Summary
本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞を分化して得られる脳内血管内皮細胞を導き出し、拡大、および凍結保存し、 また、ex vivo モデルにおける血液脳関門特性を研究するための適応法を詳述する。
Abstract
脳内血管内皮細胞(BMEC)は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から分化し、血液脳関門(BBB)機能を研究するためのex vivo細胞モデルを開発することができます。この変更されたプロトコルは、以前のプロトコルで報告されたものとは異なるドナーと試薬を使用して、ヒトのiPSCからBMECを導き出し、拡張し、凍結保存するための詳細な手順を提供します。iPSCは必須6培地で4日間処理され、続いて2日間のヒト内皮無血清培地に塩基性線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、およびB27サプリメントを添加した。6日目に、細胞をコラーゲン/フィブロネクチンマトリックス上で2日間分培養する。免疫細胞化学は、CLDN5、OCLN、TJP1、PECAM1、およびSLC2A1を用いたBMECマーカー分析のために8日目に行われる。ウェスタンブロッティングは、BMECマーカー発現を確認するために行われ、および、内皮マーカーであるSOX17の不存在を確認する。血管形成の可能性は、発芽アッセイで実証される。7日目から箸電極と電圧計を用いて、電気抵抗(TEER)を使用して、内皮間を越えた電気抵抗(TEER)を測定します。ATP結合カセットサブファミリーB部ファミリーB部材1及びATP結合カセットサブファミリーC部材1に対する流出トランスポーター活性は、8日目にマルチプレートリーダーを用いて測定される。BMECsの誘導に成功した、関連する細胞マーカーの存在によって確認され、SOX17の低レベル、血管新生電位、トランスポーター活性、およびTEER値〜2000 Ω xcm2。BMECは、コーティングされたばかりのコラーゲン/フィブロネクチンプレートまたは凍結保存に加える前に、10日目まで拡張されます。このプロトコルは、iPSC由来のBMECを少なくとも1回拡張して通行できることを示しています。しかしながら、凍結保存後に、低いTEER値およびBMECマーカーの局在化不良が観察された。BMECは、他の細胞タイプ(ニューロン、グリア、ペリサイト)、3次元脳モデル(オルガンチップおよびヒドロゲル)、脳オルガノイドの血管化、および神経精神疾患におけるBBB機能障害の研究に使用できます。
Introduction
血液脳関門機能
血液脳関門(BBB)は、血液から脳への物質の移動を制限する境界を形成する。BBBは、血管系を裏打ちする単層を形成する脳内血管内皮細胞(BMEC)で構成される。BMECは、アストロサイト、ニューロン、ペリサイト、ミクログリア、および細胞外マトリックスと共に、神経血管ユニットを形成する。BMECは、BBBが高い経皮電気抵抗(TEER)を維持することを可能にする厳しく調節されたパラセルラー構造を有し、受動拡散を制限し、バリア完全性1、2の指標として機能する。BMECsはまた、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、およびトランスマイグレーションなどの細胞間移動を助けるタンパク質、ならびに免疫応答3中の白血球の飛散を助けるタンパク質を有する。BMECは、脳内の恒育的バランスを維持するために、廃棄物の栄養と除去のために流入および流出輸送器に依存しています3.例えば、溶質キャリアファミリー2メンバー1(SLC2A1)は、BBB4を横切るグルコースの移動を担う流入トランスポーターであり、ATP結合カセットサブファミリーBメンバー1(ABCB1)およびATP結合カセットサブファミリーCメンバー1(ABCC1)などの流出トランスポーターは、基材を血流3、5、6、7に戻す責任を負う。ABCB1基質は、モルヒネ、ベラパミル4、オランザピンおよびリスペリドン8などの抗精神病薬を含み、一方、ABCC1トランスポーターは、硫酸コンジュゲート、ビンクリスチン、グルクロニド共役体4を含む様々な基質を有する。
精神障害におけるBBBモデルの応用
BBB機能障害は、統合失調症および双極性障害9,10を含む多くの神経学的および精神疾患に関与している。近年、iPSC由来のex vivo細胞モデルは、精神疾患の細胞および分子基盤を問い合わせるのに利用されているが、これらのモデルは現在、神経血管系11、12、13が果たす潜在的な役割を考慮していない。血液中を循環する末梢炎症性サイトカインがBBB14、15、16、17に悪影響を及ぼす可能性があると仮定されているが、細胞内18、19、20、21、22、トランスセルラー23、24、25、26、27、28、29、および細胞外マトリックス20、29、302、32に対する異常を示す証拠もある。 BBBの破壊は、血液の内容物が脳実質に入り、アストロサイトおよび/またはミクログリアを活性化して炎症性サイトカインを放出し、脳34に有害な影響を及ぼし得る炎症反応33を開始する。BMECはBBBの主要な構成要素であり、これらの細胞の構造および機能を調べることは、神経学的および精神障害におけるBBB機能不全の理解を高めることができる。
代替BMECモデル
iPSC1,6,35,36からBMECを導出するための効率的なプロトコルが開発される前に、研究者はBBB機能を研究するために不死化BMEC37を採用していました。しかしながら、これらのモデルの多くは望ましいBBB型を達成することができず、このようなTEER値の生理学的範囲は38,39である。iPSCを利用することは、細胞が由来する個体の遺伝的背景を保持するという利点がある。科学者たちは、人間の脳の構造と機能を再現するiPSC由来のex vivo微小環境モデルの確立に積極的に取り組んでいます。研究者たちは、生体内で見つかったBMECsと構造的および生理的に類似したBMECを導き出す方法を開発した。iPSC由来BMECの精製集団を得るための方法は、プロトコルが過去数年間に最適化されているいくつかの異なるステップを必要とします1,6,35,36.一般に、iPSC由来BMECは、エッセンシャル6(E6)培地で4日間培養され、続いてヒト内皮無血清培地(hESFM)に塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、レチノイン酸(RA)、およびB27サプリメントを添加して2日間培養する。次に、細胞をコラーゲンIV(COL4)およびフィブロネクチン(FN)マトリックスで培養し、90%均質BMECs1を得る。
BMECの同一性は、血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM1)、SLC2A1、およびタイト接合タンパク質1(TJP1)、閉塞子タンパク質(OCLN)、およびクローディン-5(CLDN)6などの緊密な接合タンパク質を含むBMECタンパク質の共発現を示す免疫蛍光によって確認される。発芽アッセイは、iPSC由来BMECの血管新生電位を確認するために使用されてきた。6 BMECのBBB完全性は、ヒロインテエル値(〜2000Ω xcm2)37の存在とABCB1およびABCC11、6、36などの流出トランスポーターに対する測定可能な活性によって評価される。Lippmannグループによる最近の方法論的進歩は、実験変動性の低下と再現性の強化を伴うiPSC由来のBMECプロトコルに至った。しかし、彼らがサブ培養段階を超えて拡大し、通過できるかどうかは不明である。私たちの変更されたプロトコルは、8日目以降にiPSC由来のBMECを渡し、凍結保存後にBBBプロパティをさらに拡張できるかどうかを評価することによって、この問題に対処することを目指しています。iPSC由来BMECの経食について記述した研究はないが、凍結融解サイクル40を受けた後に生理学的BBB特性を保持するBMEC凍結保存のためのプロトコルが存在する。しかし、凍結保存後BMECを通過させ、BBB特性を保持できることは知られていない。
Lippmann プロトコルを使用して iPSC から派生した BMEC は、ハンチントン病などの神経疾患における BBB 破壊をモデル化するために利用されてきた7.このようなiPSC由来BMECは、それぞれ41,42の血液CSFバリア及びBBBの破壊に対するナイセリア髄膜炎又はB群連鎖球菌などの細菌感染の影響を調べるためにも用いられている。また、統合失調症患者の22q欠失症候群患者からのiPSC由来BMECを用いて、研究者は、脳43への白血球の募集および外挿を補助するBMECの主要な接着分子である細胞間接着分子-1(ICAM-1)の増加を観察した。これらの研究をまとめると、複雑な神経精神疾患におけるBBB破壊を研究するためのiPSC由来BMECの有用性を示す。
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Protocol
ヒトiPSCは、マサチューセッツ総合病院およびマクリーン病院の機関審査委員会によって承認されたプロトコルを使用して健康なドナーの線維芽細胞から再プログラムされ、以前の研究44、45、46に記載されているように特徴付けられる。
注:簡単に言えば、線維芽細胞は、mRNAベースの遺伝的リプログラミング47を介してiPSCに再プログラムされた。iPSCは幹細胞培地(SCM)(材料リストを参照)で維持され、SCMの1mLで〜1.2 x 102 細胞/mLの密度で保存され、Rho関連プロテインキナーゼ阻害剤(ROCKi)Y-27632、および10%(v/v)ジメチル硫化物(DMSO)を有する10%(v/v)ジメチル硫化物(DMSO)を有する10%(v/v)の凍結物でC-液体中に凍結した。 以下の手順はすべて、特に明記されていない限り、バイオセーフティキャビネットで行われます。
1. 基質膜マトリックス希釈およびプレートコーティング
- 希薄(1:50)成長因子は、フェノールレッドなしのダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)のエンゲルブレス-ホルム群発腫瘍から精製された基質膜マトリックスを減少させた。
- 細胞培養プレートに適量の希釈基質膜マトリックス(すなわち、6ウェルプレート=1mL、12ウェルプレート=0.5mL)を塗布し、これらのプレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートする。
2. iPSC メンテナンス
注:6ウェルフラットボトムプレートのウェルあたりの最大合流値は〜1.2 x 106 細胞です。
- 凍結保存されたiPSCを10 μM Y-27632でSCMに解凍し、希釈成長因子でコーティングされた6ウェルプレートにプレートを貼り付け、基部膜マトリックスを減少させます。
- 解凍後の最初の24時間、10 μM Y-27632でIPSCをSCMに維持します。24時間後に新鮮な培地に切り替えます。
- 細胞が合格する前に80-90%の合流度に達するまで、SCMでiPSCを維持します。
- 分化に必要な密度(15,600セル/cm2)をウェルの表面積で乗算することにより、分化に必要なiPSCの数を計算します。6ウェルフラットボトムプレートの場合、15,600個のセル/cm2 に9.6cm2 を掛け、合計149,760個の細胞/ウェルを求めます。
- 通過するには、ハンクスのバランス塩溶液(HBBS)で細胞を洗います。次いで、37°Cで5分間非酵素性エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)(材料リストを参照)で細胞をインキュベートする。
- セルスクレーパーを使用して、細胞をそっと持ち上げます。新鮮なSCMで細胞を収集します。
- 細胞を希釈したSCMでコーティングし、ステップ2.3に記載されているように細胞を維持するか、SCMの1mL、10μM Y-27632、および10%DMSO(v/v)を-160°Cの温度で液体窒素中の凍結保存バイアルに保存します。
3. BMEC に対する iPSC の差別化
注: 非酵素 EDTA は細胞を束に分離します。酵素EDTA( 材料表を参照)は、細胞を単一細胞懸濁液に分離する。レチノイン酸(RA)は光から保護する必要があります。
- ダルベッコのリン酸緩衝液生理食塩基(DPBS)でiPSCを一度洗います。酵素EDTA(6ウェルプレート用1mL、12ウェルプレートの場合は0.5mL、24ウェルプレートでは0.25mL)を37°Cで約5分間インキュベートし、単一の細胞懸濁液を得る。
- 細胞と遠心分離機を室温で5分間300xg(相対遠心力)で収集します。10 μM Y-27632 を含む SCM の細胞ペレットを再懸濁します。
- トリパンブルーと自動セルカウンターまたはヘモサイトメーター装置を使用して細胞密度を決定します。SCMの15,600細胞/cm2 または149,760細胞/ウェルの密度のプレートセルは、10 μM Y-27632を24時間含むSCMの6ウェルフラットボトムプレート(表面積9.6 cm2/well)です。
- SCMをE6培地に変更して24時間後に分化を開始します。次の4日間、E6培地を毎日変更します。
- 分化の4日目に、希釈(1:200)B27サプリメント、20 ng / mL bFGF、および10 μM RAを添加したhESFMでE6培地を交換してください。このメディアは、次の 48 時間変更しないでください。
- 希釈(1:200)B27でhESFMの200 mLを調製し、hESFMの199 mLに50倍濃縮B27サプリメントの1 mLを混合します。
- トリスバッファー(5 mMトリス、pH 7.6、150 mM NaCl)の250 μLで50 μgのbFGFを再構成して、200 μg/mL のストック溶液を作り出し、bFGF の 20 ng/mL を調製します。200 μg/mL bFGF の 20 μL を 200 mL の hESFM と混合して 200 ng/mL bFGF を含む hESFM の 200 mL を準備します。
- まず、2.5 mLのDMSOを100mgのRA粉末に加えて、40mg/mLのRAストック溶液を作って10μM RAを調製します。この濃度を3 mg/mLに希釈して10 mMのストック液を作ります。10μM RAを含むhESFM 200 mLを200 mL hESFMに200 μM RAの200 μL混合して準備します。
4. iPSC由来BMECの精製用コラーゲンIV(COL4)およびフィブロネクチン(FN)マトリックスのコーティング
- 2 mg/mL FNストック溶液を作るためにFNの2mgに滅菌水の2 mLを加えます。5 mg/mL COL4 ストック溶液を作るために5 mg の COL4 に無菌水の 5 mL を加えます。
- FNを37°Cで少なくとも30分間溶解させ、コル4を室温で溶解させます。
- 滅菌水中のFNストック溶液を100 μg/mLの最終濃度に希釈し、コル4ストック溶液を400 μg/mLの最終濃度にします。
- 目的のプレート(6ウェルプレート=1mLのCOL4/FN溶液、12ウェルプレート=0.5mL、24ウェルプレート=0.25mL、12トランスウェル濾過プレート=0.25mL)を400μg/mL COL4と100μg/FNLの混合物でコーティングします。
- プレートを37°Cで最低2時間または一晩インキュベートします。トランスウェルの濾過プレートには、最低4時間を推奨します。
5. iPSC由来BMECsのサブカルチャーと精製
注:酵素EDTAによるインキュベーションは、分化の6日目の細胞の合流度に応じて15分以上かかることがあります。
- 分化の6日目に、DPBSで細胞を2回洗浄する。1 mLの酵素EDTAを1mLで、1つの細胞懸濁液が得られるまで37°Cで少なくとも15分間インキュベートする。
- 室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。希釈された(1:200)B27サプリメント、20 ng / mL bFGF、および10 μM RAで新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁します。
- 400 μg/mL COL4 と 100 μg/mL FN の混合物でコーティングされたプレートに細胞をシード. 12 ウェルプレートの 3 ウェルに対する 6 ウェルの比率を使用して、12-トランスウェルフィルタープレートの 3 つのウェル、または 24 ウェル プレートの 6 ウェル。
- 同じ細胞株から、TEER分析用の負のコントロールとして、12トランスウェル濾過プレートをコーティングした12トランスウェルにコーティングされたプレートに未分化のiPSCをシードします。
- サブ培養の24時間後、B27サプリメントのみで培地をhESFMに変更する。この手順の後に、メディアの変更は必要ありません。
6. 発芽アッセイ
- 8日目のiPSC由来BMECを収集し、100,000個の細胞/ウェルで播種し、200μL/cm2 の基底膜マトリックスでコーティングされた24ウェルフラットボトムプレートに播種します。
- これらの細胞を希釈(1:200)B27および40ng/mLの血管内皮増殖因子A(VEGFA165)で治療してください。
- 細胞を24時間ごとに観察し、2日ごとに培地を変える。
7. 免疫細胞化学(ICC)
メモ:ICCは24ウェルフラットボトムプレート上で行われます。
- 48時間のサブ培養(8日目)の後、DPBSで細胞を2回洗浄する。4%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を20分間固定します。
- DPBSで細胞を3回洗浄し、1回5分洗浄します。5%ロバ血清と0.3%トリトンX-100(v/v)を用いたDPBSの室温で1時間のプレブロック細胞。
- 一次抗体でインキュベート:マウス抗ヒトPECAM1(1:100、ストック0.5mg/mL)、ウサギの抗ヒトTJP1(1:200、 在庫 0.53 mg/mL、マウス抗ヒトCLDN5(1:200、在庫0.5 mg/mL)、マウス抗ヒトOCLN(1:200、ストック0.5 mg/mL)、ウサギの抗ヒトSLC2A1(1:100、在庫0.2 mg/mL)、DPBSで一晩で5%のドンキーを含む
- DPBSで細胞を一度洗い流し、次にDPBSで1回5分間洗浄します。
- 二次抗体を含むインキュベート細胞:ロバ抗ウサギアレクサFluor 555(1:200)とロバ抗マウス488(1:200)を含むDPBSで5%ロバ血清を1時間含む。
- このインキュベーションに続いて、Hoechst 33342三水塩化物三水和物をDPBSで10分間希釈(1:1000)を加えます。
- Hoechst 33342溶液を取り出し、DPBSで1回洗い流し、1回の洗浄につき5分間DPBSで4回洗浄します。
- 蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、細胞メーカーの発現と局在を探します。
8. TEERの測定および分析
注:コーニング12-トランスウェル濾過プレートは、1.12 cm2 ポリエチレンテレフタレート膜および0.4マイクロメートルの細孔からなるフィルタが装備されています。TEERの測定は技術的(ウェルあたり3)および生物学的複製(細胞株および/または条件当たり3つのウェル)で得られる。
- サブ培養(7日目)の24時間後に、24時間ごとに箸電極とボルトメーターを使用してTEERを測定します。測定の取得に関する具体的な説明については、voltohmmmeterユーザーマニュアルを参照してください。
- TEERを測定するには、前の晩に電圧計計を充電します。楽器と箸の電極を70%エタノールで軽く拭き取ってから、安全フードに入れます。
- 電源を入れ、製造元が推奨するオームメーターを調整します。
- 70%エタノールを使用して箸の電極とリンス電極を差し込み、その後DPBSを使用します。
- 短い端電極をトランスウェルインサート(アピカルチャンバー)に入れ、長い端をバソラハアチャンバーに入れます。
- まず、COL4/FNのみでコーティングされたブランクウェルを測定します。その後、他の井戸を測定します。
- 異なる条件(すなわち異なる細胞株を測定する)を測定するとき、70%エタノールとDPBSで箸の電極を素早くすすぐ。
- すべての測定(Ω)が記録された後、70%エタノールと滅菌水で箸の電極をすすいでください。電極を軽く拭き取り、安全フード内で空気を乾燥させます。
- 空白ウェルから TEER 値 (Ω) を 3 重に平均し、条件ごとに各未加工の TEER 値からこの平均値を差し引きます。
- 減算された値を平均化し、1.12 cm2 (12 トランスウェル挿入物の表面積) を掛けます。
- ステップ 6 の変換された値を使用して、TEER 測定の各日の TEER 値と標準誤差を示すグラフを生成します。
9. 流出トランスポーターの活動と分析
注:流出トランスポーター活性アッセイは、24ウェルフラットボトムプレート上で行われます。目的の流出トランスポーターは、ABCB1およびABCC1を含む。各条件は、コントロールウェル(すなわち、それぞれの阻害剤のないブランクウェル)で三重に行われることをお勧めします。
- 48時間のサブ培養(8日目)の後、10μMバルスポダール(ABCB1阻害剤)または10μM MK571(ABCC1阻害剤)を37°Cで1時間インキュベートする。
- 412 μLのDMSOに5mgの粉末(1214.64 g/mol)を溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mMバルスポダールストックを調製します。例えば、10 μM バルスポダールで 10 mL の hESFM を作るためには、10 mM バルスポダールの 10 μL を 10 mL の hESFM と混ぜます。
- 5 mg粉末(537.07 g/mol)を931 μLに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mM MK571ストックを調製します。例えば、10 μM MK571で10 mLのhESFMを作るためには、10 mM MK571ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混ぜます。
- 1時間後、10μMローダミン123(ABCB1基質)または10μM2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンジアセインジアセインジアセア(H2DCFDA、ABCC1基質)を37°Cで1時間、または無用にインキュベートする細胞。
- 10 mgの粉末(380.82 g/mol)をDMSOの875 μLに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して10 mMローダミン123を調製します。例えば、10 μMローダミン123で10mLのhESFMを作るために、10 mMローダミン123ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混合します。
- 50 mgの粉末(487.29 g/mol)を10.26 mLのDMSOに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mM H2DCFDAを調製します。例えば、10 μMローダミン123で10mLのhESFMを作るために、10 mMローダミン123ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混合します。
- 5%トリトンX(v/v)を含むDPBSを使用して、0.5 mLのDPBSと溶菌で細胞を2回洗浄します。
- マルチプレートまたはマイクロプレートリーダーを使用して、細胞の発光を測定します(材料リストを参照)。
- 蛍光プレートリーダーの計測器を485ナノメートル励起と530ナノメートルの発光に設定し、これらの波長で蛍光を測定します。
- トランスポーターアッセイに使用されていないウェルの場合、細胞核定量のために4%PFAで固定する前に、DPBSで細胞を2回洗浄します。
- Hoechst 33342三水和物を用いたインキュベート細胞は、DPBSで10分間希釈した三水塩化物(1:1000)各ウェルに複数の視野を画像化し、蛍光顕微鏡を用いて平均細胞核数を計算する。
- フィジーを使用して核を数え、これらのカウントに細胞ごとに蛍光値を正規化します。
- それぞれのブランク値から各条件の生蛍光蓄積値を差し引いて、蛍光の平均蓄積を計算する。
- 各条件の平均減算値。
- ステップ 9.6.1 の平均値を平均セル数で割ります。これらの値を使用して、細胞ごとに蛍光値を正規化します。
- 正規化された値を使用して、各インヒビター条件のグラフィカル表現を生成し、必要な統計分析を実行します。
10. BMECのパッシング、拡大、凍結保存
- 希釈された(1:200)B27を補充した新鮮なhESFMで8日目のBMEC培養物を補充し、細胞がCOL4 / FNマトリックスでさらに2日間拡大できるようにします。
- 新しい12-トランスウェルろ過プレートと24ウェルフラットボトムプレートに400 μg/mL COL4と100 μg/mL FNをコーティングし、4時間インキュベートします。
- 10日目に、DPBSで細胞を洗浄し、1つの細胞懸濁液が得られるまで37°Cで少なくとも15分間酵素EDTAの1mLでインキュベートする。
- 室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。
- これらの細胞を凍結保存するには、30%の胎児ウシ血清(FBS)および10%DMSOで新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁する。
- iPSC由来のBMECを-80°Cで最初の24時間イソプロパノール容器に凍結保存されたバイアルに保存し、次に液体窒素に入れて-160°Cで長期保存します。
- これらの細胞を通過させるために、希釈された(1:200)B27を補充した新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁する。
- ステップ10.2で調製したコーティングされたプレートに細胞をシードする。6ウェルプレートの1ウェルの比を使用して、12-トランスウェル濾過プレートの3つの井戸と24ウェルプレートの6ウェルにシードセル。細胞が 24 時間成長し、拡大することを許可します。
- 11日目に、ステップ8に記載されているステップに従ってTEERを測定します。
- 12日目に、手順9に記載されている手順に従ってICCを実行します。
- 凍結保存されたBMECを解凍するには、凍結保存されたバイアルを温水またはビーズバスの37oCに入れます。解凍したBMECsを希釈(1:200)B27で補ったhESFMの5 mLに移します。
- 室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。希釈(1:200)B27、10 μM RA、10 μM Y-27632を補ったhESFMで細胞を再懸濁します。
- 24時間後、希釈された(1:200)B27と10 μM Y-27632を添加したhESFMに媒体をRAなしで切り替える。
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Representative Results
BMEC差別化
このプロトコルのいくつかの重要な手順は正確に実行する必要があります (図 1) 。1日目のE6培地使用は重要であり、比較的短時間でiPSCから神経外発性系統を導出するために用いられることが多いため、複数の細胞株36にわたって再現可能な結果を生み出す。もう一つの重要なステップは、E6培地が希釈された(1:200)B27、20 ng / mL bFGFおよび10 μM RAでhESFMに切り替え、iPSC由来のBMECsを拡大する4日目です。B27サプリメントの添加は、無血清細胞培養1をサポートするウシ血清の代替として使用され、bFGFは、iPSC由来BMECs6の成長を容易にするために添加され、およびRAはBBB表現型35の開発を容易にするために使用される。最後の重要なステップは、6日目のiPSC由来BMECがCOL4/FNコーティングプレート上にサブ培養され、iPSC由来のBMECs1、6、35、36を選択する精製段階を含む。図2は、iPSCからBMECへの形態変化を示す。E6培地(1日目)の1日後、細胞形態はiPSCの形態と同様である。E6の4日目までに、細胞はiPSCとは目に見えて見え始め、ほとんどのウェル(約90%の合流率)をカバーします。6日目までに、希釈(1:200)B27、20 ng/mL bFGFおよび10μM RAでhESFMで培養される一方で、細胞形態は細長く石畳の外観を有し始める。8日目では、個々のセルは大きな石畳パターンで異なります。発芽アッセイを行い、iPSC由来BMECの血管新生ポテンシャルを実証し、VEGFA165処理の3日後にチューブ状の構造を生じた(図3)。
図1:BMECに対するヒトiPSCの分化の概要ヒトiPSCは、10μM Y-27632を含む幹細胞培地で24時間培養した後、培地をE6に4日間交換した。4日目に、培地を(1:200)B27サプリメント、20 ng/mL bFGF、および10μM RAで2日間hESFMに変更した。6日目、COL4/FN被覆プレート上に細胞をサブ培養した。7日目に、bFGFおよびRAおよびTEERを用いないB27サプリメントを用いて培地をhESFMに変更し、測定した。8日目に、ICCおよび流出トランスポーター活性アッセイが行われた。iPSC由来BMECは、それぞれTEER測定およびICC分析のためにトランスウェルプレートまたは24ウェルフラットボトムプレートに通過する前に、10日目まで拡張されました。8日目のBMECは、発芽アッセイ(描かれていない)に使用されました。iPSC由来BMECの6ウェルプレートの2ウェルを収集し、-80°Cで10%のDMSOと30%FBSでhESFMに保存し、次いで-160oCで長期保存するために液体窒素に貯蔵しました。12日目に、ICCが実施された時点で拡張iPSC由来BMECsにおいてTEER値のピークが観察された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:BMECに対するiPSCの差別化を描写する明視野画像E6培地で1日培養した後、iPSCはその特徴的な形態を保持します。E6培地の4日目には、細胞形態はiPSCとは明らかに異なって見える。6日目、細胞形態は細長く石畳の外観に変化する。8日目までに、細胞は大きく、石畳のパターンで現れます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:iPSC由来BMECsの血管形成ポテンシャル 精製されたiPSC由来BMECを、(1:200)B27サプリメントと40ng/mL VEGFA165を用いてhESFMの基質膜マトリックスに100,000細胞/cm2 で播種しました。3日間のVEGFA165治療後にチューブ状の構造が現れた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
精製されたiPSC由来BMECを、(1:200)B27サプリメントと40ng/mL VEGFA165を用いてhESFMの基質膜マトリックスに100,000細胞/cm2 で播種しました。3日間のVEGFA165治療後にチューブ状の構造が現れた。
BMEC特性評価は、細胞特異的マーカーに免疫細胞化学を用いて行った。iPSC由来BMECは、肺、肝臓、腎臓18における脳内皮細胞3および内皮細胞の緊密な接合部で一般的に発現される緊密な接合タンパク質(OCLN、TJP1、およびCLDN5)の存在について評価された。PECAM1およびSLC2A1のような他のマーカーは、以前に精製されたBMECs6のマーカーとして使用されてきた。PECAM13およびSLC2A4は、いずれもBBBの血管内皮細胞において発現される。このプロトコルを使用して生成された iPSC 由来 BMEC は、これら 5 つのマーカーすべてを共に表現した (図 4)。
図4 iPSC由来BMECsのマーカー分析ヒトiPSC由来BMECは、密接(OCLN、TJP1、CLDN5)、流入トランスポーター(SLC2A1)、および付着接合(PECAM1)タンパク質に染色された。OCLN、TJP1、およびCLDN5タンパク質は、主に細胞膜に局在する。SLC2A1およびPECAM1は、核および細胞膜の両方に局在する。Hoechst 33342三塩酸塩三水和物は、核染色に使用した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
BMECsのBBB機能を特徴付けるために、TEERをサブ培養後24時間(7日目)に測定し、培地をbFGFおよびRAを用いない希釈(1:200)B27でhESFMに変更した。TEER測定は、分化の7日目(TEER測定の0日目)から得られ、BMECsのサブ培養後8日目または48時間後に〜2000 Ω xcm2でピークを迎えた(図5)。これらのTEER値は、ラットの一次アストロサイト37と共培養iPSC由来BMECについて説明される範囲内である。iPSC ラインは、低い TEER 値に基づいて識別可能な BBB 関数を持っていませんでした。
図 5: iPSC 由来 BMECs における TEER 測定値TEER 値は、COL4/FN 行列 (分化 8 日目) でのサブ培養の 1 日後にピークに達しました。TEERの測定は技術的(ウェル当たり3つの測定)および生物学的複製(細胞株当たり3つのウェル)で得られた。ブランクウェルからの技術的平均値は、生の TEER 値から差し引かれました。これらの値は、1 日の平均値を 1.12 cm2 (12 トランスウェル挿入物の表面積) で乗算しました。誤差範囲は、標準誤差を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ABCB1およびABCC1流出トランスポーター活性を評価するために、ABCB1およびABCC1に対して取り上げた蛍光基質の量は、それぞれの阻害剤によるインキュベーションに続いて定量した。予想通り、PSC833(ABCB1阻害剤)またはMK-571(ABCC1阻害剤)を用いたABCB1およびABCC1流出輸送体の阻害は、ローダミン123(R123)または2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセチン(H2DC)の増加につながった(図6)。この証拠は、このプロトコルを用いて導出されたBMECが流出トランスポーター活性を有することを示唆している。
図6:iPSC由来BMECsにおける流出トランスポーター活性BMECsにおける流出トランスポーター活性は、ローダミン123(R123)または2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(H2DCFDA)の蓄積を定量することによって決定した。 )PSC833(ATP結合カセットサブファミリーBメンバー1(ABCB1)阻害剤)またはMK-571(ATP結合カセットサブファミリーCメンバー1(ABCC1)阻害剤)の有無。各条件に対して技術的三重化が行われた(N=1)。制御条件(すなわち阻害剤なし)からの蛍光値は、生蛍光値から差し引いた。これらの蛍光蓄積は、各技術的複製について細胞ごとに正規化した。統計的有意性は、3つの技術的複製から学生t検定を用いて決定された。ABCB1阻害剤の有無にかかわらずR123の蓄積の間に統計的有意性は認められなかった(t-stat= -1.66,p=0.11)。ABCC1阻害剤の有無にかかわらずH2DCFDAの蓄積の間に統計的有意性が認められた(t-stat=-7.23,p=0.04)。*p<0.05。誤差範囲は、標準誤差を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
iPSC由来BMECsの過渡、拡大、凍結保存
もう一つの目的は、iPSC由来のBMECがサブ培養後に通過し、凍結保存できるかどうかを調査することであった。この目的のために、7日目のiPSC由来BMECは、新しくコーティングされたCOL4/FN 12トランスウェル濾過プレートに加えて新しくコーティングされたCOL4/FN 12トランスウェルを被覆したプレートに加えて、ICC分析用の24ウェルフラットボトムプレートに渡す前に、10日目まで拡大することを許可された(図7)。この条件を用いてiPSC由来BMECは増殖を続け、OCLN、TJP1、CLDN5、SCL2A1、およびPECAM1(図8)の発現を維持し、合格後も適切なTEER値(ピーク時2000 Ω xcm2)を維持し続けた(図9)。凍結保存された BMEC は、後に解凍され、拡張され、その後、通過した(図7)。BMECsのTEER測定は、解凍後24時間およびそれ以降さらに数日で得られた。これらの解凍後BMECのTEER測定は、新たに由来するBMECと比較して(わずか800 Ω xcm2でピークに達する)減少した。ポスト解凍されたBMECの2回目の合格は、さらに低いTEER値(わずか200〜300 Ω x cm2)を示し(図9)、タイトな接合形成のほつれたパターンおよび/またはそばかすパターンを示した(図10)。ウェスタンブロット分析48は、iPSCが主に内皮マーカー(SOX17)49およびいくつかのタイトな接合マーカー(OCLN)を発現しているが、他のBMEC関連マーカー(TJP1、CLDN5、およびSLC2A1)を発現していないことを明らかにした(図11)。BMECは主に内皮関連マーカー(TJP1、CLDN5、OCLNおよびSLC2A1)を発現し、内皮マーカーSOX17の低レベルを有する。
図 7: 拡大および凍結保存された iPSC 由来の BMECs の明るいフィールド イメージA) 10日目(最初のサブ培養の4日後)細胞は最大合流に達した。B)11日目、COL4/FNに渡してから24時間後に24ウェルプレートをコーティングした。C)Day12、COL4 / FNコーティング24ウェルプレートにパスを加えた48時間後。ピークTEER値が観察され、ICCが実施された。D) COL4/FNコーティング6ウェルプレート上の48時間の解凍後のiPSC由来BMEC;細胞は以前1.2 x 102 細胞/mLで凍結保存されていた。E) 解凍後のiPSC由来BMECがCOL4/FN被覆6ウェルプレートに通過してから24時間後。F) 解凍後の iPSC 由来 BMEC が通過してから 48 時間後。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:過渡後のiPSC由来BMECsのICCBMECは、TEER値がピークに達した12日目まで、COL4/FNマトリックス上で通過し、維持された。12日目のBMECは、密接(OCLN、TJP1、CLDN5)、流入トランスポーター(SLC2A1)および付着接合(PECAM1)タンパク質に染色された。式パターンとローカリゼーションは、図 4 に示すように、パス処理が実行されなかった条件で観察されたものと似ています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 9: iPSC、非通過 BMEC、通過 BMEC、凍結保存 BMEC、および凍結保存および通過 BMEC における TEER 測定値の比較1 日目に、TEER 値は非通過および通過型 BMEC にピークを迎えましたが、iPSC または凍結保存型 BMEC はピークに達しませんでした。凍結保存された BMEC は、3 日目から 7 日目の間に適度な TEER 値を持ち、凍結保存および通過 BMEC の TEER 値はさらに低くなっています。iPSC は 0 日目から 9 日目までの測定可能な TEER 値を示しませんでした。TEER測定は、技術的(ウェル当たり3つの測定)および生物学的複製(細胞株当たり3)で得られた。ブランクウェルからの技術的平均値は、生の TEER 値から差し引かれました。これらの値は、1 日の平均値を 1.12 cm2 (12 トランスウェル挿入物の表面積) で乗算しました。誤差範囲は、標準誤差を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 10: 凍結保存および通過 BMECsの ICCピークTEER値が観察されるまで、BMECはCOL4/FN上で通過し、維持された。BMECは、密接(OCLN、TJP1、CLDN5)、流入トランスポーター(SLC2A1)および付着接合(PECAM1)タンパク質に染色された。密閉結合マーカーの発現パターンは、非通過BMEC(図4)および通過BMEC(図8)と比較するとほつれやそばかすに見えた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図11:iPSC、非通過BMEC、通過BMEC、および凍結保存および通過BMECのウェスタンブロット分析。TJP1、OCLN、SOX17、SLC2A1、CLDN5、および負荷制御(GAPDH)のレベルを示すウェスタンブロット。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
変更とトラブルシューティング
このプロトコルでは、BMECsの誘導のためにiPSC培養中に一般的に使用される細胞外マトリックスおよび細胞培養培地を使用する際にいくつかの変更を加えた(図1)。これらの変更は、Lippmann プロトコル1に記載されているように、ヒト iPSC から BMECS を導出する能力に影響を与えませんでした。異なる健康なドナーからのiPSCラインは、この変更されたプロトコルが他の行1との以前の研究に匹敵する結果を示すことを実証するために使用された。凍結保存のために、B27サプリメントは1%血小板貧血漿由来血清(PDS)40の代わりに使用されたが、これは、その後の培養におけるBMECの忠実度に影響を与えた。トラブルシューティングに関しては、TEER 値は安定化する前に急激に変動する可能性があります。この変動は、プレートを37°Cから室温37に移動する際に発生する温度変化に起因する可能性があります。この問題を解決するには、迅速、効率的、および一貫して測定を行う必要があります。必要に応じて、Blumeららによって提供される数式を使用して温度効果を考慮に入れ、温度補正されたTEER値を得ることができる。
このプロトコルの制限事項
BBB表現型が堅牢なBMEC(すなわち高いTEER値)を得たにもかかわらず、このBBB特性を長期間維持することは依然として大きな課題です。ここに示すように、このプロトコルを使用したピークTEER値(〜2000 Ω xcm2)は、以前に報告されたピークTEER値(〜8000 Ω xcm2)1よりはるかに低かった。この観察にもかかわらず、TEER値は、以前に報告された値1の通常の範囲(2000-8000 Ω xcm2)以内に収まる。第2の制限は、使用される異なるiPSCラインから生じるピークTEER値の変動であり、このプロトコル36の他のバージョンでは観察されている。異なる細胞株間の変動は、各iPSCラインの成長および膨張率に起因する可能性があり、これは環境因子51の影響を受ける。もう一つの制限は、私たちのプロトコルがBMECの忠実さを維持していなかったので、凍結保存に関連しています。1%PDS40は凍結保存中にBMECの安定性を高める可能性があります。
既存の方法に関する重要性
iPSC由来のBMECは、特定の個体の遺伝的背景を持つ細胞を提供し、疾患生物学の研究にこれらの細胞を利用する上で価値がある。これは、他の動物から抽出された動物モデルや一次BMEC培養物37を使用する場合には当てはまらない。さらに、インビトロの一次BMEC培養は、低いTEER値(〜100 Ω xcm237)を示し、ここで説明するプロトコルを有するヒトiPSC由来BMECで達成されたものよりもはるかに低い。この変更されたプロトコルは、より長い使用のためにそれらを拡張し、維持する可能性を持つ、iPSCから人間のBMECを取得するための詳細な方法を提供します。特に複数の細胞株を一度に研究する場合、差別化されたBMECを通過して保存する能力は、実験設計において汎用性と柔軟性を提供します。これらの結果に基づいて、iPSC由来のBMECは最初のサブ培養ステップ(図7、図8、図9)の後に拡張および継代することができるが、凍結保存はさらなる調査が必要である。このプロトコルは、他の幹細胞ベースの細胞モデルと組み合わせて使用して、脳オルガノイドの血管化などの革新的なアプローチを開発することもできます。脳オルガノイドを生成する現在の方法は、BBB52,53を構成する神経血管ユニットの内皮細胞および重要な要素を欠いているため、ヒト脳の細胞型の不完全な再構成をもたらす。ここで説明するプロトコルは、3Dモデルよりも安価で実装が容易な2次元トランスウェル/共培養システムを使用して、難易度と再現性のあるアプローチを提供できます。
このプロトコルの今後の応用
このプロトコルは、統合失調症や双極性障害などの神経精神障害における神経血管系およびBBBの役割を研究するために利用することができ、そこでは神経血管系の欠損が役割9、10、20、54、55を担うように仮説されている。このプロトコル36の以前のバージョンは、統合失調症43を有するハンチントン病7および22q欠失症候群患者のiPSCラインからBMECを導出するために使用されていた。両方の研究7,43は、BBBに関連する細胞内および/または細胞間機能を調査するためにこの方法の利用に成功したことを示した。以前のプロトコル1における動物血清の交和効果の可能性についていくつかの懸念が提起されている。ここで使用する無血清プロトコルは、BMECsを導出するための以前のプロトコルと同様の結果を生成しながら、この懸念を取り除きます。
BMECs の差別化と拡張に関する重要なステップ
このプロトコルを実装する場合、4 つの重要な手順があります。まず、iPSCを最適な密度(すなわち、〜15,600セル/cm2で播種)することが、効率的なBMEC分化のために重要である。分化の4日目までに細胞密度が高すぎたり低すぎたりすると、培養物は細胞異質性56のより大きな速度を示し得る。第2の重要なステップは、E6培地を使用して分化を開始する1日目と4日目の分化の誘導である。E6は、以前のプロトコル6,35で使用されていた「無条件培地」の代わりに利用される。E6培地は、分化時間を13日から8日に短縮するだけでなく、密接タンパク質(TJP1、OCLN、CLDN5)およびBMECマーカー(PECAM1およびSLC2A1)36の発現を促進する。E6培地を用いれば、適切なTEER値(図5)およびABCB1およびABCC1流出トランスポーター活性(図6)6,35を得た。第三に、無血清状態に対して許可されるウシ血清の代わりにB27を用い、BMEC分化1の一貫性および信頼性を向上させる。最後に、iPSC由来BMECsを拡大するという観点から、細胞は、約100%の合流に達したときに継代するべきである。このプロトコルに基づいて、iPSC由来のBMECは、初期のサブ培養段階の後にさらに拡張および継代することができる(図7、図8および図9)。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立精神衛生研究所の新しい科学者のためのバイオビヘイビア研究賞(BRAINS)賞R01MH113858(R.K.へ)、国立衛生研究所賞KL2 TR002542(PL)によってサポートされました。国立精神衛生研究所臨床科学者開発賞K08MH086846(R.K.へ)、シドニーRベアJr財団グラント(P.L.)ドリスデューク慈善財団臨床科学者開発賞(R.K.)、ライアン・リヒト・サン・バイポーラ財団(R.K.)、フィリス& ジェローム・ライル・ラッパポート財団(R.K.)、ハーバード幹細胞研究所(R.K.へ)、スティーブ・ウィリスとエリッサ・フロイト(R.K.へ)。私たちは、彼女の批判的な読書と原稿に関するフィードバックのためにアニー・カトゥリア博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100mL | |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A-31572 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb | Cell Signaling | 3528S | |
| CLDN5 (Claudin-5) | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma Aldrich | C5533-5mg | |
| Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 8670 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) | Corning | 353046 | |
| Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) | Corning | 353047 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) | Corning | 3460 | |
| Countess slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DMEM/F12 (without phenol red) | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-50mL | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663-10ML | |
| DPBS (+/+) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 | World Precision Instruments | N/A | |
| Essential 6 Medium (Thermo Fisher) | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-2mg | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 24020-117 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human endothelial serum-free medium | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| InCell Analyzer 6000 | General Electric | N/A | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| MK-571 | Sigma Aldrich | M7571-5MG | |
| NutriStem | Stemgent | 01-0005 | |
| Occludin | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Recombinant Human VEGF 165 | Peprotech | 100-20 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-100MG | |
| Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702-10MG | |
| SLC2A1 (GLUT-1) | ThermoFisher | PA1-21041 | |
| SOX17 | Cell Signaling | 81778S | |
| TJP-1 (ZO-1) | ThermoFisher | PA5-28869 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) | Sigma Aldrich | SML0572-5MG | |
| Versene solution | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Tocris/Thermo Fisher Scientific | 1254 |
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