Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

Dit protocol beschrijft een aangepaste methode om microvasculaire endotheelcellen van de hersenen af te leiden, uit te breiden en cryopreserveren, verkregen door het differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en om de eigenschappen van de bloed-hersenbarrière in een ex vivo model te bestuderen.

Abstract

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMECs) kunnen worden onderscheiden van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) om ex vivo cellulaire modellen te ontwikkelen voor het bestuderen van de bloed-hersenbarrière (BBB) functie. Dit gewijzigde protocol biedt gedetailleerde stappen om BMECs af te leiden, uit te breiden en cryopreserve te maken van menselijke iPC's met behulp van een andere donor en reagentia dan die in eerdere protocollen. iPSC's worden behandeld met essentiële 6 medium gedurende 4 dagen, gevolgd door 2 dagen humaan endotheel serumvrij kweekmedium aangevuld met basis fibroblast groeifactor, retinoïnezuur en B27 supplement. Op dag 6 worden cellen gedurende 2 dagen onderverdeeld in een collageen/fibronectinematrix. Immunocytochemie wordt uitgevoerd op dag 8 voor BMEC-markeranalyse met behulp van CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 en SLC2A1. Western blotting wordt uitgevoerd om bmec-markeringsexpressie en afwezigheid van SOX17, een endodermale marker, te bevestigen. Angiogeen potentieel wordt aangetoond met een kiemende test. Trans-endotheel elektrische weerstand (TEER) wordt gemeten met behulp van eetstok elektroden en voltohmmeter vanaf dag 7. Efflux transporter activiteit voor ATP binding cassette onderfamilie B lid 1 en ATP binding cassette onderfamilie C lid 1 wordt gemeten met behulp van een multi-plate reader op dag 8. Succesvolle afleiding van BMECs wordt bevestigd door de aanwezigheid van relevante celmarkers, lage niveaus van SOX17, angiogeen potentieel, transportactiviteit en TEER-waarden ~2000 Ω x cm2. BMECs worden uitgebreid tot dag 10 alvorens over te gaan op vers gecoate collageen/fibronectine platen of cryopreserved. Dit protocol toont aan dat iPSC-afgeleide BMECs ten minste één keer kunnen worden uitgebreid en doorgegeven. Lagere TEER-waarden en een slechtere lokalisatie van BMEC-markers werden echter waargenomen na cryopreservatie. BMECs kunnen worden gebruikt in co-cultuur experimenten met andere celtypen (neuronen, glia, pericyten), in driedimensionale hersenmodellen (organ-chip en hydrogel), voor vascularisatie van hersenorganoïden, en voor het bestuderen van BBB-disfunctie bij neuropsychiatrische aandoeningen.

Introduction

Bloed-hersenbarrièrefunctie
De bloed-hersenbarrière (BBB) vormt een grens die de beweging van stoffen van het bloed naar de hersenen beperkt. De BBB bestaat uit microvasculaire endotheelcellen (BMECs) die een monolaag vormen langs de vasculatuur. BMECs vormen samen met astrocyten, neuronen, pericyten, microglia en extracellulaire matrix de neurovasculaire eenheid. BMECs hebben een strak gereguleerde paracellulaire structuur die de BBB in staat stelt een hoge trans-endotheel elektrische weerstand (TEER) te handhaven, die passieve diffusie beperkt en dient als indicator voor barrière-integriteit1,2. BMECs hebben ook eiwitten die helpen bij transcellulaire beweging zoals endocytose, transcytose en transmigratie, evenals extravasatie van leukocyten tijdens een immuunrespons3. BMECs vertrouwen op influx en efflux transporters voor voeding en verwijdering van afvalproducten, om een homeostatische balans in de hersenen te behouden3. Solute Carrier Family 2 member 1 (SLC2A1) is bijvoorbeeld een influx transporter die verantwoordelijk is voor de beweging van glucose over de BBB4, terwijl efflux transporters zoals de ATP binding cassette subfamilie B lid 1 (ABCB1) en de ATP binding cassette subfamilie C lid 1 (ABCC1) verantwoordelijk zijn voor het terugbrengen van substraten terug in de bloedstroom3,5,6,7. ABCB1-substraten omvatten morfine, verapamil4en antipsychotica zoals olanzapine en risperidon8, terwijl de ABCC1-transporteur een verscheidenheid aan substraten heeft, waaronder sulfaatconjugaten, vincristine en glucuronideconjugaten4.

Toepassing van BBB-modellen bij psychiatrische stoornissen
BBB-disfunctie is betrokken bij een aantal neurologische en psychiatrische stoornissen, waaronder schizofrenie en bipolairestoornis 9,10. Onlangs werden van iPSC afgeleide ex vivo cellulaire modellen gebruikt om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van psychiatrische stoornissen te ondervragen, maar deze modellen houden momenteel geen rekening met de potentiële rol van de neurovasculatuur11,12,13. Er wordt aangenomen dat perifere inflammatoire cytokinen die in het bloed circuleren een negatieve invloed kunnen hebben op de BBB14,15,16,17, maar er is ook bewijs voor paracellulaire18,19,20,21,22, transcellulaire23,24,25,26,27,28,29, en extracellulaire matrix20,29,30,31,32 afwijkingen die bijdragen aan BBB-disfunctie. Verstoring van de BBB kan ertoe leiden dat de inhoud van het bloed het hersenparenchym binnendringt en astrocyten en/of microglia activeert om pro-inflammatoire cytokinen vrij te geven, die op hun beurt een ontstekingsreactieinitiëren 33 die schadelijke effecten op de hersenen kan hebben34. BMECs zijn de primaire component van de BBB en het onderzoeken van de structuur en functie van deze cellen kan het begrip van BBB-disfunctie bij neurologische en psychiatrische stoornissen verbeteren.

Alternatieve BMEC-modellen
Voorafgaand aan de ontwikkeling van efficiënte protocollen voor het afleiden van BMECs uit iPSC's1,6,35,36,hadden onderzoekers vereeuwigde BMECs37 gebruikt om de BBB-functie te bestuderen. Veel van deze modellen slaagden er echter niet in om wenselijke BBB-fenotypen te bereiken, zo'n fysiologisch bereik van TEER-waarden38,39. Het gebruik van iPSC's heeft het voordeel dat de genetische achtergrond van het individu waaruit de cellen zijn afgeleid, behouden blijft. Wetenschappers werken actief aan het opzetten van iPSC-afgeleide ex vivo micromilieumodellen die de structuur en functie van het menselijk brein samenvatten. Onderzoekers hebben methoden ontwikkeld om BMECs af te leiden die structureel en fysiologisch vergelijkbaar zijn met BMECs gevonden in vivo. Methoden voor het verkrijgen van gezuiverde populaties van iPSC-afgeleide BMECs vereisen een aantal verschillende stappen waarbij protocollen in de afgelopen jaren zijn geoptimaliseerd1,6,35,36. Over het algemeen worden iPSC-afgeleide BMECs gedurende 4 dagen gekweekt in Essential 6 (E6) medium, gevolgd door 2 dagen in humaan endotheel serumvrij medium (hESFM) aangevuld met basis fibroblast groeifactor (bFGF), retinoïnezuur (RA) en B27 supplement. De cellen worden vervolgens gekweekt op een collageen IV (COL4) en fibronectine (FN) matrix om >90% homogene BMECs te verkrijgen1.

De identiteit van BMECs wordt bevestigd door immunofluorescentie die de co-expressie van BMEC-eiwitten laat zien, waaronder bloedplaatjes-endotheelcelhechtingsmolecuul-1 (PECAM1), SLC2A1 en strakke verbindingseiwitten zoals tight junction protein 1 (TJP1), occludin (OCLN) en claudin-5 (CLDN5)6. Kiemtests zijn gebruikt om het angiogene potentieel van van iPSC afgeleide BMECs te bevestigen. 6 De BBB-integriteit van BMECs wordt beoordeeld door de aanwezigheid van fysiologische in vitro TEER-waarden (~2000Ω x cm2)37 en meetbare activiteit voor effluxtransporters zoals ABCB1 en ABCC11,6,36. Recente methodologische vooruitgang van de Lippmann-groep heeft geleid tot iPSC-afgeleide BMEC-protocollen met verminderde experimentele variabiliteit en verbeterde reproduceerbaarheid1. Het is echter niet bekend of ze kunnen worden uitgebreid en voorbij het sub-culturing stadium kunnen worden doorgetrokken. Ons gewijzigde protocol is bedoeld om dit probleem aan te pakken door iPSC-afgeleide BMECs na dag 8 door te geven en te beoordelen of ze verder kunnen worden uitgebreid om BBB-eigenschappen te behouden na cryopreservatie. Hoewel er geen studies zijn beschreven over het passeren van iPSC-afgeleide BMECs, bestaat er een protocol voor BMEC cryopreservatie dat fysiologische BBB-eigenschappen behoudt na het ondergaan van een vriesdooicyclus40. Het is echter niet bekend dat BMECs na cryopreservatie kunnen worden doorgegang en BBB-eigenschappen behouden.

BMECs afgeleid van iPSC's die het Lippmann-protocol gebruiken, zijn gebruikt om BBB-verstoring bij neurologische aandoeningen zoals de Ziekte van Huntingtonte modelleren 7. Dergelijke van iPSC afgeleide BMECs zijn ook gebruikt om de effecten van bacteriële infectie zoals Neisseria meningitidis of Groep B Streptococcus op verstoring van de bloed-CSF-barrière en BBB respectievelijk41,42te onderzoeken . Ook, met behulp van iPSC-afgeleide BMECs van 22q deletiesyndroom patiënten met schizofrenie, onderzoekers waargenomen een toename van intercellulaire adhesie molecuul-1 (ICAM-1), een belangrijke adhesie molecuul in BMECs die helpen bij de werving en extravasatie van leukocyten in de hersenen43. Samen tonen deze studies het nut aan van iPSC-afgeleide BMECs voor het bestuderen van BBB-verstoring bij complexe neuropsychiatrische aandoeningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menselijke iPSC 's werden geherprogrammeerd vanuit de fibroblasten van gezonde donoren met behulp van een protocol dat werd goedgekeurd door de Institutional Review Boards van het Massachusetts General Hospital en McLean Hospital, en werd gekenmerkt zoals beschreven in eerdere studies44,45,46.

OPMERKING: Kortom, fibroblasten werden geherprogrammeerd naar iPSC via mRNA-gebaseerde genetische herprogrammering47. De iPSC's werden onderhouden in stamcelmedium (SCM) (zie materiaallijst) en opgeslagen bij een dichtheid van ~1,2 x 102 cellen/ml met 1 ml SCM, 10 μM met rho-geassocieerde eiwitkinaseremmer (ROCKi) Y-27632, en 10% (v/v) dimethylsulfide (DMSO), in cryopreserveerde flacons in vloeibare stikstof bij -160 °C. Alle onderstaande procedures worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast, tenzij anders vermeld.

1. Keldermembraanmatrixverdunning en plaatcoating

  1. Verdun (1:50) groeifactor verminderde keldermembraanmatrix gezuiverd van Engelbreth-Holm-Swarm tumor in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zonder fenolrood.
  2. Bedek celkweekplaten met de juiste hoeveelheid verdunde keldermembraanmatrix (d.w.z. 6-putplaat = 1 ml, 12-putplaat = 0,5 ml) en incubeer deze platen gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C.

2. iPSC onderhoud

OPMERKING: De maximale samenvloeiing per put in een plaat met een vlakke bodem van 6 putten is ~ 1,2 x 106 cellen.

  1. Ontdooi cryopreserveerde iPSC's in SCM met 10 μM Y-27632 en plaat op een 6-put plaat bedekt met verdunde groeifactor verminderde keldermembraanmatrix.
  2. Onderhoud iPSC's in SCM met 10 μM Y-27632 gedurende de eerste 24 uur na ontdooien. Schakel na 24 uur over op vers medium.
  3. Onderhoud iPSC's in SCM totdat cellen 80-90% gelijktijdigheid bereiken voordat ze passeren.
    1. Bereken hoeveel iPSC's nodig zijn voor differentiatie door de gewenste dichtheid voor differentiatie (15.600 cellen/cm2)te vermenigvuldigen met het oppervlak van de put. Vermenigvuldig voor een plaat met een vlakke bodem van 6 putten 15.600 cellen/cm2 met 9,6 cm2 voor een totaal van 149.760 cellen/put.
  4. Was de cellen met Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS). Incubeert vervolgens de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C met niet-enzymatisch ethyleendiaminetetraacetisch zuur (EDTA) (zie materiaallijst).
    1. Gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig op te tillen. Verzamel cellen in verse SCM.
    2. Plaatcellen op celkweekplaten bedekt met verdunde SCM en onderhouden cellen zoals beschreven in stap 2.3 of bewaren ze op ~1,2 x 106 cellen/ml in 1 ml SCM, 10 μM Y-27632 en 10% DMSO (v/v) in cryopreserveerde flacons in vloeibare stikstof bij een temperatuur van -160 °C.

3. Differentiatie van iPSC's naar BMECs

OPMERKING: Niet-enzymatische EDTA scheidt cellen in klonten. Enzymatische EDTA (zie Tabel met materialen)scheidt cellen in eencellige suspensie. Retinoïnezuur (RA) moet worden beschermd tegen licht.

  1. Was iPSC's eenmaal met Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS). Incubeer met enzymatische EDTA (1 ml voor 6-putplaat, 0,5 ml voor 12-putplaat en 0,25 ml voor 24-putplaat) gedurende ongeveer 5 minuten bij 37 °C om een suspensie met één cel op te leveren.
  2. Verzamel cellen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 300 x g (relatieve centrifugaalkracht). Resuspend celkorrels in SCM met 10 μM Y-27632.
  3. Bepaal de celdichtheid met behulp van Trypan Blue en een geautomatiseerde celteller of een hemocytometerapparaat. Plaatcellen met een dichtheid van 15.600 cellen/cm2 of 149.760 cellen/put van een 6-put vlakke bodemplaat (met een oppervlakte van 9,6 cm2/put) in SCM met 10 μM Y-27632 gedurende 24 uur.
  4. Start differentiatie na 24 uur door SCM naar E6 medium te veranderen. Verander E6 medium dagelijks voor de komende 4 dagen.
  5. Vervang op dag 4 van differentiatie E6 medium door hESFM aangevuld met verdund (1:200) B27 supplement, 20 ng/ml bFGF en 10 μM RA. Verander dit medium de komende 48 uur niet.
  6. Bereid 200 ml hESFM met verdunde (1:200) B27, meng 1 ml van 50x geconcentreerd B27-supplement tot 199 ml hESFM.
  7. Bereid 20 ng/ml bFGF voor door 50 μg bFGF te reconstitueren in 250 μL Tris-buffer (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) om 200 μg/ml voorraadoplossing te maken. Bereid 200 ml hESFM met 20 ng/ml bFGF door 20 μL van 200 μg/ml bFGF te mengen met 200 ml hESFM.
  8. Bereid 10 μM RA door eerst een 40 mg/ml RA-stamoplossing te maken door 2,5 ml DMSO toe te voegen aan 100 mg RA-poeder. Verdun deze concentratie tot 3 mg/ml om 10 mM voorraadoplossing te maken. Bereid 200 ml hESFM met 10 μM RA door 200 μL 10μM RA te mengen in 200 ml hESFM.

4. Coating collageen IV (COL4) en fibronectine (FN) Matrix voor zuivering van iPSC-afgeleide BMEC

  1. Voeg 2 ml steriel water toe aan 2 mg FN om 1 mg/ml FN-voorraadoplossing te maken. Voeg 5 ml steriel water toe aan 5 mg COL4 om een voorraadoplossing van 1 mg/ml COL4 te maken.
    1. Laat FN minstens 30 minuten oplossen bij 37 °C en de COL4 lost op bij kamertemperatuur.
  2. Verdun de FN-stamoplossing in steriel water tot een uiteindelijke concentratie van 100 μg/ml en COL4-stamoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 400 μg/ml.
  3. Bedek de gewenste platen (6-putplaat = 1 ml COL4/FN-oplossing, 12-putplaat = 0,5 ml, 24-putplaat= 0,25 ml en 12-transwell gefilterde plaat = 0,25 ml) met het mengsel van 400 μg/ml COL4 en 100 μg/ml FN.
  4. Incubeer platen gedurende ten minste 2 uur of 's nachts bij 37 °C; voor transwell gefilterde platen wordt een minimum van 4 uur aanbevolen.

5. Subcultuur en zuivering van iPSC-afgeleide BMECs

OPMERKING: Incubatie met enzymatische EDTA kan langer dan 15 minuten duren, afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen op dag 6 van differentiatie.

  1. Was op dag 6 van differentiatie twee keer cellen met DPBS. Incubeer met 1 ml enzymatische EDTA gedurende ten minste 15 minuten bij 37 °C totdat een suspensie met één cel is verkregen.
  2. Verzamel cellen via centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspend celkorrels met verse hESFM met verdund (1:200) B27 supplement, 20 ng/ml bFGF en 10 μM RA.
  3. Zaadcellen op platen bedekt met een mengsel van 400 μg/ml COL4 en 100 μg/ml FN. Zaadcellen met een verhouding van 1 put van een plaat met 6 putten tot 3 putten van een plaat met 12 putten, 3 putten van een gefilterde plaat met 12 transwells of 6 putten van een plaat met 24 putten.
  4. Zaad ongedifferentieerde iPSC's van dezelfde cellijn naar COL4/FN gecoate 12-transwell gefilterde plaat als negatieve controle voor TEER-analyse.
  5. Na 24 uur sub-culturing, verander medium naar hESFM met B27 supplement alleen. Na deze stap zijn er geen middelgrote wijzigingen meer nodig.

6. Ontspruitende test

  1. Verzamel dag 8 iPSC-afgeleide BMECs en zaai ze op 100.000 cellen/put op een 24-put platbodemplaat vers bedekt met 200 μL/cm2 keldermembraanmatrix.
  2. Behandel deze cellen met hESFM met verdunde (1:200) B27 en 40 ng/ml vasculaire endotheelgroeifactor A (VEGFA165).
  3. Observeer cellen om de 24 uur en verander het medium om de twee dagen.

7. Immunocytochemie (ICC)

OPMERKING: ICC wordt uitgevoerd op platen met een vlakke bodem van 24 putten.

  1. Na 48 uur sub-culturing (dag 8), was cellen twee keer met DPBS. Fixeer cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten.
  2. Was cellen drie keer met DPBS, 5 minuten per wasbeurt. Blokkeer cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in DPBS met 5% ezelserum en 0,3% Triton X-100 (v/v).
  3. Incubatie met primaire antilichamen: muisanti-mens-PECAM1 (1:100, stam 0,5 mg/ml), konijn anti-mens-TJP1 (1:200, stam 0,53 mg/ml), muis anti-mens-CLDN5 (1:200, voorraad 0,5 mg/ml), muisanti-mens-OCLN (1:200, voorraad 0,5 mg/ml) en konijn anti-mens-SLC2A1(1:100, voorraad 0,2 mg/ml) in DPBS met 5% ezelserum 's nachts bij 4°C.
    1. Spoel de cellen eenmaal af met DPBS en was vervolgens vijf keer gedurende 5 minuten per wasbeurt met DPBS.
  4. Incub cellen met secundaire antilichamen: ezel-anti-konijn Alexa Fluor 555 (1:200) en ezel-anti-muis 488 (1:200) in DPBS met 5% ezelserum gedurende 1 uur.
  5. Voeg na deze incubatie Hoechst 33342 trihydrochloridetrihydraat verdund (1:1000) gedurende 10 minuten toe aan DPBS.
    1. Verwijder de Hoechst 33342-oplossing en spoel eenmaal met DPBS en was vier keer met DPBS gedurende 5 minuten per wasbeurt.
  6. Visualiseer cellen op fluorescentiemicroscopen om te zoeken naar expressie en lokalisatie van celmakers.

8. TEER-meting en -analyse

OPMERKING: Corning 12-Transwell gefilterde platen zijn uitgerust met filters bestaande uit 1,12 cm2 polyethyleen tereftalaat membranen en 0,4 micrometer poriën. TEER-metingen worden verkregen in technische (3 per put) en biologische replica's (3 putten per cellijn en/of toestand).

  1. Meet 24 uur na sub-culturing (dag 7) elke 24 uur TEER met behulp van eetstokelektrodes en een voltohmmeter. Raadpleeg de gebruikershandleiding van de Voltohmmeter voor specifieke instructies voor het verkrijgen van metingen.
    1. Om TEER te meten, laadt u het voltohmmeter-instrument de avond ervoor op. Veeg het instrument en de eetstokelektrodes licht af met 70% ethanol voordat u ze in de veiligheidskap plaatst.
    2. Schakel de stroom in en kalibreer de ohm-meter zoals aanbevolen door de fabrikant.
    3. Sluit de eetstokelektrodes aan en spoel elektroden af met 70% ethanol gevolgd door DPBS.
    4. Plaats de kortere eindelektrode in de transputinzet (de apicale kamer) en het langere uiteinde in de basolaterale kamer.
    5. Meet eerst een lege put die alleen is bedekt met COL4 / FN. Meet vervolgens de andere putten.
    6. Spoel eetstokelektrodes snel af met 70% ethanol gevolgd door DPBS bij het meten van verschillende omstandigheden (d.w.z. het meten van verschillende cellijnen).
  2. Nadat alle metingen (in Ω) zijn geregistreerd, spoelt u eetstokelektrodes af met 70% ethanol en vervolgens steriel water. Veeg de elektrode voorzichtig af en laat deze aan de lucht drogen in de veiligheidskap.
  3. Gemiddelde van de driedubbele TEER-waarden (in Ω) van de lege put en trek deze gemiddelde waarde af van elke ruwe TEER-waarde op voorwaarde.
    1. Gemiddelde van de afgetrokken waarden en vermenigvuldig ze met 1,12 cm2 (het oppervlak van de 12-transwell insert).
    2. Gebruik getransformeerde waarden uit stap 6 om de grafiek te genereren met TEER-waarde en standaardfouten voor elke dag TEER-meting.

9. Efflux Transporter Activiteit en Analyse

OPMERKING: Efflux transporter activiteitstest wordt uitgevoerd op een 24-put vlakke bodemplaat. Efflux transporteurs van belang zijn onder andere ABCB1 en ABCC1. Het wordt aanbevolen om elke aandoening in drievoud uit te voeren met controleputten (d.w.z. lege putten zonder de respectieve remmers).

  1. Na 48 uur sub-culturing (dag 8) gedurende 1 uur bij 37 °C cellen incuberen met 10 μM Valspodar (ABCB1-remmer) of 10 μM MK571 (ABCC1-remmer).
    1. Bereid 10 mM Valspodaire bouillon door 5 mg poeder (1214,64 g/mol) op te lossen in 412 μL DMSO en verdun tot een werkconcentratie van 10 μM. Om bijvoorbeeld 10 ml hESFM met 10 μM Valspodar te maken, mengt u 10 μL valspodarvoorraad van 10 mM met 10 ml hESFM.
    2. Bereid 10 mM MK571 voorraad door 5 mg poeder (537,07 g/mol) op te lossen in 931 μL en verdun tot een werkconcentratie van 10 μM. Om bijvoorbeeld 10 ml hESFM te maken met 10 μM MK571, mengt u 10 μL van 10 mM MK571 voorraad met 10 ml hESFM.
  2. Incubeer na 1 uur cellen met 10 μM rhodamine 123 (ABCB1-substraat) of 10 μM 2',7'-dichloorhydrofluoresceïnediacetaat (H2DCFDA, ABCC1-substraat) met of zonder hun respectieve remmers gedurende 1 uur bij 37 °C.
    1. Bereid 10 mM rhodamine 123 door 10 mg poeder (380,82 g/mol) op te lossen in 875 μL DMSO en verdun tot een werkconcentratie van 10 μM. Om bijvoorbeeld 10 ml hESFM te maken met 10 μM rhodamine 123, mengt u 10 μL van 10 mM rhodamine 123 voorraad met 10 ml hESFM.
    2. Bereid 10 mM H2DCFDA door 50 mg poeder (487,29 g/mol) op te lossen in 10,26 ml DMSO en verdun tot een werkconcentratie van 10 μM. Om bijvoorbeeld 10 ml hESFM te maken met 10 μM rhodamine 123, mengt u 10 μL van 10 mM rhodamine 123 voorraad met 10 ml hESFM.
  3. Was cellen tweemaal met 0,5 ml DPBS en lyse met DPBS met 5% Triton-X (v/v).
  4. Meet de fluorescentie van de gelyseerde cellen met behulp van een meerplaats- of microplaatlezer (zie materiaallijst).
    1. Stel het instrument van de fluorescerende plaatlezer in op 485 nanometer excitatie en 530 nanometer emissie en meet fluorescentie op deze golflengten.
    2. Voor putten die niet in de transportertest worden gebruikt, was cellen twee keer met DPBS voordat u ze bevestigt met 4% PFA voor celkernenkwantificering.
  5. Incubeer cellen met Hoechst 33342 trihydrochloridetrihydraat verdund (1:1000) in DPBS gedurende 10 minuten. Beeld meerdere visuele velden in elke put om het gemiddelde aantal celkernen te berekenen met behulp van fluorescentiemicroscopen.
  6. Tel kernen met Fiji en normaliseer fluorescentiewaarden per cel voor deze tellingen.
    1. Bereken de gemiddelde accumulatie van fluorescentie door de ruwe fluorescentieaccumulatiewaarde voor elke voorwaarde af te trekken van de respectieve lege waarde.
    2. Gemiddelde afgetrokken waarden voor elke voorwaarde.
    3. Deel de gemiddelde waarden van stap 9.6.1 door het gemiddelde aantal cellen. Gebruik deze waarden om fluorescentiewaarden per cel te normaliseren.
    4. Gebruik genormaliseerde waarden om een grafische weergave te genereren voor elke remmeraandoening en voer de nodige statistische analyses uit.

10. Passaging, Expanding en Cryopreserving BMECs

  1. Vul dag 8 BMEC-culturen aan met verse hESFM aangevuld met verdunde (1:200) B27 en laat cellen nog twee dagen uitbreiden op de COL4/FN-matrix.
  2. Bedek een nieuwe 12-Transwell gefilterde plaat en een 24-put vlakke bodemplaat met 400 μg/ml COL4 en 100 μg/ml FN en incubeer gedurende 4 uur.
  3. Was op dag 10 cellen met DPBS en incubeer met 1 ml enzymatische EDTA gedurende ten minste 15 minuten bij 37°C totdat een suspensie met één cel is verkregen.
  4. Verzamel cellen via centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    1. Om deze cellen cryopreserveer te maken, resuspend celkorrels met verse hESFM met 30% Foetaal Runderserum (FBS) en 10% DMSO.
    2. Bewaar iPSC-afgeleide BMECs in cryopreserveerde flacons in een isopropanolcontainer gedurende de eerste 24 uur bij -80 °C en plaats deze vervolgens in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -160 °C.
    3. Om deze cellen te passeren, resuspend celkorrels met verse hESFM aangevuld met verdund (1:200) B27.
  5. Zaadcellen op gecoate platen bereid in stap 10.2. Zaadcellen met een verhouding van 1 put van een 6-puts plaat tot 3 putten van een 12-transwell gefilterde plaat en tot 6 putten van een 24-put plaat. Laat cellen 24 uur groeien en uitzetten.
  6. Meet teer op dag 11 door de stappen in stap 8 te volgen.
  7. Voer icc op dag 12 uit door de stappen te volgen die zijn vermeld in stap 9.
  8. Om cryopreserveerde BMECs te ontdooien, plaatst u de cryopreserveerde flacons in een warm water of kraalbad op 37oC. Breng vervolgens de ontdooide BMECs over naar 5 ml hESFM aangevuld met verdunde (1:200) B27.
    1. Verzamel cellen via centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in hESFM aangevuld met verdund (1:200) B27, 10 μM RA en 10 μM Y-27632.
    2. Schakel na 24 uur medium naar hESFM aangevuld met verdund (1:200) B27 en 10 μM Y-27632 zonder RA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BMEC Differentiatie
Een paar kritieke stappen in dit protocol moeten nauwkeurig worden gevolgd (figuur 1). E6 gemiddeld gebruik op dag 1 is belangrijk, omdat het vaak wordt gebruikt voor het afleiden van neuro-ecomderm-afstamming van iPSC's binnen een relatief korte periode die reproduceerbare resultaten oplevert over meerdere cellijnen36. Een andere belangrijke stap is op dag 4 van differentiatie, waarbij E6 medium moet worden overgeschakeld op hESFM met verdunde (1:200) B27, 20 ng/ml bFGF en 10 μM RA om iPSC-afgeleide BMECs uit te breiden. De toevoeging van B27-supplement wordt gebruikt als alternatief voor runderserum ter ondersteuning van serumvrije celculuring1, bFGF wordt toegevoegd om de groei van iPSC-afgeleide BMECs6te vergemakkelijken , en RA wordt gebruikt om de ontwikkeling van het BBB-fenotype35te vergemakkelijken . De laatste belangrijke stap betreft de zuiveringsfase, waarbij dag 6 iPSC-afgeleide BMECs worden gesubcultiveerd op een COL4/FN-gecoate plaat om iPSC-afgeleide BMECs1,6,35,36te selecteren . Figuur 2 toont de morfologische overgang van iPSC's naar BMECs. Na één dag E6 medium (dag 1) is cellulaire morfologie vergelijkbaar met die van iPSC's. Tegen dag 4 van E6 beginnen cellen zichtbaar verschillend te lijken van iPSC's en bedekken ze het grootste deel van de put (~ 90% samenvloeiing). Tegen dag 6, terwijl gekweekt in hESFM met verdunde (1:200) B27, 20 ng/ml bFGF en 10 μM RA, begint cellulaire morfologie een langwerpig en kasseien uiterlijk te hebben. Op dag 8 is elke afzonderlijke cel verschillend in een groot kasseienpatroon. Een kiemende test werd uitgevoerd om het angiogene potentieel van iPSC-afgeleide BMECs aan te tonen, wat resulteerde in buisachtige structuren na 3 dagen behandeling met VEGFA165 (figuur 3).

Figure 1
Figuur 1: Overzicht voor differentiatie van menselijke iPSC's naar BMECs. Menselijke iPSC's werden aanvankelijk gedurende 24 uur gekweekt in stamcelmedium met 10 μM Y-27632 voordat het medium gedurende 4 dagen werd gewijzigd in E6. Op dag 4 werd medium gewijzigd in hESFM met (1:200) B27 supplement, 20 ng/ml bFGF en 10 μM RA gedurende 2 dagen. Op dag 6 werden cellen onderverdeeld in COL4/FN-gecoate platen. Op dag 7, medium werd gewijzigd in hESFM met B27 supplement zonder bFGF en RA en TEER werd gemeten. Op dag 8 werden icc- en efflux transporter-activiteitstests uitgevoerd. iPSC-afgeleide BMECs werden uitgebreid tot dag 10 voordat ze werden doorgegeven aan een transputplaat of een 24-puts vlakke bodemplaat voor respectievelijk TEER-meting en ICC-analyse. Dag 8 BMECs werden gebruikt voor de kiemtest (niet afgebeeld). 2 putten van een 6-putplaat van iPSC-afgeleide BMECs werden verzameld en opgeslagen in hESFM met 10% DMSO en 30% FBS bij -80 °C en vervolgens in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -160oC. Op dag 12 werd een piek in de TEER-waarde waargenomen in uitgebreide iPSC-afgeleide BMECs waarop ICC werd uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Bright-field Images Depicting Differentiation of iPSCs to BMECs. Na één dag cultuur in E6-medium behouden iPSC's hun karakteristieke morfologie. Op dag 4 in E6-medium lijkt cellulaire morfologie duidelijk anders dan iPSC's. Op dag 6 verandert de cellulaire morfologie in een langwerpig en kasseien uiterlijk. Op dag 8 lijken cellen groot en met een kasseienpatroon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Angiogeen potentieel van van iPSC afgeleide BMECs. Gezuiverde iPSC-afgeleide BMECs werden gezaaid op 100.000 cel/cm2 op keldermembraanmatrix in hESFM met (1:200) B27 supplement en 40ng/mL VEGFA165. Buisachtige structuren verschenen na 3 dagen behandeling met VEGFA165. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gezuiverde iPSC-afgeleide BMECs werden gezaaid op 100.000 cel/cm2 op keldermembraanmatrix in hESFM met (1:200) B27 supplement en 40ng/mL VEGFA165. Buisachtige structuren verschenen na 3 dagen behandeling met VEGFA165.

BMEC-karakterisering werd uitgevoerd met behulp van immunocytochemie voor celspecifieke markers. iPSC-afgeleide BMECs werden beoordeeld op de aanwezigheid van strakke verbindingseiwitten (OCLN, TJP1 en CLDN5), die vaak worden uitgedrukt in de nauwe verbindingen van hersendotheelcellen3 en endotheelcellen in de longen, lever ennieren 18. Andere markers zoals PECAM1 en SLC2A1, zijn eerder gebruikt als markers voor gezuiverde BMECs6. PECAM13 en SLC2A4 worden beide uitgedrukt in vasculaire endotheelcellen van de BBB. De iPSC-afgeleide BMECs die met dit protocol werden gegenereerd, drukten alle vijf deze markers samen uit (figuur 4).

Figure 4
Figuur 4: Marker analyse van iPSC-afgeleide BMECs. Menselijke iPSC-afgeleide BMECs werden bevlekt voor strakke kruising (OCLN, TJP1, CLDN5), influx transporter (SLC2A1) en adherens junction (PECAM1) eiwitten. OCLN-, TJP1- en CLDN5-eiwitten zijn voornamelijk gelokaliseerd in het celmembraan. SLC2A1 en PECAM1 zijn gelokaliseerd in zowel de kernen als het celmembraan. Hoechst 33342 trihydrochloridetrihydraat werd gebruikt voor nucleaire kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de BBB-functie van BMECs te karakteriseren, werd TEER 24 uur (dag 7) na sub-culturing gemeten en werd het medium gewijzigd in hESFM met verdunde (1:200) B27 zonder bFGF en RA. TEER-metingen werden verkregen vanaf dag 7 van differentiatie (dag 0 van de TEER-meting) en bereikten een piek van ~ 2000 Ω x cm2 op dag 8 of 48 uur na sub-culturing BMECs (figuur 5). Deze TEER-waarden liggen binnen het beschreven bereik voor co-gekweekte iPSC-afgeleide BMECs met rat primaire astrocyten37. De iPSC-lijn had geen waarneembare BBB-functie volgens hun lage TEER-waarden.

Figure 5
Figuur 5: TEER-metingen in iPSC-afgeleide BMECs. TEER-waarden piekten na één dag sub-culturing op COL4/FN-matrix (op dag 8 van differentiatie). TEER-metingen werden verkregen in technische (3 metingen per put) en biologische replica's (3 putten per cellijn). De technische gemiddelde waarde van een lege put is afgetrokken van ruwe TEER-waarden. Deze waarden werden voor elke dag gemiddeld en vermenigvuldigd met 1,12 cm2 (oppervlakte van de 12-transwell insert). Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om abcb1 en ABCC1 efflux transporter activiteit te evalueren, werd de hoeveelheid fluorescerend substraat opgenomen voor ABCB1 en ABCC1 gekwantificeerd na incubatie met hun respectieve remmers. Zoals verwacht leidde remming van ABCB1- en ABCC1-effluxtransporters met PSC833 (ABCB1-remmer) of MK-571 (ABCC1-remmer) tot een toename van respectievelijk rhodamine 123 (R123) of 2',7'-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (H2DCFDA) (figuur 6). Dit bewijs suggereert dat BMECs afgeleid met behulp van dit protocol efflux transporter activiteit hebben.

Figure 6
Figuur 6: Efflux Transporter Activiteit in iPSC-afgeleide BMECs. De effluxtransporteractiviteit in BMECs werd bepaald door de accumulatie van rhodamine 123 (R123) of 2',7'-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (H2DCFDA) te kwantificeren in aanwezigheid of afwezigheid van PSC833 (ATP binding cassette subfamilie B lid 1 (ABCB1) remmer) of MK-571 (ATP binding cassette subfamilie C lid 1 (ABCC1) remmer). Voor elke voorwaarde werden technische drievouden uitgevoerd (N=1). Fluorescentiewaarden van de controletoestand (d.w.z. zonder remmers) werden afgetrokken van ruwe fluorescentiewaarden. Deze fluorescentieaccumulatie werd per cel genormaliseerd voor elke technische replicerende. Statistische significantie werd bepaald aan de hand van de t-toets van studenten uit de drie technische replica's. Er werd geen statistische significantie waargenomen tussen de accumulatie van R123 met en zonder ABCB1-remmer (t-stat= -1,66, p=0,11). Statistische significantie werd waargenomen tussen de accumulatie van H2DCFDA met en zonder ABCC1-remmer (t-stat=-7,23, p=0,04). *p<0,05. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Passaging, Expanding en Cryopreserving iPSC-afgeleide BMECs
Een ander doel was om te onderzoeken of iPSC-afgeleide BMECs konden worden doorgegeven en cryopreserveerd na sub-culturing. Hiertoe mochten dag 7 iPSC-afgeleide BMECs tot dag 10 worden uitgebreid voordat ze op nieuw gecoate COL4/FN 12-transwell gefilterde platen voor TEER-meting en 24-put platbodemplaat voor ICC-analyse werden gefilterd (figuur 7). Met behulp van deze voorwaarde bleven iPSC-afgeleide BMECs zich verspreiden, handhaafden de expressie van OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 en PECAM1 (figuur 8), en bleven de juiste TEER-waarden behouden (piek op ~ 2000 Ω x cm2) na passaging (figuur 9). Cryopreserveerde BMECs werden later ontdooid, uitgebreid en vervolgens doorgebladerd (figuur 7). TEER-metingen van BMECs werden 24 uur na ontdooiing en enkele dagen daarna verkregen. De TEER-metingen van deze na ontdooide BMECs werden verminderd (met een piek van slechts 800 Ω x cm2) in vergelijking met vers verkregen BMECs. Een tweede passaging van post ontdooide BMECs vertoonde nog lagere TEER-waarden (piekte op slechts 200-300 Ω x cm2) (figuur 9) en vertoonde gerafelde en/of sproetenpatronen van de strakke verbindingsformatie (figuur 10). Uit westersevlekanalyse 48 bleek dat iPSC's voornamelijk een endodermale marker (SOX17)49 en enkele strakke verbindingsmarkers (OCLN) uitdrukten, maar niet andere BMEC-gerelateerde markers (TJP1, CLDN5 en SLC2A1) (figuur 11). BMECs drukten voornamelijk endotheelgerelateerde markers uit (TJP1, CLDN5, OCLN en SLC2A1), met lage niveaus van de endodermal marker, SOX17.

Figure 7
Figuur 7: Heldere veldafbeeldingen van uitgebreide en cryopreserveerde iPSC-afgeleide BMECs. A) Cellen van dag 10 (4 dagen na de initiële subcultuur) bereikten de maximale samenvloeiing. B) Dag 11, 24 uur na passaging op COL4/FN gecoate 24-putten plaat. C) Dag12, 48 uur na passaging op COL4/FN gecoate 24-putten plaat; piekTEER-waarden werden waargenomen en ICC werd uitgevoerd. D) 48 uur na ontdooide iPSC-afgeleide BMECs op COL4/FN gecoate 6-putten plaat; cellen waren voorheen cryopreserveerd bij 1,2 x 102 cellen/ml. E) 24 uur nadat post-ontdooide iPSC-afgeleide BMECs werden doorgegeven op COL4/FN gecoate 6-putten plaat. F) 48 uur nadat post-ontdooide iPSC-afgeleide BMECs werden doorgegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: ICC van iPSC-afgeleide BMECs na Passaging. BMECs werden doorgegeven en onderhouden op col4/fn matrix tot dag 12, toen teer waarden piekten. BMECs op dag 12 werden bevlekt voor strakke kruising (OCLN, TJP1, CLDN5), influx transporter (SLC2A1) en adherens junction (PECAM1) eiwitten. Het expressiepatroon en de lokalisatie lijken op die waargenomen in omstandigheden waarin passaging niet werd uitgevoerd, zoals weergegeven in figuur 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Vergelijking van TEER-metingen in iPSC's, niet-passaged BMECs, passaged BMECs, cryopreserved BMECs en cryopreserved & passaged BMECs. Op dag 1 piekten de TEER-waarden voor niet-passaged en passaged BMECs, maar niet iPSC's of cryopreserveerde BMECs. Cryopreserveerde BMECs hadden gematigde TEER-waarden tussen dag 3 en 7, met nog lagere TEER-waarden voor de cryopreserveerde en doorge passageerde BMECs. iPSC's hebben geen meetbare TEER-waarden aangetoond tussen dag 0 en 9. TEER-metingen werden verkregen in technische (3 metingen per put) en biologische replica's (3 per cellijn). De technische gemiddelde waarde van een lege put is afgetrokken van de ruwe TEER-waarden. Deze waarden werden voor elke dag gemiddeld en vermenigvuldigd met 1,12 cm2 (oppervlakte van de 12-transwell insert). Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 10
Figuur 10: ICC van cryopreserveerde & passaged BMECs. BMECs werden doorgegeven en gehandhaafd op COL4/FN totdat piekTEER-waarden werden waargenomen. BMECs werden gekleurd voor strakke kruising (OCLN, TJP1, CLDN5), influx transporter (SLC2A1) en adherens junction (PECAM1) eiwitten. Het expressiepatroon van strakke verbindingsmarkeringen leek gerafeld en/of sproeten in vergelijking met niet-doorgelichte BMECs (figuur 4) en doorgelichte BMECs (figuur 8). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 11
Figuur 11: Westerse vlekanalyse van iPSC's, niet-gepasseerde BMECs, passaged BMECs en cryopreserved & passaged BMECs. Westerse vlekken met niveaus van TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 en laadcontrole (GAPDH). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wijzigingen en probleemoplossing

In dit protocol hebben we enkele wijzigingen aangebracht in het gebruik van een veelgebruikte extracellulaire matrix en celkweekmedia tijdens iPSC-culturing voor afleiding van BMECs (figuur 1). Deze wijzigingen hadden geen invloed op het vermogen om BMECS af te leiden van menselijke iPSC 's zoals beschreven in het Lippmann-protocol1. Een iPSC-lijn van een andere gezonde donor werd gebruikt om aan te tonen dat dit gewijzigde protocol resultaten vertoont die vergelijkbaar zijn met eerdere studies met andere regels1. Voor cryopreservatie, B27 supplement werd gebruikt in plaats van 1% bloedplaatjes slechte plasma-afgeleide serum (PDS)40, maar dit beïnvloedde BMEC getrouwheid in de daaropvolgende culturing. Met betrekking tot het oplossen van problemen kunnen TEER-waarden snel fluctueren voordat ze worden gestabiliseerd. Deze fluctuatie kan het gevolg zijn van temperatuurveranderingen die optreden wanneer de platen van 37 °C naar kamertemperatuur worden verplaatst37. Om dit probleem op te lossen, moeten metingen snel, efficiënt en consistent worden uitgevoerd. Indien nodig kunnen temperatuureffecten worden meegerekend met behulp van een wiskundige formule van Blume et al. 200949 om temperatuurgecorrigeerde TEER-waarden te verkrijgen.

Beperkingen van dit protocol

Ondanks het verkrijgen van BMECs met een robuust BBB fenotype (d.w.z. hoge TEER-waarde), blijft het een grote uitdaging om deze BBB-eigenschap voor langere tijd te behouden. Zoals hier wordt getoond, waren piekTEER-waarden (~ 2000 Ω x cm2) met behulp van dit protocol veel lager dan eerder gerapporteerde piekTEER-waarden (~ 8000 Ω x cm2)1. Ondanks deze constatering vielen de TEER-waarden binnen het gebruikelijke bereik (2000-8000 Ω x cm2) van eerder gerapporteerde waarden1. Een tweede beperking is de variabiliteit in piekTEER-waarden die het gevolg is van verschillende gebruikte iPSC-lijnen, die is waargenomen in andere versies van dit protocol36. De variatie tussen de verschillende cellijnen kan te wijten zijn aan de groei - en expansiesnelheid van elke iPSC-lijn, die wordt beïnvloed dooromgevingsfactoren 51. Een andere beperking houdt verband met cryopreservatie, omdat ons protocol geen BMEC-getrouwheid handhaafde. Het is mogelijk dat 1% PDS40 zorgt voor een grotere stabiliteit van BMECs tijdens cryopreservatie.

Betekenis met betrekking tot bestaande methoden

De van iPSC afgeleide BMECs leveren cellen met de genetische achtergrond van specifieke individuen, wat waardevol is bij het gebruik van deze cellen voor de studie van ziektebiologie. Dit is niet het geval bij het gebruik van diermodellen of primaire BMEC-culturen gewonnen uit andere dieren37. Bovendien vertonen in vitro primaire BMEC-culturen lage TEER-waarden (~ 100 Ω x cm237), veel lager dan die bereikt met menselijke iPSC-afgeleide BMECs met het hier beschreven protocol. Dit gewijzigde protocol biedt een gedetailleerde methode voor het verkrijgen van menselijke BMECs van iPSC's, met het potentieel om ze uit te breiden en te onderhouden voor langer gebruik. De mogelijkheid om gedifferentieerde BMECs te passeren en op te slaan kan veelzijdigheid en flexibiliteit bieden in experimenteel ontwerp, vooral bij het bestuderen van meerdere cellijnen tegelijk. Op basis van deze resultaten kunnen iPSC-afgeleide BMECs worden uitgebreid en doorgegeven na de eerste sub-culturing stap(figuur 7, figuur 8 en figuur 9),maar cryopreservatie moet verder worden onderzocht. Dit protocol kan ook worden gebruikt in combinatie met andere stamcelgebaseerde cellulaire modellen om innovatieve benaderingen te ontwikkelen, zoals vascularisatie van hersenorganoïden. De huidige methoden voor het genereren van hersenorganoïden resulteren in een onvolledige reconstitutie van celtypen van het menselijk brein , omdat ze endotheelcellen en kritieke elementen van de neurovasculaire eenheid die de BBB52,53vormen,missen . Het hier beschreven protocol kan een tracteerbare en reproduceerbare aanpak bieden met behulp van tweedimensionale Transwell / co-culturing-systemen die goedkoper en gemakkelijker te implementeren zijn dan 3D-modellen.

Toekomstige toepassingen van dit protocol

Dit protocol kan worden gebruikt om de rol van de neurovasculatuur en BBB bij neuropsychiatrische stoornissen zoals schizofrenie en bipolaire stoornis te bestuderen, waarbij tekorten in de neurovasculatuur zijn verondersteld een rol te spelen9,10,20,54,55. Eerdere versies van dit protocol36 waren gebruikt om BMECs af te leiden van iPSC-lijnen van patiënten met de ziekte van Huntington7 en 22q deletiesyndroom patiënten met schizofrenie43. Beide studies7,43 toonden een succesvol gebruik van deze methode aan om de paracellulaire en/of transcellulaire functie in verband met de BBB te onderzoeken. Er zijn enkele zorgen geuit over de mogelijke verstorende effecten van dierlijk serum in eerdere protocollen1. Het serumvrije protocol dat hier wordt gebruikt, verwijdert deze bezorgdheid en produceert vergelijkbare resultaten als eerdere protocollen voor het afleiden van BMECs.

Kritieke stappen voor het differentiëren en uitbreiden van BMECs

Er zijn vier kritieke stappen bij het implementeren van dit protocol. Ten eerste is het zaaien van iPSC's met een optimale dichtheid (d.w.z. zaaien bij ~ 15.600 cellen / cm2) belangrijk voor efficiënte BMEC-differentiatie. Als de celdichtheid op dag 4 van differentiatie te hoog of te laag is, kunnen culturen grotere percentages cellulaire heterogeniteitvertonen 56. Een tweede belangrijke stap is de inductie van differentiatie tussen dag 1 en dag 4, waarbij het E6-medium wordt gebruikt om differentiatie te initiëren. E6 wordt gebruikt in plaats van het "ongeconditioneerde medium" dat in eerdere protocollen6,35werd gebruikt . E6 medium verkort niet alleen de differentiatietijd van 13 dagen naar 8 dagen, maar het bevordert ook de expressie van strakke verbindingseiwitten (TJP1, OCLN, CLDN5) en BMEC-markers (PECAM1 en SLC2A1)36. Het gebruik van E6 medium resulteerde ook in de juiste TEER-waarden (figuur 5) en ABCB1 en ABCC1 efflux transporter activiteit (figuur 6)6,35. Ten derde is het gebruik van B27 in plaats van runderserum toegestaan voor serumvrije toestand, wat de consistentie en betrouwbaarheid van BMEC-differentiatie verbeterde1. Ten slotte, in termen van het uitbreiden van de iPSC-afgeleide BMECs, moeten cellen worden doorgegeven wanneer ze ~ 100% confluency bereiken. Op basis van dit protocol kunnen iPSC-afgeleide BMECs verder worden uitgebreid en doorgegeven na de eerste sub-culturing fase (figuur 7, figuur 8 en figuur 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (to R.K.), een National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). een National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (to R.K.), a Sydney R Baer Jr Foundation Grant (to P.L.) the Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (to R.K.), the Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (to R.K.), the Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (naar R.K.), het Harvard Stem Cell Institute (naar R.K.) en door Steve Willis en Elissa Freud (naar R.K.). We danken Dr. Annie Kathuria voor haar kritische lezing en feedback op het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Neurowetenschappen Human induced pluripotent stam cells brain microvascular endothelial cells blood brain barrier trans-endothelial electrical resistance transporter activity microvascular schizophrenia bipolaire disorder passaging expansion cryopreservation
Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya,… More

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter