Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Вывод, Расширение, Криоконсервация и Характеристика микрососудистых эндотелиальных клеток мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

Этот протокол подробно адаптированный метод для получения, расширения и криопресервного мозга микрососудистых эндотелиальных клеток, полученных путем дифференциации человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, а также для изучения свойств гемового барьера мозга в модели ex vivo.

Abstract

Микрососудистые эндотелиальные клетки мозга (BMECs) могут быть дифференцированы от индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) для разработки ex vivo клеточных моделей для изучения функции гемового мозга барьера (BBB). Этот измененный протокол содержит подробные шаги по получению, расширению и криопресервированию БМЕК от человеческих iPSCs с использованием различных доноров и реагентов, чем те, которые сообщалось в предыдущих протоколах. iPSCs обрабатываются с существенным 6 средних в течение 4 дней, а затем 2 дней человека эндотелиальной сыворотки свободной культуры среды дополняется основным фактором роста фибробластов, ретинойной кислоты и B27 дополнения. В день 6, клетки суб-культурных на коллагена / фибронектина матрицы в течение 2 дней. Иммуноцитохимия проводится в день 8 для анализа маркеров BMEC с использованием CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 и SLC2A1. Западный blotting выполняется для подтверждения выражения маркера BMEC, и отсутствие SOX17, эндодермальный маркер. Ангиогенный потенциал демонстрируется с прорастания анализа. Транс-эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) измеряется с помощью электродов палочки и вольтомметра, начиная с 7-го дня. Деятельность транспортера Efflux для АТФ, связывающего кассетный субсемейный член B 1 и АТФ, связывающего кассетный субсемейный член C 1, измеряется с помощью многоэтажного считыватель на 8-й день. Успешное выведение BMECs подтверждается наличием соответствующих клеточных маркеров, низким уровнем SOX17, ангиогенным потенциалом, транспортерной активностью и значениями TEER 2000 Ω x cm2. BMECs расширены до дня 10 перед passaging на свежеокрашенных коллагена / фибронектина пластин или криоконсервированных. Этот протокол демонстрирует, что BMECs, полученные iPSC, могут быть расширены и пролететь по крайней мере один раз. Однако снижение значений TEER и более низкая локализация маркеров BMEC наблюдались после криоконсервации. БМЕК могут быть использованы в экспериментах совместной культуры с другими типами клеток (нейроны, глиа, перициты), в трехмерных моделях мозга (орган-чип и гидрогель), для васкуляризации органоидов мозга, а также для изучения дисфункции BBB при нейропсихиатрических расстройствах.

Introduction

Функция гемово-мозгового барьера
Гемово-мозговой барьер (BBB) образует границу, которая ограничивает движение веществ из крови в мозг. BBB состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга (BMECs), которые образуют монослой, выстилающий сосуды. БМЕК вместе со астроцитами, нейронами, перицитами, микроглией и внеклеточной матрицей образуют нервно-сосудистый блок. BMECs имеют жестко регулируемую параклеточную структуру, которая позволяет BBB поддерживать высокое транс-эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER), которое ограничивает пассивную диффузию и служит индикатором барьернойцелостности 1,2. BMECs также имеют белки, которые помогают с трансклеточного движения, такие как эндоцитоз, трансцитоз, и трансмиграции, а также экстравазии лейкоцитов во время иммунногоответа 3. BMECs полагаться на приток и эффлюкс транспортеров для питания и удаления отходов, для того, чтобы поддерживать гомеостатический баланс в головном мозге3. Например, solute перевозчика семьи 2 члена 1 (SLC2A1) является приток транспортер отвечает за движение глюкозы через BBB4, в то время как efflux транспортеры, такие как ATP связывания кассеты субсемейный член B 1 (ABCB1) и ATP связывания кассеты субсемейный член C 1 (ABCC1) несут ответственность за возвращение субстратов обратно в кровоток3,5,7. ABCB1 субстраты включают морфин, verapamil4, и антипсихотики, такие как оланзапин ирисперидон 8, в то время как транспортер ABCC1 имеет различные субстраты, включая сульфатные конъюгаты, винкристин, и глюкуронидконъюгирует 4.

Применение моделей BBB при психических расстройствах
BBB дисфункция была вовлечена в ряд неврологических и психических расстройств, в том числе шизофрении и биполярногорасстройства 9,10. В последнее время, iPSC полученных ex vivo клеточных моделей в настоящее время используются для допроса клеточных и молекулярных основ психических расстройств, но эти модели в настоящее время не принимают во внимание потенциальную роль, которую играет нейроваскулатура11,12,13. Предполагается, что периферические воспалительные цитокины, циркулирующие вкрови,могут негативно повлиять на BBB14,15,16,17,но есть также доказательства для параклеточных18,19,20,21,22, трансцеллюлярные23,24,25,26,27,28,29,и внеклеточнойматрицы 20,29,30,31,32 аномалии способствует дисфункции BBB. Нарушение BBB может привести к содержанию крови, поступающих в мозг паренхима и активации астроцитов и / или микроглии, чтобы освободить провоспалительные цитокины, которые, в свою очередь, инициироватьвоспалительные реакции 33, которые могут иметь пагубные последствиядля мозга 34. BMECs являются основным компонентом BBB и изучения структуры и функции этих клеток может повысить понимание дисфункции BBB в неврологических и психических расстройств.

Альтернативные модели BMEC
До разработки эффективных протоколов для получения BMECs от iPSCs1,6,35,36, исследователи использовали увековеченные BMECs37 для изучения функции BBB. Тем не менее, многие из этих моделей не смогли достичь желаемого BBB фенотипов, такой физиологический диапазон значений TEER38,39. Использование iPSCs имеет то преимущество, сохраняя генетический фон человека, из которого клетки получены. Ученые активно работают над созданием iPSC-производных ex vivo микросреду модели, которые резюмируют структуру и функцию человеческого мозга. Исследователи разработали методы для получения BMECs, которые структурно и физиологически похожи на BMECs найти in vivo. Методы получения очищенных популяций БМЕК, полученных из iPSC, требуют ряда различных шагов, при этом в последние нескольколет оптимизированы протоколы 1,6,35,36. Как правило, БМЕК, полученные iPSC, культурированы в среде Essential 6 (E6) в течение 4 дней, а затем в течение 2 дней в эндотелиальной сыворотке человека свободной среды (hESFM) дополняется основным фактором роста фибробластов (bFGF), ретинойной кислоты (RA), и B27 дополнения. Клетки затем культури на коллагена IV (COL4) и фибронектина (FN) матрицы для получения 90% однородных BMECs1.

Идентичность БМЕК подтверждается иммунофлуоресценцией, показывающей совместное выражение белков BMEC, включая тромбоцитно-эндотелиарную молекулу адгезии клеток-1 (PECAM1), SLC2A1, и жесткие белки соединения, такие как плотный белок соединения 1 (TJP1), occludin (OCLN) и claudin-5 (CLDN5)6. Прорастание анализы были использованы для подтверждения ангиогенного потенциала IPSC полученных БМЕК. 6 Целостность BMECs BBB оценивается наличием физиологических значений IN vitro TEER (2000 х см2) 37иизмеримой активностью для транспортеров эффлюкса, таких как ABCB1 и ABCC11,6,36. Недавние методологические достижения группы Lippmann привели к iPSC-производным протоколам BMEC с уменьшенной экспериментальной изменчивостью и повышенной воспроизводимостью1. Однако неизвестно, могут ли они быть расширены и выйти за пределы субподготовной стадии. Наш измененный протокол направлен на решение этой проблемы путем прохода BMECs, полученных iPSC, за 8-й день и оценки того, могут ли они быть дополнительно расширены, чтобы сохранить свойства BBB после криоконсервации. Хотя никакие исследования не описали прохождение IPSC полученных BMECs, протокол существует для криоконсервации BMEC, который сохраняет физиологические свойства BBB после прохождения замораживания оттепелицикла 40. Тем не менее, не известно, после криоконсервации BMECs могут быть провечены и сохранить свойства BBB.

BMECs, полученные из iPSCs с помощью протокола Lippmann были использованы для моделирования BBB нарушения неврологических расстройств, таких как болезнь Хантингтона7. Такие БМЕК, полученные iPSC, также использовались для исследования влияния бактериальной инфекции, такой как Neisseria meningitidis или Group B Streptococcus на нарушение гембо-CSF барьера и BBB соответственно41,42. Кроме того, используя IPSC полученных BMECs от 22q удаления синдрома пациентов с шизофренией, исследователи наблюдали увеличение межклеточной молекулы адгезии-1 (ICAM-1), основные молекулы адгезии в BMECs, которые помогают с набором и экстравазиилейкоцитов в мозг 43. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют полезность IPSC полученных БМЕК для изучения BBB нарушения в сложных нейропсихиатрических расстройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Человеческие iPSCs были перепрограммированы из фибробластов здоровых доноров, используяпротокол,утвержденный Институциональный обзор советов Массачусетской больницы общего профиля и больницы Маклин, и характеризуется как описано впредыдущих исследованиях 44,45,46.

ПРИМЕЧАНИЕ: Кратко, фибробласты были перепрограммированы на iPSC через MRNA основе генетического перепрограммирования47. IPSCs были сохранены в среде стволовых клеток (СКМ) (см. список материалов) и хранились при плотности 1,2 х 102 клеток/мл с 1 мл СКМ, 10 МКМ с ингибитором киназы биоассоциированных белков (ROCKi) Y-27632 и 10% (v/v) диметилсульфидом (DMSO), в криоконсервированных флаконах в жидком азоте при -160 градусов по Цельсию. Все следующие процедуры, приведенные ниже, осуществляются в кабинете по биобезопасности, если не указано иное.

1. Подвал мембраны матрицы разбавления и пластины покрытия

  1. Разбавленный (1:50) фактор роста уменьшил мембранную матрицу подвала, очищенную от опухоли Энгельбрет-Холм-Рой в модифицированной игленной среде Дулбекко (DMEM) без фенола красного цвета.
  2. Пластины культуры клеток пальто с соответствующим количеством разбавленной мембранной матрицы подвала (т.е. 6-хорошо пластины 1mL, 12-хорошо пластины 0,5 мл) и инкубировать эти пластины при 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 1 час.

2. Техническое обслуживание iPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное слияние на колодец в 6-хорошо плоской нижней пластины составляет 1,2 х 106 клеток.

  1. Оттепель криоконсервированных iPSCs в СКМ с 10 МКМ Y-27632 и пластины на 6-хорошо пластины покрыты разбавленным фактором роста снижение мембранной матрицы подвала.
  2. Поддерживайте iPSC в СКМ с 10 МКМ Y-27632 в течение первых 24 часов после оттаивания. Переключитесь на свежую среду через 24 часа.
  3. Поддерживайте iPSC в СКМ до тех пор, пока клетки не достигнут 80-90% слияния перед проемом.
    1. Рассчитайте, сколько iPSCs потребуется для дифференциации путем умножения желаемой плотности для дифференциации (15600ячеек/см 2)по площади поверхности колодеца. Для 6-ну плоский дно пластины, умножить 15600 клеток /см 2 на 9,6см 2 в общей сложности 149 760 клеток / хорошо.
  4. Чтобы пройти, мыть клетки с Хэнкса сбалансированного раствора соли (HBBS). Затем инкубировать клетки неизиматической этилендиаминтетраатетической кислотой (ЭДТА) (см. список материалов) в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию.
    1. Используйте сотовый скребок, чтобы аккуратно снять клетки. Соберите ячейки в свежем СКМ.
    2. Плитные клетки на пластинах клеточной культуры, покрытых разбавленным СКМ, и поддерживают клетки, описанные в шаге 2.3, или хранят их на уровне1,2 х 10 6 клеток/мл в 1 мл СКМ, 10 МК Y-27632 и 10% DMSO (v/v) в криоконсервированных флаконах в жидком азоте при температуре -160 градусов по Цельсию.

3. Дифференциация iPSCs на BMECs

ПРИМЕЧАНИЕ: Неизиматический ЭДТА разделяет клетки на сгустки. Энзиматическая ЭДТА (см. таблицу материалов) разделяетклетки на одноклеточную подвеску. Ретинойная кислота (РА) должна быть защищена от света.

  1. Вымойте iPSCs один раз с фосфатным буферным салином Dulbecco (DPBS). Инкубировать с энзиматической ЭДТА (1 мл для 6-хорошо пластины, 0,5 мл для 12-хорошо пластины, и 0,25 мл для 24-хорошо пластины) в течение примерно 5 минут при 37 градусов по Цельсию, чтобы дать одной клеточной подвески.
  2. Соберите клетки и центрифугу при температуре 300 х г (относительная центробежная сила) в течение 5 минут при комнатной температуре. Реуспендные клеточные гранулы в СКМ, содержащие 10 МКМ Y-27632.
  3. Определите плотность клеток с помощью Trypan Blue и автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра устройства. Клетки плиты при плотности 15600клеток/см 2 или 149 760 клеток/хорошо 6-хорошо плоской нижней пластины (с площадью поверхности 9,6см 2/хорошо) в СКМ, содержащей 10 МК Y-27632 в течение 24 часов.
  4. Инициировать дифференциацию через 24 часа, изменив SCM на E6 среды. Изменение E6 среды ежедневно в течение следующих 4 дней.
  5. На 4-й день дифференциации замените E6 medium hESFM, дополненным разбавленной (1:200) добавкой B27, 20 ng/mL bFGF и 10 МКГ РА. Не меняй эту среду в течение следующих 48 часов.
  6. Приготовьте 200 мл hESFM с разбавленным (1:200) B27, смешайте 1 мл 50x концентрированной добавки B27 до 199 мл hESFM.
  7. Подготовьте 20 нг/мл буфера bFGF путем восстановления 50 мкг bFGF в 250 МКЛ буфера Трис (5 мМ Трис, рН 7,6, 150 мМр NaCl), чтобы сделать 200 мкг/мл фондового раствора. Подготовь 200 мл hESFM, содержащий 20 нг/мл bFGF, смешивая 20 мл 200 мкг/мл bFGF с 200 мл hESFM.
  8. Приготовьте 10 МКМ РА, сначала сделав 40 мг/мл раствора запасов РА, добавив 2,5 мл DMSO до 100 мг порошка РА. Разбавить эту концентрацию до 3 мг/мл, чтобы сделать 10 мМ бульонный раствор. Подготовь 200 мл hESFM, содержащий 10 МКМ РА, смешивая 200 МКЛ из 10 МКМ РА в 200 мл hESFM.

4. Покрытие коллагена IV (COL4) и фибронектина (FN) Матрица для очистки IPSC-производных BMEC

  1. Добавьте 2 мл стерильной воды в 2 мг FN, чтобы сделать 1 мг/мл раствора FN бульона. Добавьте 5 мл стерильной воды в 5 мг COL4, чтобы сделать 1 мг/мл раствора COL4.
    1. Разрешить FN растворяться в течение по крайней мере 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию и COL4 растворяться при комнатной температуре.
  2. Разбавить раствор бульона FN в стерильной воде до конечной концентрации 100 мкг/мл и раствор запаса COL4 до конечной концентрации 400 мкг/мл.
  3. Покрыть желаемые пластины (6-хорошо пластины - 1 мл раствора COL4/FN, 12-хорошо пластины 0,5 мл, 24-хорошо пластины 0,25 мл, и 12-трансвелл фильтрованной пластины 0,25 мл) со смесью 400 мкг / мл COL4 и 100 мкг / мл FN.
  4. Инкубационые пластины в течение как минимум 2 часов или на ночь при 37 градусах Цельсия; для трансвелл фильтрованных пластин, как минимум 4 часа рекомендуется.

5. Суб-культура и очистка БМЕК, полученных из iPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация с энзиматической ЭДТА может занять более 15 минут в зависимости от слияния клеток на 6-й день дифференциации.

  1. На 6-й день дифференциации, мыть клетки дважды с DPBS. Инкубировать с 1 мл энзиматической ЭДТА, по крайней мере 15 минут при 37 градусов по Цельсию, пока одна подвеска ячейки не будет получена.
  2. Собирайте клетки с помощью центрифугации при температуре 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Реуспендные клеточные гранулы со свежим hESFM с разбавленной (1:200) добавкой B27, 20 ng/mL bFGF и 10 МКМ РА.
  3. Семенные клетки на пластинах, покрытых смесью 400 мкг/мл COL4 и 100 мкг/мл FN. Семенные клетки, используя соотношение 1 колодец 6-хорошо пластины до 3 скважин 12-хорошо пластины, 3 скважины 12-трансвелл фильтрованной пластины, или 6 скважин 24-хорошо пластины.
  4. Семя недифференцированных iPSCs от той же линии ячейки на COL4/FN покрытием 12-трансвелл фильтрованной пластины, как отрицательный контроль для анализа TEER.
  5. После 24 часов суб-культирования, изменить средний на hESFM с B27 дополнения только. После этого шага не требуется никаких средних изменений.

6. Прорастание анализа

  1. Соберите BMECs, полученные в день 8 iPSC, и посеять их на 100 000 клеток/хорошо на 24-хорошо плоскую нижнюю пластину, недавно покрытую 200 йл/см2 мембранной матрицы подвала.
  2. Лечить эти клетки с hESFM с разбавленным (1:200) B27 и 40 нг/мл сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGFA165).
  3. Наблюдайте за ячейками каждые 24 часа и меняйте носитель каждые два дня.

7. Иммуноцитохимия (ICC)

ПРИМЕЧАНИЕ: МЦК осуществляется на 24-хорошо плоских нижних пластин.

  1. После 48 часов субподряда (день 8), мыть клетки дважды с DPBS. Исправьте клетки с 4% параформальдегидом (PFA) в течение 20 минут.
  2. Вымойте клетки три раза с DPBS, 5 минут на стирку. Предблокираторные клетки в течение 1 часа при комнатной температуре в DPBS с 5% ослиной сывороткой и 0,3% Triton X-100 (v/v).
  3. Инкубация первичными антителами: мышь анти-человек-PECAM1 (1:100, запас 0,5 мг/мл), кролик анти-человек-TJP1 (1:200, запас 0,53 мг/мл), мышь анти-человека-CLDN5 (1:200, запасы 0,5 мг/мл), мышь анти-человек-OCLN (1:200, запас 0,5 мг/мл), и кролика анти-человека-SLC2A1 (1:100, запас 0,2 мг / мл) в DPBS содержащие 5% осла сыворотки на ночь при 4 градусов по Цельсию.
    1. Промыть клетки один раз с DPBS, а затем мыть пять раз в течение 5 минут за стирку с DPBS.
  4. Инкубационые клетки со вторичными антителами: осел-анти-кролик Alexa Fluor 555 (1:200) и осел-анти-мышь 488 (1:200) в DPBS, содержащий 5% ослиной сыворотки в течение 1 часа.
  5. После этой инкубации добавьте тригидрохлорид тригидрат Hoechst 33342 разбавленный (1:1000) в DPBS в течение 10 минут.
    1. Удалите раствор Hoechst 33342 и смойте один раз DPBS и промойте четыре раза DPBS в течение 5 минут за стирку.
  6. Визуализация клеток на флуоресценции микроскопов для искать выражения и локализации клеток органов.

8. Измерение и анализ TEER

ПРИМЕЧАНИЕ: Корни 12-Transwell фильтрованные пластины оснащены фильтрами, состоящими из 1,12см 2 полиэтиленовых терефталат мембран и 0,4 микрометра пор. Измерения TEER получены в техническом (3 на скважину) и биологических репликациях (3 скважины на линию клетки и/или состояние).

  1. Через 24 часа после субподряда (день 7) измеряйте TEER с помощью электродов палочки и вольтомметра каждые 24 часа. Обратитесь к voltohmmeter руководство пользователя для конкретных инструкций по получению измерений.
    1. Для измерения TEER, зарядить вольтомметр инструмент накануне вечером. Слегка протрите инструмент и электроды палочки с 70% этанола, прежде чем поместить их в защитный капюшон.
    2. Включите питание и откалибровать ohm метр в зависимости от рекомендации производителя.
    3. Подключите электроды палочки и промыть электроды с 70% этанола следуют DPBS.
    4. Поместите более короткий конечный электрод в транс-хорошо вставить (апиальная камера) и больше конца в базолатеральной камере.
    5. Первая мера пустой колодец, который покрыт COL4 / FN только. Затем измерьте другие скважины.
    6. Быстро промыть палочкой электродов с 70% этанола следуют DPBS при измерении различных условий (т.е. измерения различных клеточных линий).
  2. После всех измерений (в Ω) были зарегистрированы, промыть палочки электродов с 70% этанола, а затем стерильной воды. Аккуратно протрите электрод и дайте ему высохнуть в защитной капот.
  3. Среднее тройное значение TEER (в Ω) из пустой колодец и вычесть это среднее значение из каждого сырья TEER значение условием.
    1. Средние вычитаемые значения и умножить их на 1,12см 2 (площадь поверхности 12-трансвелл вставки).
    2. Используйте преобразованные значения из шага 6 для создания графика, показывающего значение TEER и стандартные ошибки для каждого дня измерения TEER.

9. Деятельность и анализ транспортера Efflux

ПРИМЕЧАНИЕ: Efflux транспортер деятельности анализ выполняется на 24-хорошо плоский дно пластины. Транспортеры Efflux, представляющие интерес, включают ABCB1 и ABCC1. Рекомендуется, чтобы каждое условие выполнялось в три раза с помощью контрольных скважин (т.е. пустых скважин без соответствующих ингибиторов).

  1. После 48 часов субподготовки (день 8), инкубационые клетки с 10 МК Вальсподар (ингибитор ABCB1) или 10 МКМ MK571 (ингибитор ABCC1) в течение 1 часа при 37 градусов по Цельсию.
    1. Приготовьте запас 10 мМ Вальсподар, растворив 5 мг порошка (1214,64 г/мол) в 412 МКЛ ДМСО и разбавляя до рабочей концентрации 10 МКМ. Например, чтобы сделать 10 мл hESFM с 10 МКМ Вальсподар, смешать 10 МКЛ из 10 мМ Валсподар бульон с 10 мл hESFM.
    2. Приготовьте запас 10 мМ МК571, растворив 5 мг порошка (537,07 г/мол) в 931 л и разбавляя до рабочей концентрации 10 МКМ. Например, чтобы сделать 10 мл hESFM с 10 МК571, смешайте 10 МЛ 10 мМ МК571 с 10 мл hESFM.
  2. Через 1 час инкубируют клетки с 10 ЗМ родамин 123 (субстрат ABCB1) или 10 МК 2',7'-дихлордигидрофлюорецеин диацетат (H2DCFDA, ABCC1 субстрат) с или без их соответствующих ингибиторов в течение 1 часа при 37 градусов по Цельсию.
    1. Приготовьте 10 мМ родамин 123 путем растворения 10 мг порошка (380,82 г/мол) в 875 МКЛ ДМСО и разбавьте к рабочей концентрации 10 МКМ. Например, сделать 10 мл hESFM с 10 мкм родамина 123, смешать 10 МЛ 10 мМ родамин 123 бульона с 10 мл hESFM.
    2. Приготовьте 10 мМ H2DCFDA путем растворения 50 мг порошка (487,29 г/мол) в 10,26 мл ДМСО и разбавляют до рабочей концентрации 10 МКМ. Например, сделать 10 мл hESFM с 10 мкм родамина 123, смешать 10 МЛ 10 мМ родамин 123 бульона с 10 мл hESFM.
  3. Вымойте клетки дважды с 0,5 мл DPBS и лиза с помощью DPBS, содержащего 5% Triton-X (v/v).
  4. Измерьте флуоресценцию лизированных клеток с помощью многоплавного или микропластиного считывателя (см. список материалов).
    1. Установите флуоресцентный прибор для считывания пластин до 485 нанометров и выбросов 530 нанометров и измерьте флуоресценцию на этих длинах волн.
    2. Для скважин, не используемых в анализе транспортера, мыть клетки дважды с DPBS перед фиксацией их с 4% PFA для количественной оценки ядер клеток.
  5. Инкубировать клетки с Hoechst 33342 тригидрохлорид тригидрат разбавленных (1:1000) в DPBS в течение 10 минут. Изображение несколько визуальных полей в каждой хорошо для расчета среднего ядра клеток рассчитывает с помощью флуоресценции микроскопов.
  6. Подсчитайте ядра, использующие Фиджи, и нормализуйте значения флуоресценции на основе каждой клетки по этим подсчетам.
    1. Рассчитайте среднее накопление флуоресценции, вычитая сырое значение накопления флуоресценции для каждого условия из его соответствующего пустого значения.
    2. Средние вычитаемые значения для каждого условия.
    3. Разделите средние значения с шага 9.6.1 на средние значения ячеев. Используйте эти значения для нормализации значений флуоресценции на основе на ячейку.
    4. Используйте нормализованные значения для создания графического представления для каждого условия ингибитора и выполнения любого необходимого статистического анализа.

10. Пассирование, расширение и криоконсервирование БМЕКов

  1. Пополнить день 8 культур BMEC со свежим hESFM дополняется разбавленной (1:200) B27 и позволяют клеткам расширяться еще на два дня на матрице COL4/FN.
  2. Пальто новой 12-Transwell фильтрованной пластины и 24-хорошо плоский дно пластины с 400 мкг / мл COL4 и 100 мкг / мл FN и инкубировать в течение 4 часов.
  3. На 10-й день промывка клеток с DPBS и инкубации с 1 мл энзиматической ЭДТА, по крайней мере 15 минут при 37 градусов по Цельсию, пока одна подвеска ячейки не будет получена.
  4. Собирайте клетки с помощью центрифугации при температуре 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
    1. Чтобы криопресервовать эти клетки, повторно подать клеточные гранулы со свежим hESFM с 30% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 10% DMSO.
    2. Храните BMECs, полученные iPSC, в криоконсервированных флаконах в контейнере изопропанола в течение первых 24 часов при -80 градусов по Цельсию, а затем поместите в жидкий азот для длительного хранения при -160 градусов по Цельсию.
    3. Для прохождения этих клеток, повторного использования клеточных гранул со свежим hESFM дополняется разбавленной (1:200) B27.
  5. Семенные клетки на покрытых пластинах, подготовленных в шаге 10.2. Семенные клетки, использующие соотношение 1 скважины 6-хорошо пластины до 3 скважин 12-трансвелл фильтрованной пластины и 6 скважин 24-хорошо пластины. Разрешить клетки расти и расширяться в течение 24 часов.
  6. На 11-й день измерьте TEER, следуя шагам, перечисленным в шаге 8.
  7. На 12-й день выполните МУС, выполнить следующие шаги, перечисленные в шаге 9.
  8. Чтобы разморозить криоконсервированные БМЕКи, поместите криоконсервированные флаконы в теплую воду или ванну с бисером при 37oC. Затем перенесите размороженые БМЕКи на 5 мл hESFM, дополненные разбавленным (1:200) B27.
    1. Собирайте клетки с помощью центрифугации при температуре 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Повторное ослабление клеток в hESFM дополняется разбавленным (1:200) B27, 10 МКМ РА и 10 МК Y-27632.
    2. Через 24 часа переключитесь средний на hESFM, дополненный разбавленным (1:200) B27 и 10 МК Y-27632 без РА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Дифференциация BMEC
Следует точно следовать нескольким важным шагам в этом протоколе(рисунок 1). E6 среднего использования на день 1 имеет важное значение, так как он часто используется для получения нейроэктодерм линии от iPSCs в течение относительно короткого периода времени дает воспроизводимые результаты через несколько клеточныхлиний 36. Другим важным шагом является на 4-й день дифференциации, где E6 среды должны быть переключены на hESFM с разбавленной (1:200) B27, 20 нг / мл bFGF и 10 МКГ РА для расширения IPSC полученных БМЕК. Добавление дополнения B27 используется в качестве альтернативы сыворотки крупного рогатого скота для поддержкикультирования клеток без сыворотки 1, bFGF добавляется для облегчения роста IPSC полученных BMECs6, и РА используется для облегчения развития фенотипа BBB35. Последний важный шаг включает в себя этап очистки, где день 6 iPSC полученных BMECs суб-культурных на COL4 / FN покрытием пластины для выбора IPSC полученных BMECs1,6,35,36. Рисунок 2 демонстрирует морфологический переход от IPSCs к BMECs. После одного дня E6 среды (день 1), клеточной морфологии похож на iPSCs. К 4-й день E6 клетки начинают заметно отличаются от iPSCs и покрывают большую часть колодец (90% слияния). К 6-му дню, в то время как культурный в hESFM с разбавленным (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF и 10 МКР, клеточная морфология начинает иметь удлиненный и булыжник внешний вид. На 8-й день каждая отдельная клетка отличается большим булыжником. Прорастание анализ был выполнен, чтобы продемонстрировать ангиогенный потенциал IPSC полученных БМЕК, в результате чего трубчатые структуры после 3 дней лечения VEGFA165 (Рисунок 3).

Figure 1
Рисунок 1: Наброски для дифференциации человеческих iPSCs к BMECs. Человеческие iPSCs были первоначально культурны в среде стволовых клеток, содержащей 10 МК Y-27632 в течение 24 часов, прежде чем изменить средний на E6 в течение 4 дней. На 4-й день среда была изменена на hESFM с дополнением B27 (1:200), 20 ng/mL bFGF и 10 МКМ РА в течение 2 дней. На 6-й день клетки были суб-культурны на пластинах с покрытием COL4/FN. На 7-й день, средний был изменен на hESFM с B27 дополнения без bFGF и РА и TEER был измерен. На 8-й день были проведены анализы деятельности МЦК и efflux. BMECs, полученные iPSC, были расширены до 10-го дня, прежде чем их переили на транс-пластину или 24-хорошо плоскую нижнюю пластину для измерения TEER и анализа ICC, соответственно. День 8 BMECs были использованы для прорастания анализа (не изображен). 2 скважины из 6-хорошо пластины IPSC полученных БМЕК были собраны и хранятся в hESFM с 10% DMSO и 30% FBS при -80 градусов по Цельсию, а затем в жидком азоте для длительного хранения при -160oC. На 12-й день пик стоимости TEER наблюдался в расширенных БМЕК, полученных iPSC, после чего был выполнен ICC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Яркие полевые изображения, изображающие дифференциацию iPSCs к BMECs. После одного дня культуры в среде E6, iPSCs сохраняют свою характерную морфологию. На 4-й день в среде E6 клеточная морфология заметно отличается от iPSCs. На 6-й день клеточная морфология меняется на удлиненный и булыжник. Днем 8, клетки появляются большие и с булыжником картины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Ангиогенный потенциал БМЕК, полученных из iPSC. Очищенные BMECs, полученные iPSC, были посеяны на 100 000клеток/см 2 на мембранную матрицу подвала в hESFM с дополнением B27 (1:200) и 40ng/mL VEGFA165. Трубчатые структуры появились после 3 дней лечения VEGFA165. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Очищенные BMECs, полученные iPSC, были посеяны на 100 000клеток/см 2 на мембранную матрицу подвала в hESFM с дополнением B27 (1:200) и 40ng/mL VEGFA165. Трубчатые структуры появились после 3 дней лечения VEGFA165.

Характеристика BMEC была выполнена с использованием иммуноцитохимии для клеточных маркеров. BMECs, полученные iPSC, были оценены на наличие плотных белков соединения (OCLN, TJP1 и CLDN5), которые обычно выражаются в тесных соединениях эндотелиальныхклеток мозга 3 и эндотелиальных клеток в легких, печени ипочках 18. Другие маркеры, такие как PECAM1 и SLC2A1, ранее использовались в качестве маркеров для очищенных BMECs6. PECAM13 и SLC2A4 выражены в сосудистых эндотелиальных клетках BBB. BMECs, полученные iPSC, генерируемые с помощью этого протокола, совместно выразили все пять этих маркеров(рисунок 4).

Figure 4
Рисунок 4: Маркерный анализ БМЕК, полученных из iPSC. BMECs, полученные человеком iPSC, были окрашены для плотного соединения (OCLN, TJP1, CLDN5), транспортера притока (SLC2A1) и придерживается соединения (PECAM1) белков. Белки OCLN, TJP1 и CLDN5 в основном локализованы в клеточной мембране. SLC2A1 и PECAM1 локализованы как в ядрах, так и в клеточной мембране. Для ядерного окрашивания использовался тригидрохлоридный тригидрат Hoechst 33342. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Чтобы охарактеризовать функцию BBB BMECs, TEER был измерен 24 часа (день 7) после субподряда и среда была изменена на hESFM с разбавленным (1:200) B27 без bFGF и RA. Измерения TEER были получены начиная с 7-го дня дифференциации (день 0 измерения TEER) и достигли максимума в 2000 евро Ωх см 2 на 8-й день или 48 часов после субподготовки БМЕКов(рисунок 5). Эти значения TEER находятся в пределах диапазона, описанного для совместно культурных БМЕК, полученных iPSC, с первичными астроцитамикрыс 37. Линия iPSC не имеет каких-либо заметных функций BBB в соответствии с их низкими значениями TEER.

Figure 5
Рисунок 5: Измерения TEER в BMECs, полученных iPSC. Значения TEER достигли своего пика после одного дня субподряда на матрице COL4/FN (на 8-й день дифференциации). Измерения TEER были получены в технических (3 измерения на скважину) и биологических репликациях (3 скважины на линию ячейки). Техническое среднее значение из пустой колодец было вычтено из необработанных значений TEER. Эти значения были усреднежены за каждый день и умножены на 1,12см 2 (площадь поверхности 12-трансвелловой вставки). Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Для оценки активности транспортера ABCB1 и ABCC1, количество флуоресцентного субстрата, взятого на ABCB1 и ABCC1, было количественно подсчитано после инкубации с их соответствующими ингибиторами. Как и ожидалось, ингибирование транспортеров Эффлюкса ABCB1 и ABCC1 с PSC833 (ингибитор ABCB1) или MK-571 (ингибитор ABCC1) привело к увеличению родамина 123 (R123) или 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA),соответственно (рисунок 6). Эти данные свидетельствуют о том, что БМЕКи, полученные с помощью этого протокола, имеют деятельность транспортера эффлюкса.

Figure 6
Рисунок 6: Efflux Транспортер деятельности в iPSC-производных BMECs. Транспортерная активность Efflux в БМЕКа была определена путем количественной оценки накопления родамина 123 (R123) или 2',7'-dichlorodihydrofluorescein диацетата (H2DCFDA ) при наличии или отсутствии ингибитора PSC833 (ингибитор АТФ- связывающей кассеты B члена 1 (ABCB1) или ингибитора MK-571 (ингибитор подсемейной кассеты 1 (ABCC1). Для каждого условия были выполнены технические трипликаты (N-1). Значения флуоресценции из контрольного состояния (т.е. без ингибиторов) были вычтены из необработанных значений флуоресценции. Эти накопления флуоресценции нормализовались на основе каждой клетки для каждой технической репликации. Статистическая значимость была определена с помощью студенческого т-теста из трех технических репликаций. Статистической значимости между накоплением R123 с ингибитором ABCB1 и без него не наблюдалось (t-stat -1.66, p-0.11). Статистическая значимость наблюдалась между накоплением ингибитора H2DCFDA с ингибитором ABCC1 и без него (t-stat-7.23, p-0.04). 0,05 евро. Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Пассирование, расширение и криоконсервирование БМЕК, полученных из iPSC
Другая цель заключалась в том, чтобы выяснить, можно ли пройти и криоконсервированные БМЕК, полученные из IPSC, после субподряда. Для этой цели, день 7 iPSC полученных BMECs было разрешено расширить до 10-го дня, прежде чем передавать их на недавно покрытием COL4/FN 12-трансвелл фильтрованные пластины для измерения TEER и 24-хорошо плоский дно пластины для анализа ICC (Рисунок 7). Используя это условие iPSC полученных BMECs продолжал размножаться, поддерживал выражение OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1, и PECAM1 (Рисунок 8), и продолжал поддерживать надлежащие значения TEER (пик на 2000 Ωх см 2) после прохода (Рисунок 9). Криоконсервированные БМЕКи позже разморозили, расширили, а затем прохождение (Рисунок 7). Измерения TEER BMECs были получены через 24 часа после оттаивания и еще через несколько дней после этого. Измерения TEER этих посттаятых БМЕКов были уменьшены (пик только на 800 Ωх см 2)по сравнению со свежеизведенными БМЕ. Второй проход после оттаяли BMECs выставлены еще ниже TEER значения (пик только на 200-300 Ωх см 2) (Рисунок 9) и показал потертые и / или веснушчатые узоры жесткой формирования соединения (Рисунок 10). Западный анализпомарки 48 показал, что iPSCs в основном выразили эндодермальный маркер (SOX17)49 и некоторые жесткие маркеры соединения (OCLN), но не другие маркеры, связанные с BMEC (TJP1, CLDN5 и SLC2A1) (Рисунок 11). BMECs в основном выраженные эндотелиальные связанные маркеры (TJP1, CLDN5, OCLN и SLC2A1), с низким уровнем эндодермального маркера, SOX17.

Figure 7
Рисунок 7: Яркие полевые изображения расширенных и криоконсервированных BMECs, полученных iPSC. A) День 10 (4 дня после первоначальной суб-культуры) клетки достигли максимального слияния. B) День 11, 24 часа после прохода на COL4/FN покрытием 24-колодцев пластины. C) День12, 48 часов после прохода на COL4/FN покрытием 24-колодцев пластины; наблюдались пиковые значения TEER и был выполнен ICC. D) 48 часов БМЕК, полученных из iPSC, на пластине с покрытием COL4/FN с покрытием 6 скважин; ранее криоконсервированные клетки находились на уровне 1,2 х10 2 клеток/мл. E) через 24 часа после того, как после оттаяли IPSC полученных BMECs были проходят на COL4 /FN покрытием 6-колодцев пластины. F) через 48 часов после прохождения БМЕК, полученных после оттепели iPSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: МЦК БМЕК, полученных из iPSC, после passaging. BMECs были проходные и поддерживается на матрице COL4/FN до 12-го дня, когда значения TEER достигли своего пика. BMECs на день 12 были запятнаны для плотного соединения (OCLN, TJP1, CLDN5), транспортера притока (SLC2A1) и придерживается соединения (PECAM1) протеины. Шаблон выражения и локализация напоминают те, которые наблюдаются в условиях, когда не было выполнено проходное время, как показано на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: Сравнение измерений TEER в iPSCs, непролетных БМЕКах, проходных БМЕКах, криоконсервированных БМЕКах и криоконсервированных и проходных БМЕКах. На 1-й день значения TEER достигли максимума для непроверяемых и проходных БМЕКов, но не iPSCs или криоконсервированных БМЕКов. Cryopreserved BMECs имели умеренные значения TEER между 3 и 7 днями, с еще более низкими значениями TEER для криоконсервированных и проходных BMECs. iPSCs не продемонстрировали каких-либо измеримых значений TEER между днем 0 и 9. Измерения TEER были получены в технических (3 измерения на колодец) и биологических репликациях (3 на линию клетки). Техническое среднее значение из пустой колодец было вычтено из необработанных значений TEER. Эти значения были усреднежены за каждый день и умножены на 1,12см 2 (площадь поверхности 12-трансвелловой вставки). Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 10
Рисунок 10: МЦК криоконсервированных и проходных БМЕКов. BMECs были проходные и поддерживается на COL4/FN до тех пор, пока не наблюдались пиковые значения TEER. BMECs были запятнаны для плотного соединения (OCLN, TJP1, CLDN5), транспортера притока (SLC2A1) и придерживается протеинов соединения (PECAM1). Выражение модели жестких маркеров соединения появились изношенные и / или веснушчатый по сравнению с не проходных BMECs (Рисунок 4) и проходных BMECs (Рисунок 8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 11
Рисунок 11: Западный анализ помарки iPSCs, non-passaged BMECs, проходные BMECs, и криоконсервированные и проходные BMECs. Западные помарки, показывающие уровни TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 и управления погрузкой (GAPDH). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Модификации и устранение неполадок

В этом протоколе мы внесли некоторые изменения в использование широко используемой внеклеточной матрицы и средств культуры клеток во время культивирования iPSC для производных БМЕК(рисунок 1). Эти изменения не повлияли на способность получать BMECS из человеческих iPSCs, как описано в протоколе Lippmann1. Линия iPSC от другого здорового донора была использована, чтобы продемонстрировать, что этот измененный протокол показывает результаты, сопоставимые с предыдущими исследованиями с другимилиниями 1. Для криоконсервации, B27 дополнение было использовано вместо 1% тромбоцитов бедных плазмы полученных сыворотки (PDS)40, но это повлияло на верность BMEC в последующем культивировании. Что касается устранения неполадок, то значения TEER могут быстро колебаться перед стабилизацией. Это колебание может быть результатом изменений температуры, происходящих при перемещается пластины от 37 градусов по Цельсию до комнатнойтемпературы 37. Для решения этой проблемы необходимо проводить измерения быстро, эффективно и последовательно. При необходимости, температурные эффекты могут быть учтены с помощью математической формулы, предоставленной Blume et al. 200949 для получения скорректированных температурных значений TEER.

Ограничения этого протокола

Несмотря на получение BMECs с надежным фенотипом BBB (т.е. высокой стоимостью TEER), сохранение этого свойства BBB в течение длительного периода времени по-прежнему является серьезной проблемой. Как показано здесь, пиковые значения TEER (2000 Ω x cm2) с помощью этого протокола были намного ниже, чем ранее сообщалось пиковые значения TEER (8000 Ωх см 2)1. Несмотря на это наблюдение, значения TEER упали в пределах обычного диапазона (2000-8000 Ω x cm2) ранее сообщенныхзначений 1. Вторым ограничением является изменчивость пиковых значений TEER, которая является результатом различных используемых линий iPSC, которая наблюдалась в других версиях этого протокола36. Различия между различными клеточными линиями могут быть обусловлены темпами роста и расширения каждой линии iPSC, на которые влияют факторы окружающей среды51. Другое ограничение связано с криоконсервации, так как наш протокол не поддерживает верность BMEC. Вполне возможно, что 1% PDS40 обеспечивает большую стабильность BMECs во время криоконсервации.

Значение с уважением к существующим методам

БМЕК, полученные iPSC, обеспечивают клетки, которые имеют генетический фон конкретных людей, что ценно при использовании этих клеток для изучения биологии болезней. Это не тот случай при использовании моделей животных или первичных культур BMEC, извлеченных из другихживотных 37. Кроме того, в пробирке первичные культуры BMEC показывают низкие значения TEER (100 Ωх см 237), что значительно ниже, чем те, которые достигаются с помощью БМЕК, полученных человеком iPSC с протоколом, описанным здесь. Этот измененный протокол содержит подробный метод получения БМЕКа человека от iPSCs, с потенциалом для расширения и поддержания их для более длительного использования. Возможность прохода и хранения дифференцированных БМЕК может обеспечить универсальность и гибкость в экспериментальном проектировании, особенно при изучении нескольких клеточных линий одновременно. Основываясь на этих результатах, BMECs, полученные iPSC, могут быть расширены и протечены после первоначального этапа субподготовки(рисунок 7, рисунок 8 и рисунок 9),но криоконсервация нуждается в дальнейшем исследовании. Этот протокол также может быть использован в сочетании с другими стволовыми клетками на основе клеточных моделей для разработки инновационных подходов, таких как васкуляризация органоидов мозга. Текущие методы для генерации органоидов мозга приводят к неполной реконструкции типов клеток человеческого мозга, поскольку им не хватает эндотелиальных клеток и критических элементов нервно-мышечной единицы, которые составляют BBB52,53. Описанный здесь протокол может обеспечить воспроизводимый и воспроизводимый подход с использованием двухмерных систем Transwell/co-culturing, которые дешевле и проще в реализации, чем 3D-модели.

Будущие применения этого протокола

Этот протокол может быть использован для изучения роли нейроваскулатуры и BBB в нейропсихиатрических расстройств, таких как шизофрения и биполярное расстройство, где дефицит в нейровакулатуре былипредположили,чтобы играть роль 9,10,20,54,55. Предыдущие версии этого протокола36 были использованы для получения BMECs из iPSC линий пациентов сболезнью Хантингтона 7 и 22q синдром удаления пациентов сшизофренией 43. Оба исследования7,43 продемонстрировали успешное использование этого метода для исследования параклеточной и / или трансклеточной функции, связанной с BBB. Некоторые опасения были подняты по поводу потенциального путаницы последствия сыворотки животных в предыдущих протоколах1. Протокол без сыворотки, используемый здесь, устраняет эту озабоченность, создавая аналогичные результаты к предыдущим протоколам для получения BMECs.

Критические шаги по дифференциации и расширению БМЕК

При реализации этого протокола необходимо сделать четыре важных шага. Во-первых, посев iPSCs при оптимальной плотности (т.е. посев на уровне 15600 клеток/см2)имеет важное значение для эффективной дифференциации BMEC. Если плотность клеток слишком высока или слишком низка к 4-му дню дифференциации, культуры могут показывать более высокие показатели клеточной неоднородности56. Вторым важным шагом является индукция дифференциации между 1-м и 4-м днем, где среда E6 используется для инициирования дифференциации. E6 используется вместо «некондиционной среды», которая использовалась в предыдущихпротоколах 6,35. E6 среды не только сократить время дифференциации от 13 дней до 8 дней, но он также способствует выражению жесткой соединения белков (TJP1, OCLN, CLDN5) и BMEC маркеров (PECAM1 и SLC2A1)36. Использование E6 среды также привело к надлежащей TEER значения (Рисунок 5) и ABCB1 и ABCC1 эффлюкс транспортер деятельности (Рисунок 6)6,35. В-третьих, использование B27 вместо сыворотки крупного рогатого скота позволило без сыворотки состояние, которое улучшило консистенцию и надежность дифференциации BMEC1. Наконец, с точки зрения расширения BMECs, полученных iPSC, клетки должны быть протечены, когда они достигают 100% слияния. На основе этого протокола BMECs, полученные iPSC, могут быть дополнительно расширены и протекали после начальной стадии субподготовки(рисунок 7, рисунок 8 и рисунок 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом психического здоровья Биобехавиоальные исследования Награды для инновационных новых ученых (BRAINS) Премия R01MH113858 (К.К.), Национальные институты здравоохранения премии KL2 TR002542 (PL). Национальный институт психического здоровья клинического научного развития премии K08MH086846 (в Р.К.), Сидней R Baer Jr Фонд Грант (P.L.) Дорис Дьюк Благотворительный фонд клинического научного развития премии (R.K.), Райан Лихт Сан Биполярный фонд (в Р.К.), Филлис и Джером Лайл Раппапорт Фонд (К.К.), Гарвардский институт стволовых клеток (R.K.) и Стив Уиллис и Элисса Фрейд (R.K.). Мы благодарим доктора Энни Катурию за ее критическое чтение и отзывы о рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Неврология Выпуск 165 Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки микрососудистые эндотелиальные клетки мозга гемовостой барьер транс-эндотелиальная электрическая устойчивость транспортерная активность микрососудистая шизофрения биполярное расстройство пассирование расширение криоконсервация
Вывод, Расширение, Криоконсервация и Характеристика микрососудистых эндотелиальных клеток мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya,… More

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter