2DCFDA, ABCC1 substrat) med eller uten sine respektive hemmere i 1 time ved 37 °C.
    1. Forbered 10 mM rhodamin 123 ved å oppløse 10 mg pulver (380,82 g/mol) i 875 μL DMSO og fortynne til arbeidskonsentrasjon på 10 μM. For eksempel, for å lage 10 ml hESFM med 10 μM rhodamin 123, bland 10 μL av 10 mM rhodamin 123 lager med 10 ml hESFM.
    2. Forbered 10 mM H2DCFDA ved å oppløse 50 mg pulver (487,29 g/mol) i 10,26 ml DMSO og fortynne til arbeidskonsentrasjon på 10 μM. For eksempel, for å lage 10 ml hESFM med 10 μM rhodamin 123, bland 10 μL av 10 mM rhodamin 123 lager med 10 ml hESFM.
  3. Vask celler to ganger med 0,5 ml DPBS og lyse ved hjelp av DPBS som inneholder 5% Triton-X (v/v).
  4. Mål fluorescens av de lysede cellene ved hjelp av en multiplate- eller mikroplateleser (se materialliste).
    1. Sett fluorescerende plateleserinstrument til 485 nanometer eksitasjon og 530 nanometerutslipp og måle fluorescens ved disse bølgelengdene.
    2. For brønner som ikke brukes i transportøranalysen, vask celler to ganger med DPBS før du fester dem med 4% PFA for cellekjerner kvantifisering.
  5. Inkuber celler med Hoechst 33342 trihydrokloridtrihydrat fortynnet (1:1000) i DPBS i 10 minutter. Bilde flere visuelle felt i hver brønn for å beregne gjennomsnittlig cellekjerner teller ved hjelp av fluorescensmikroskoper.
  6. Telle kjerner ved hjelp av Fiji og normalisere fluorescens verdier på en per celle basis til disse tellingene.
    1. Beregn gjennomsnittlig akkumulering av fluorescens ved å trekke rå fluorescens akkumuleringsverdi for hver betingelse fra sin respektive blanke verdi.
    2. Gjennomsnittlig trukket verdier for hver betingelse.
    3. Del gjennomsnittsverdier fra trinn 9.6.1 med gjennomsnittlig celletall. Bruk disse verdiene til å normalisere fluorescensverdier per celle.
    4. Bruk normaliserte verdier til å generere en grafisk representasjon for hver inhibitortilstand og utføre enhver nødvendig statistisk analyse.

10. Passaging, utvide og Kryopreservere BMV

  1. Etterfyll dag 8 BMEC kulturer med frisk hESFM supplert med fortynnet (1:200) B27 og la cellene utvide i to dager på COL4 / FN matrise.
  2. Coat en ny 12-Transwell filtrert plate og en 24-brønns flat bunnplate med 400 μg / ml COL4 og 100 μg / ml FN og inkuber i 4 timer.
  3. På dag 10 vasker du celler med DPBS og inkubere med 1 ml enzymatisk EDTA i minst 15 minutter ved 37 °C til en enkeltcellesuspensjon oppnås.
  4. Samle celler via sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    1. For å kryopreserve disse cellene, resuspend celle pellets med frisk hESFM med 30% Fetal Bovine Serum (FBS) og 10% DMSO.
    2. Oppbevar iPSC-avledede BMECer i kryopreserverte hetteglass i en isopropanolbeholder de første 24 timene ved -80 °C, og plasser deretter i flytende nitrogen for langtidslagring ved -160 °C.
    3. For å passere disse cellene, resuspend celle pellets med frisk hESFM supplert med fortynnet (1:200) B27.
  5. Frøceller på belagte plater tilberedt i trinn 10.2. Frøceller ved hjelp av et forhold på 1 brønn av en 6-brønns plate til 3 brønner av en 12-transwell filtrert plate og til 6 brønner av en 24-brønns plate. La cellene vokse og utvide i 24 timer.
  6. På dag 11 måler du TEER ved å følge trinnene som er oppført i trinn 8.
  7. På dag 12 utfører du ICC ved å følge trinnene som er oppført i trinn 9.
  8. For å tine kryopreserverte BMV-er, legg de kryoserverte hetteglassene i et varmt vann eller perlebad ved 37oC. Deretter overfører de tinte BMECene til 5 ml hESFM supplert med fortynnet (1:200) B27.
    1. Samle celler via sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspend cellene i hESFM supplert med fortynnet (1:200) B27, 10 μM RA og 10 μM Y-27632.
    2. Etter 24 timer, bytt medium til hESFM supplert med fortynnet (1:200) B27 og 10 μM Y-27632 uten RA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BMEC differensiering
Noen kritiske trinn i denne protokollen bør følges nøyaktig (figur 1). E6 middels bruk på dag 1 er viktig, siden det ofte brukes til å utlede nevroekodær avstamning fra iPSCer innen relativt kort tid gir reproduserbare resultater på tvers av flere cellelinjer36. Et annet viktig skritt er på dag 4 av differensiering, hvor E6 medium bør byttes til hESFM med fortynnet (1:200) B27, 20 ng / ml bFGF og 10 μM RA for å utvide iPSC-avledede BMV- er. Tillegg av B27 supplement brukes som et alternativ til storfe serum for å støtte serum-fri celle culturing1,bFGF er lagt til for å lette veksten av iPSC-avledede BMECs6, og RA brukes til å lette utviklingen av BBB fenotype35. Det siste viktige trinnet innebærer rensingsstadiet, der dag 6 iPSC-avledede BMECer er subkulturert på en COL4/FN-belagt plate for å velge iPSC-avledede BMECer1,6,35,36. Figur 2 viser den morfologiske overgangen fra iPSCer til BMECer. Etter en dag med E6 medium (dag 1), er cellulær morfologi lik iPSCs. Ved dag 4 av E6 begynner cellene å virke synlig forskjellig fra iPSCer og dekker det meste av brønnen (~ 90% samløpet). På dag 6, mens kultivert i hESFM med fortynnet (1:200) B27, 20 ng / ml bFGF og 10 μM RA, begynner cellulær morfologi å ha et langstrakt og brosteinsutseende. På dag 8 er hver enkelt celle distinkt i et stort brosteinsmønster. En spirende analyse ble utført for å demonstrere det angiogene potensialet til iPSC-avledede BMECer, noe som resulterte i rørlignende strukturer etter 3 dager med VEGFA165-behandling (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Disposisjon for differensiering av menneskelige iPSCer til BMECer. Humane iPSCer ble opprinnelig dyrket i stamcellemedium som inneholdt 10 μM Y-27632 i 24 timer før medium skiftes til E6 i 4 dager. På dag 4 ble mediet endret til hESFM med (1:200) B27 supplement, 20 ng/ml bFGF og 10 μM RA i 2 dager. På dag 6 ble cellene subkulturert på COL4/FN-belagte plater. På dag 7 ble mediet endret til hESFM med B27 supplement uten bFGF og RA og TEER ble målt. På dag 8 ble icc- og effluxtransportøraktivitetsanalyser utført. iPSC-avledede BMECer ble utvidet til dag 10 før de ble sendt til en transbrønnplate eller en 24-brønns flat bunnplate for TEER-måling og ICC-analyse. Dag 8 BMV-er ble brukt til spirende analyse (ikke avbildet). 2 brønner av en 6-brønns plate med iPSC-avledede BMECer ble samlet inn og lagret i hESFM med 10% DMSO og 30% FBS ved -80 °C og deretter i flytende nitrogen for langtidslagring ved -160oC. På dag 12 ble det observert en topp i TEER-verdien i utvidede iPSC-avledede BMECer på hvilket tidspunkt ICC ble utført. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Lysfeltsbilder som viser differensiering av iPSCer til BMECer. Etter en dag med kultur i E6 medium beholder iPSCer sin karakteristiske morfologi. På dag 4 i E6 medium, cellulær morfologi vises tydelig forskjellig fra iPSCer. På dag 6 endres cellulær morfologi til et langstrakt og brosteinsutseende. På dag 8 ser cellene store ut og med et brosteinsmønster. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Angiogent potensial for iPSC-avledede BMECer. Renset iPSC-avledede BMECer ble seeded på 100.000 celle / cm2 på kjeller membran matrise i hESFM med (1:200) B27 supplement og 40ng / ml VEGFA165. Rørlignende strukturer dukket opp etter 3 dager med VEGFA165 behandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Renset iPSC-avledede BMECer ble seeded på 100.000 celle / cm2 på kjeller membran matrise i hESFM med (1:200) B27 supplement og 40ng / ml VEGFA165. Rørlignende strukturer dukket opp etter 3 dager med VEGFA165 behandling.

BMEC-karakterisering ble utført ved hjelp av immunocytokjemi for cellespesifikke markører. iPSC-avledede BMV-er ble vurdert for tilstedeværelse av tette koblingsproteiner (OCLN, TJP1 og CLDN5), som ofte uttrykkes i de tette kryssene av hjerneendeotelceller3 og endotelceller i lunge,lever og nyre18. Andre markører som PECAM1 og SLC2A1, har tidligere blitt brukt som markører for rensede BMECer6. PECAM13 og SLC2A4 uttrykkes begge i vaskulære endotelceller i BBB. De iPSC-avledede BMEC-ene som genereres ved hjelp av denne protokollen, uttrykte alle fem markørene (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Markøranalyse av iPSC-avledede BMECer. Humane iPSC-avledede BMECer ble farget for tett veikryss (OCLN, TJP1, CLDN5), tilstrømningstransportør (SLC2A1) og tilhengere av proteiner (PECAM1). OCLN-, TJP1- og CLDN5-proteiner er primært lokalisert i cellemembranen. SLC2A1 og PECAM1 er lokalisert i både kjerner og cellemembran. Hoechst 33342 trihydrokloridtrihydrat ble brukt til kjernefysisk farging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å karakterisere BBB-funksjonen til BMV-er ble TEER målt 24 timer (dag 7) etter sub-culturing og mediet ble endret til hESFM med fortynnet (1:200) B27 uten bFGF og RA. TEER-målinger ble oppnådd fra dag 7 i differensiering (dag 0 av TEER-måling) og nådde en topp på ~2000 Ω x cm2 på dag 8 eller 48 timer etter sub-culturing BMV(figur 5). Disse TEER-verdiene er innenfor området som er beskrevet for co-kultiverte iPSC-avledede BMECer med rotte primære astrocytter37. IPSC-linjen hadde ingen merkbar BBB-funksjon i henhold til deres lave TEER-verdier.

Figure 5
Figur 5: TEER-målinger i iPSC-avledede BMECer. TEER-verdiene toppet seg etter en dag med underkultur på COL4/FN-matrise (på dag 8 av differensiering). TEER-målinger ble oppnådd i tekniske (3 tiltak per brønn) og biologiske replikeringer (3 brønner per cellelinje). Den tekniske gjennomsnittsverdien fra en tom brønn ble trukket fra rå TEER-verdier. Disse verdiene ble i gjennomsnitt for hver dag og multiplisert med 1,12 cm2 (overflateareal av 12-transwell innsats). Feilfelt representerer standardfeil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å evaluere aktiviteten til ABCB1 og ABCC1 effluxtransportør ble mengden fluorescerende substrat tatt opp for ABCB1 og ABCC1 kvantifisert etter inkubasjon med sine respektive inhibitorer. Som forventet førte hemming av ABCB1 og ABCC1 efflukstransportere med PSC833 (ABCB1-hemmer) eller MK-571 (ABCC1-hemmer) til en økning i rhodamin 123 (R123) eller 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA), henholdsvis (figur 6). Dette beviset tyder på at BMV-er avledet ved hjelp av denne protokollen har efflux transporter aktivitet.

Figure 6
Figur 6: Efflux Transporter-aktivitet i iPSC-avledede BMECer. Efflux transportør aktivitet i BMECs ble bestemt ved å kvantifisere akkumulering av rhodamin 123 (R123) eller 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) i tilstedeværelse eller fravær av PSC833 (ATP bindende kassett underfamilie B medlem 1 (ABCB1) hemmer) eller MK-571 (ATP bindende kassett underfamilie C medlem 1 (ABCC1) hemmer). Tekniske triplikater ble utført for hver tilstand (N=1). Fluorescensverdier fra kontrolltilstanden (f.eks. uten inhibitorer) ble trukket fra rå fluorescensverdier. Disse fluorescens akkumulering ble normalisert på en per celle basis for hver teknisk repliker. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av student t-test fra de tre tekniske repliker. Det ble ikke observert statistisk signifikans mellom akkumulering av R123 og uten ABCB1-hemmer (t-stat= -1,66, p=0,11). Statistisk signifikans ble observert mellom akkumulering av H2DCFDA med og uten ABCC1-hemmer (t-stat=-7,23, p=0,04). *p<0,05. Feilfelt representerer standardfeil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Passaging, utvide og kryobe reservere iPSC-avledede BMECer
Et annet mål var å undersøke om iPSC-avledede BMV-er kunne bli passasjer og kryopreservert etter sub-culturing. For dette formålet fikk dag 7 iPSC-avledede BMECer lov til å utvide til dag 10 før de ble sendt på nybelagte COL4/FN 12-transwell filtrerte plater for TEER-måling og 24-brønns flatbunnsplate for ICC-analyse (figur 7). Ved hjelp av denne tilstanden fortsatte iPSC-avledede BMEC-er å spre seg, opprettholdt uttrykket for OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 og PECAM1 (figur 8), og fortsatte å opprettholde riktige TEER-verdier (topp på ~ 2000 Ω x cm2) etter passaging (figur 9). Kryopreserverte BMV-er ble senere tint, utvidet og deretter passasjer (figur 7). TEER-målinger av BMV-er ble oppnådd 24 timer etter tining og flere dager etter det. TEER-målinger av disse ettertinne BMV-ene ble redusert (på bare 800 Ω x cm 2 )sammenlignetmed nyavledede BMECer. En annen passaging av innlegg tint BMV-er viste enda lavere TEER-verdier (på topp på bare 200-300 Ω x cm2) (figur 9) og viste frynsete og/eller fregnete mønstre i den tette koblingsformasjonen (figur 10). Western blot analyse48 viste at iPSCs primært uttrykten en endodermal markør (SOX17)49 og noen tette veikryss markører (OCLN), men ikke andre BMEC relaterte markører (TJP1, CLDN5, og SLC2A1) (Figur 11). BMECs uttrykte primært endotelrelaterte markører (TJP1, CLDN5, OCLN og SLC2A1), med lave nivåer av endodermal markør, SOX17.

Figure 7
Figur 7: Bright Field Bilder av utvidede og kryoserverte iPSC-avledede BMECer. A) Dag 10 (4 dag etter innledende underkultur) celler nådd maksimal samløpet. B) Dag 11, 24 timer etter passaging på COL4/FN belagt 24-brønner plate. C) Dag 12, 48 timer etter passaging på COL4 / FN belagt 24-brønner plate; teerverdier ble observert og ICC ble utført. D) 48 timer etter tint iPSC-avledede BMECer på COL4/FN belagt 6-brønner plate; celler ble tidligere kryopreservert ved 1,2 x 102 celler/ml. E) 24 timer etter at post-tint iPSC-avledede BMECer ble sendt på COL4 / FN belagt 6-brønner plate. F) 48 timer etter at post-tinte iPSC-avledede BMECer ble passasjer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: ICC av iPSC-avledede BMECer etter passaging. BMEC-er ble passasjer og vedlikeholdt på COL4/FN-matrisen frem til dag 12, da TEER-verdiene nådde toppen. BMECs på dag 12 ble farget for tett veikryss (OCLN, TJP1, CLDN5), tilstrømning transportør (SLC2A1) og adherens junction (PECAM1) proteiner. Uttrykksmønsteret og lokaliseringen ligner de som observeres under forhold der passaging ikke ble utført, som vist i figur 4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Sammenligning av TEER-målinger i iPSCer, ikke-passasjer BMECer, passasjer BMECer, kryoreserverte BMV-er og kryoreserverte og passasjer BMV-er. På dag 1 nådde TEER-verdiene for bMECer som ikke er passasjer, men ikke iPSCer eller kryoserverte BMECer. Kryopreserverte BMV-er hadde moderate TEER-verdier mellom dag 3 og 7, med enda lavere TEER-verdier for de kryoserverte og passasjer bMECene. iPSC-er viste ingen målbare TEER-verdier mellom dag 0 og 9. TEER-målinger ble oppnådd i tekniske (3 målinger per brønn) og biologiske replikeringer (3 per cellelinje). Den tekniske gjennomsnittsverdien fra en tom brønn ble trukket fra de rå TEER-verdiene. Disse verdiene ble i gjennomsnitt for hver dag og multiplisert med 1,12 cm2 (overflateareal av 12-transwell innsats). Feilfelt representerer standardfeil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: ICC av kryoreserverte og passasjer BMECer. BMEC-er ble passasjer og vedlikeholdt på COL4/FN til topp-TEER-verdier ble observert. BMECs ble farget for tett veikryss (OCLN, TJP1, CLDN5), tilstrømningstransportør (SLC2A1) og tilhengere av proteiner (PECAM1). Uttrykksmønsteret for tette koblingsmarkører virket frynsete og/eller fregnet sammenlignet med bMECer uten passasje (figur 4) og passasjer BMECer (figur 8). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Vestlig blot analyse av iPSCer, ikke-passasjer BMECer, passasjer BMECs, og kryoreservert & passasjer BMV. Vestlige flekker som viser nivåer av TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 og lastekontroll (GAPDH). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endringer og feilsøking

I denne protokollen gjorde vi noen endringer i bruk av en vanlig brukt ekstracellulær matrise og cellekulturmedier under iPSC-dyrking for avledning av BMB(figur 1). Disse endringene påvirket ikke muligheten til å utlede BMECS fra menneskelige iPSCer som beskrevet i Lippmann-protokollen1. En iPSC-linje fra en annen sunn donor ble brukt til å vise at denne modifiserte protokollen viser resultater som kan sammenlignes med tidligere studier med andre linjer1. For kryopreservasjon ble B27-tillegg brukt i stedet for 1% blodplatefattig plasmaavledet serum (PDS)40,men dette påvirket BMEC-gjengivelse i påfølgende kultering. Når det gjelder feilsøking, kan TEER-verdier svinge raskt før de stabiliserer seg. Denne svingningen kan skyldes temperaturendringer når platene flyttes fra 37 °C til romtemperatur37. For å overvinne dette problemet, bør målinger tas raskt, effektivt og konsekvent. Om nødvendig kan temperatureffekter tas med i beregningen ved hjelp av en matematisk formel levert av Blume et al. 200949 for å oppnå temperatur korrigerte TEER-verdier.

Begrensninger i denne protokollen

Til tross for å oppnå BMV-er med en robust BBB fenotype (det vil si høy TEER-verdi), fortsetter det å opprettholde denne BBB-egenskapen i en lengre periode å være en stor utfordring. Som vist her, topp TEER verdier (~ 2000 Ω x cm2) ved hjelp av denne protokollen var mye lavere enn tidligere rapportert peak TEER verdier (~ 8000 Ω x cm2)1. Til tross for denne observasjonen falt TEER-verdiene innenfor det vanlige området (2000-8000 Ω x cm2) av tidligere rapporterte verdier1. En annen begrensning er variasjonen i topp TEER-verdier som skyldes forskjellige iPSC-linjer som brukes, som er observert i andre versjoner av denneprotokollen 36. Variasjonen mellom ulike cellelinjer kan skyldes vekst og ekspansjonshastighet for hver iPSC-linje, som påvirkes av miljøfaktorer51. En annen begrensning er relatert til kryopreservation, da vår protokoll ikke opprettholdt BMEC-gjengivelse. Det er mulig at 1% PDS40 gir større stabilitet av BMV-er under kryopreservation.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder

De iPSC-avledede BMEC-ene gir celler som har den genetiske bakgrunnen til bestemte individer, noe som er verdifullt for å utnytte disse cellene til studiet av sykdomsbiologi. Dette er ikke tilfelle når du bruker dyremodeller eller primære BMEC kulturer hentet fra andre dyr37. Videre viser in vitro primære BMEC-kulturer lave TEER-verdier (~ 100 Ω x cm237), mye lavere enn de som oppnås med menneskelige iPSC-avledede BMV-er med protokollen som er beskrevet her. Denne modifiserte protokollen gir en detaljert metode for å skaffe menneskelige BMECer fra iPSCer, med potensial til å utvide og vedlikeholde dem for lengre bruk. Evnen til å passere og lagre differensierte BMV-er kan gi allsidighet og fleksibilitet i eksperimentell design, spesielt når du studerer flere cellelinjer samtidig. Basert på disse resultatene kan iPSC-avledede BMV-er utvides og passeres etter det første sub-culturing trinn (Figur 7, Figur 8 og Figur 9), men kryopreservation trenger videre undersøkelse. Denne protokollen kan også brukes sammen med andre stamcellebaserte cellulære modeller for å utvikle innovative tilnærminger som vaskularisering av hjerneorganoider. Nåværende metoder for å generere hjerneorganoider resulterer i en ufullstendig rekonstituering av celletyper av den menneskelige hjernen siden de mangler endotelceller og kritiske elementer i den nevrovaskulære enheten som utgjør BBB52,53. Protokollen som er beskrevet her, kan gi en tractable og reproduserbar tilnærming ved hjelp av todimensjonale Transwell / co-culturing systemer som er billigere og enklere å implementere enn 3D-modeller.

Fremtidige anvendelser av denne protokollen

Denne protokollen kan benyttes til å studere rollen som nevrovaskulatur og BBB i nevropsykiatriske lidelser som schizofreni og bipolar lidelse, hvor underskudd i nevrovaskulaturen har blitt hypotetisk til å spille enrolle 9,10,20,54,55. Tidligere versjoner av denneprotokollen 36 hadde blitt brukt til å utlede BMECer fra iPSC-linjer av pasienter med Huntington sykdom7 og 22q sletting syndrom pasienter med schizofreni43. Beggestudiene 7,43 viste vellykket utnyttelse av denne metoden for å undersøke paracellulær og/ eller transcellulær funksjon relatert til BBB. Noen bekymringer har blitt reist om de potensielle forvirrende effektene av dyreserum i tidligere protokoller1. Den serumfrie protokollen som brukes her, fjerner denne bekymringen samtidig som den gir lignende resultater til tidligere protokoller for utleding av BMV-er.

Kritiske trinn for differensiering og utvidelse av BMV-er

Det er fire kritiske trinn når du implementerer denne protokollen. Først er såing av iPSCer med optimal tetthet (det vil at såing på ~ 15 600 celler / cm2) er viktig for effektiv BMEC differensiering. Hvis celletettheten er for høy eller for lav etter dag 4 differensiering, kan kulturer vise større forekomst av cellulær heterogenitet56. Et annet viktig trinn er induksjon av differensiering mellom dag 1 og dag 4, hvor E6 medium brukes til å initiere differensiering. E6 benyttes i stedet for det "ubetingede mediet" som ble brukt i tidligereprotokoller 6,35. Ikke bare kutter E6 medium ned differensieringstiden fra 13 dager til 8 dager, men det fremmer også uttrykket for tette koblingsproteiner (TJP1, OCLN, CLDN5) og BMEC-markører (PECAM1 og SLC2A1)36. Bruk av E6-medium resulterte også i riktige TEER-verdier (figur 5) og ABCB1 og ABCC1 effluxtransportøraktivitet (figur 6)6,35. For det tredje, bruk av B27 i stedet for storfe serum tillatt for serumfri tilstand, noe som forbedret konsistensen og påliteligheten av BMEC differensiering1. Til slutt, når det gjelder å utvide iPSC-avledede BMECer, bør cellene passeres når de når ~ 100% samløpet. Basert på denne protokollen kan iPSC-avledede BMECer utvides ytterligere og passeres etter det første sub-culturing-stadiet (figur 7, figur 8 og figur 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (til R.K.), en National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). en National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (til R.K.), en Sydney R Baer Jr Foundation Grant (til P.L.) Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (til R.K.), Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (til R.K.), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (til R.K.), Harvard Stem Cell Institute (til R.K.) og av Steve Willis og Elissa Freud (til R.K.). Vi takker dr. Annie Kathuria for hennes kritiske lesing og tilbakemeldinger på manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 165 Human indusert pluripotente stamceller mikrovaskulære endotelceller blodhjernebarriere trans-endotel elektrisk motstand transportøraktivitet mikrovaskulær schizofreni bipolar lidelse passaging ekspansjon kryopreservation
Avledning, utvidelse, kryopreservasjon og karakterisering av mikrovaskulære endotelceller fra humane induserte pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya,… More

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter