Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

Este protocolo detalha um método adaptado para derivar, expandir e criopreservar células microvasculares microvasculares cerebrais obtidas pela diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e para estudar as propriedades da barreira cerebral no sangue em um modelo ex vivo.

Abstract

As células-tronco endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) podem ser diferenciadas das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSCs) para desenvolver modelos celulares ex vivo para estudar a função de barreira hematoencefálica (BBB). Este protocolo modificado fornece etapas detalhadas para derivar, expandir e criopreservar BMECs de iPSCs humanos usando um doador e reagentes diferentes dos relatados em protocolos anteriores. Os iPSCs são tratados com meio essencial de 6 por 4 dias, seguidos por 2 dias de cultura endotelial-livre de soro humano complementada com fator básico de crescimento do fibroblasto, ácido retinóico e suplemento B27. No dia 6, as células são subculturadas em uma matriz de colágeno/fibronectina por 2 dias. A imunocitoquímica é realizada no dia 8 para análise de marcadores BMEC utilizando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 e SLC2A1. A mancha ocidental é realizada para confirmar a expressão do marcador BMEC, e a ausência de SOX17, um marcador endodérmico. O potencial angiogênico é demonstrado com um ensaio brotante. A resistência elétrica trans-endotelial (TEER) é medida usando eletrodos de pauzinho e voltohmômetro a partir do dia 7. A atividade de transporte da Efflux para o membro B da subfamília de fita 1 e atp de ligação c membro 1 é medida usando um leitor de várias placas no dia 8. A derivação bem sucedida de BMECs é confirmada pela presença de marcadores celulares relevantes, baixos níveis de SOX17, potencial angiogênico, atividade de transporte e valores TEER ~2000 Ω x cm2. Os BMECs são expandidos até o dia 10 antes de passar para placas de colágeno/fibronectina recém-revestidas ou criopreservadas. Este protocolo demonstra que os BMECs derivados do iPSC podem ser expandidos e passagens pelo menos uma vez. No entanto, foram observados valores de TEER mais baixos e pior localização dos marcadores BMEC após a criopreservação. Os BMECs podem ser utilizados em experimentos de co-cultura com outros tipos de células (neurônios, glia, pericytes), em modelos cerebrais tridimensionais (organ-chip e hidrogel), para vascularização de organoides cerebrais, e para estudar a disfunção BBB em distúrbios neuropsiquiátricos.

Introduction

Função de barreira hemencefálica
A barreira hemencefálica (BBB) forma um limite que limita o movimento de substâncias do sangue para o cérebro. O BBB é composto por células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) que formam uma monocamada que reveste a vasculatura. BMECs, juntamente com astrócitos, neurônios, periciosos, microglia e matriz extracelular, formam a unidade neurovascular. Os BMECs possuem uma estrutura paracelular bem regulada que permite ao BBB manter alta resistência elétrica trans-endotelial (TEER), que limita a difusão passiva e serve como indicador de integridade da barreira1,2. Os BMECs também possuem proteínas que auxiliam no movimento transcelular, como endocitose, transcitose e transmigração, bem como extravasação de leucócitos durante uma resposta imune3. Os BMECs contam com transportes de influxo e efflux para nutrição e remoção de resíduos, a fim de manter um equilíbrio homeostático no cérebro3. Por exemplo, a família transportadora solute 2 membro 1 (SLC2A1) é um transportador de fluxo responsável pelo movimento de glicose através do BBB4, enquanto transportadores efflux como o subfamília de de ligação ATP membro B (ABCB1) e o membro C da fita c de ligação ATP 1 (ABCC1) são responsáveis por devolver substratos de volta à corrente sanguínea3,5,6,7. Os substratos ABCB1 incluem morfina, verapamil4e antipsicóticos como olanzapina e risperidona8,enquanto o transportador ABCC1 possui uma variedade de substratos, incluindo conjugados de sulfato, vincristina e conjugados de glucuronídeos4.

Aplicação de Modelos BBB em Transtornos Psiquiátricos
A disfunção bbb tem sido implicada em uma série de transtornos neurológicos e psiquiátricos, incluindo esquizofrenia e transtorno bipolar9,10. Recentemente, modelos celulares ex vivo derivados do iPSC estão sendo utilizados para interrogar os fundamentos celulares e moleculares de transtornos psiquiátricos, mas esses modelos atualmente não levam em conta o potencial papel desempenhado pela neurovasculatura11,12,13. É hipótese que citocinas inflamatórias periféricas que circulam no sangue podem impactar negativamente o BBB14,15,16,17, mas também há evidências de paracelular18,19,20,21,122, transcelular23,24,25,26,27,28,29, e matriz extracelular20,29,30,31,32 anormalidades contribuindo para a disfunção BBB. A interrupção do BBB pode resultar no conteúdo do sangue entrando no parenchyma cerebral e ativando astrócitos e/ou microglia para liberar citocinas proinflamatórias, que por sua vez iniciam uma resposta inflamatória33 que pode ter efeitos prejudiciais no cérebro34. Os BMECs são o componente primário do BBB e examinar a estrutura e a função dessas células pode melhorar a compreensão da disfunção BBB em transtornos neurológicos e psiquiátricos.

Modelos alternativos de BMEC
Antes do desenvolvimento de protocolos eficientes para o eduque de BMECs dos iPSCs1,6,35,36, os pesquisadores haviam empregado BMECsimortalizados 37 para estudar a função BBB. No entanto, muitos desses modelos não conseguiram alcançar fenótipos BBB desejáveis, uma gama fisiológica de valores TEER38,39. Utilizar iPSCs tem a vantagem de manter o fundo genético do indivíduo do qual as células são derivadas. Os cientistas estão trabalhando ativamente no estabelecimento de modelos de microambiente ex vivo derivados do iPSC que recapitulem a estrutura e a função do cérebro humano. Pesquisadores desenvolveram métodos para derivar BMECs que são estruturalmente e fisiologicamente semelhantes aos BMECs encontrados in vivo. Os métodos para a obtenção de populações purificadas de BMECs derivados do iPSC exigem uma série de etapas diferentes, com protocolos sendo otimizados nos últimos anos1,6,35,36. Geralmente, os BMECs derivados do iPSC são cultivados em meio Essential 6 (E6) por 4 dias, seguidos por 2 dias em meio endotelial-livre de soro humano (hESFM) complementados com fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF), ácido retinóico (RA) e suplemento B27. As células são então cultivadas em uma matriz de colágeno IV (COL4) e fibronectina (FN) para obter >90% BMECs homogêneos1.

A identidade dos BMECs são confirmadas pela imunofluorescência que mostra a co-expressão de proteínas BMEC, incluindo molécula de adesão celular plaquetária-endotelial-1 (PECAM1), SLC2A1 e proteínas de junção apertadas como proteína de junção apertada 1 (TJP1), occludina (OCLN) e claudin-5 (CLDN5)6. Ensaios de broto têm sido usados para confirmar o potencial angiogênico de BMECs derivados do iPSC. 6 A integridade BBB dos BMECs é avaliada pela presença de valores fisiológicos in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 e atividade mensurável para transportadores de efflux como ABCB1 e ABCC11,6,36. Os recentes avanços metodológicos do grupo Lippmann levaram a protocolos BMEC derivados do IPSC com variabilidade experimental reduzida e reprodutibilidade aprimorada1. No entanto, não se sabe se eles podem ser expandidos e passagens para além do estágio de subcultura. Nosso protocolo modificado visa resolver esse problema, aprovando BMECs derivados do iPSC para além do dia 8 e avaliando se eles podem ser expandidos para reter propriedades BBB após a criopreservação. Embora nenhum estudo tenha descrito a passagem de BMECs derivados do iPSC, existe um protocolo para a criopreservação BMEC que retém propriedades fisiológicas do BBB após passar por um ciclo de congelamento40. No entanto, não se sabe se BMECs pós-criopreservação podem ser passagens e reter propriedades BBB.

BMECs derivados de iPSCs usando o protocolo Lippmann têm sido utilizados para modelar a interrupção do BBB em distúrbios neurológicos como a doença de Huntington7. Esses BMECs derivados do iPSC também têm sido usados para investigar os efeitos da infecção bacteriana, como neisseria meningitidis ou Estreptococos do Grupo B na interrupção da barreira hemo-CSF eBBB, respectivamente 41,42. Além disso, usando BMECs derivados do iPSC de pacientes com síndrome de exclusão de 22q com esquizofrenia, os pesquisadores observaram um aumento na molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), uma molécula de adesão importante em BMECs que auxiliam no recrutamento e extravasação de leucócitos no cérebro43. Juntos, esses estudos demonstram a utilidade dos BMECs derivados do iPSC para estudar a interrupção do BBB em distúrbios neuropsiquiátricos complexos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Os iPSCs humanos foram reprogramados dos fibroblastos de doadores saudáveis por meio de protocolo aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional do Hospital Geral de Massachusetts e do Hospital McLean, e caracterizados como descritos em estudos anteriores44,45,46.

NOTA: Brevemente, os fibroblastos foram reprogramados para o iPSC através da reprogramação genética baseada em mRNA47. Os iPSCs foram mantidos em células-tronco média (SCM) (ver lista de material) e armazenados a uma densidade de ~1,2 x 102 células/mL com 1 mL de SCM, 10 μM com inibidor de proteína quinase associada a rho (ROCKi) Y-27632, e 10% (v/v) sulfeto de dimetil (DMSO), em frascos criopreservados em nitrogênio líquido a -160 °C. Todos os procedimentos a seguir são realizados em um gabinete de biossegurança, a menos que seja declarado o contrário.

1. Diluição da matriz da membrana do porão e revestimento da placa

  1. Fator de crescimento diluído (1:50) reduziu a matriz de membrana do porão purificada do tumor Engelbreth-Holm-Swarm no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco sem vermelho fenol.
  2. Placas de cultura de células de revestimento com a quantidade apropriada de matriz de membrana de porão diluída (ou seja, placa de 6 poços = 1mL, placa de 12 poços = 0,5 mL) e incubar essas placas a 37 °C por pelo menos 1 hora.

2. manutenção iPSC

NOTA: A confluência máxima por poço em uma placa de fundo plano de 6 poços é ~1,2 x 106 células.

  1. Descongelar iPSCs criopreservados em SCM com 10 μM Y-27632 e placa em uma placa de 6 poços revestida com fator de crescimento diluído reduziu a matriz de membrana do porão.
  2. Mantenha iPSCs em SCM com 10 μM Y-27632 nas primeiras 24 horas após o descongelamento. Mude para meio fresco após 24 horas.
  3. Mantenha iPSCs em SCM até que as células atinjam 80-90% de confluência antes da passagem.
    1. Calcule quantas iPSCs serão necessárias para diferenciação multiplicando a densidade desejada para diferenciação (15.600 células/cm2) pela área superficial do poço. Para uma placa de fundo plano de 6 poços, multiplique 15.600 células/cm2 por 9,6 cm2 para um total de 149.760 células/poço.
  4. Para passar, lave as células com a Solução de Sal Balanceado (HBBS) da Hanks. Em seguida, incubar as células com ácido etilenodiaminatotraacético não enzimático (EDTA) (ver lista de materiais) por 5 minutos a 37 °C.
    1. Use um raspador de células para retirar suavemente as células. Coletar células em SCM fresco.
    2. Células de placas em placas de cultura celular revestidas com SCM diluído e manter células conforme descrito na etapa 2.3 ou armazená-las em ~1,2 x 106 células/mL em 1 mL de SCM, 10 μM Y-27632, e 10% DMSO (v/v) em frascos criopreservados em nitrogênio líquido a temperatura de -160 °C.

3. Diferenciação de iPSCs para BMECs

NOTA: EDTA não enzimática separa as células em aglomerados. EDTA enzimática (ver Tabela de Materiais) separa as células em suspensão de célula única. O ácido retinóico (RA) deve ser protegido contra a luz.

  1. Lave iPSCs uma vez com o Phosphate Buffer Saline (DPBS) de Dulbecco. Incubar com EDTA enzimática (1 mL para placa de 6 poços, 0,5 mL para placa de 12 poços e 0,25 mL para placa de 24-bem) por aproximadamente 5 minutos a 37 °C para produzir uma única suspensão celular.
  2. Coletar células e centrífugas a 300 x g (força centrífuga relativa) por 5 minutos à temperatura ambiente. Pelotas de células resuspendas em SCM contendo 10 μM Y-27632.
  3. Determine a densidade celular usando o Trypan Blue e o contador de células automatizado ou um dispositivo hemótmetro. Células de placa a uma densidade de 15.600 células/cm2 ou 149.760 células/poço de uma placa de fundo plano de 6 poços (com uma área superficial de 9,6 cm2/bem) em SCM contendo 10 μM Y-27632 por 24 horas.
  4. Inicie a diferenciação após 24 horas mudando SCM para E6 médio. Mude o E6 diariamente para os próximos 4 dias.
  5. No dia 4 de diferenciação, substitua o E6 médio por hESFM suplementado com suplemento B27 diluído (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA. Não troque este meio pelas próximas 48 horas.
  6. Prepare 200 mL de hESFM com diluído (1:200) B27, misture 1 mL de suplemento B27 concentrado de 50x a 199 mL de hESFM.
  7. Prepare 20 ng/mL de bFGF reconstituindo 50 μg de bFGF em 250 μL de buffer Tris (5 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl) para fazer 200 μg/mL solução de estoque. Prepare 200 mL de hESFM contendo 20 ng/mL bFGF misturando 20 μL de 200 μg/mL bFGF com 200 mL de hESFM.
  8. Prepare 10 μM RA fazendo primeiro uma solução de estoque de 40 mg/mL de RA adicionando 2,5 mL de DMSO a 100 mg de pó de RA. Diluir esta concentração para 3 mg/mL para fazer uma solução de estoque de 10 mM. Prepare 200 mL de hESFM contendo RA de 10 μM misturando 200 μL de RA de 10μM em 200 mL hESFM.

4. Revestimento de colágeno IV (COL4) e fibronectina (FN) Matriz para Purificação de BMEC derivado do iPSC

  1. Adicione 2 mL de água estéril a 2 mg de FN para fazer uma solução de estoque de 1 mg/mL FN. Adicione 5 mL de água estéril a 5 mg de COL4 para fazer uma solução de estoque COL4 de 1 mg/mL.
    1. Deixe a FN dissolver por pelo menos 30 minutos a 37 °C e o COL4 se dissolver à temperatura ambiente.
  2. Solução de estoque FN diluída em água estéril para uma concentração final de 100 μg/mL e solução de estoque COL4 para uma concentração final de 400 μg/mL.
  3. Cubra as placas desejadas (placa de 6-bem = 1 mL de solução COL4/FN, placa de 12 poços = 0,5 mL, placa de 24-bem= 0,25 mL e placa filtrada de 12 transwell = 0,25 mL) com a mistura de 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN.
  4. Incubar placas por uma mínima de 2 horas ou durante a noite a 37 °C; para placas filtradas Transwell, recomenda-se um mínimo de 4 horas.

5. Subcultura e purificação de BMECs derivados do iPSC

NOTA: A incubação com EDTA enzimática pode levar mais de 15 minutos, dependendo da confluência das células no dia 6 de diferenciação.

  1. No dia 6 de diferenciação, lave as células duas vezes com DPBS. Incubar com 1 mL de EDTA enzimática por pelo menos 15 minutos a 37 °C até obter uma única suspensão celular.
  2. Coletar células através de centrifugação a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Pelotas de célula resuspend com hESFM fresco com suplemento B27 diluído (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA.
  3. Células de sementes em placas revestidas com uma mistura de 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN. Células de sementes usando uma razão de 1 poço de uma placa de 6 poços para 3 poços de uma placa de 12 poços, 3 poços de uma placa filtrada de 12 transwell, ou 6 poços de uma placa de 24 poços.
  4. IPSCs indiferenciados da mesma linha celular em placa filtrada de 12 transwell revestidas de COL4/FN como controle negativo para análise de TEER.
  5. Após 24 horas de subcultura, troque de médio para hESFM apenas com suplemento B27. Não são necessárias alterações médias após esta etapa.

6. Ensaio de broto

  1. Colete os BMECs derivados do iPSC do dia 8 e semeeá-los a 100.000 células/poço em uma placa de fundo plano de 24 poços recém-revestida com 200 μL/cm2 de matriz de membrana de porão.
  2. Trate essas células com hESFM com diluído (1:200) B27 e 40 ng/mL do fator de crescimento endotelial vascular A (VEGFA165).
  3. Observe as células a cada 24 horas e troque o meio a cada dois dias.

7. Imunocytoquímica (ICC)

NOTA: O ICC é realizado em placas de fundo plano de 24 poços.

  1. Após 48 horas de subcultura (dia 8), lave as células duas vezes com DPBS. Fixar células com 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 minutos.
  2. Lave as células três vezes com DPBS, 5 minutos por lavagem. Células pré-bloco por 1 hora à temperatura ambiente em DPBS com 5% de soro de burro e 0,3% Triton X-100 (v/v).
  3. Incubar com anticorpos primários: camundongo anti-humano-PECAM1 (1:100, estoque 0,5 mg/mL), coelho anti-humano-TJP1 (1:200, estoque 0,53 mg/mL), rato anti-humano-CLDN5 (1:200, estoque 0,5 mg/mL), camundongo anti-humano-OCLN (1:200, estoque 0,5 mg/mL), e coelho anti-humano-SLC2A1 (1:100, estoque 0,2 mg/mL) em DPBS contendo 5% de soro de burro durante a noite a 4°C.
    1. Enxágüe células uma vez com DPBS e depois lave cinco vezes por 5 minutos por lavagem com DPBS.
  4. Incubar células com anticorpos secundários: burro-anti-coelho Alexa Fluor 555 (1:200) e burro-anti-mouse 488 (1:200) em DPBS contendo 5% de soro de burro por 1 hora.
  5. Após esta incubação, adicione Hoechst 33342 trihidrocloide trihidrocloride diluído (1:1000) em DPBS por 10 minutos.
    1. Remova a solução Hoechst 33342 e enxágue uma vez com DPBS e lave quatro vezes com DPBS por 5 minutos por lavagem.
  6. Visualize células em microscópios de fluorescência para procurar expressão e localização de fabricantes de células.

8. Medição e Análise do TEER

NOTA: As placas filtradas de Corning 12-Transwell são equipadas com filtros compostos por 1,12 cm2 membranas tereftalatos de polietileno e poros de 0,4 micrômetros. As medições teer são obtidas em réplicas técnicas (3 por poço) e biológicas (3 poços por linha celular e/ou condição).

  1. 24 horas após a subcultura (dia 7), meça o TEER usando eletrodos de pauzinho e um voltohmômetro a cada 24 horas. Consulte o manual do usuário voltohmômetro para obter instruções específicas sobre a obtenção de medições.
    1. Para medir o TEER, carregue o instrumento voltohmômetro na noite anterior. Limpe levemente o instrumento e os eletrodos de pauzinho com 70% de etanol antes de colocá-los no capô de segurança.
    2. Ligue a potência e calibra o medidor ohm conforme recomendado pelo fabricante.
    3. Conecte os eletrodos de pauzinho e enxágue os eletrodos com 70% de etanol seguidos pelo DPBS.
    4. Coloque o eletrodo final mais curto na pastilha trans-bem (a câmara apical) e a extremidade mais longa na câmara basolateral.
    5. Primeiro meça um poço em branco que é revestido apenas com COL4/FN. Então meça os outros poços.
    6. Enxágüe rapidamente eletrodos de pauzinho com 70% de etanol seguidos por DPBS ao medir diferentes condições (ou seja, medir diferentes linhas celulares).
  2. Depois de todas as medidas (em Ω) terem sido registradas, enxágue eletrodos de pauzinho com 70% de etanol e, em seguida, água estéril. Limpe suavemente o eletrodo e deixe-o secar no capô de segurança.
  3. Em média, os valores de TEER triplicado (em Ω) do poço em branco e subtraia esse valor médio de cada valor TEER bruto por condição.
    1. Média dos valores subtraídos e multiplicá-los por 1,12 cm2 (a área superficial da inserção de 12 transwell).
    2. Use valores transformados a partir da etapa 6 para gerar o gráfico mostrando o valor do TEER e os erros padrão para cada dia de medição do TEER.

9. Atividade e Análise do Transporte Efflux

NOTA: O ensaio de atividade do transportador Efflux é realizado em uma placa de fundo plano de 24 poços. Os transportadores de interesse da Efflux incluem a ABCB1 e a ABCC1. Recomenda-se que cada condição seja realizada em triplicado com poços de controle (ou seja, poços em branco sem os respectivos inibidores).

  1. Após 48 horas de subcultura (dia 8), incubam células com Valspodar de 10 μM (inibidor ABCB1) ou 10 μM MK571 (inibidor ABCC1) por 1 hora a 37 °C.
    1. Prepare 10 mM de estoque valspodar dissolvendo 5 mg de pó (1214,64 g/mol) em 412 μL de DMSO e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM Valspodar, misture 10 μL de 10 mM de estoque valspodar com 10 mL de hESFM.
    2. Prepare 10 mM MK571 de estoque dissolvendo 5 mg de pó (537,07 g/mol) em 931 μL e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM MK571, misture 10 μL de 10 mM MK571 com 10 mL de hESFM.
  2. Após 1 hora, incubar células com 10 μM de rhodamina 123 (substrato ABCB1) ou 10 μM 2',7'-diclorodihifluoresceína (H2DCFDA, substrato ABCC1) com ou sem seus respectivos inibidores por 1 hora a 37 °C.
    1. Prepare 10 mM de rhodamina 123 dissolvendo 10 mg de pó (380,82 g/mol) em 875 μL de DMSO e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM de rhodamina 123, misture 10 μL de 10 mM rhodamina 123 estoque com 10 mL de hESFM.
    2. Prepare 10 mM H2DCFDA dissolvendo 50 mg de pó (487,29 g/mol) em 10,26 mL de DMSO e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM de rhodamina 123, misture 10 μL de 10 mM rhodamina 123 estoque com 10 mL de hESFM.
  3. Lave as células duas vezes com 0,5 mL de DPBS e lise utilizando DPBS contendo 5% triton-X (v/v).
  4. Meça fluorescência das células líssedas usando um leitor de várias placas ou microplaca (ver lista de materiais).
    1. Defina o instrumento do leitor de placas fluorescentes para excitação de 485 nanômetros e 530 nanômetros e meça fluorescência nesses comprimentos de onda.
    2. Para poços não utilizados no ensaio do transportador, lave as células duas vezes com DPBS antes de corrigi-las com 4% de PFA para quantificação de núcleos celulares.
  5. Incubar células com Hoechst 33342 trihidroclorito trihidrodlorida diluída (1:1000) em DPBS por 10 minutos. Imagem múltiplos campos visuais em cada poço para calcular a contagem média de núcleos celulares usando microscópios de fluorescência.
  6. Conte núcleos usando Fiji e normalize valores de fluorescência em uma base por célula para essas contagens.
    1. Calcule o acúmulo médio de fluorescência subtraindo o valor de acumulação de fluorescência bruta para cada condição a partir de seu respectivo valor em branco.
    2. Valores subtraídos médios para cada condição.
    3. Divida os valores médios da etapa 9.6.1 pela contagem média de células. Use esses valores para normalizar os valores de fluorescência em uma base por célula.
    4. Utilize valores normalizados para gerar uma representação gráfica para cada condição inibidora e realizar qualquer análise estatística necessária.

10. Troca de passes, expansão e criopreservação de BMECs

  1. Reabastecer as culturas do dia 8 BMEC com hESFM fresco suplementado com B27 diluído (1:200) e permitir que as células se expandam por mais dois dias na matriz COL4/FN.
  2. Cubra uma nova placa filtrada de 12 Transwell e uma placa de fundo plana de 24 poços com 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN e incubar por 4 horas.
  3. No dia 10, lave as células com DPBS e incuba com 1 mL de EDTA enzimática por pelo menos 15 minutos a 37°C até que uma única suspensão celular seja obtida.
  4. Coletar células através de centrifugação a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
    1. Para criopreservar essas células, resuspend pelotas de células com hESFM fresco com 30% de soro bovino fetal (FBS) e 10% DMSO.
    2. Armazene BMECs derivados do iPSC em frascos criopreservados em um recipiente isopropanol durante as primeiras 24 horas a -80 °C, em seguida, coloque em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo a -160 °C.
    3. Para a passagem dessas células, resuspend pelotas de células com hESFM fresco suplementado com diluído (1:200) B27.
  5. Células de sementes em placas revestidas preparadas na etapa 10.2. Células de sementes usando uma razão de 1 poço de uma placa de 6 poços para 3 poços de uma placa filtrada de 12 transwell e para 6 poços de uma placa de 24 poços. Permitir que as células cresçam e se expandam por 24 horas.
  6. No dia 11, meça o TEER seguindo as etapas listadas na Etapa 8.
  7. No dia 12, execute o ICC seguindo as etapas listadas na Etapa 9.
  8. Para descongelar BMECs criopreservados, coloque os frascos criopreservados em uma água morna ou banho de contas a 37oC. Em seguida, transfira os BMECs descongelados para 5 mL de hESFM complementados com B27 diluídos (1:200).
    1. Coletar células através de centrifugação a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Resuspend as células em hESFM complementadas com diluído (1:200) B27, 10 μM RA e 10 μM Y-27632.
    2. Após 24 horas, mude de médio para hESFM complementado com diluído (1:200) B27 e 10 μM Y-27632 sem RA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Diferenciação BMEC
Alguns passos críticos neste protocolo devem ser seguidos com precisão(Figura 1). O uso médio do E6 no dia 1 é importante, uma vez que é frequentemente usado para obter linhagem neuroectoderme de iPSCs dentro de um período relativamente curto de tempo produzindo resultados reprodutíveis em múltiplas linhas celulares36. Outro passo importante é no dia 4 de diferenciação, onde o meio E6 deve ser trocado para hESFM com BMECs derivados do iPSC (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA para expandir BMECs derivados do iPSC. A adição do suplemento B27 é usada como alternativa ao soro bovino para suportar a cultura celular sem soro1, bFGF é adicionado para facilitar o crescimento dos BMECs derivados do iPSC6, e a RA é usada para facilitar o desenvolvimento do fenótipo BBB35. A última etapa importante envolve o estágio de purificação, onde os BMECs derivados do iPSC do dia 6 são subculturados em uma placa revestida COL4/FN para selecionar BMECs derivados do iPSC1,6,35,36. A Figura 2 demonstra a transição morfológica de iPSCs para BMECs. Após um dia de e6 médio (dia 1), a morfologia celular é semelhante à dos iPSCs. No 4º dia de E6, as células começam a parecer visivelmente distintas dos iPSCs e cobrem a maior parte do poço (~90% de confluência). No dia 6, enquanto cultivado em hESFM com diluído (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA, a morfologia celular começa a ter uma aparência alongada e de paralelepípedos. No dia 8, cada célula individual é distinta em um grande padrão de paralelepípedos. Um ensaio de broto foi realizado para demonstrar o potencial angiogênico dos BMECs derivados do iPSC, que resultou em estruturas semelhantes a tubos após 3 dias de tratamento VEGFA165(Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Esboço para diferenciação de iPSCs humanos aos BMECs. Os iPSCs humanos foram inicialmente cultivados em células-tronco, contendo 10 μM Y-27632 por 24 horas antes de mudar de médio para E6 por 4 dias. No dia 4, o médio foi alterado para hESFM com (1:200) suplemento B27, 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA por 2 dias. No dia 6, as células foram subculturadas em placas revestidas de COL4/FN. No dia 7, o médio foi alterado para hESFM com suplemento B27 sem bFGF e RA e TEER foi medido. No dia 8, foram realizados ensaios de atividade de transporte icc e efflux. Os BMECs derivados do iPSC foram expandidos até o dia 10 antes de serem encaminhados para uma placa de poço trans ou uma placa inferior plana de 24 poços para medição de TEER e análise icc, respectivamente. Dia 8 BMECs foram usados para o ensaio de broto (não retratado). 2 poços de uma placa de 6 poços de BMECs derivados do iPSC foram coletados e armazenados em hESFM com 10% de DMSO e 30% FBS a -80 °C e depois em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo a -160oC. No dia 12, observou-se um pico no valor do TEER em BMECs derivados do iPSC em expansão, momento em que o ICC foi realizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagens de campo brilhante representando a diferenciação dos iPSCs para BMECs. Após um dia de cultura no meio E6, os iPSCs mantêm sua morfologia característica. No 4º dia em meio E6, a morfologia celular parece distintamente diferente das iPSCs. No dia 6, a morfologia celular muda para uma aparência alongada e de paralelepípedos. No dia 8, as células aparecem grandes e com um padrão de paralelepípedos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Potencial angiogênico de BMECs derivados do iPSC. Os BMECs derivados do iPSC foram semeados a 100.000 células/cm2 na matriz de membrana do porão em hESFM com (1:200) suplemento B27 e 40ng/mL VEGFA165. Estruturas semelhantes a tubos apareceram após 3 dias de tratamento VEGFA165. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os BMECs derivados do iPSC foram semeados a 100.000 células/cm2 na matriz de membrana do porão em hESFM com (1:200) suplemento B27 e 40ng/mL VEGFA165. Estruturas semelhantes a tubos apareceram após 3 dias de tratamento VEGFA165.

A caracterização do BMEC foi realizada utilizando-se imunocittoquímica para marcadores específicos de células. Os BMECs derivados do iPSC foram avaliados para a presença de proteínas de junção apertadas (OCLN, TJP1 e CLDN5), que são comumente expressas nas junções apertadas das células endoteliais cerebrais3 e células endoteliais no pulmão, fígado e rim18. Outros marcadores, como PECAM1 e SLC2A1, foram previamente utilizados como marcadores para BMECs purificados6. PECAM13 e SLC2A4 são expressos em células endoteliais vasculares do BBB. Os BMECs derivados do iPSC gerados usando este protocolo co-expressaram todos os cinco marcadores(Figura 4).

Figure 4
Figura 4: Análise de marcadores de BMEC derivados do iPSC. Os BMECs derivados do iPSC humano foram manchados para junção apertada (OCLN, TJP1, CLDN5), transporte de influxo (SLC2A1) e proteínas de junção de aderentes (PECAM1). As proteínas OCLN, TJP1 e CLDN5 são localizadas principalmente na membrana celular. SLC2A1 e PECAM1 são localizados tanto nos núcleos quanto na membrana celular. Hoechst 33342 trihidrocloide trihidroclodida trihidrodrate foi usado para coloração nuclear. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para caracterizar a função BBB dos BMECs, o TEER foi medido 24 horas (dia 7) após subcultura e o meio foi alterado para hESFM com diluído (1:200) B27 sem bFGF e RA. As medições de TEER foram obtidas a partir do dia 7 de diferenciação (dia 0 de medição do TEER) e atingiram ~2000 Ω x cm2 no dia 8 ou 48 horas após a subcultura de BMECs(Figura 5). Esses valores teer estão dentro do intervalo descrito para BMECs co-cultivados derivados do iPSC com astrócitos primários de ratos37. A linha iPSC não tinha nenhuma função BBB discernível de acordo com seus baixos valores de TEER.

Figure 5
Figura 5: Medições teer em BMECs derivados do iPSC. Os valores do TEER atingiram o pico após um dia de subcultura na matriz COL4/FN (no dia 8 de diferenciação). As medições de TEER foram obtidas em análise técnica (3 medidas por poço) e em réplicas biológicas (3 poços por linha celular). O valor médio técnico de um poço em branco foi subtraído dos valores brutos do TEER. Esses valores foram mediados para cada dia e multiplicados por 1,12 cm2 (área superficial da pastilha de 12 transwell). As barras de erro representam erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para avaliar a atividade de transporte efflux ABCB1 eFFLUX, a quantidade de substrato fluorescente absorto para ABCB1 e ABCC1 foi quantificada após a incubação com seus respectivos inibidores. Como esperado, a inibição dos transportadores efflux ABCB1 efflux com PSC833 (inibidor ABCB1) ou MK-571 (inibidor ABCC1) levou a um aumento na rhodamina 123 (R123) ou 2',7'-dichlorodihifluorescein diacetato (H2DCFDA), respectivamente (Figura 6). Esta evidência sugere que os BMECs derivados usando este protocolo têm atividade de transporte efflux.

Figure 6
Figura 6: Atividade do Transporte Efflux em BMECs derivados do iPSC. A atividade de transporte de Efflux em BMECs foi determinada quantificando o acúmulo de rhodamina 123 (R123) ou 2',7'-diclolorodihifluoresceína (H2DCFDA) na presença ou ausência de PSC833 (inibidor de fita de ligação ATP membro B 1 (ABCB1) ou MK-571 (inibidor da subfamília C de ligação ATP 1 (ABCC1). Foram realizados triplicados técnicos para cada condição (N=1). Os valores de fluorescência da condição de controle (ou seja, sem inibidores) foram deduzidos dos valores de fluorescência bruta. Estes acúmulos de fluorescência foram normalizados por célula para cada replicação técnica. A significância estatística foi determinada por meio do teste t estudantil das três réplicas técnicas. Não foi observada significância estatística entre o acúmulo de R123 com e sem inibidor ABCB1 (t-stat= -1,66, p=0,11). Observou-se significância estatística entre o acúmulo de H2DCFDA com e sem inibidor ABCC1 (t-stat=-7,23, p=0,04). *p<0,05. As barras de erro representam erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

BMECs derivados de passagem, expansão e criopreservação do iPSC
Outro objetivo era investigar se os BMECs derivados do IPSC poderiam ser passagemdos e criopreservados após a subcultura. Para isso, os BMECs derivados do iPSC do dia 7 foram autorizados a expandir-se até o dia 10 antes de passá-los para placas filtradas COL4/FN 12 transwell recém-revestidas para medição de TEER e placa de fundo plano de 24 poços para análise ICC(Figura 7). Utilizando essa condição, os BMECs derivados do iPSC continuaram a proliferar, mantiveram a expressão de OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 e PECAM1 (Figura 8),e continuaram a sustentar os valores adequados de TEER (pico de~2000 Ω x cm2) após a aprovação(Figura 9). Os BMECs criopreservados foram posteriormente descongelados, expandidos e, em seguida, aprovados(Figura 7). As medições teer de BMECs foram obtidas 24 horas após o descongelamento e vários dias depois disso. As medições de TEER desses BMECs pós-descongelados foram reduzidas (pico de apenas 800 Ω x cm2) quando comparadas com BMECs recém-derivadas. Uma segunda passagem de BMECs pós-descongelados exibiu valores de TEER ainda mais baixos (atingindo apenas 200-300 Ω x cm2)(Figura 9) e mostrou padrões desgastados e/ou sardentas da formação de junção apertada(Figura 10). A análise de manchas ocidentais48 revelou que os iPSCs expressavam principalmente um marcador endodérmico (SOX17)49 e alguns marcadores de junção apertados (OCLN), mas não outros marcadores relacionados ao BMEC (TJP1, CLDN5 e SLC2A1)(Figura 11). Os BMECs expressaram principalmente marcadores relacionados ao endotelial (TJP1, CLDN5, OCLN e SLC2A1), com baixos níveis do marcador endodérmico, SOX17.

Figure 7
Figura 7: Imagens de campo brilhante de BMECs derivadas de iPSC expandidos e criopreservados. A) Dia 10 (4 dias após a subcultura inicial) as células atingiram a confluência máxima. B) Dia 11, 24 horas após a passagem para a placa col4/FN revestida de 24 poços. C) Dia 12, 48 horas após a passagem para placa de 24 poços revestidos col4/FN; foram observados valores de TEER de pico e CCI. D) 48 horas BMECs derivados do iPSC pós-descongelados na placa de 6 poços revestidas de COL4/FN; as células foram previamente criopreservadas em 1,2 x 102 células/mL. E) 24 horas após bMECs derivados do iPSC pós-descongelados serem encaminhados para placa de 6 poços revestidas de COL4/FN. F) 48 horas após a passagem de BMECs derivados do iPSC pós-descongelados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: ICC de BMECs derivados do iPSC após a passagem. Os BMECs foram passagemdos e mantidos na matriz COL4/FN até o dia 12, quando os valores do TEER atingiram o pico. Os BMECs do dia 12 foram manchados para junção apertada (OCLN, TJP1, CLDN5), transporte de influxo (SLC2A1) e proteínas de junção de aderentes (PECAM1). O padrão de expressão e a localização se assemelham aos observados em condições em que a passagem não foi realizada, como mostra a Figura 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Comparando medições de TEER em iPSCs, BMECs não-passagens, BMECs com passagem, BMECs criopreservados e BMECs criopreservados e aprovados. No primeiro dia, os valores do TEER atingiram o pico para BMECs não-passagens e passagens, mas não iPSCs ou BMECs criopreservados. Os BMECs criopreservados apresentaram valores de TEER moderados entre os dias 3 e 7, com valores de TEER ainda mais baixos para os BMECs criopreservados e aprovados. Os iPSCs não demonstraram nenhum valor de TEER mensurável entre os dias 0 e 9. As medições de TEER foram obtidas em análise técnica (3 medidas por poço) e em réplicas biológicas (3 por linha celular). O valor médio técnico de um poço em branco foi subtraído dos valores brutos do TEER. Esses valores foram mediados para cada dia e multiplicados por 1,12 cm2 (área superficial da pastilha de 12 transwell). As barras de erro representam erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: ICC de BMECs criopreservados e aprovados. Os BMECs foram passagemdos e mantidos em COL4/FN até que os valores de TEER de pico fossem observados. Os BMECs foram manchados para junção apertada (OCLN, TJP1, CLDN5), transporte de influxo (SLC2A1) e proteínas de junção de aderentes (PECAM1). O padrão de expressão dos marcadores de junção apertados parecia desgastado e/ou sardenta quando comparado com BMECs não-passagens(Figura 4) e BMECs com passagem(Figura 8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: Análise de manchas ocidentais de iPSCs, BMECs não-passagens, BMECs com passagem e BMECs criopreservados e passagens. Manchas ocidentais mostrando níveis de TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 e controle de carregamento (GAPDH). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modificações e solução de problemas

Neste protocolo, fizemos algumas modificações no uso de uma matriz extracelular comumente usada e meios de cultura celular durante a cultura iPSC para derivação de BMECs (Figura 1). Essas mudanças não impactaram a capacidade de derivar BMECS de iPSCs humanos, conforme descrito no protocolo Lippmann1. Uma linha iPSC de um doador saudável diferente foi usada para demonstrar que este protocolo modificado mostra resultados comparáveis aos estudos anteriores com outras linhas1. Para criopreservação, o suplemento B27 foi usado no lugar de 1% de soro derivado de plasma pobre (PDS)40,mas isso afetou a fidelidade BMEC na posterior cultura. Em relação à solução de problemas, os valores do TEER podem flutuar rapidamente antes de estabilizar. Esta flutuação pode resultar de mudanças de temperatura ocorrendo quando as placas são movidas de 37 °C para temperatura ambiente37. Para superar essa questão, as medidas devem ser tomadas de forma rápida, eficiente e consistente. Se necessário, os efeitos da temperatura podem ser levados em conta usando uma fórmula matemática fornecida por Blume et al. 200949 para obter valores teer corrigidos pela temperatura.

Limitações deste Protocolo

Apesar de obter BMECs com um fenótipo BBB robusto (ou seja, alto valor de TEER), manter essa propriedade BBB por um longo período de tempo continua sendo um grande desafio. Como mostrado aqui, os valores de TEER de pico (~2000 Ω x cm2) usando este protocolo foram muito inferiores aos valores de PICO TEER relatados anteriormente (~8000 Ω x cm2)1. Apesar dessa observação, os valores do TEER caíram dentro da faixa usual (2000-8000 Ω x cm2) dos valores relatados anteriormente1. Uma segunda limitação é a variabilidade nos valores de PICO TEER que resulta de diferentes linhas iPSC utilizadas, o que tem sido observado em outras versões deste protocolo36. A variação entre diferentes linhas celulares pode ser devido à taxa de crescimento e expansão de cada linha iPSC, que é impactada pelos fatores ambientais51. Outra limitação está relacionada à criopreservação, pois nosso protocolo não manteve a fidelidade BMEC. É possível que 1% PDS40 proporcione maior estabilidade dos BMECs durante a criopreservação.

Significância em relação aos métodos existentes

Os BMECs derivados do iPSC fornecem células que têm o histórico genético de indivíduos específicos, o que é valioso na utilização dessas células para o estudo da biologia da doença. Não é o caso quando se utiliza modelos animais ou culturas BMEC primárias extraídas de outros animais37. Além disso, as culturas BMEC primárias in vitro apresentam baixos valores de TEER (~100 Ω x cm237), muito inferiores aos obtidos com BMECs derivados do iPSC humano com o protocolo descrito aqui. Este protocolo modificado fornece um método detalhado para a obtenção de BMECs humanos a partir de iPSCs, com potencial para expandi-los e mantê-los para uso mais longo. A capacidade de passagem e armazenamento de BMECs diferenciados pode proporcionar versatilidade e flexibilidade no design experimental, especialmente quando se estuda múltiplas linhas celulares ao mesmo tempo. Com base nesses resultados, os BMECs derivados do iPSC podem ser expandidos e aprovados após a etapa inicial de subcultura(Figura 7, Figura 8 e Figura 9), mas a criopreservação precisa de uma investigação mais aprofundada. Este protocolo também pode ser usado em conjunto com outros modelos celulares baseados em células-tronco para desenvolver abordagens inovadoras, como a vascularização de organoides cerebrais. Os métodos atuais para gerar organoides cerebrais resultam em uma reconstituição incompleta dos tipos celulares do cérebro humano, uma vez que não possuem células endoteliais e elementos críticos da unidade neurovascular que compõem o BBB52,53. O protocolo descrito aqui pode fornecer uma abordagem tratável e reprodutível usando sistemas transwell/co-culturação bidimensionais que são menos caros e fáceis de implementar do que modelos 3D.

Aplicações futuras deste protocolo

Este protocolo pode ser utilizado para estudar o papel da neurovasculatura e do BBB em distúrbios neuropsiquiátricos como esquizofrenia e transtorno bipolar, onde os déficits na neurovasculatura foram hipótesedos para desempenhar um papel9,10,20,54,55. Versões anteriores deste protocolo36 foram utilizadas para derivar BMECs de linhas iPSC de pacientes com síndrome de exclusão de Huntington7 e 22q pacientes com esquizofrenia43. Ambos os estudos7,43 demonstraram utilização bem sucedida deste método para investigar a função paracelular e/ou transcelular relacionada ao BBB. Algumas preocupações foram levantadas sobre os potenciais efeitos de confusão do soro animal nos protocolos anteriores1. O protocolo sem soro utilizado aqui remove essa preocupação ao produzir resultados semelhantes aos protocolos anteriores para a deriva de BMECs.

Etapas críticas para diferenciar e expandir BMECs

Há quatro passos críticos na implementação deste protocolo. Primeiro, a semeadura de iPSCs em uma densidade ótima (ou seja, semeadura em ~15.600 células/cm2) é importante para uma diferenciação eficiente de BMEC. Se a densidade celular for muito alta ou muito baixa até o dia 4 de diferenciação, as culturas podem apresentar maiores taxas de heterogeneidade celular56. Um segundo passo importante é a indução da diferenciação entre o dia 1 e o dia 4, onde o meio E6 é utilizado para iniciar a diferenciação. O E6 é utilizado no lugar do "meio incondicionado" que foi utilizado nos protocolos anteriores6,35. Não só o E6 médio reduz o tempo de diferenciação de 13 dias para 8 dias, como também promove a expressão de proteínas de junção apertadas (TJP1, OCLN, CLDN5) e marcadores BMEC (PECAM1 e SLC2A1)36. O uso do meio E6 também resultou em valores adequados de TEER (Figura 5) e atividade de transporte abcb1 e ABCC1 efflux(Figura 6)6,35. Em terceiro lugar, o uso de B27 em vez de soro bovino permitiu a condição livre de soro, o que melhorou a consistência e a confiabilidade da diferenciação BMEC1. Por fim, em termos de expansão dos BMECs derivados do iPSC, as células devem ser passagemdas quando atingem ~100% de confluência. Com base neste protocolo, os BMECs derivados do iPSC podem ser ainda mais expandidos e aprovados após o estágio inicial de subculturação(Figura 7, Figura 8 e Figura 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio R01MH113858 (para R.K.), do National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS), r01MH113858 (para R.K.), prêmio kl2 TR002542 (PL). um National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (para R.K.), um Sydney R Baer Jr Foundation Grant (para P.L.) o Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (para R.K.), a Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (para R.K.), o Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (para R.K.), o Harvard Stem Cell Institute (para R.K.) e por Steve Willis e Elissa Freud (para R.K.). Agradecemos à Dra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Neurociência Questão 165 Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem células endoteliais microvasculares do cérebro barreira cerebral sanguínea resistência elétrica trans-endotelial atividade transportadora microvascular esquizofrenia transtorno bipolar passagem expansão criopreservação
Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya,… More

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter