Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin ayırt edilmesiyle elde edilen beyin mikrovasküler endotel hücrelerini türetmek, genişletmek ve kriyoprezerserve etmek ve bir ex vivo modelde kan beyin bariyeri özelliklerini incelemek için uyarlanmış bir yöntemi detaylandırmaktadır.

Abstract

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (VPC'ler), kan-beyin bariyeri (BBB) fonksiyonunu incelemek için ex vivo hücresel modeller geliştirmek için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler) ayırt edilebilir. Bu değiştirilmiş protokol, önceki protokollerde bildirilenlerden farklı bir donör ve reaktif kullanarak insan iPSC'lerinden BMEC'leri türetmek, genişletmek ve kriyoprezerk için ayrıntılı adımlar sağlar. iPSC'ler 4 gün boyunca esansiyel 6 ortam ile tedavi edilir, ardından temel fibroblast büyüme faktörü, retinoik asit ve B27 takviyesi ile desteklenmiş 2 günlük insan endotel serumsuz kültür ortamı ile tedavi edilir. 6. günde, hücreler 2 gün boyunca bir kollajen / fibronektin matrisi üzerine alt kültürlenir. İmmünostokimya, CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 ve SLC2A1 kullanılarak BMEC belirteç analizi için 8. Batı blotting, BMEC işaretleyici ifadesini ve endodermal bir işaretleyici olan SOX17'nin yokluğunu onaylamak için gerçekleştirilir. Anjiyojenik potansiyel filizlenen bir test ile gösterilmiştir. Trans-endotel elektrik direnci (TEER), 7. günden itibaren çubuk elektrotlar ve voltohmmetre kullanılarak ölçülür. ATP bağlama kaseti alt familyası B üye 1 ve ATP bağlama kaseti alt familyası C üye 1 için efflux taşıyıcı etkinliği 8. günde çok plakalı okuyucu kullanılarak ölçülür. BMEC'lerin başarılı türemesi, ilgili hücre belirteçlerinin varlığı, düşük SOX17 seviyeleri, anjiyojenik potansiyel, taşıyıcı aktivitesi ve TEER değerlerinin ~2000 Ω x cm2varlığı ile doğrulanır. BMEC'ler, taze kaplanmış kollajen/ fibronektin plakalarına geçmeden veya kriyoprezserved olmadan önce 10 güne kadar genişletilir. Bu protokol, iPSC türevli BMEC'lerin en az bir kez genişletilebileceğini ve geçebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyondan sonra daha düşük TEER değerleri ve BMEC işaretleyicilerinin daha zayıf lokalizasyonu gözlenmiştir. BMEC'ler diğer hücre tipleriyle (nöronlar, glialar, perisitler) ortak kültürdeneylerinde, üç boyutlu beyin modellerinde (organ çipi ve hidrojel), beyin organoidlerinin damarlanması ve nöropsikiyatrik bozukluklarda BBB disfonksiyonunun incelenmesi için kullanılabilir.

Introduction

Kan-Beyin Bariyer fonksiyonu
Kan-beyin bariyeri (BBB), maddelerin kandan beyne hareketini sınırlayan bir sınır oluşturur. BBB, vaskülat astarlı bir monolayer oluşturan beyin mikrovasküler endotel hücrelerinden (VPC' ler) oluşur. BMEC'ler, astrositler, nöronlar, perisitler, mikroglia ve hücre dışı matris ile birlikte nörovasküler üniteyi oluşturur. BMEC'ler, BBB'nin pasif difüzyonu sınırlayan ve bariyer bütünlüğünün bir göstergesi olarak hizmet eden yüksek trans-endotel elektrik direncini (TEER) korumasını sağlayan sıkı bir şekilde düzenlenmiş parasellüler yapıya sahiptir1,2. BMEC'ler ayrıca endositoz, transsitoz ve transmigrasyon gibi hücrelerarası hareketin yanı sıra immün yanıt sırasında lökositlerin ekstravazasyonuna yardımcı olan proteinlere sahiptir3. BMEC'ler, beyinde homeostatik bir dengeyi korumak için atık ürünlerin beslenmesi ve uzaklaştırılması için akın ve efflux taşıyıcılarınagüvenir 3. Örneğin, solute taşıyıcı ailesi 2 üye 1 (SLC2A1), Glikozun BBB4boyunca hareketinden sorumlu bir akın taşıyıcısıdır, ATP bağlama kaseti alt ailesi gibi efflux taşıyıcıları ise B üye 1 (ABCB1) ve ATP bağlama kaseti alt familyası C üye 1 (ABCC1), substratları kan akışına geri döndürmekten sorumludur3,5,6,7. ABCB1 substratları morfin, verapamil4ve olanzapine ve risperidone8gibi antipsikotikleri içerirken, ABCC1 taşıyıcısı sülfat konjugeleri, vincristine ve glucuronide konjugeleri4dahil olmak üzere çeşitli substratlara sahiptir.

Psikiyatrik Bozukluklarda BBB Modellerinin Uygulanması
BBB disfonksiyonu, şizofreni ve bipolar bozukluk9,10dahil olmak üzere bir dizi nörolojik ve psikiyatrik rahatsızlığa karışmıştır. Son zamanlarda, psikiyatrik bozuklukların hücresel ve moleküler temellerini sorgulamak için iPSC türevli ex vivo hücresel modeller kullanılmaktadır, ancak bu modeller şu anda nörovasküler11 , 12,13tarafından oynanan potansiyel rolü dikkate almamaktadır. Kanda dolaşan periferik inflamatuar sitokinlerin BBB14 , 15,16,17'yi olumsuz yönde etkileyebileceği varsayılmaktadır, ancak paraselüler18 , 19,20,21,21için de kanıtlarvardır.22, hücreler arası23,24,25,26,27,28,29ve hücre dışı matris20,29,30,31,BBB disfonksiyona katkıda bulunan32 anormallik. BBB'nin bozulması, kanın içeriğinin beyin parenkimine girmesine ve proinflamatuar sitokinleri serbest bırakmak için astrositleri ve / veya mikrogliayı aktive etmesine neden olabilir, bu da beyin üzerinde zararlı etkileri olabilecek enflamatuar bir yanıt33 başlatır34. BMEC'ler BBB'nin birincil bileşenidir ve bu hücrelerin yapısının ve işlevinin incelenmesi nörolojik ve psikiyatrik bozukluklarda BBB disfonksiyonunun anlaşılmasını artırabilir.

Alternatif BMEC Modelleri
IPSC 1 , 6 , 35,36'danBMEC'leri türetmek için etkili protokollerin geliştirilmesindenönce,araştırmacılar BBB işlevini incelemek için ölümsüzleştirilmiş BMEC37'yi çalıştırmışlardı. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu istenen BBB fenotiplerine ulaşamadı, böyle bir fizyolojik TEER değerleri aralığı38,39. IPSC'lerin kullanılması, hücrelerin türetildiği bireyin genetik arka planını koruma avantajına sahiptir. Bilim adamları, insan beyninin yapısını ve işlevini yeniden sağlayan iPSC türevi ex vivo mikroçevronment modelleri oluşturmak için aktif olarak çalışıyorlar. Araştırmacılar, yapısal ve fizyolojik olarak in vivo bulunan BMEC'lere benzeyen BMEC'leri türetmek için yöntemler geliştirmiştir. iPSC türevi BMEC'lerin saflaştırılmış popülasyonlarını elde etmek için yöntemler, son birkaç yılda optimize edilen protokollerle bir dizi farklı adım gerektirir1,6,35,36. Genellikle, iPSC türevi BMEC'ler Essential 6 (E6) ortamında 4 gün boyunca kültürlenir, ardından temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), retinoik asit (RA) ve B27 takviyesi ile desteklenmiş insan endotel serumsuz ortamında (hESFM) 2 gün kültürlenir. Hücreler daha sonra bir kollajen IV (COL4) ve fibronektin (FN) matrisi üzerinde kültürlenir ve >% 90 homojen BMEC1elde edilir.

VPC'lerin kimliği, trombosit-endotel hücre yapışma molekülü-1 (PECAM1), SLC2A1 ve sıkı kavşak proteini 1 (TJP1), occludin (OCLN) ve claudin-5 (CLDN5)6gibi sıkı kavşak proteinleri de dahil olmak üzere BMEC proteinlerinin birlikte ekspresyonunu gösteren immünoresans ile doğrulanır. Filizlenen tahliller, iPSC türevli VPC'lerin anjiyojenik potansiyelini doğrulamak için kullanılmıştır. 6 BMEC'lerin BBB bütünlüğü, fizyolojik in vitro TEER değerlerinin (~2000Ω x cm2)37 varlığı ve ABCB1 ve ABCC11,6,36gibi efflux taşıyıcıları için ölçülebilir aktivite ile değerlendirilir. Lippmann grubunun son metodolojik gelişmeleri, deneysel değişkenliği azaltılmış ve tekrarlanabilirliği artırılmış iPSC türevi BMEC protokollerine yol açmıştır1. Bununla birlikte, alt kültleme aşamasının ötesine genişletilip geçilemeyecekleri bilinmemektedir. Değiştirilmiş protokolümüz, iPSC türevi BMEC'leri 8. Hiçbir çalışma iPSC türevi BMEC'lerin geçtiğini açıklamamakla birlikte, bmec kriyoprezervasyonu için donma-çözülme döngüsünden geçtikten sonra fizyolojik BBB özelliklerini koruyan bir protokolvardır 40. Bununla birlikte, kriyoprezervasyon sonrası BMEC'lerin geçebileceği ve BBB özelliklerini koruyabileceği bilinmemektedir.

Lippmann protokolünü kullanan iPSC'lerden türetilen BMEC'ler Huntington hastalığı7gibi nörolojik bozukluklarda BBB bozulmasını modellemek için kullanılmıştır. Bu tür iPSC türevli BMEC'ler, Neisseria meningitidis veya B Grubu Streptococcus gibi bakteriyel enfeksiyonun kan-CSF bariyerinin ve BBB'nin bozulması üzerindeki etkilerini araştırmak için dekullanılmıştır. Ayrıca, şizofrenili 22q delesyon sendromu hastalarından iPSC türevi BMEC'ler kullanan araştırmacılar, LÖK'lerde lökositlerin beyne alınmasına ve ekstravazasyonuna yardımcı olan önemli bir yapışma molekülü olan hücreler arası yapışma molekülü-1'de (ICAM-1) bir artış gözlemlediler43. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar karmaşık nöropsikiyatrik bozukluklarda BBB bozulmasını incelemek için iPSC türevi BMEC'lerin yararını göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan iPSC'leri, Massachusetts Genel Hastanesi ve McLean Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylanan bir protokol kullanılarak sağlıklı donörlerin fibroblastlarından yeniden programlandı ve önceki çalışmalarda açıklandığı gibi karakterize edildi44,45,46.

NOT: Kısaca, fibroblastlar mRNA tabanlı genetik yeniden programlama ile iPSC'ye yeniden programlandı47. IPSC'ler kök hücre ortamında (SCM) muhafaza edildi (malzeme listesine bakın) ve 1 mL SCM ile ~1.2 x10 2 hücre/ mL yoğunluğunda depolandı, -160 °C'de sıvı nitrojende kriyoprezor olarak korunan şişelerde eşkenar dörtgen ilişkili protein kinaz inhibitörü (ROCKi) Y-27632 ve %10 (v/v) dimetil sülfit (DMSO) ile 10 μM. Aşağıdaki işlemlerin tümü, aksi belirtilmedikçe bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.

1. Bodrum membran matrisi seyreltme ve plaka kaplaması

  1. Seyreltik (1:50) büyüme faktörü, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'ndaki (DMEM) Engelbreth-Holm-Swarm tümöründen fenol kırmızısı olmadan saflaştırılmış bodrum membran matrisini azalttı.
  2. Uygun miktarda seyreltilmiş bodrum membran matrisi (yani, 6 kuyu plakası = 1mL, 12 kuyu plakası = 0,5 mL) ile hücre kültürü plakalarını kaplayın ve bu plakaları en az 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.

2. iPSC bakımı

NOT: 6 kuyu düz tabanlı bir plakada kuyu başına maksimum izdiah ~ 1,2 x 106 hücredir.

  1. Cryopreserved iPSC'leri 10 μM Y-27632 ile SCM'ye çözün ve plakayı seyreltilmiş büyüme faktörü azaltılmış bodrum membran matrisi ile kaplanmış 6 kuyulu bir plakaya koyun.
  2. Çözülmeden sonraki ilk 24 saat boyunca 10 μM Y-27632 ile SCM'de iPSC'leri koruyun. 24 saat sonra taze ortama geçin.
  3. Hücreler geçmeden önce %80-90 izdiah edene kadar IPSC'leri SCM'de saklayın.
    1. Farklılaşma için istenen yoğunluğu (15.600 hücre/cm2)kuyunun yüzey alanıyla çarparak farklılaşma için kaç iPSC'ye ihtiyaç duyulacağını hesaplayın. 6 kuyulu düz-alt plaka için, toplam 149.760 hücre / kuyu için 15.600 hücre / cm 2 ile 9.6 cm2'yi çarpın.
  4. Geçiş yapmak için hücreleri Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBBS) ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca enzymatic olmayan etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) (malzeme listesine bakın) ile kuluçkaya yatırın.
    1. Hücreleri yavaşça kaldırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücreleri taze SCM'de toplayın.
    2. Hücreleri seyreltilmiş SCM ile kaplanmış hücre kültürü plakalarına koyun ve hücreleri adım 2.3'te açıklandığı gibi tutun veya 1 mL SCM'de ~1.2 x10 6 hücre/mL, 10 μM Y-27632 ve %10 DMSO (v/v) sıvı nitrojendeki sıvı nitrojendeki şişelerde -160 °C sıcaklıkta saklayın.

3. IPSC'lerin BMEC'lere Farklılaştırılması

NOT: Enzymatic olmayan EDTA hücreleri kümelere ayırır. Enzymatic EDTA (bkz. Malzeme Tablosu)hücreleri tek hücreli süspansiyona ayırır. Retinoik asit (RA) ışıktan korunmalıdır.

  1. IPSC'leri Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salin 'i (DPBS) ile bir kez yıkayın. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 37 °C'de yaklaşık 5 dakika boyunca enzymatic EDTA (6 kuyu plakası için 1 mL, 12 kuyu plakası için 0,5 mL ve 24 kuyu plakası için 0,25 mL) ile kuluçkalayın.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da (göreceli santrifüj kuvveti) hücreleri ve santrifüjleri toplayın. SCM'de 10 μM Y-27632 içeren hücre peletlerini yeniden salım.
  3. Trypan Blue ve otomatik hücre sayacı veya hemositometre cihazı kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin. 24 saat boyunca 10 μMY-27632 içeren SCM'de 6 kuyulu düz tabanlı plakanın (9,6 cm2/kuyuyüzey alanına sahip) 15.600 hücre/cm 2 veya 149.760 hücre/kuyu yoğunluğunda plaka hücreleri.
  4. SCM'yi E6 ortamına değiştirerek 24 saat sonra farklılaşmayı başlatın. Önümüzdeki 4 gün boyunca E6 ortamını günlük olarak değiştirin.
  5. Farklılaşmanın 4. gününde, E6 ortamını seyreltilmiş (1:200) B27 takviyesi, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM RA ile desteklenmiş hESFM ile değiştirin. Önümüzdeki 48 saat boyunca bu ortamı değiştirmeyin.
  6. Seyreltilmiş (1:200) B27 ile 200 mL hESFM hazırlayın, 199 mL hESFM'ye 1 mL konsantre B27 takviyesi karıştırın.
  7. 200 μg/mL stok çözümü yapmak için 250 μL Tris tamponunda (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) 50 μg bFGF yeniden inşa ederek 20 ng/mL bFGF hazırlayın. 200 mL 200 μg/mL bFGF'yi 200 mL hESFM ile karıştırarak 20 ng/mL bFGF içeren 200 mL hESFM hazırlayın.
  8. 100 mg RA tozunu 2,5 mL DMSO ekleyerek önce 40 mg/mL RA stok çözeltisi yaparak 10 μM RA hazırlayın. 10 mM stok çözeltisi yapmak için bu konsantrasyonu 3 mg / mL'ye seyreltin. 200 mL hESFM'de 200 μL 10μM RA'yı karıştırarak 10 μM RA içeren 200 mL hESFM hazırlayın.

4. iPSC Türevi BMEC'in Saflaştırılması için kollajen IV (COL4) ve fibronektin (FN) Matrisini kaplama

  1. 1 mg/mL FN stok çözeltisi yapmak için 2 mg FN'ye 2 mL steril su ekleyin. 1 mg/mL COL4 stok çözeltisi yapmak için 5 mg COL4'e 5 mL steril su ekleyin.
    1. FN'nin 37 °C'de en az 30 dakika, COL4'ün ise oda sıcaklığında çözülmesine izin verin.
  2. FN stok çözeltisini steril suda 100 μg/mL'lik son konsantrasyona ve COL4 stok çözeltisini 400 μg/mL'lik son konsantrasyona seyreltin.
  3. İstenilen plakaları (6 kuyulu plaka = 1 mL COL4/FN çözeltisi, 12 kuyu plakası = 0,5 mL, 24 kuyu plakası= 0,25 mL ve 12 transwell filtreli plaka = 0,25 mL) 400 μg/mL COL4 ve 100 μg/mL FN karışımı ile kaplayın.
  4. Plakaları en az 2 saat veya 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın; Transwell filtreli plakalar için en az 4 saat önerilir.

5. iPSC Türevli BMEC'lerin alt kültürü ve saflaştırılması

NOT: Enzymatic EDTA ile inkübasyon, farklılaşmanın 6. gününde hücrelerin birleştiği güne bağlı olarak 15 dakikadan uzun sürebilir.

  1. Farklılaşmanın 6. gününde hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. Tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar 37 °C'de en az 15 dakika 1 mL enzimatik EDTA ile kuluçkaya yatırın.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla hücreleri toplayın. Seyreltilmiş (1:200) B27 takviyesi, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM RA ile taze hESFM ile hücre peletlerini yeniden söyün.
  3. 400 μg/mL COL4 ve 100 μg/mL FN karışımı ile kaplanmış plakalara tohum hücreleri, 6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusu ile 12 kuyulu bir plakanın 3 kuyusu, 12 transwell filtreli plakanın 3 kuyusu veya 24 kuyulu bir plakanın 6 kuyusunun oranı kullanılarak tohum hücreleri.
  4. Aynı hücre hattından COL4/FN kaplı 12 transwell filtreli plakaya TEER analizi için negatif kontrol olarak tohum farklılaşmamış iPSC'ler.
  5. 24 saatlik alt kültlemeden sonra, ortamı yalnızca B27 takviyesi ile hESFM olarak değiştirin. Bu adımdan sonra orta değişiklik gerekmez.

6. Filizlenen tahlil

  1. 8. Gün iPSC türevi BMEC'leri toplayın ve bunları 100.000 hücre/kuyuda, 200 μL/cm 2 bodrum membran matrisi ile yeni kaplanmış24 kuyulu düz tabanlı bir tabağa tohumlayın.
  2. Bu hücreleri hESFM ile seyreltilmiş (1:200) B27 ve 40 ng/mL vasküler endotel büyüme faktörü A (VEGFA165) ile tedavi edin.
  3. Her 24 saatte bir hücreleri gözlemleyin ve ortamı her iki günde bir değiştirin.

7. İmmünostokimya (ICC)

NOT: ICC, 24 kuyulu düz tabanlı plakalarda gerçekleştirilir.

  1. 48 saatlik alt kültlemeden sonra (8. gün), hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. %4 paraformaldehit (PFA) içeren hücreleri 20 dakika boyunca sabitleyin.
  2. Hücreleri DPBS ile üç kez yıkayın, yıkama başına 5 dakika. DPBS'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 eşek serumu ve %0,3 Triton X-100 (v/v) ile ön blok hücreler.
  3. Birincil antikorlarla kuluçkaya yaslanın: fare anti-insan-PECAM1 (1:100, stok 0,5 mg/mL), tavşan anti-insan-TJP1 (1:200, stok 0,53 mg/mL), fare anti-insan-CLDN5 (1:200, 4°C'de gece boyunca %5 eşek serumu içeren DPBS'de stok 0,5 mg/mL), fare anti-insan-OCLN (1:200, stok 0,5 mg/mL) ve tavşan anti-insan-SLC2A1 (1:100, stok 0,2 mg/mL).
    1. Hücreleri DPBS ile bir kez durulayın ve ardından DPBS ile yıkama başına 5 dakika boyunca beş kez yıkayın.
  4. İkincil antikorlarla hücreleri kuluçkaya bırakın: eşek-anti-tavşan Alexa Fluor 555 (1:200) ve eşek-fare karşıtı 488 (1:200) DPBS'de 1 saat boyunca% 5 eşek serumu içerir.
  5. Bu inkübasyonu takiben, 10 dakika boyunca DPBS'de seyreltilmiş (1:1000) Hoechst 33342 trihidrochloride trihidrat ekleyin.
    1. Hoechst 33342 solüsyonünü çıkarın ve DPBS ile bir kez durulayın ve yıkama başına 5 dakika boyunca DPBS ile dört kez yıkayın.
  6. Hücre üreticilerinin ifadesini ve lokalizasyonunu aramak için floresan mikroskoplardaki hücreleri görselleştirin.

8. TEER Ölçüm ve Analizi

NOT: Corning 12-Transwell filtreli plakalar 1,12 cm2 polietilen tereftalat membran ve 0,4 mikrometre gözenekten oluşan filtrelerle donatılmıştır. TEER ölçümleri teknik (kuyu başına 3) ve biyolojik çoğaltmalarda (hücre hattı ve/veya durum başına 3 kuyu) elde edilir.

  1. Alt kültlemeden 24 saat sonra (7. gün), her 24 saatte bir çubuk elektrotları ve bir voltohmmetre kullanarak TEER'i ölçün. Ölçümlerin eldeine ilişkin özel talimatlar için voltohmmeter kullanım kılavuzuna bakın.
    1. TEER'i ölçmek için voltohmmeter aletini bir gece önce şarj edin. Aleti ve çubuk elektrotları emniyet başlığına yerleştirmeden önce% 70 etanol ile hafifçe silin.
    2. Gücü kapatın ve ohm ölçüm cihazını üreticinin önerdiği şekilde kalibre edin.
    3. Yemek çubuğu elektrotlarını takın ve elektrotları% 70 etanol ile durulayın ve ardından DPBS.
    4. Daha kısa uç elektrodu trans-kuyu kesici ucuna (apikal oda) ve daha uzun ucu bazolateral odaya yerleştirin.
    5. öncelikle yalnızca COL4/FN ile kaplanmış boş bir kuyuyu ölçün. O zaman diğer kuyuları ölç.
    6. Farklı koşulları ölçerken (yani farklı hücre hatlarını ölçerken) yemek çubuğu elektrotlarını %70 etanol ve ardından DPBS ile hızlı bir şekilde durulayın.
  2. Tüm ölçümler kaydedildikten sonra (Ω), çubuk elektrotları% 70 etanol ve ardından steril su ile durulayın. Elektrotu hafifçe silin ve emniyet kaputunda havanın kurumasına izin verin.
  3. Boş kuyudan üç taraflı TEER değerlerini (Ω olarak) ortalama ve bu ortalama değeri her ham TEER değerinden koşula göre çıkarın.
    1. Çıkarılan değerlerin ortalamasını elde edin ve bunları 1,12 cm2 (12 transwell kesici ucun yüzey alanı) ile çarpın.
    2. TEER değerini ve TEER ölçümünün her günü için standart hataları gösteren grafiği oluşturmak için 6.

9. Efflux Transporter Aktivitesi ve Analizi

NOT: Efflux taşıyıcı aktivite tahlili 24 kuyulu düz tabanlı bir plaka üzerinde gerçekleştirilir. İlgi çekici Efflux taşıyıcıları arasında ABCB1 ve ABCC1 bulunmaktadır. Her durumun kontrol kuyuları (yani ilgili inhibitörler olmadan boş kuyular) ile üç taraflı olarak yapılması önerilir.

  1. 48 saatlik alt kültlemeden sonra (8. gün), hücreleri 37 °C'de 1 saat boyunca 10 μM Valspodar (ABCB1 inhibitörü) veya 10 μM MK571 (ABCC1 inhibitörü) ile kuluçkaya yatırın.
    1. 412 μL DMSO'da 5 mg toz (1214,64 g/mol) eriterek 10 mM Valspodar stoğu hazırlayın ve 10 μM çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, 10 μM Valspodar ile 10 mL hESFM yapmak için, 10 μL 10 mM Valspodar stoğunu 10 mL hESFM ile karıştırın.
    2. 931 μL'de 5 mg tozu (537,07 g/mol) eriterek 10 mM MK571 stoğu hazırlayın ve 10 μM çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, 10 μM MK571 ile 10 mL hESFM yapmak için, 10 mM MK571 stoğun 10 μL'si ile 10 mL hESFM karıştırın.
  2. 1 saat sonra, 10 μM rhodamin 123 (ABCB1 substrat) veya 10 μM 2',7'-diklorodihydrofluorescein diasetat (H2DCFDA, ABCC1 substrat) ile hücreleri 37 °C'de 1 saat boyunca inhibitörleri ile veya olmadan kuluçkaya yatırın.
    1. 875 μL DMSO'da 10 mg toz (380,82 g/mol) eriterek 10 mM rhodamin 123 hazırlayın ve 10 μM çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, 10 μM rhodamin 123 ile 10 mL hESFM yapmak için, 10 mM rhodamin 123 stoğunun 10 μL'si ile 10 mL hESFM karıştırın.
    2. 10,26 mL DMSO'da 50 mg toz (487,29 g/mol) eriterek 10 mM H2DCFDA hazırlayın ve 10 μM çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, 10 μM rhodamin 123 ile 10 mL hESFM yapmak için, 10 mM rhodamin 123 stoğunun 10 μL'si ile 10 mL hESFM karıştırın.
  3. %5 Triton-X (v/v) içeren DPBS kullanarak hücreleri 0,5 mL DPBS ve lyse ile iki kez yıkayın.
  4. Çok plakalı veya mikro plaka okuyucu kullanarak katlanmış hücrelerin floresanını ölçün (malzeme listesine bakın).
    1. Floresan plaka okuyucu aletini 485 nanometre ekscitasyon ve 530 nanometre emisyonu olarak ayarlayın ve bu dalga boylarında floresan ölçümü yapın.
    2. Işınlayıcı testinde kullanılmayan kuyular için, hücreleri hücre çekirdeği nicelemesi için% 4 PFA ile sabitlemeden önce DPBS ile iki kez yıkayın.
  5. Hücreleri Hoechst 33342 trihidroklorür trihidrat ile DPBS'de 10 dakika boyunca seyreltilmiş (1:1000) kuluçkaya yatır. Floresan mikroskoplar kullanarak ortalama hücre çekirdeği sayılarını hesaplamak için her kuyuda birden fazla görsel alan görüntüleyin.
  6. Fiji kullanarak çekirdekleri sayın ve floresan değerlerini hücre başına bu sayımlara göre normalleştirin.
    1. Her koşul için ham floresan biriktirme değerini ilgili boş değerinden çıkararak ortalama floresan birikimini hesaplayın.
    2. Her koşul için ortalama çıkarılan değerler.
    3. Ortalama değerleri adım 9.6.1'den ortalama hücre sayısına bölün. Floresan değerlerini hücre bazında normalleştirmek için bu değerleri kullanın.
    4. Her inhibitör durumu için grafiksel bir gösterim oluşturmak ve gerekli istatistiksel analizleri gerçekleştirmek için normalleştirilmiş değerleri kullanın.

10. BMEC'leri Geçirme, Genişletme ve Kriyoprezitan

  1. Seyreltilmiş (1:200) B27 ile desteklenmiş taze hESFM ile 8 BMEC kültürünü yenileyin ve hücrelerin COL4 /FN matrisinde iki gün daha genişlemesine izin verin.
  2. Yeni bir 12-Transwell filtreli plakayı ve 400 μg/mL COL4 ve 100 μg/mL FN ile 24 kuyulu düz tabanlı bir plakayı kapla ve 4 saat kuluçkaya yatır.
  3. 10. günde, hücreleri DPBS ile yıkayın ve tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar 37 °C'de en az 15 dakika boyunca 1 mL enzimatik EDTA ile kuluçkaya yatırın.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla hücreleri toplayın.
    1. Bu hücreleri kriyopreserve etmek için% 30 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve% 10 DMSO ile taze hESFM ile hücre peletlerini yeniden biriktirin.
    2. iPSC türevli BMEC'leri kriyoprezerkasyonlu şişelerde -80 °C'de ilk 24 saat boyunca bir izopropanol kabında saklayın, ardından -160 °C'de uzun süreli depolama için sıvı nitrojene yerleştirin.
    3. Bu hücreleri geçirmek için, seyreltilmiş (1:200) B27 ile desteklenmiş taze hESFM ile hücre peletlerini yeniden biriktirin.
  5. Adım 10.2'de hazırlanan kaplamalı plakalara tohum hücreleri. 6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusunun 12 transwell filtreli plakanın 3 kuyusuna ve 24 kuyulu bir plakanın 6 kuyusuna oranını kullanan tohum hücreleri. Hücrelerin 24 saat boyunca büyümesine ve genişlemesine izin verin.
  6. 11. günde, Adım 8'de listelenen adımları izleyerek TEER'i ölçün.
  7. 12. günde, Adım 9'da listelenen adımları izleyerek ICC gerçekleştirin.
  8. Kriyoprezer korunmuş BMEC'leri eritmek için, kriyoprezerserved şişeleri 37 o C'de ılık bir suya veya boncukbanyosuna yerleştirin. Daha sonra çözülmüş BMEC'leri seyreltilmiş (1:200) B27 ile birlikte 5 mL hESFM'ye aktarın.
    1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla hücreleri toplayın. Seyreltilmiş (1:200) B27, 10 μM RA ve 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş hESFM'deki hücreleri yeniden biriktirin.
    2. 24 saat sonra, RA olmadan seyreltilmiş (1:200) B27 ve 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş orta ila hESFM'ye geçin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BMEC Farklılaşması
Bu protokoldeki birkaç kritik adım tam olarak takip edilmelidir (Şekil 1). 1. günde E6 orta kullanımı önemlidir, çünkü genellikle birden fazla hücre hattında tekrarlanabilir sonuçlar veren nispeten kısa bir süre içinde iPSC'lerden nöroektoderm soyu türetmek için kullanılır36. Bir diğer önemli adım, E6 ortamının seyreltilmiş (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM RA ile iPSC türevi BMEC'leri genişletmek için hESFM'ye geçilmesi gereken farklılaşmanın 4. B27 takviyesinin eklenmesi, serumsuz hücre kültürasyonunu desteklemek için sığır serumu1'ealternatif olarak kullanılır, bFGF iPSC türevi BMEC6'nınbüyümesini kolaylaştırmak için eklenir ve RA, BBB fenotip35'ingelişimini kolaylaştırmak için kullanılır. Son önemli adım, gün 6 iPSC türevi BMEC'lerin iPSC türevi BMEC'leri seçmek için COL4 / FN kaplamalı bir plaka üzerine alt kültüre edildiği saflaştırma aşamasını içerir1,6,35,36. Şekil 2, iPSC'lerden BMEC'lere morfolojik geçişi göstermektedir. Bir günlük E6 ortamından sonra (gün 1), hücresel morfoloji iPSC'lerinkine benzer. E6'nın 4. 6. güne gelindiğinde, hESFM'de seyreltilmiş (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM RA ile kültürlenirken, hücresel morfoloji uzun ve parke taşı görünümüne sahip olmaya başlar. 8. günde, her bir hücre büyük bir parke taşı deseninde farklıdır. 3 günlük VEGFA165 tedavisinden sonra tüp benzeri yapılarla sonuçlanan iPSC türevi VPC'lerin anjiyojenik potansiyelini göstermek için filizlenen bir test yapılmıştır (Şekil 3).

Figure 1
Şekil 1: İnsan iPSC'lerinin BMEC'lere Farklılaştırılması için Anahat. İnsan iPSC'leri başlangıçta 10 μM Y-27632 içeren kök hücre ortamında 4 gün boyunca ortayı E6'ya değiştirmeden önce 24 saat boyunca kültürlendi. 4. günde orta, 2 gün boyunca (1:200) B27 takviyesi, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM RA ile hESFM olarak değiştirildi. 6. günde hücreler COL4/FN kaplamalı plakalara alt kültüre alındı. 7. günde orta, bFGF ve RA olmadan B27 takviyesi ile hESFM olarak değiştirildi ve TEER ölçüldü. 8. günde ICC ve efflux transporter aktivite tahlilleri yapıldı. iPSC türevi BMEC'ler, sırasıyla bir trans kuyu plakasına veya TEER ölçümü ve ICC analizi için 24 kuyulu düz bir alt plakaya geçmeden önce 10 güne kadar genişletildi. 8. gün BMEC'ler filizlenen test için kullanılmıştır (tasvir değildir). 6 kuyulu iPSC türevi BMEC'lerin 2 kuyusu toplanmış ve %10 DMSO ve %30 FBS ile -80 °C'de hESFM'de ve daha sonra -160oC'de uzun süreli depolama için sıvı nitrojende saklanmıştır. 12. günde, ICC'nin gerçekleştirildiği genişletilmiş iPSC türevi BMEC'lerde TEER değerinde bir zirve gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: IPSC'lerin BMEC'lere Farklılaştırılmasını Gösteren Parlak Alan Görüntüleri. E6 ortamında bir günlük kültürden sonra, iPSC'ler karakteristik morfolojilerini korurlar. E6 ortamında 4. günde hücresel morfoloji iPSC'lerden belirgin bir şekilde farklı görünmektedir. 6. günde hücresel morfoloji uzun ve parke taşı görünümüne dönüşür. 8. güne kadar, hücreler büyük ve parke taşı desenli görünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: iPSC türevi VPC'lerin Anjiyojenik Potansiyeli. Saflaştırılmış iPSC türevi BMEC'ler 100.000 hücre/cm2'de (1:200) B27 takviyesi ve 40ng/mL VEGFA165 ile hESFM'deki bodrum membran matrisine tohumlandı. Tüp benzeri yapılar 3 günlük VEGFA165 tedavisinden sonra ortaya çıktı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Saflaştırılmış iPSC türevi BMEC'ler 100.000 hücre/cm2'de (1:200) B27 takviyesi ve 40ng/mL VEGFA165 ile hESFM'deki bodrum membran matrisine tohumlandı. Tüp benzeri yapılar 3 günlük VEGFA165 tedavisinden sonra ortaya çıktı.

BMEC karakterizasyonu hücreye özgü belirteçler için immünositotimi kullanılarak gerçekleştirildi. iPSC türevi VPC'ler, akciğer, karaciğer ve böbrek18'dekibeyin endotel hücreleri3 ve endotel hücrelerinin sıkı kavşaklarında yaygın olarak ifade edilen sıkı kavşak proteinlerinin (OCLN, TJP1 ve CLDN5) varlığı açısından değerlendirildi. PECAM1 ve SLC2A1 gibi diğer belirteçler, daha önce saflaştırılmış BMEC6için belirteçler olarak kullanılmıştır. PECAM13 ve SLC2A4, BBB'nin vasküler endotel hücrelerinde eksprese edilir. Bu protokol kullanılarak oluşturulan iPSC türevi BMEC'ler, bu işaretleyicilerin beşini de birlikte ifade etti (Şekil 4).

Figure 4
Şekil 4: iPSC Türevli BMEC'lerin İşaretçi Analizi. İnsan iPSC türevi BMEC'ler sıkı kavşak (OCLN, TJP1, CLDN5), akın taşıyıcı (SLC2A1) ve yapışan kavşak (PECAM1) proteinleri için lekelendi. OCLN, TJP1 ve CLDN5 proteinleri öncelikle hücre zarında lokalizedir. SLC2A1 ve PECAM1 hem çekirdek hem de hücre zarında lokalizedir. Hoechst 33342 trihidroklorür trihidrat nükleer boyama için kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

BMEC'lerin BBB işlevini karakterize etmek için, TEER alt kültlemeden 24 saat (7 gün) sonra ölçüldü ve ortam bFGF ve RA olmadan seyreltilmiş (1:200) B27 ile hESFM olarak değiştirildi. TEER ölçümleri, farklılaşmanın 7. gününden (TEER ölçümünün 0. günü) başlayarak elde edildi ve alt-kült BMEC'lerden 8 veya 48 saat sonra~2000 Ω x cm 2'de zirve yaptı (Şekil 5). Bu TEER değerleri, sıçan birincil astrositleri37olan birlikte kültürlenmiş iPSC türevi BMEC'ler için açıklanan aralıktadır. iPSC satırı, düşük TEER değerlerine göre ayırt edilebilir bir BBB işlevine sahip değildi.

Figure 5
Şekil 5: iPSC Türevli BMEC'lerde TEER Ölçümleri. TEER değerleri, COL4/FN matrisinde (farklılaşmanın 8. gününde) bir günlük alt kültlemeden sonra zirve yaptı. Teer ölçümleri teknik (kuyu başına 3 ölçü) ve biyolojik repliklerde (hücre hattı başına 3 kuyu) elde edildi. Boş bir kuyudan teknik ortalama değer ham TEER değerlerinden çıkarılır. Bu değerler her gün için ortalama alındı ve 1,12 cm2 (12 transwell kesici ucun yüzey alanı) ile çarpıldı. Hata çubukları standart hatayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ABCB1 ve ABCC1 efflux transporter aktivitesini değerlendirmek için, ABCB1 ve ABCC1 için alınan floresan substrat miktarı, ilgili inhibitörleri ile inkübasyondan sonra ölçülmüştür. Beklendiği gibi, PSC833 (ABCB1 inhibitörü) veya MK-571 (ABCC1 inhibitörü) ile ABCB1 ve ABCC1 efflux taşıyıcılarının inhibisyonu, sırasıyla rhodamin 123 (R123) veya 2',7'-diklorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) artışına yol açmıştır (Şekil 6). Bu kanıt, bu protokol kullanılarak türetilen BMEC'lerin efflux transporter etkinliğine sahip olduğunu göstermektedir.

Figure 6
Şekil 6: iPSC Türevli BMEC'lerde Efflux Transporter Etkinliği. VPC'lerde efflux taşıyıcı aktivitesi rhodamin 123 (R123) veya 2',7'-diklorodihydrofluorescein diasetat birikimi ölçülerek belirlendi (H2DCFDA ) PSC833 (ATP bağlama kaseti alt familyası B üye 1 (ABCB1) inhibitörü) veya MK-571 (ATP bağlama kaseti alt familyası C üye 1 (ABCC1) inhibitörünün varlığı veya yokluğunda. Her durum için teknik triplicates yapıldı (N=1). Kontrol durumundan (yani inhibitörsüz) floresan değerleri ham floresan değerlerinden düşüldü. Bu floresan birikimi her teknik kopya için hücre bazında normalleştirildi. üç teknik kopyadan öğrenci t-testi kullanılarak istatistiksel önem belirlendi. ABCB1 inhibitörü olan ve olmayan R123 birikimi arasında istatistiksel bir anlamlılık gözlenmedi (t-stat= -1.66, p=0.11). ABCC1 inhibitörü olan ve olmayan H2DCFDA birikimi arasında istatistiksel anlamlılık gözlendi (t-stat=-7.23, p=0.04). *p<0,05. Hata çubukları standart hatayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

iPSC Türevli BMEC'leri Geçirme, Genişletme ve Kriyoprezitan Koruma
Bir diğer amaç, iPSC türevi BMEC'lerin alt kültlemeden sonra geçiş yapılıp yapılamayacağını ve kriyopreziserved edilip edilemeyeceğini araştırmaktı. Bu amaçla, 7. gün iPSC türevi BMEC'lerin TEER ölçümü için yeni kaplanmış COL4/FN 12-transwell filtreli plakalara ve ICC analizi için 24 kuyu düz tabanlı plakaya geçirmeden önce 10. güne kadar genişlemesine izin verildi (Şekil 7). Bu koşulu kullanarak iPSC türevi BMEC'ler çoğalmaya devam etti, OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 ve PECAM1 (Şekil 8) ifadesini sürdürdü ve geçtikten sonra uygun TEER değerlerini (tepe noktası ~ 2000 Ω x cm2) sürdürmeye devam etti (Şekil 9). Kriyoprezizasyonlu BMEC'ler daha sonra çözüldü, genişletildi ve sonra geçirildi (Şekil 7). BMEC'lerin TEER ölçümleri çözülmeden 24 saat sonra ve bundan birkaç gün sonra elde edildi. Bu çözülme sonrası BMEC'lerin TEER ölçümleri, yeni türetilmiş BMEC'lere kıyasla azaltıldı (sadece 800 Ω x cm2'dezirve yaptı). Çözülen BMEC'lerin ikinci bir geçişi daha da düşük TEER değerleri sergiledi (sadece 200-300 Ω x cm2'dezirve yaptı ) (Şekil 9) ve sıkı kavşak oluşumunun yıpranmış ve / veya çilli desenlerini gösterdi (Şekil 10). Batı blot analizi48, iPSC'lerin öncelikle endodermal bir işaretleyici (SOX17)49 ve bazı sıkı bağlantı işaretleyicilerini (OCLN) ifade ettiğini, ancak bmec ile ilgili diğer belirteçleri (TJP1, CLDN5 ve SLC2A1) ifade etmediğini ortaya koydu (Şekil 11). BMEC'ler öncelikle endotelle ilgili belirteçleri (TJP1, CLDN5, OCLN ve SLC2A1) endodermal işaretleyicinin düşük seviyeleri olan SOX17 ile ifade etti.

Figure 7
Şekil 7: Genişletilmiş ve Kriyoprezserved iPSC türevli BMEC'lerin Parlak Alan Görüntüleri. A) 10. gün (ilk alt kültürden 4 gün sonra) hücreler maksimum izdiah süresine ulaştı. B) 11. gün, COL4/FN kaplamalı 24 kuyu plakasına geçtikten 24 saat sonra. C) Gün12, COL4 / FN kaplamalı 24 kuyu plakasına geçtikten 48 saat sonra; en yüksek TEER değerleri gözlendi ve ICC gerçekleştirildi. D) COL4 /FN kaplamalı 6-wells plaka üzerinde çözülen iPSC türevi BMEC'ler sonrası 48 saat; hücreler daha önce 1.2 x10 2 hücre/mL'de kriyoprezserved edildi. E) Çözülme sonrası iPSC türevi BMEC'ler COL4/FN kaplı 6 kuyu plakasına geçirildikten 24 saat sonra. F) Çözülme sonrası iPSC türevi BMEC'ler geçirildikten 48 saat sonra. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Passaging'den sonra iPSC Türevli BMEC'lerin ICC'si. BMEC'ler, TEER değerlerinin zirve yaptığı 12. 12. günde BMEC'ler sıkı kavşak (OCLN, TJP1, CLDN5), akın taşıyıcı (SLC2A1) ve yapışan kavşak (PECAM1) proteinleri için lekelendi. İfade deseni ve yerelleştirme, Şekil 4'te gösterildiği gibi, geçişin gerçekleştirilmediği koşullarda gözlemlenenlere benzer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: IPSC'lerde, pasajsız BMEC'lerde, geçişli BMEC'lerde, kriyoprezerserved BMEC'lerde ve kriyoprezer korunmuş ve geçişli BMEC'lerde TEER Ölçümlerinin Karşılaştırılması. 1. günde, TEER değerleri geçişsiz ve geçişli BMEC'ler için zirveye ulaştı, ancak iPSC'ler veya kriyoprezer korunmuş BMEC'ler için zirve yapmadı. Kriyoprezer korunmuş BMEC'ler, 3 ile 7. iPSC'ler 0 ile 9. Teer ölçümleri teknik (kuyu başına 3 ölçüm) ve biyolojik repliklerde (hücre hattı başına 3 ölçüm) elde edildi. Boş bir kuyudan teknik ortalama değer ham TEER değerlerinden çıkarılır. Bu değerler her gün için ortalama alındı ve 1,12 cm2 (12 transwell kesici ucun yüzey alanı) ile çarpıldı. Hata çubukları standart hatayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10: Kriyopreziz korunmuş ve geçişli BMEC'lerin ICC'si. BMEC'ler, en yüksek TEER değerleri gözlemlenene kadar COL4/FN'de geçirildi ve muhafaza edildi. BMEC'ler sıkı kavşak (OCLN, TJP1, CLDN5), akın taşıyıcı (SLC2A1) ve yapışan kavşak (PECAM1) proteinleri için lekelendi. Sıkı bağlantı işaretleyicilerinin ifade deseni, paslı olmayan BMEC'ler (Şekil 4) ve geçişli BMEC'ler ( Şekil8) ile karşılaştırıldığında yıpranmış ve / veya çilli görünmüş görünmüştü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 11
Şekil 11: iPSC'lerin, pasajsız BMEC'lerin, paslı BMEC'lerin ve kriyoprezserved & passaged BMEC'lerin Batı blot analizi. TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 ve yükleme kontrolü (GAPDH) seviyelerini gösteren batı lekeleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Değişiklikler ve Sorun Giderme

Bu protokolde, BMEC'lerin türetimi için iPSC kültürü sırasında yaygın olarak kullanılan hücre dışı matris ve hücre kültürü medyasının kullanılmasında bazı değişiklikler yaptık (Şekil 1). Bu değişiklikler, Lippmann protokolünde açıklandığı gibi bmecs'i insan iPSC'lerinden türetme yeteneğini etkilemedi1. Bu değiştirilmiş protokolün diğer satırlarla önceki çalışmalarla karşılaştırılabilir sonuçlar gösterdiğini göstermek için farklı bir sağlıklı donörden bir iPSC hattı kullanılmıştır1. Kriyoprezervasyon için, B27 takviyesi% 1 trombosit zayıf plazma türevi serum (PDS)40yerine kullanıldı , ancak bu sonraki kültlemede BMEC sadakatini etkiledi. Sorun giderme ile ilgili olarak, TEER değerleri sabitlenmeden önce hızla dalgalanabilir. Bu dalgalanma, plakalar 37 °C'den oda sıcaklığı 37'ye taşındığındameydanagelen sıcaklık değişimlerinden kaynaklanabilir. Bu konunun üstesinden gelmek için ölçümler hızlı, verimli ve tutarlı bir şekilde yapılmalıdır. Gerekirse, sıcaklık düzeltilmiş TEER değerlerini elde etmek için Blume ve ark. 200949 tarafından sağlanan matematiksel bir formül kullanılarak sıcaklık etkileri hesaba katılabilir.

Bu Protokolün Sınırlamaları

Güçlü bir BBB fenotipine (yani yüksek TEER değerine) sahip BMEC'ler elde etmesine rağmen, bu BBB özelliğini uzun süre korumak büyük bir zorluk olmaya devam ediyor. Burada gösterildiği gibi, bu protokolü kullanan tepe TEER değerleri (~2000 Ω x cm2),daha önce bildirilen en yüksek TEER değerlerinden (~8000 Ω x cm2)1'dençok daha düşüktü. Bu gözleme rağmen, TEER değerleri daha önce bildirilen1değerlerinin normal aralığına (2000-8000 Ω x cm2)düştü. İkinci bir sınırlama, bu protokolün diğer sürümlerinde gözlemlenen farklı iPSC çizgilerinden kaynaklanan tepe TEER değerlerindekideğişkenliktir 36. Farklı hücre hatları arasındaki değişim, çevresel faktörlerden etkilenen her bir iPSC hattının büyüme ve genişleme hızından kaynaklanıyor olabilir51. Başka bir sınırlama, protokolümüz BMEC sadakatini korumadığı için kriyoprezervasyonla ilgilidir. %1 PDS40'ın kriyoprezervasyon sırasında BMEC'lerin daha fazla stabilitesini sağlaması mümkündür.

Mevcut Yöntemlere Göre Önemi

iPSC türevli BMEC'ler, belirli bireylerin genetik arka planına sahip hücreler sağlar ve bu hücrelerin hastalık biyolojisi çalışması için kullanılmasında değerlidir. Diğer hayvanlardan çıkarılan hayvan modelleri veya birincil BMEC kültürleri kullanırken durum böyle değildir37. Ayrıca, in vitro birincil BMEC kültürleri, burada açıklanan protokolle insan iPSC türevi BMEC'lerle elde edilenlerden çok daha düşük TEER değerleri (~100 Ω x cm237)göstermektedir. Bu değiştirilmiş protokol, iPSC'lerden insan BMEC'leri elde etmek için ayrıntılı bir yöntem sağlar ve bunları daha uzun kullanım için genişletme ve sürdürme potansiyeline sahiptir. Farklılaştırılmış BMEC'leri geçme ve saklama yeteneği, özellikle aynı anda birden fazla hücre hattını incelerken deneysel tasarımda çok yönlülük ve esneklik sağlayabilir. Bu sonuçlara dayanarak, iPSC türevi BMEC'ler ilk alt kültleme adımından sonra genişletilebilir ve pas geçilebilir (Şekil 7, Şekil 8 ve Şekil 9), ancak kriyoprezervasyonun daha fazla araştırılması gerekir. Bu protokol, beyin organoidlerinin damarlanması gibi yenilikçi yaklaşımlar geliştirmek için diğer kök hücre tabanlı hücresel modellerle birlikte de kullanılabilir. Beyin organoidleri üretmek için mevcut yöntemler, endotel hücrelerinden ve BBB52,53'üoluşturan nörovasküler ünitenin kritik unsurlarından yoksun oldukları için insan beyninin hücre tiplerinin eksik bir şekilde yeniden birleştirilmesiyle sonuçlanır. Burada açıklanan protokol, 3D modellere göre daha ucuz ve uygulanması daha kolay olan iki boyutlu Transwell/co-culturing sistemleri kullanılarak çekişli ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlayabilir.

Bu Protokolün Gelecekteki Uygulamaları

Bu protokol, nörovasküler ve BBB'nin şizofreni ve bipolar bozukluk gibi nörovasküler bozukluklardaki rolünü incelemek için kullanılabilir, burada nörovaskülerürdeki açıkların9,10,20,54,55rol oynadığı hipotez edilmiştir. Bu protokolün önceki versiyonları36, Huntington hastalığı 7 ve şizofreni43olan22q silme sendromu hastalarının iPSC hatlarından BMEC'leri türetmek için kullanılmıştır. Her iki çalışmada 7,43 BBB ile ilgili parasellüler ve/veya hücreler arası fonksiyonu araştırmak için bu yöntemin başarılı bir şekilde kullanıldığını göstermiştir. Önceki protokollerde hayvan serumunun potansiyel şaşırtıcı etkileri hakkında bazı endişeler dile getirildi1. Burada kullanılan serumsuz protokol, BMEC'leri türetmek için önceki protokollere benzer sonuçlar üretirken bu endişeyi ortadan kaldırır.

BMEC'leri Ayırt Etmek ve Genişletmek için Kritik Adımlar

Bu iletişim kuralını uygularken dört kritik adım vardır. İlk olarak, iPSC'lerin optimum yoğunlukta tohumlanması (örneğin, ~15.600 hücre/cm2'detohumlama) verimli BMEC farklılaşması için önemlidir. Hücre yoğunluğu farklılaşmanın4. İkinci önemli adım, farklılaşmayı başlatmak için E6 ortamının kullanıldığı 1. E6, önceki protokoller6,35'tekullanılan "koşulsuz ortam" yerine kullanılır. E6 ortamı sadece farklılaşma süresini 13 günden 8 güne düşürmekle kalmaz, aynı zamanda sıkı bağlantı proteinlerinin (TJP1, OCLN, CLDN5) ve BMEC belirteçlerinin (PECAM1 ve SLC2A1)36ekspresyonunu da teşvik eder. E6 ortamının kullanımı ayrıca uygun TEER değerleri (Şekil 5) ve ABCB1 ve ABCC1 efflux taşıyıcı aktivitesi (Şekil 6)6,35ile sonuçlandı. Üçüncü olarak, B27'nin sığır serumu yerine kullanılması, BMEC farklılaşmanın tutarlılığını ve güvenilirliğini artıran serumsuz durum için izin verdi1. Son olarak, iPSC türevi BMEC'lerin genişletilmesi açısından, hücreler ~% 100 izdiah süresine ulaştıklarında geçilmelidir. Bu protokole dayanarak, iPSC türevi BMEC'ler ilk alt kültleme aşamasından sonra daha da genişletilebilir ve geçiş yapılabilir (Şekil 7, Şekil 8 ve Şekil 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü KL2 TR002542 (PL) olan Yenilikçi Yeni Bilim İnsanları için Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Biyobehavioral Araştırma Ödülleri R01MH113858 (R.K.'ye) tarafından desteklendi. Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Klinik Bilimci Geliştirme Ödülü K08MH086846 (R.K.'ye), Sydney R Baer Jr Vakfı Hibesi (P.L.'ye) Doris Duke Hayır Kurumu Klinik Bilimci Geliştirme Ödülü (R.K.'ye), Ryan Licht Sang Bipolar Vakfı (R.K.'ye), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Vakfı (R.K.'ye), Harvard Kök Hücre Enstitüsü (R.K.'ye) ve Steve Willis ve Elissa Freud (R.K.'ye). Dr. Annie Kathuria'ya makale hakkındaki eleştirel okumaları ve geri bildirimleri için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Nörobilim Sayı 165 İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler beyin mikrovasküler endotel hücreleri kan beyin bariyeri trans-endotel elektrik direnci taşıyıcı aktivite mikrovasküler şizofreni bipolar bozukluk geçiş genişleme kriyoprezervasyon
İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya,… More

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter