Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo adattato per derivare, espandere e crioconservare le cellule endoteliali microvascolari cerebrali ottenute differenziando le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e per studiare le proprietà della barriera eculare nel sangue in un modello ex vivo.

Abstract

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) possono essere differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) per sviluppare modelli cellulari ex vivo per lo studio della funzione della barriera eculare-encefalica (BBB). Questo protocollo modificato fornisce passaggi dettagliati per ricavare, espandere e crioconservare IPC dagli iPSC umani utilizzando un donatore e reagenti diversi da quelli riportati nei protocolli precedenti. Gli iPSC vengono trattati con 6 mezzi essenziali per 4 giorni, seguiti da 2 giorni di mezzo di coltura senza siero endoteliale umano integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base, acido retinoico e integratore B27. Al giorno 6, le cellule vengono sotto-coltivate su una matrice di collagene / fibronectina per 2 giorni. L'immunocitochimica viene eseguita al giorno 8 per l'analisi dei marcatori BMEC utilizzando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 e SLC2A1. Il western blotting viene eseguito per confermare l'espressione del marcatore BMEC e l'assenza di SOX17, un marcatore endodermico. Il potenziale angiogenico è dimostrato con un saggio di germogliazione. La resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) viene misurata utilizzando elettrodi a bacchetta e voltohmmetro a partire dal giorno 7. L'attività del trasportatore Efflux per la sottofamiglia di cassette di binding ATP B membro 1 e la sottofamiglia di cassette di binding ATP C membro 1 viene misurata utilizzando un lettore multi-piastra al giorno 8. Una derivazione riuscita dei BMEC è confermata dalla presenza di marcatori cellulari rilevanti, bassi livelli di SOX17, potenziale angiogenico, attività del trasportatore e valori TEER ~2000 Ω x cm2. I BMEC vengono espansi fino al giorno 10 prima di passare su piastre di collagene/fibronectina appena rivestite o crioconservate. Questo protocollo dimostra che i BMEC derivati da iPSC possono essere espansi e passaggi almeno una volta. Tuttavia, dopo la crioconservazione sono stati osservati valori TEER più bassi e una localizzazione più scarsa dei marcatori BMEC. I BMEC possono essere utilizzati in esperimenti di co-coltura con altri tipi di cellule (neuroni, glia, periciti), in modelli cerebrali tridimensionali (organ-chip e idrogel), per la vascolarizzazione degli organoidi cerebrali e per lo studio della disfunzione BBB nei disturbi neuropsichiatrici.

Introduction

Funzione barriera ematico-encefalica
La barriera eto-encefalica (BBB) forma un confine che limita il movimento delle sostanze dal sangue al cervello. La BBB è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) che formano un monostrato che rivestono la vascolarizzazione. I BMEC, insieme ad astrociti, neuroni, periciti, microglia e matrice extracellulare, formano l'unità neurovascolare. I BMEC hanno una struttura paracellulare strettamente regolata che consente alla BBB di mantenere un'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER), che limita la diffusione passiva e funge da indicatore di integritàdella barriera 1,2. I BMEC hanno anche proteine che aiutano con il movimento transcellulare come l'endocitosi, la tracitosi e la trasmigrazione, così come l'estravasazione dei leucociti durante una risposta immunitaria3. I BMEC si affidano ai trasportatori di afflussi ed efflux per il nutrimento e la rimozione dei prodotti di scarto, al fine di mantenere un equilibrio omeostatico nelcervello 3. Ad esempio, solute carrier family 2 membro 1 (SLC2A1) è un trasportatore di afflusso responsabile del movimento del glucosio attraverso il BBB 4 ,mentrei trasportatori efflux come la sottofamiglia di cassette binding ATP B membro 1 (ABCB1) e la sottofamiglia di cassette binding ATP membro C 1 (ABCC1) sono responsabili della restituzione dei substrati nel flussosanguigno 3,5,6,7. I substrati ABCB1 includono morfina, verapamil4e antipsicotici come olanzapina e risperidone8, mentre il trasportatore ABCC1 ha una varietà di substrati tra cui coniugati solfati, vincristina e coniugatiglucuronide 4.

Applicazione di modelli BBB nei disturbi psichiatrici
La disfunzione della BBB è stata implicata in una serie di disturbi neurologici e psichiatrici, tra cui schizofrenia e disturbobipolare 9,10. Recentemente, i modelli cellulari ex vivo derivati da iPSC vengono utilizzati per interrogare le basi cellulari e molecolari dei disturbi psichiatrici, ma questi modelli attualmente non tengono conto del ruolo potenziale svolto dalla neurovascolarizzazione11,12,13. Si ipotizza che le citochine infiammatorie periferiche che circolano nel sangue possano avere un impatto negativo sulla BBB14,15,16,17, ma ci sono anche prove diparacellulare 18,19,20,21, 122, matrice transcellulare23,24,25,26,27,28,29e matrice extracellulare20,29,30,31,32 anomalie che contribuiscono alla disfunzione BBB. L'interruzione della BBB può comportare l'ingresso del contenuto di sangue nel parenchima cerebrale e l'attivazione di astrociti e / o microglia per rilasciare citochine proinfiammatorie, che a loro volta avviano unarisposta infiammatoria 33 che può avere effetti dannosi sulcervello 34. I BMEC sono la componente primaria della BBB e l'esame della struttura e della funzione di queste cellule può migliorare la comprensione della disfunzione BBB nei disturbi neurologici e psichiatrici.

Modelli BMEC alternativi
Prima dello sviluppo di protocolli efficienti per la derivazione di BMEC da iPSC1,6,35,36, i ricercatori avevano utilizzato BMECimmortalati 37 per studiare la funzione BBB. Tuttavia, molti di questi modelli non sono riusciti a raggiungere i fenotipi BBB desiderabili, un tale intervallo fisiologico di valori TEER38,39. L'utilizzo degli iPSC ha il vantaggio di mantenere il background genetico dell'individuo da cui derivano le cellule. Gli scienziati stanno lavorando attivamente alla definizione di modelli di microambiente ex vivo derivati da iPSC che ricapitolano la struttura e la funzione del cervello umano. I ricercatori hanno sviluppato metodi per ricavare BMEC strutturalmente e fisiologicamente simili ai BMEC trovati in vivo. I metodi per ottenere popolazioni purificate di BMEC derivati da iPSC richiedono una serie di passaggi diversi con protocolli ottimizzati negli ultimianni 1,6,35,36. Generalmente, i BMEC derivati da iPSC sono coltivati in mezzo Essential 6 (E6) per 4 giorni, seguiti da 2 giorni nel mezzo umano endoteliale senza siero (hESFM) integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), acido retinoico (RA) e integratore B27. Le cellule vengono quindi coltivate su una matrice di collagene IV (COL4) e fibronectina (FN) per ottenere >90% BMEC omogenei1.

L'identità dei BMEC è confermata dall'immunofluorescenza che mostra la coesimozione di proteine BMEC tra cui molecola di adesione delle cellule piastrine-endoteliali-1 (PECAM1), SLC2A1 e proteine di giunzione stretta come la proteina di giunzione stretta 1 (TJP1), l'occludina (OCLN) e la claudina-5 (CLDN5)6. I test di germinazione sono stati utilizzati per confermare il potenziale angiogenico dei BMEC derivati da iPSC. 6 L'integrità BBB dei BMEC è valutata dalla presenza di valori teer fisiologici in vitro (~2000Ω x cm2)37 e attività misurabile per trasportatori di efflux come ABCB1 e ABCC11,6,36. I recenti progressi metodologici del gruppo Lippmann hanno portato a protocolli BMEC derivati da iPSC con ridotta variabilità sperimentale e maggiore riproducibilità1. Tuttavia, non è noto se possano essere espansi e superati oltre lo stadio di sotto-ristrutturazione. Il nostro protocollo modificato mira ad affrontare questo problema passando i BMEC derivati da iPSC oltre il giorno 8 e valutando se possono essere ulteriormente ampliati per mantenere le proprietà BBB dopo la crioconservazione. Sebbene nessuno studio abbia descritto la passaging di BMEC derivati da iPSC, esiste un protocollo per la crioconservazione BMEC che mantiene proprietà fisiologiche BBB dopo aver subito un ciclo di congelamento-disgelo40. Tuttavia, non è noto che i BMEC post-crioconservazione possano essere passaggi e mantenere le proprietà BBB.

I BPC derivati da iPSC che utilizzano il protocollo Lippmann sono stati utilizzati per modellare l'interruzione della BBB in disturbi neurologici come la malattia di Huntington7. Tali BMEC derivati da iPSC sono stati utilizzati anche per indagare gli effetti di infezioni batteriche come Neisseria meningitidis o Gruppo B Streptococcus sull'interruzione della barriera ematica-CSF e BBBrispettivamente 41,42. Inoltre, utilizzando BMEC derivati da iPSC da pazienti con sindrome da cancellazione di 22q con schizofrenia, i ricercatori hanno osservato un aumento della molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), una delle principali molecole di adesione nei BMEC che aiutano con il reclutamento e l'estravasione dei leucocitinel cervello 43. Nel loro insieme, questi studi dimostrano l'utilità di BMEC derivati dall'iPSC per lo studio dell'interruzione della BBB nei disturbi neuropsichiatrici complessi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Gli iPSC umani sono stati riprogrammati dai fibroblasti di donatori sani utilizzando un protocollo approvato dagli Institutional Review Boards del Massachusetts General Hospital e del McLean Hospital, e caratterizzato come descritto negli studiprecedenti 44,45,46.

NOTA: In breve, i fibroblasti sono stati riprogrammati in iPSC tramite riprogrammazione genetica basata sull'mRNA47. Gli iPSC sono stati mantenuti in mezzo a cellule staminali (SCM) (vedi elenco dei materiali) e conservati ad una densità di ~1,2 x 102 cellule/mL con 1 mL di SCM, 10 μM con inibitore della protein chinasi rho-associata (ROCKi) Y-27632 e 10% (v/v) solfuro dimetile (DMSO), in fiale crioconservate in azoto liquido a -160 °C. Tutte le seguenti procedure sono eseguite in un armadio per la biosicurezza, salvo diversa indicazione.

1. Diluizione della matrice della membrana basale e rivestimento della piastra

  1. Il fattore di crescita diluito (1:50) ha ridotto la matrice della membrana basale purificata dal tumore Engelbreth-Holm-Swarm nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco senza rosso fenolo.
  2. Rivestire piastre di coltura cellulare con la quantità appropriata di matrice di membrana basale diluita (cioè piastra a 6 porri = 1mL, piastra da 12 porri = 0,5 mL) e incubare queste piastre a 37 °C per almeno 1 ora.

2. manutenzione iPSC

NOTA: La massima confluenza per pozzo in una piastra a fondo piatto a 6 po 'è ~1,2 x 106 celle.

  1. Scongelare gli iPSC crioconservati in SCM con 10 μM Y-27632 e placcare su una piastra a 6 porri rivestita con fattore di crescita diluito ridotta matrice di membrana basale.
  2. Mantenere gli IPSC in SCM con 10 μM Y-27632 per le prime 24 ore dopo lo scongelamento. Passare al mezzo fresco dopo 24 ore.
  3. Mantenere gli IPSC in SCM fino a quando le celle non raggiungono l'80-90% di confluenza prima della passaging.
    1. Calcolare quanti iPSC saranno necessari per la differenziazione moltiplicando la densità desiderata per la differenziazione (15.600 celle/cm2) per la superficie del pozzo. Per una piastra a fondo piatto a 6 po', moltiplicare 15.600 celle/cm2 per 9,6 cm2 per un totale di 149.760 cellule/pozzo.
  4. Per passare, lavare le cellule con la soluzione di sale bilanciato di Hanks (HBBS). Quindi, incubare le cellule con acido etilendiamminatetraacetico non enzimatico (EDTA) (vedi elenco dei materiali) per 5 minuti a 37 °C.
    1. Utilizzare un raschietto per rimuovere delicatamente le cellule. Raccogliere celle in SCM fresco.
    2. Celle a piastre su piastre di coltura cellulare rivestite con SCM diluito e mantenere le celle come descritto al passaggio 2.3 o conservarle a ~1,2 x10 6 celle/mL in 1 mL di SCM, 10 μM Y-27632 e 10% DMSO (v/v) in fiale crioconservate in azoto liquido a temperatura di -160 °C.

3. Differenziazione degli iPSC in BMEC

NOTA: L'EDTA non enzimatica separa le cellule in grumi. L'EDTA enzimatica (vedi Tabella dei materiali)separa le cellule in sospensioni a cella singola. L'acido retinoico (RA) deve essere protetto dalla luce.

  1. Lavare gli iPSC una volta con la salina tampone fosfato (DPBS) di Dulbecco. Incubare con EDTA enzimatica (1 mL per piastra a 6 potte, 0,5 mL per piastra da 12 pocchi e 0,25 mL per piastra a 24 po porsi) per circa 5 minuti a 37 °C per produrre una sospensione a cella singola.
  2. Raccogliere cellule e centrifughe a 300 x g (forza centrifuga relativa) per 5 minuti a temperatura ambiente. Pellet di cellule resuspend in SCM contenenti 10 μM Y-27632.
  3. Determinare la densità cellulare utilizzando Trypan Blue e il contatore automatico delle celle o un dispositivo emocitometro. Celle a piastre ad una densità di 15.600 celle/cm2 o 149.760 celle/pozzo di una piastra a fondo piatto a 6 po' (con una superficie di 9,6 cm2/pozzo)in SCM contenente 10 μM Y-27632 per 24 ore.
  4. Avviare la differenziazione dopo 24 ore cambiando SCM in mezzo E6. Cambia mezzo E6 ogni giorno per i prossimi 4 giorni.
  5. Il giorno 4 della differenziazione, sostituire il mezzo E6 con hESFM integrato con supplemento B27 diluito (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA. Non cambiare questo supporto per le prossime 48 ore.
  6. Preparare 200 mL di hESFM con B27 diluito (1:200), mescolare 1 mL di 50x concentrato B27 supplemento a 199 mL di hESFM.
  7. Preparare 20 ng/mL di bFGF ricostituendo 50 μg di bFGF in 250 μL di tampone Tris (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) per realizzare una soluzione stock di 200 μg/mL. Preparare 200 mL di hESFM contenente 20 ng/mL bFGF mescolando 20 μL di 200 μg/mL bFGF con 200 mL di hESFM.
  8. Preparare 10 μM RA facendo prima una soluzione di 40 mg/mL di RA stock aggiungendo 2,5 mL di DMSO a 100 mg di polvere RA. Diluire questa concentrazione a 3 mg/mL per realizzare una soluzione stock da 10 mM. Preparare 200 mL di hESFM contenente 10 μM RA mescolando 200 μL di 10μM RA in 200 mL hESFM.

4. Rivestimento collagene IV (COL4) e fibronectina (FN) Matrice per la purificazione del BMEC derivato da iPSC

  1. Aggiungere 2 mL di acqua sterile a 2 mg di FN per fare 1 mg/mL di soluzione di calcio FN. Aggiungere 5 mL di acqua sterile a 5 mg di COL4 per fare una soluzione di 1 mg/mL COL4.
    1. Lasciare sciogliere FN per almeno 30 minuti a 37 °C e il COL4 per sciogliersi a temperatura ambiente.
  2. Diluire la soluzione stock di FN in acqua sterile ad una concentrazione finale di 100 μg/mL e soluzione di stock COL4 ad una concentrazione finale di 400 μg/mL.
  3. Rivestire le piastre desiderate (piastra a 6 po porsi = 1 mL di soluzione COL4/FN, piastra a 12 po porsi = 0,5 mL, piastra a 24 po porsi = 0,25 mL e piastra filtrata a 12 transwell = 0,25 mL) con la miscela di 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN.
  4. Incubare le piastre per un minimo di 2 ore o pernottamento a 37 °C; per le piastre filtrate Transwell, si consiglia un minimo di 4 ore.

5. Sottocoltura e purificazione dei BMEC derivati da iPSC

NOTA: L'incubazione con EDTA enzimatica può richiedere più di 15 minuti a seconda della confluenza delle cellule il giorno 6 della differenziazione.

  1. Il giorno 6 della differenziazione, lavare le cellule due volte con DPBS. Incubare con 1 mL di EDTA enzimatica per almeno 15 minuti a 37 °C fino a ottenere una sospensione a singola cella.
  2. Raccogliere le cellule tramite centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Pellet di cellule resuspend con hESFM fresco con integratore B27 diluito (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA.
  3. Cellule di semi su piastre rivestite con una miscela di 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN.
  4. Sementi di iPSC indifferenziati dalla stessa linea cellulare su piastra filtrata col4/FN rivestita a 12 transwell come controllo negativo per l'analisi TEER.
  5. Dopo 24 ore di sotto-coltura, cambiare medio-hESFM solo con supplemento B27. Non sono necessarie modifiche medie dopo questo passaggio.

6. Saggio di germinazione

  1. Raccogli i BMEC derivati da iPSC del giorno 8 e seminali a 100.000 cellule / pozzo su una piastra a fondo piatto da 24 po 'appena rivestita con 200 μL / cm2 di matrice di membrana basale.
  2. Trattare queste cellule con hESFM con diluito (1:200) B27 e 40 ng/mL di fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGFA165).
  3. Osservare le cellule ogni 24 ore e cambiare il mezzo ogni due giorni.

7. Immunocitochimica (ICC)

NOTA: ICC viene eseguito su piastre a fondo piatto da 24 pozzi.

  1. Dopo 48 ore di sotto-coltivazione (giorno 8), lavare le cellule due volte con DPBS. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA) per 20 minuti.
  2. Lavare le celle tre volte con DPBS, 5 minuti per lavaggio. Preblocchiare le celle per 1 ora a temperatura ambiente in DPBS con il 5% di siero d'asino e lo 0,3% di Tritone X-100 (v/v).
  3. Incubare con anticorpi primari: topo anti-umano-PECAM1 (1:100, stock 0,5 mg/mL), coniglio anti-umano-TJP1 (1:200, stock 0,53 mg/mL), topo anti-umano-CLDN5 (1:200, 0,5 mg/mL), topo anti-umano-OCLN (1:200, stock 0,5 mg/mL) e coniglio anti-umano-SLC2A1(1:100, stock 0,2 mg/mL) in DPBS contenente il 5% di siero d'asino durante la notte a 4°C.
    1. Risciacquare le cellule una volta con DPBS e quindi lavare cinque volte per 5 minuti per lavaggio con DPBS.
  4. Incubare le cellule con anticorpi secondari: asino-anti-coniglio Alexa Fluor 555 (1:200) e asino-anti-topo 488 (1:200) in DPBS contenente il 5% di siero d'asino per 1 ora.
  5. A seguito di questa incubazione, aggiungere hoechst 33342 triidrocloruro triidrato diluito (1:1000) in DPBS per 10 minuti.
    1. Rimuovere la soluzione Hoechst 33342 e risciacquare una volta con DPBS e lavare quattro volte con DPBS per 5 minuti per lavaggio.
  6. Visualizza le cellule su microscopi a fluorescenza per cercare espressione e localizzazione dei produttori di cellule.

8. Misurazione e analisi TEER

NOTA: Le piastre filtrate Corning 12-Transwell sono dotate di filtri costituiti da membrane in polietilene tereftalatoda 1,12 cm e pori da 0,4 micrometri. Le misurazioni TEER sono ottenute in repliche tecniche (3 per pozzo) e biologiche (3 pozzi per linea cellulare e/o condizione).

  1. 24 ore dopo la sotto-coltura (giorno 7), misurare TEER usando elettrodi a bacchetta e un voltohmmetro ogni 24 ore. Fare riferimento al manuale d'uso del voltohmmetro per istruzioni specifiche sull'ottenimento delle misurazioni.
    1. Per misurare teer, caricare lo strumento voltohmmetro la sera prima. Pulire leggermente lo strumento e gli elettrodi a bacchetta con il 70% di etanolo prima di posizionarli nella cappa di sicurezza.
    2. Accendere e calibrare il misuratore ohm come raccomandato dal produttore.
    3. Collegare gli elettrodi a bacchetta e sciacquare gli elettrodi con il 70% di etanolo seguito da DPBS.
    4. Posizionare l'elettrodo finale più corto nell'inserto trans-pozzo (la camera apicali) e l'estremità più lunga nella camera basolaterale.
    5. Per prima cosa misurare un pozzo vuoto rivestito solo con COL4 / FN. Quindi misurare gli altri pozzi.
    6. Risciacquare rapidamente gli elettrodi a bacchetta con il 70% di etanolo seguito da DPBS quando si misurano condizioni diverse (cioè misurare diverse linee cellulari).
  2. Dopo aver registrato tutte le misurazioni (in Ω) , sciacquare gli elettrodi di bacchetta con il 70% di etanolo e quindi acqua sterile. Pulire delicatamente l'elettrodo e lasciarlo asciugare all'aria nella cappa di sicurezza.
  3. Mediare i valori TEER triplicati (in Ω) dal pozzo vuoto e sottrarre questo valore medio da ogni valore TEER non elaborati per condizione.
    1. Mediare i valori sottratti e moltiplicarli per 1,12 cm2 (la superficie dell'inserto a 12 transwell).
    2. Usare i valori trasformati del passaggio 6 per generare il grafico che mostra il valore TEER e gli errori standard per ogni giorno di misurazione TEER.

9. Attività e analisi del trasportatore Efflux

NOTA: Il test di attività del trasportatore Efflux viene eseguito su una piastra a fondo piatto da 24 po '. I trasportatori Efflux di interesse includono ABCB1 e ABCC1. Si raccomanda di eseguire ogni condizione in triplice copia con pozzi di controllo (cioè pozzi vuoti senza i rispettivi inibitori).

  1. Dopo 48 ore di sotto-coltivazione (giorno 8), incubare cellule con 10 μM Valspodar (inibitore ABCB1) o 10 μM MK571 (inibitore ABCC1) per 1 ora a 37 °C.
    1. Preparare 10 mM di brodo di Valspodar sciogliendo 5 mg di polvere (1214,64 g/mol) in 412 μL di DMSO e diluire alla concentrazione di lavoro di 10 μM. Ad esempio, per fare 10 mL di hESFM con 10 μM Valspodar, mescolare 10 μL di 10 mM di stock di Valspodar con 10 mL di hESFM.
    2. Preparare 10 mM MK571 stock sciogliendo 5 mg di polvere (537,07 g/mol) in 931 μL e diluire alla concentrazione di lavoro di 10 μM. Ad esempio, per fare 10 mL di hESFM con 10 μM MK571, mescolare 10 μL di 10 mM MK571 stock con 10 mL di hESFM.
  2. Dopo 1 ora, incubare le cellule con 10 μM di rodiammina 123 (substrato ABCB1) o 10 μM 2',7'-dilodiidrofluoresceina diacetato (substrato H2DCFDA, ABCC1) con o senza i rispettivi inibitori per 1 ora a 37 °C.
    1. Preparare 10 mM di rodiammina 123 sciogliendo 10 mg di polvere (380,82 g/mol) in 875 μL di DMSO e diluire alla concentrazione di lavoro di 10 μM. Ad esempio, per fare 10 mL di hESFM con 10 μM di rodiammina 123, mescolare 10 μL di 10 mM di rodiammina 123 stock con 10 mL di hESFM.
    2. Preparare 10 mM H2DCFDA sciogliendo 50 mg di polvere (487,29 g/mol) in 10,26 mL di DMSO e diluire alla concentrazione di lavoro di 10 μM. Ad esempio, per fare 10 mL di hESFM con 10 μM di rodiammina 123, mescolare 10 μL di 10 mM di rodiammina 123 stock con 10 mL di hESFM.
  3. Lavare le celle due volte con 0,5 mL di DPBS e lisciviare utilizzando DPBS contenente il 5% di Triton-X (v/v).
  4. Misurare la fluorescenza delle cellule liscitte utilizzando un lettore multipiastra o micropiastra (vedi elenco dei materiali).
    1. Impostare lo strumento lettore di lastre fluorescenti su eccitazione di 485 nanometri e emissione di 530 nanometri e misurare la fluorescenza a queste lunghezze d'onda.
    2. Per i pozzi non utilizzati nel saggio del trasportatore, lavare le cellule due volte con DPBS prima di fissarle con il 4% di PFA per la quantificazione dei nuclei cellulari.
  5. Incubare le cellule con Hoechst 33342 tricloruro di triidrato diluito (1:1000) in DPBS per 10 minuti. Immagine di più campi visivi in ogni pozzo per calcolare il conteggio medio dei nuclei cellulari utilizzando microscopi a fluorescenza.
  6. Conta i nuclei usando le Figi e normalizza i valori di fluorescenza per cella in base a questi conteggi.
    1. Calcolare l'accumulo medio di fluorescenza sottraendo il valore di accumulo di fluorescenza grezza per ogni condizione dal rispettivo valore in bianco.
    2. Valori medi sottratti per ogni condizione.
    3. Dividere i valori medi dal passaggio 9.6.1 per il conteggio medio delle celle. Utilizzare questi valori per normalizzare i valori di fluorescenza per cella.
    4. Utilizzare valori normalizzati per generare una rappresentazione grafica per ogni condizione inibitore ed eseguire qualsiasi analisi statistica necessaria.

10. BMEC di passaging, espansione e crioconservazione

  1. Reintegrare le colture BMEC del giorno 8 con hESFM fresco integrato con B27 diluito (1:200) e consentire alle cellule di espandersi per altri due giorni sulla matrice COL4 / FN.
  2. Rivestire una nuova piastra filtrata 12-Transwell e una piastra a fondo piatto da 24 po 'con 400 μg / mL COL4 e 100 μg / mL FN e incubare per 4 ore.
  3. Il giorno 10, lavare le cellule con DPBS e incubare con 1 mL di EDTA enzimatica per almeno 15 minuti a 37 °C fino a ottenere una sospensione a singola cella.
  4. Raccogliere le cellule tramite centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    1. Per crioconservare queste cellule, resuspend cell pellets con hESFM fresco con 30% siero bovino fetale (FBS) e 10% DMSO.
    2. Conservare i BMEC derivati da iPSC in flaconcini crioconservati in un contenitore isopropanolo per le prime 24 ore a -80 °C, quindi mettere in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine a -160 °C.
    3. Per passare queste cellule, pellet di cellule resuspend con hESFM fresco integrato con B27 diluito (1:200).
  5. Cellule di semi su piastre rivestite preparate nella fase 10.2. Cellule di semi che utilizzano un rapporto di 1 pozzo di una piastra da 6 po 'a 3 pozzi di una piastra filtrata a 12 transwell e a 6 pozzi di una piastra da 24 po '. Consentire alle cellule di crescere ed espandersi per 24 ore.
  6. Il giorno 11 misurare TEER seguendo i passaggi elencati nel passaggio 8.
  7. Il giorno 12 eseguire ICC seguendo i passaggi elencati nel passaggio 9.
  8. Per scongelare i BMEC crioconservati, posizionare le fiale crioconservate in acqua tiepida o bagno di perline a 37oC. Quindi trasferire i BMEC scongelati a 5 mL di hESFM integrati con B27 diluito (1:200).
    1. Raccogliere le cellule tramite centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimescolare le cellule in hESFM integrate con B27 diluito (1:200), 10 μM RA e 10 μM Y-27632.
    2. Dopo 24 ore, passare da medio a hESFM integrato con diluito (1:200) B27 e 10 μM Y-27632 senza RA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Differenziazione BMEC
È necessario seguire con precisione alcuni passaggi critici di questo protocollo (figura 1). L'uso medio E6 il primo giorno è importante, poiché viene spesso utilizzato per derivare il lignaggio neuroectoderma dagli IPSC in un periodo di tempo relativamente breve producendo risultati riproducibili su più lineecellulari 36. Un altro passo importante è il giorno 4 della differenziazione, dove il mezzo E6 dovrebbe essere passato a hESFM con B27 diluito (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA per espandere i BMEC derivati da iPSC. L'aggiunta di integratore B27 viene utilizzata come alternativa al siero bovino per supportare la coltivazione cellulare senza siero1, bFGF viene aggiunto per facilitare la crescita di BMEC derivati da iPSC6e RA viene utilizzato per facilitare lo sviluppo del fenotipo BBB35. L'ultimo passo importante riguarda la fase di purificazione, in cui i BMEC derivati da iPSC del giorno 6 vengono sotto-coltivati su una piastra rivestita COL4 / FN per selezionare BMEC derivati da iPSC1,6,35,36. La figura 2 illustra la transizione morfologica dagli iPSC ai BMEC. Dopo un giorno di mezzo E6 (giorno 1), la morfologia cellulare è simile a quella degli iPSC. Al giorno 4 di E6, le cellule iniziano ad apparire visibilmente distinte dagli iPSC e coprono la maggior parte del pozzo (~90% di confluenza). Entro il giorno 6, mentre coltivato in hESFM con B27 diluito (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA, la morfologia cellulare inizia ad avere un aspetto allungato e ciottolato. Al giorno 8, ogni singola cellula è distinta in un grande motivo di ciottoli. È stato eseguito un test di germinazione per dimostrare il potenziale angiogenico dei BMEC derivati da iPSC, che hanno portato a strutture simili a tubi dopo 3 giorni di trattamento VEGFA165 (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Schema per la differenziazione degli iPSC umani in BMEC. Gli iPSC umani sono stati inizialmente coltivati in un mezzo di cellule staminali contenente 10 μM Y-27632 per 24 ore prima di passare da medio a E6 per 4 giorni. Il giorno 4, il mezzo è stato cambiato in hESFM con (1:200) supplemento B27, 20 ng / mL bFGF e 10 μM RA per 2 giorni. Il giorno 6, le celle sono state sotto-coltivate su piastre rivestite COL4 / FN. Il giorno 7, il mezzo è stato cambiato in hESFM con supplemento B27 senza bFGF e RA e TEER è stato misurato. Il giorno 8 sono stati eseguiti test di attività di trasporto ICC ed efflux. I BMEC derivati da iPSC sono stati espansi fino al giorno 10 prima di essere traslocati rispettivamente in una piastra trans o in una piastra inferiore piatta da 24 pomp po 'per la misurazione TEER e l'analisi ICC. I BMEC del giorno 8 sono stati utilizzati per il saggio di germinazione (non raffigurato). 2 pozzi di una piastra a 6 pozzetti di BMEC derivati da iPSC sono stati raccolti e conservati in hESFM con 10% DMSO e 30% FBS a -80 °C e quindi in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine a -160oC. Il giorno 12, è stato osservato un picco nel valore TEER nei BMEC derivati da iPSC espansi a quel punto in cui è stato eseguito ICC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagini a campo luminoso raffiguranti la differenziazione degli iPSC in BMEC. Dopo un giorno di coltura nel mezzo E6, gli iPSC mantengono la loro morfologia caratteristica. Il quarto giorno nel mezzo E6, la morfologia cellulare appare distintamente diversa dagli iPSC. Il giorno 6, la morfologia cellulare cambia in un aspetto allungato e ciottolato. Al giorno 8, le cellule appaiono grandi e con un motivo acciotto ciottoli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Potenziale angiogenico dei BMEC derivati dall'iPSC. I BMEC derivati da iPSC purificati sono stati seminati a 100.000 cell/cm2 sulla matrice di membrana basale in hESFM con supplemento B27 (1:200) e VEGFA165 40ng/mL. Strutture simili a tubi sono apparse dopo 3 giorni di trattamento VEGFA165. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I BMEC derivati da iPSC purificati sono stati seminati a 100.000 cell/cm2 sulla matrice di membrana basale in hESFM con supplemento B27 (1:200) e VEGFA165 40ng/mL. Strutture simili a tubi sono apparse dopo 3 giorni di trattamento VEGFA165.

La caratterizzazione BMEC è stata eseguita utilizzando l'immunocitochimica per marcatori specifici delle cellule. I BMEC derivati da iPSC sono stati valutati per la presenza di proteine di giunzione strette (OCLN, TJP1 e CLDN5), che sono comunemente espresse nelle giunzioni strette delle cellule endoteliali cerebrali3 e delle cellule endoteliali nel polmone, nel fegato e nelrene 18. Altri marcatori come PECAM1 e SLC2A1, sono stati precedentemente utilizzati come marcatori per BMEC purificati6. PECAM13 e SLC2A4 sono entrambi espressi in cellule endoteliali vascolari della BBB. I BMEC derivati da iPSC generati utilizzando questo protocollo hanno co-espresso tutti e cinque questi marcatori (Figura 4).

Figure 4
Figura 4: Analisi marcatore dei BMEC derivati da iPSC. I BMEC derivati dall'iPSC umano sono stati macchiati per le proteine di giunzione stretta (OCLN, TJP1, CLDN5), trasportatore di afflusso (SLC2A1) e giunzione di adesione (PECAM1). Le proteine OCLN, TJP1 e CLDN5 sono principalmente localizzate nella membrana cellulare. SLC2A1 e PECAM1 sono localizzati sia nei nuclei che nella membrana cellulare. Hoechst 33342 triidrato di tricloruro fu utilizzato per la colorazione nucleare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per caratterizzare la funzione BBB dei BMEC, TEER è stato misurato 24 ore (giorno 7) dopo la sotto-coltivazione e il mezzo è stato cambiato in hESFM con diluito (1:200) B27 senza bFGF e RA. Le misurazioni TEER sono state ottenute a partire dal giorno 7 della differenziazione (giorno 0 della misurazione TEER) e hanno raggiunto il picco di ~2000 Ω x cm2 il giorno 8 o 48 ore dopo la sottocultura dei BMEC(figura 5). Questi valori TEER rientrano nell'intervallo descritto per i BMEC derivati da iPSC co-coltivati con astrociti primari del ratto37. La linea iPSC non aveva alcuna funzione BBB distinguibile in base ai loro bassi valori TEER.

Figure 5
Figura 5: Misurazioni TEER nei BMEC derivati da iPSC. I valori TEER hanno raggiunto il picco dopo un giorno di sotto-coltivazione sulla matrice COL4/FN (il giorno 8 della differenziazione). Le misurazioni TEER sono state ottenute in repliche tecniche (3 misure per pozzo) e biologiche (3 pozzi per linea cellulare). Il valore medio tecnico di un pozzo vuoto è stato sottratto dai valori TEER non elaborati. Questi valori sono stati mediati per ogni giorno e moltiplicati per 1,12 cm2 (superficie dell'inserto a 12 transwell). Le barre di errore rappresentano un errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per valutare l'attività del trasportatore di efflux ABCB1 e ABCC1, la quantità di substrato fluorescente prelevato per ABCB1 e ABCC1 è stata quantificata dopo l'incubazione con i rispettivi inibitori. Come previsto, l'inibizione dei trasportatori di efflux ABCB1 e ABCC1 con PSC833 (inibitore ABCB1) o MK-571 (inibitore ABCC1) ha portato ad un aumento della rhodamine 123 (R123) o 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (H2DCFDA), rispettivamente (Figura 6). Questi dati suggeriscono che i BMEC derivati utilizzando questo protocollo hanno un'attività di trasporto efflux.

Figure 6
Figura 6: Attività del trasportatore Efflux nei BMEC derivati da iPSC. L'attività del trasportatore Efflux nei BMEC è stata determinata quantificando l'accumulo di rodiammina 123 (R123) o 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (H2DCF 1 (ABCB1) o MK-571 (sottofamiglia di cassette di legame ATP membro 1 (ABCC1) o MK-571 (sottofamiglia di cassette di legame ATP membro C 1 (ABCC1). Sono stati eseguiti triplicati tecnici per ogni condizione (N=1). I valori di fluorescenza dalla condizione di controllo (cioè senza inibitori) sono stati detratti dai valori di fluorescenza grezza. Questi accumuli di fluorescenza sono stati normalizzati per cellula per ogni replica tecnica. La significatività statistica è stata determinata utilizzando il test t degli studenti delle tre repliche tecniche. Non è stata osservata alcuna significatività statistica tra l'accumulo di R123 con e senza inibitore ABCB1 (t-stat= -1,66, p=0,11). La significatività statistica è stata osservata tra l'accumulo di H2DCFDA con e senza inibitore ABCC1 (t-stat=-7.23, p=0.04). *p<0,05. Le barre di errore rappresentano un errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

BMEC derivati da iPSC passaging, expanding e crioconservazione
Un altro obiettivo era quello di studiare se i BMEC derivati dall'iPSC potessero essere passaggi e crioconservati dopo la sotto-coltivazione. A tal fine, i BMEC derivati dall'iPSC del giorno 7 sono stati autorizzati ad espandersi fino al giorno 10 prima di passarli su piastre filtrate COL4/FN a 12 transwell appena rivestite per la misurazione TEER e una piastra a fondo piatto a 24 pompenti per l'analisi ICC (Figura 7). Utilizzando questa condizione, i BMEC derivati da iPSC hanno continuato a proliferare, hanno mantenuto l'espressione di OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 e PECAM1 (Figura 8) e hanno continuato a sostenere valori TEER adeguati (picco a ~2000 Ω x cm2) dopo il passaging (Figura 9). I BMEC crioconservati sono stati successivamente scongelati, ampliati e poi passaggi (Figura 7). Le misurazioni TEER dei BMEC sono state ottenute 24 ore dopo lo scongelamento e diversi altri giorni dopo. Le misurazioni TEER di questi BMEC post-scongelati sono state ridotte (raggiungendo un picco di soli 800 Ω x cm2)rispetto ai BMEC appena derivati. Un secondo passaging di BMEC post scongelati presentava valori TEER ancora più bassi (con un picco di soli 200-300 Ω x cm2) (Figura 9) e mostrava modelli sfilacciati e/o lentigginosi della formazione di giunzioni strette (Figura 10). L'analisi westernblot 48 ha rivelato che gli iPSC esprimevano principalmente un marcatore endodermico (SOX17)49 e alcuni marcatori di giunzione stretti (OCLN), ma non altri marcatori correlati al BMEC (TJP1, CLDN5 e SLC2A1)(Figura 11). I BFC esprimevano principalmente marcatori correlati endoteliali (TJP1, CLDN5, OCLN e SLC2A1), con bassi livelli del marcatore endodermico, SOX17.

Figure 7
Figura 7: Immagini a campo luminoso di BMEC espansi e crioconservati derivati da iPSC. A) Le cellule del giorno 10 (4 giorni dopo la sottocoltura iniziale) hanno raggiunto la massima confluenza. B) Giorno 11, 24 ore dopo il passamento su piastra 24-pozzi rivestita COL4/FN. C) Giorno12, 48 ore dopo il passamento su piastra 24-pozzi rivestita col4/FN; sono stati osservati valori TEER di picco ed è stata eseguita l'ICC. D) 48 ore di BMEC derivati dall'iPSC post-scongelati su piastra a 6 pozzi rivestita con COL4/FN; le cellule erano precedentemente crioconservate a 1,2 x 102 cellule/mL. E) 24 ore dopo che i BMEC derivati da iPSC post-scongelati sono stati traslocati su una piastra a 6 pozzi rivestita con COL4/FN. F) 48 ore dopo il passaggio dei BMEC derivati dall'iPSC post-scongelati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: ICC dei BMEC derivati da iPSC dopo la passaging. I BMEC sono stati passaggi e mantenuti sulla matrice COL4/FN fino al giorno 12, quando i valori TEER hanno raggiunto il picco. I BPC del giorno 12 sono stati macchiati per le proteine di giunzione stretta (OCLN, TJP1, CLDN5), trasportatore di afflusso (SLC2A1) e giunzione di adesione (PECAM1). Il modello di espressione e la localizzazione assomigliano a quelli osservati in condizioni in cui il passaging non è stato eseguito, come mostrato nella figura 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Confronto delle misurazioni TEER in iPSC, BMEC non passaggi, BMEC a passaggio, BMEC crioconservati e BMEC crioconservati e passaggi. Il primo giorno, i valori teer hanno raggiunto il picco per i BMEC non passaggi e passaggi, ma non per gli IPSC o i BMEC crioconservati. I BMEC crioconservati avevano valori TEER moderati tra il giorno 3 e il 7, con valori TEER ancora più bassi per i BMEC crioconservati e passaggi. Gli iPSC non hanno dimostrato valori TEER misurabili tra il giorno 0 e il 9. Le misurazioni TEER sono state ottenute in repliche tecniche (3 misurazioni per pozzo) e biologiche (3 per linea cellulare). Il valore medio tecnico di un pozzo vuoto è stato sottratto dai valori TEER non elaborati. Questi valori sono stati mediati per ogni giorno e moltiplicati per 1,12 cm2 (superficie dell'inserto a 12 transwell). Le barre di errore rappresentano un errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: ICC dei BMEC crioconservati e passaggi. I BMEC sono stati passaggi e mantenuti su COL4/FN fino a quando non sono stati osservati valori di TEER di picco. I BFC sono stati macchiati per le proteine di giunzione stretta (OCLN, TJP1, CLDN5), trasportatore di afflusso (SLC2A1) e giunzione di adesione (PECAM1). Il modello di espressione dei marcatori di giunzione stretti appariva sfilacciato e/o lentigginoso rispetto ai BMEC non passaggi(figura 4) e ai BMEC passaggi (Figura 8). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11: Analisi western blot di IPSC, BMEC non passaggi, BMEC a passaggio e BMEC crioconservati e passaggi. Macchie occidentali che mostrano livelli di TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 e controllo del carico (GAPDH). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modifiche e risoluzione dei problemi

In questo protocollo sono state apportate alcune modifiche all'utilizzo di una matrice extracellulare comunemente utilizzata e di supporti di coltura cellulare durante la coltura iPSC per la derivazione di BMEC (Figura 1). Queste modifiche non hanno influito sulla capacità di ricavare BMECS dagli iPSC umani come descritto nel protocolloLippmann 1. Una linea iPSC di un donatore sano diverso è stata utilizzata per dimostrare che questo protocollo modificato mostra risultati paragonabili a quelli precedenti con altre linee1. Per la crioconservazione, il supplemento B27 è stato utilizzato al posto dell'1% di siero derivato dal plasma povero di piastrine (PDS)40,ma questo ha influenzato la fedeltà BMEC nella successiva coltivazione. Per quanto riguarda la risoluzione dei problemi, i valori TEER possono fluttuare rapidamente prima di stabilizzarsi. Questa fluttuazione può derivare da variazioni di temperatura che si verificano quando le piastre vengono spostate da 37 °C a temperaturaambiente 37. Per superare questo problema, le misurazioni devono essere effettuate in modo rapido, efficiente e coerente. Se necessario, gli effetti di temperatura possono essere fattorizzare utilizzando una formula matematica fornita da Blume et al.

Limitazioni del presente protocollo

Nonostante l'ottenimento di BMEC con un fenotipo BBB robusto (ad esempio un elevato valore TEER), mantenere questa proprietà BBB per un lungo periodo di tempo continua a essere una sfida importante. Come illustrato di seguito, i valori di TEER di picco (~2000 Ω x cm2) utilizzando questo protocollo erano molto inferiori ai valori DI TEER di picco riportati in precedenza (~8000 Ω x cm2)1. Nonostante questa osservazione, i valori TEER rientravano nell'intervallo abituale (2000-8000 Ω x cm2) dei valori precedentementeriportati 1. Una seconda limitazione è la variabilità nei valori TEER di picco che deriva da diverse linee iPSC utilizzate, che è stata osservata in altre versioni di questo protocollo36. La variazione tra le diverse linee cellulari può essere dovuta al tasso di crescita e espansione di ogni linea iPSC, che è influenzato da fattori ambientali51. Un'altra limitazione è legata alla crioconservazione, in quanto il nostro protocollo non ha mantenere la fedeltà BMEC. È possibile che l'1% di PDS40 fornisca una maggiore stabilità dei BMEC durante la crioconservazione.

Significato rispetto ai metodi esistenti

I BMEC derivati dall'iPSC forniscono cellule che hanno il background genetico di individui specifici, il che è prezioso nell'utilizzo di queste cellule per lo studio della biologia delle malattie. Ciò non si verifica quando si utilizzano modelli animali o colture BMEC primarie estratte da altri animali37. Inoltre, le colture BMEC primarie in vitro mostrano bassi valori di TEER (~100 Ω x cm237), molto inferiori a quelli ottenuti con IPC derivati dall'iPSC umano con il protocollo qui descritto. Questo protocollo modificato fornisce un metodo dettagliato per ottenere BMEC umani dagli IPSC, con il potenziale di espanderli e mantenerli per un uso più lungo. La capacità di passare e memorizzare BMEC differenziati può fornire versatilità e flessibilità nella progettazione sperimentale, specialmente quando si studiano più linee cellulari contemporaneamente. Sulla base di questi risultati, i BMEC derivati da iPSC possono essere espansi e passaggi dopo la fase di sottocultura iniziale (figura 7, figura 8 e figura 9), ma la crioconservazione necessita di ulteriori indagini. Questo protocollo può anche essere utilizzato in combinazione con altri modelli cellulari basati su cellule staminali per sviluppare approcci innovativi come la vascolarizzazione degli organoidi cerebrali. I metodi attuali per generare organoidi cerebrali si traducono in una ricostituzione incompleta dei tipi cellulari del cervello umano poiché mancano di cellule endoteliali ed elementi critici dell'unità neurovascolare che comprendono la BBB52,53. Il protocollo qui descritto può fornire un approccio trattabile e riproducibile utilizzando sistemi transwell/co-culturing bidimensionali meno costosi e più facili da implementare rispetto ai modelli 3D.

Future applicazioni di questo protocollo

Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il ruolo della neurovascolarizzazione e della BBB nei disturbi neuropsichiatrici come schizofrenia e disturbo bipolare, dove sono stati ipotizzati deficit nella neurovascolarizzazione per svolgere un ruolo9,10,20,54,55. Versioni precedenti di questo protocollo36 erano state utilizzate per ricavare BMEC da linee iPSC di pazienti con malattia di Huntington7 e 22q pazienti con schizofrenia43. Entrambigli studi 7,43 hanno dimostrato un utilizzo riuscito di questo metodo per studiare la funzione paracellulare e/o transcellulare correlata alla BBB. Nei protocolli precedenti 1 sono state sollevate alcune preoccupazioni circa i potenziali effetti confondenti del sieroanimale. Il protocollo privo di siero utilizzato qui elimina questa preoccupazione, producendo al contempo risultati simili ai protocolli precedenti per la derivazione dei BMEC.

Passaggi critici per differenziare ed espandere i BMEC

Nell'implementazione di questo protocollo sono disponibili quattro passaggi critici. In primo luogo, la semina di iPSC a una densità ottimale (cioè la semina a ~ 15.600 cellule / cm2) è importante per un'efficiente differenziazione BMEC. Se la densità cellulare è troppo alta o troppo bassa al giorno 4 della differenziazione, le colture possono mostrare tassi maggiori di eterogeneità cellulare56. Un secondo passo importante è l'induzione della differenziazione tra il primo e il giorno 4, dove il mezzo E6 viene utilizzato per iniziare la differenziazione. E6 viene utilizzato al posto del "mezzo incondizionato" che è stato utilizzato nei protocolliprecedenti 6,35. E6 medium non solo interrompe il tempo di differenziazione da 13 giorni a 8 giorni, ma promuove anche l'espressione di proteine di giunzione strette (TJP1, OCLN, CLDN5) e marcatori BMEC (PECAM1 e SLC2A1)36. L'uso del mezzo E6 ha anche portato a valori TEER adeguati (Figura 5) e all'attività del trasportatore di efflux ABCB1 e ABCC1 (Figura 6)6,35. In terzo luogo, l'uso del B27 al posto del siero bovino ha consentito condizioni indenne da siero, il che ha migliorato la coerenza e l'affidabilità della differenziazione BMEC1. Infine, in termini di espansione dei BMEC derivati dall'iPSC, le cellule dovrebbero essere passaggio quando raggiungono una confluenza del ~100%. Sulla base di questo protocollo, i BMEC derivati da iPSC possono essere ulteriormente ampliati e passaggi dopo la fase iniziale di sotto-ristrutturazione (Figura 7, Figura 8 e Figura 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da un National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (a R.K.), un National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). un National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (a R.K.), un Sydney R Baer Jr Foundation Grant (a P.L.) il Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (a R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (a R.K.), il Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (a R.K.), l'Harvard Stem Cell Institute (a R.K.) e da Steve Willis ed Elissa Freud (a R.K.). Ringraziamo la dott.ssa Annie Kathuria per la sua lettura critica e il feedback sul manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Neuroscienze Numero 165 Cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo cellule endoteliali microvascolari cerebrali barriera emiencefalica resistenza elettrica trans-endoteliale attività del trasportatore microvascolare schizofrenia disturbo bipolare passaging espansione crioconservazione
Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya,… More

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter