Summary
이 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포를 분화하여 얻은 뇌 미생물 내피 세포를 도출, 확장 및 냉동 보존하고, 전 생체 모델에서 혈액 뇌 장벽 특성을 연구하는 적응된 방법을 자세히 설명합니다.
Abstract
뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC)는 혈액 뇌 장벽 (BBB) 기능을 연구하기위한 전 생체 세포 모델을 개발하기 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)와 분화 될 수있다. 이 수정된 프로토콜은 이전 프로토콜에 보고된 프로토콜과 는 다른 기증자 및 시약을 사용하여 인간 iPSC로부터 BME를 파생, 확장 및 냉동 보존하는 세부 단계를 제공합니다. iPSC는 4일 동안 필수 6배지로 처리되며, 그 다음으로 기본적인 섬유아세포 성장인자, 망막산 및 B27 보충제로 보충된 인체 내피 성 혈청 없는 배양 배지의 2일 이후에 이어지며. 6일째에, 세포는 2일 동안 콜라겐/섬유넥틴 매트릭스에 하위 배양된다. 면역 세포화학은 CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 및 SLC2A1을 사용하여 BMEC 마커 분석을 위해 8일째에 수행됩니다. 서양 블로팅은 BMEC 마커 발현, 및 SOX17의 부재, 내피 마커를 확인하기 위해 수행된다. 혈관 신생 잠재력은 발아 분석으로 입증됩니다. 트랜스 내피 전기 저항(TEER)은 7일부터 젓가락 전극 및 화산계를 사용하여 측정됩니다. ATP 결합 카세트 서브패밀리 B 멤버 1 및 ATP 바인딩 카세트 서브패밀리 C 멤버 1에 대한 Efflux 수송 활성은 8일째에 멀티 플레이트 판독기를 사용하여 측정된다. BMEC의 성공적인 파생은 관련 세포 마커의 존재에 의해 확인된다, SOX17의 낮은 수준, 혈관 신생 잠재력, 수송 활성 및 TEER 값 ~2000 Ω x cm2. BMEC는 갓 코팅 된 콜라겐 / 섬유 네틴 플레이트 또는 냉동 보존에 전달하기 전에 10 일까지 확장됩니다. 이 프로토콜은 iPSC 유래 BMEC를 적어도 한 번 확장하고 통과할 수 있음을 보여줍니다. 그러나, 낮은 TEER 값및 BMEC 마커의 가난한 지역화가 극저온 보존 후에 관찰되었다. BMEC는 다른 세포 유형 (뉴런, 신경교, pericytes)와 공동 배양 실험, 3 차원 뇌 모델 (장기 칩 및 하이드로겔),뇌 오르가노이드의 혈관화, 신경 정신 장애에서 BBB 기능 장애를 연구하는 데 활용할 수 있습니다.
Introduction
혈액-뇌 장벽 기능
혈액-뇌 장벽 (BBB) 뇌에 혈액에서 물질의 움직임을 제한 하는 경계를 형성. BBB는 혈관을 안대기하는 단층층을 형성하는 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC)로 구성됩니다. BMEC는 성상 세포, 뉴런, pericytes, microglia 및 세포외 매트릭스와 함께 신경 혈관 단위를 형성합니다. BMEC는 BBB가 고트랜스 내피성 내피성 내성(TEER)을 유지할 수 있도록 엄격하게 조절된 파라세포 구조를 가지며, 이는 수동 확산을 제한하고 장벽 무결성1,2의지표역할을 한다. BMEC는 또한 면역 반응 도중 백혈구의 사치뿐만 아니라 내분비증, transcytosis 및 환원과 같은 세포간 운동을 지원하는 단백질이있습니다 3. BMEC는 뇌3의동종 성 균형을 유지하기 위해 폐기물의 영양 및 제거를위한 유입 및 efflux 수송에 의존합니다. 예를 들어, solute carrier family 2 멤버 1(SLC2A1)은 BBB4를가로지르는 포도당의 이동을 담당하는 유입 수송기이며, ATP 결합 카세트 서브패밀리 B 멤버 1(ABCB1) 및 ATP 결합 카세트 서브패밀리 C멤버 1(ABCC1)과 같은 efflux 수송기는 기판을혈류량3,5,6, 7,7, 7, 7, 7, 7, 7, 6, 7로되돌리는 역할을 한다. ABCB1 기판에는 모르핀, 베라파밀4,그리고 올란자핀 과 리스페리돈8과같은 항정신병제를 포함하고 있으며, ABCC1 수송기는 황산염 침추, 빈크리스틴 및 글루큐로니드 컨쥬게이트4를포함한 다양한 기판을 가지고 있다.
정신 장애에서 BBB 모델의 응용 프로그램
BBB 기능 장애는 정신 분열증과 양극성 장애9,10을포함하여 다수의 신경 및 정신 장애에 연루되었습니다. 최근에는 iPSC 유래 전 생체내 세포 모델이 정신 질환의 세포 및 분자 기초를 심문하는 데 활용되고 있지만, 이들 모델은 현재 신경혈관수(11,12,13)에의해 잠재적인 역할을 고려하지 않고 있다. 혈액에서 순환하는 말초 염증 성 사이토카인이 BBB 14,15,16,17에부정적인 영향을 줄 수 있지만, 세포세포18,19,20,21,22,세포간23,24,25, 25,26,27,28, 29,및 외세포 매트릭스 20,29,29,및 외세포 매트릭스20,29, 39이상을 기여하는 증거가 있다고 가설된다. BBB의 중단은 뇌 완두콩에 들어가는 혈액의 내용이 생상세포 및/또는 마이크로글리아를 활성화하여 염증성 사이토카인을 방출하는 결과를 초래할 수 있으며, 이는 차례로 뇌에 해로운 영향을 미칠 수 있는 염증 반응33을 개시한다. BMEC는 BBB의 주요 구성 요소이며 이러한 세포의 구조와 기능을 검사하면 신경 및 정신 장애에서 BBB 기능 장애에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
대체 BMEC 모델
iPSC1,6,35,36에서BMEC를 도출하기위한 효율적인 프로토콜의 개발에 앞서 연구자들은 BBB 기능을 연구하기 위해 불멸의 BMEC37을 사용했습니다. 그러나, 이들 모델의 대부분은 바람직한 BBB 표현형을 달성하지 못했으며, 이러한 생리학적 범위의 TEER값(38,39). iPSC를 활용하는 것은 세포가 파생되는 개별의 유전적 배경을 유지하는 장점이 있다. 과학자들은 인체 뇌의 구조와 기능을 재구성하는 iPSC 유래 ex vivo 마이크로 환경 모델을 확립하기 위해 적극적으로 노력하고 있습니다. 연구원은 생체 내에서 발견되는 BMEC와 구조적이고 생리적으로 유사한 BMEC를 파생시키는 방법을 개발했습니다. iPSC 유래 BMEC의 정제된 인구를 획득하는 방법은 지난 몇 년 동안최적화되는프로토콜과 다른 단계의 숫자를 필요로1,6,35,36. 일반적으로 iPSC 유래 BMEC는 4일 동안 에센셜 6(E6) 배지에서 배양되며, 그 다음으로 기본적인 섬유아세포 성장인자(bFGF), 망막산(RA) 및 B27 보충제로 보충된 인간 내피 혈청 프리 배지(hESFM)에서 2일 간 배양된다. 세포는 콜라겐 IV (COL4) 및 섬유 넥틴 (FN) 매트릭스에 배양되어 >90 % 균질 BMEC1을얻습니다.
BMEC의 정체는 혈소판-내피 세포 접착 분자-1(PECAM1), SLC2A1 및 타이트 접합 단백질 1(TJP1), 클로르딘(OCLN), 클라딘-5(CLDN5) 및 클라딘-5(CLDN5)와 같은 단단한접합 단백질을 포함하는 BMEC 단백질의 공동 발현을 보여주는 면역형광에 의해 확인된다. 발아 된 술은 iPSC 유래 BMEC의 혈관 신생 잠재력을 확인하는 데 사용되었습니다. 6 BMEC의 BBB 무결성은 체외 TEER 값(~2000Ω x cm2)37 및 ABCB1 및 ABCC11,6,36과같은 efflux 수송자에 대한 측정 가능한 활동의 존재에 의해 평가된다. Lippmann 그룹에 의한 최근의 방법론적 진보는 iPSC 유래 BMEC 프로토콜로 이어졌으며 실험 가변성을 감소시키고 재현성을향상시켰습니다. 그러나 하위 배양 단계를 넘어 확장되고 통과 될 수 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 당사의 수정된 프로토콜은 iPSC에서 파생된 BMEC를 8일째 이후로 통과시키고 냉동 보존 후 BBB 특성을 유지하기 위해 더 확장될 수 있는지 여부를 평가하여 이 문제를 해결하는 것을 목표로 합니다. iPSC 유래 BMEC의 패싱을 설명한 연구는 없지만, 동결 해동주기(40)를겪은 후 생리적 BBB 특성을 유지하는 BMEC 냉동 보존에 대한 프로토콜이 존재한다. 그러나, 동결 후 BMEC는 BBB 속성을 통과하고 유지할 수 있다는 것은 알려져 있지 않다.
Lippmann 프로토콜을 사용하여 iPSC에서 파생된 BMEC는 헌팅턴병7과같은 신경 장애의 BBB 중단을 모델링하는 데 활용되었다. 이러한 iPSC 유래 BMEC는 또한 혈액-CSF 장벽 및 BBB의 중단에 Neisseria 뇌막염 또는 B 연쇄상 구균과 같은 세균 감염의 효력을 각각41,42에조사하는 데 사용되었습니다. 또한, 정신 분열증을 가진 22q 삭제 증후군 환자에서 iPSC 유래 BMEC를 사용하여, 연구원은 뇌로 백혈구의 모집 및 사치를 돕는 BMECs에 있는 주요 접착 분자-1 (ICAM-1)의 증가를 관찰했습니다43. 종합하면, 이 연구 결과는 복잡한 신경 정신병 장애에 있는 BBB 중단을 공부하기 위한 iPSC 파생한 BMECs의 유용성을 보여줍니다.
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Protocol
인간 iPSCs는 매사추세츠 종합 병원 및 맥린 병원의 기관 검토 위원회에 의해 승인된 프로토콜을 사용하여 건강한 기증자의 섬유아세포에서 재프로그래밍되고, 이전 연구결과 44,45,46에기술된 것과 같이 특징지어졌습니다.
참고 : 간단히, 섬유 아세포는 mRNA 기반의 유전자 재프로그래밍(47)을통해 iPSC로 다시 프로그래밍되었다. iPSC는 줄기 세포 배지(SCM)(재료 목록 참조)에서 유지되고 SCM의 1mL을 가진 ~1.2 x 102 세포/mL의 밀도로 저장되고, rho 관련 단백질 키나아제 억제제(ROCKi) Y-27632를 가진 10 μM, 및 10% (v/v) 디메틸 황화물(DMSO), 액체 질소에서 냉동 보존 바이알 -160°C. 아래의 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
1. 지하 멤브레인 매트릭스 희석 및 판 코팅
- 희석 (1:50) 성장 인자는 페놀 레드없이 덜벡코의 수정 독수리 매체 (DMEM)에서 엥겔브레스 - 홈 군단 종양에서 정제 된 지하 막 매트릭스를 감소시켰다.
- 희석 된 지하 막 매트릭스 (즉, 6 웰 플레이트 = 1mL, 12 웰 플레이트 = 0.5 mL)의 적절한 양량으로 세포 배양 판을 코팅하고 적어도 1 시간 동안 37 °C에서 이러한 플레이트를 배양한다.
2. iPSC 유지 보수
참고: 6웰 의 평평한 바닥 플레이트에서 웰당 최대 수렴성은 ~1.2 x 106 셀입니다.
- 10 μM Y-27632로 SCM에 냉동 보존 iPSC를 해동하고 희석 된 성장 인자 감소 지하 멤브레인 매트릭스로 코팅 된 6 웰 플레이트에 플레이트.
- 해동 후 처음 24시간 동안 10μM Y-27632로 SCM에서 iPSC를 유지합니다. 24시간 후에 신선한 매체로 전환하십시오.
- 세포가 통과하기 전에 80-90% 합류에 도달할 때까지 SCM에서 iPSC를 유지합니다.
- 분화(15,600셀/cm2)를 양면적으로 곱하여 분화에 필요한 iPSC수를 계산합니다. 6웰 플랫 바닥 플레이트의 경우, 총 149,760 셀/웰에 대해 15,600셀/cm2x 9.6cm2를 곱합니다.
- 통과하려면 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBBS)으로 세포를 씻으시면 됩니다. 이어서, 비효소 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 세포를 37°C에서 5분간 배양한다.
- 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀을 부드럽게 들어 올립니다. 신선한 SCM에서 세포를 수집합니다.
- 플레이트 세포는 희석된 SCM로 코팅된 세포 배양판에 코팅되어 2.3단계에서 설명한 바와 같이 세포를 유지하거나 SCM 1mL에서 ~1.2 x 106 세포/mL, 10μM Y-27632 및 10% DMSO(v/v)에서 액체 질소 온도에서 액체 질소의 온도에서 보존된 바이알에 저장한다.
3. IPSC를 BC로 차별화
참고: 비 효소 EDTA는 세포를 덩어리로 분리합니다. 효소 EDTA(재료표 참조)는 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 망리노산(RA)은 빛으로부터 보호되어야 합니다.
- DPBS(DPBS)로 iPSC를 한 번 세척합니다. 효소 EDTA(6웰 플레이트용 1mL, 12웰 플레이트용 0.5mL, 24웰 플레이트용 0.25mL)로 37°C에서 약 5분간 배양하여 단일 셀 서스펜션을 산출한다.
- 실온에서 5분 동안 세포와 원심분리기를 300 x g(상대 원심력)로 수집합니다. 10 μM Y-27632를 포함하는 SCM에서 세포 펠릿을 재중단합니다.
- Trypan Blue 및 자동 셀 카운터 또는 혈전계 장치를 사용하여 세포 밀도를 결정합니다. 플레이트 셀은 15,600 셀/cm2 또는 149,760 셀/웰의 6웰 플랫 바닥 플레이트(표면적 9.6cm 2/well)의 밀도로 24시간 동안 10μM Y-27632를 함유하고 있다.
- SCM을 E6 매체로 변경하여 24시간 후에 차별화를 시작합니다. 다음 4 일 동안 매일 E6 매체를 변경합니다.
- 차별화 4일째에 E6 배지를 희석(1:200) B27 보충제, 20ng/mL bFGF, 10 μM RA로 보충한 hESFM으로 교체하십시오. 다음 48시간 동안 이 매체를 변경하지 마십시오.
- 희석 (1:200) B27hESFM200mL을 준비하여, 50x 농축 B27 보충제 의 1mL을 hESFM 199mL에 혼합한다.
- 200 μg/mL 스톡 용액을 만들기 위해 트리스 버퍼(5mM Tris, pH 7.6, 150m MM NaCl)의 250 μL에서 bFGF 50 μg를 재구성하여 bFGF 20ng/mL을 준비합니다. 200 μg/mL bFGF의 20 μL을 hESFM 200mL로 혼합하여 20 ng/mL bFGF를 함유한 200mL의 hESFM을 준비한다.
- 10μM RA를 먼저 100 mg의 RA 분말에 DMSO 2.5 mL를 추가하여 RA 스톡 용액 40 mg/mL을 제조하여 준비하십시오. 이 농도를 3 mg/mL로 희석하여 10mM 스톡 솔루션을 만듭니다. 200mL hESFM에 10μM RA의 200 μL을 혼합하여 10 μM RA를 포함하는 200mL의 hESFM을 준비하십시오.
4. iPSC-파생 BMEC의 정화를 위한 코팅 콜라겐 IV(COL4) 및 섬유네틴(FN) 매트릭스
- 1 mg / mL FN 재고 용액을 만들기 위해 FN 2 mg에 멸균 수2 mL을 추가하십시오. 1 mg / mL COL4 재고 용액을 만들기 위해 5 mL의 멸균 수를 COL4 5 mg에 추가하십시오.
- FN이 37°C에서 30분 이상 용해되고 COL4가 실온에서 용해되도록 합니다.
- 멸균 물에 FN 스톡 솔루션을 희석하여 최종 농도100 μg/mL 및 COL4 스톡 용액을 400 μg/mL의 최종 농도로 희석시다.
- 원하는 플레이트(6웰 플레이트 = 1mL 의 COL4/FN 용액, 12웰 플레이트 = 0.5mL, 24웰 플레이트= 0.25mL, 및 12-트랜스웰 여과판 = 0.25 mL)을 400 μg/mL COL4 및 100μg/mL FN의 혼합물로 코팅합니다.
- 37°C에서 최소 2시간 또는 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다. 트랜스웰 여과 플레이트의 경우 최소 4시간이 권장됩니다.
5. iPSC 파생 BMEC의 하위 배양 및 정화
참고: 효소 EDTA를 가진 잠복기는 분화의 6일에 세포의 연결에 따라 15 분 이상 걸릴 수 있습니다.
- 차별화 6일째에 DPBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지 37°C에서 적어도 15분 동안 효소 EDTA 1mL로 배양한다.
- 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심 분리를 통해 세포를 수집합니다. 희석 (1:200) B27 보충, 20 ng /mL bFGF 및 10 μM RA와 신선한 hESFM으로 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 400 μg/mL COL4 및 100 μg/mL FN의 혼합물로 코팅된 플레이트에 종자 셀은 6웰 플레이트의 1웰 비율을 12웰 플레이트의 3웰, 12웰 여과판의 3웰 또는 24웰 플레이트의 6웰을 사용하여 코팅하였다.
- 종자 미분화 된 iPSCs는 TEER 분석을 위한 부정적인 제어로 COL4/FN 코팅 된 12-트랜스웰 여과 판에 동일한 세포주에서 분리되지 않았다.
- 24 시간 의 하위 배양 후, B27 보충만 hESFM에 매체를 변경합니다. 이 단계 후에는 중간 변경이 필요하지 않습니다.
6. 발아 분석
- 8일 iPSC 유래 BMEC를 수집하고 지하 멤브레인 매트릭스 200 μL/cm2로 새로 코팅된 24웰의 평평한 바닥 플레이트에 100,000개의 세포/우물로 시드합니다.
- 이러한 세포를 hESFM로 희석 (1:200) B27 및 40 ng/mL의 혈관 내피 성장 인자 A (VEGFA165)로 치료한다.
- 24시간마다 세포를 관찰하고 2일마다 배지를 변경합니다.
7. 면역 세포 화학 (ICC)
참고 : ICC는 24 잘 평평한 바닥 플레이트에 수행됩니다.
- 48시간의 하위 배양(8일째) 후에는 DPBS로 두 번 세척합니다. 4% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 20분 간 수정합니다.
- DPBS로 셀을 세 번 씻고, 세척당 5분. DPBS의 실온에서 1시간 동안 전블록 셀을 5% 당나귀 혈청과 0.3% 트리톤 X-100(v/v).
- 1차 항체가 있는 인큐베이션: 마우스 항인간-PECAM1 (1:100, 주식 0.5 mg/mL), 토끼 항인간-TJP1 (1:200, 주식 0.53 mg/mL), 마우스 항인간-CLDN5 (1:200, 주식 0.5 mg/mL), 마우스 항인간-OCLN (1:200, 주식 0.5 mg/mL), 토끼 안티 인간-SLC2A1 (1:100, 주식 0.2 mg/mL) DPBS에 1박 5%
- DPBS로 세포를 한 번 헹구고 DPBS로 세척당 5분간 5회 세척합니다.
- 이차 항체를 가진 세포를 배양: 당나귀 항 토끼 알렉사 플루오 555 (1:200) 및 당나귀 항 마우스 488 (1:200) DPBS에서 5% 당나귀 혈청을 1 시간 동안 포함하는.
- 이 배양에 이어, 10분 동안 DPBS에 Hoechst 33342 트리하이드로염 삼수화물 희석(1:1000)을 첨가한다.
- Hoechst 33342 용액을 제거하고 DPBS로 한 번 헹구고 DPBS로 4번 세척하면 세척당 5분간 세척합니다.
- 형광 현미경에 세포를 시각화하여 세포 제조업체의 발현 및 국소화를 찾습니다.
8. TEER 측정 및 분석
참고: 코닝 12-트랜스웰 여과 판에는 1.12cm2 폴리에틸렌 테레프탈레이트 멤브레인과 0.4 마이크로미터 모공으로 구성된 필터가 장착되어 있습니다. TEER 측정은 기술적(웰당 3개) 및 생물학적 복제(세포주 당 3웰 및/또는 상태)에서 수득됩니다.
- 서브 배양 후 24시간(7일차)은 24시간마다 젓가락 전극과 볼토름계를 사용하여 TEER를 측정합니다. 측정 에 대한 구체적인 지침은 voltohmmeter 사용자 설명서를 참조하십시오.
- TEER을 측정하려면 전날 밤 화산계 장비를 충전하십시오. 안전 후드에 넣기 전에 기기와 젓가락 전극을 70% 에탄올로 가볍게 닦으릅니다.
- 제조업체에서 권장하는 대로 전원을 켜고 옴 미터를 보정합니다.
- 젓가락 전극을 연결하고 전극을 70% 에탄올로 헹구고 DPBS가 그 뒤를 따릅니다.
- 더 짧은 말단 전극을 트랜스웰 인서트(apical chamber)에 넣고 더 긴 끝을 바소포측 챔버에 넣습니다.
- 먼저 COL4/FN만 코팅된 빈 웰을 측정합니다. 그런 다음 다른 우물을 측정합니다.
- 다른 조건(즉, 다른 세포주를 측정)할 때 DPBS가 70% 에탄올로 젓가락 전극을 빠르게 헹구고 있습니다.
- 모든 측정 (Ω)이 기록 된 후, 70 %의 에탄올과 젓가락 전극을 헹구고 물을 멸균합니다. 전극을 부드럽게 닦아 안전 후드에서 공기를 건조시키십시오.
- 빈 우물에서 (Ω)의 삼중 TEER 값을 평균하고 조건에 따라 각 원시 TEER 값에서이 평균 값을 뺍니다.
- 빼낸 값을 평균하고 1.12cm 2(12-트랜스웰 인서치의 표면적)로 곱합니다.
- 6단계에서 변형된 값을 사용하여 TEER 값과 TEER 측정의 일일 표준 오류를 보여주는 그래프를 생성합니다.
9. Efflux 운송 활동 및 분석
참고 : Efflux 수송 활동 분석은 24 웰 평면 바닥 플레이트에서 수행됩니다. 관심있는 Efflux 운송업체로는 ABCB1과 ABCC1이 있습니다. 각 조건은 제어 우물 (즉, 각각의 억제제없이 빈 우물)와 triplicate에서 수행되어야한다는 것이 좋습니다.
- 48시간 의 하위 배양(8일째) 후, 37°C에서 1시간 동안 10μM 발스포다르(ABCB1 억제제) 또는 10μM MK571(ABCC1 억제제)으로 세포를 배양한다.
- DMSO의 412 μL에서 5 mg의 분말(1214.64 g/mol)을 용해하고 10 μM의 작동 농도로 희석하여 10mM Valspodar 재고를 준비하십시오. 예를 들어, 10 μM Valspodar와 hESFM의 10mL를 만들려면, hESFM의 10 mL와 10 mM Valspodar 재고의 10 μL을 혼합합니다.
- 931 μL에 5 mg 분말 (537.07 g/mol)을 용해하고 10 μM의 작업 농도로 희석하여 10 mM MK571 재고를 준비하십시오. 예를 들어, 10 μM MK571로 hESFM 10mL를 만들려면 10mM MK571 재고의 10 μL을 hESFM 10mL와 혼합한다.
- 1시간 후, 10μM 로다민 123(ABCB1 기판) 또는 10 μM 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세이션(H2DCFDA, ABCC1 기판)을 37°C에서 1시간 동안 각각의 억제제 유무로 배양한다.
- DMSO 875 μL에서 10 mg의 분말(380.82 g/mol)을 용해하고 10 μM의 작동 농도로 희석하여 10mM 로다민(123)을 준비한다. 예를 들어, 10 μM 로다민 123으로 hESFM 10mL을 만들기 위해 10mM 로다민 123의 10 μL을 hESFM 10mL과 혼합한다.
- 10mM H2DCFDA는 DMSO 10.26mL에서 50 mg의 분말(487.29 g/mol)을 용해하고 10 μM의 작동 농도로 희석하여 10mM H2DCFDA를 준비합니다. 예를 들어, 10 μM 로다민 123으로 hESFM 10mL을 만들기 위해 10mM 로다민 123의 10 μL을 hESFM 10mL과 혼합한다.
- 5% 트리톤-X(v/v)를 함유한 DPBS를 사용하여 DPBS 및 lyse의 0.5mL로 셀을 두 번 세척합니다.
- 멀티 플레이트 또는 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 용액 세포의 형광을 측정합니다(재료 목록 참조).
- 형광 플레이트 판독기 기기를 485 나노미터 발산 및 530 나노미터 방출로 설정하고 이러한 파장에서 형광을 측정합니다.
- 수송기 분석에서 사용되지 않는 우물의 경우, 세포 핵 정량화를 위해 4 % PFA로 고정하기 전에 DPBS로 두 번 세포를 세척하십시오.
- Hoechst 33342 트리하이드로염 삼수화물 희석 (1:1000)을 10 분 동안 DPBS로 세포를 배양한다. 각 우물의 여러 시각적 필드를 이미지하여 형광 현미경을 사용하여 평균 세포 핵 수를 계산합니다.
- 피지를 사용하여 핵을 계산하고 이러한 카운트에 세포 단위로 형광 값을 정규화.
- 각 조건의 원어형 축적 값을 각 빈 값에서 빼서 형광의 평균 축적을 계산합니다.
- 각 조건에 대한 평균 빼기 값입니다.
- 평균 값을 9.6.1 단계에서 평균 셀 수로 나눕니다. 이러한 값을 사용하여 셀당 형광 값을 정규화합니다.
- 정규화된 값을 사용하여 각 억제제 조건에 대한 그래픽 표현을 생성하고 필요한 통계 분석을 수행합니다.
10. 패시징, 확장 및 냉동 보존 BME
- 희석 (1:200) B27로 보충된 신선한 hESFM으로 8 BMEC 배양을 보충하고 세포가 COL4/FN 매트릭스에서 이틀 더 확장할 수 있도록 합니다.
- 새로운 12-Transwell 여과 판과 400 μg/mL COL4 및 100 μg/mL FN과 100 μg/mL FN과 24웰 플랫 바닥 플레이트를 4시간 동안 코팅합니다.
- 10일째에, DPBS로 세포를 세척하고 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지 37°C에서 적어도 15분 동안 효소 EDTA1mL로 배양한다.
- 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심 분리를 통해 세포를 수집합니다.
- 이 세포를 극저온보존하기 위하여는, 30% 태아 소 혈청 (FBS) 및 10% DMSO와 신선한 hESFM로 세포 펠릿을 재중단합니다.
- iPSC 유래 BMEC를 -80°C에서 처음 24시간 동안 이소프로판올 용기에 냉동 보존 된 바이알에 저장한 다음 -160 °C에서 장기 저장을 위해 액체 질소에 놓습니다.
- 이러한 세포를 통과하기 위해, 희석 (1:200) B27로 보충 신선한 hESFM으로 세포 펠릿을 다시 중단.
- 10.2 단계에서 준비된 코팅 된 접시에 종자 세포를 종자 세포. 종자 세포는 12-트랜스웰 여과 판의 3웰에 6웰 플레이트의 1웰의 비율을 사용하고 24웰 플레이트의 6웰을 사용한다. 세포가 24시간 동안 성장하고 확장할 수 있도록 합니다.
- 11일, 8단계에 나열된 단계를 수행하여 TEER를 측정합니다.
- 12일, 9단계에 나열된 단계를 수행하여 ICC를 수행하십시오.
- 냉동 보존 된 BMEC를 해동하려면 냉동 보존 된 유리알을 따뜻한 물이나 비드 욕조에 37oC에 놓습니다. 그런 다음 해동된 BMEC를 희석(1:200) B27로 보충한 hESFM 5mL로 전송한다.
- 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심 분리를 통해 세포를 수집합니다. 희석 (1:200) B27, 10 μM RA 및 10 μM Y-27632로 보충 hESFM에서 세포를 다시 중단합니다.
- 24시간 후, 라없이 희석 (1:200) B27 및 10 μM Y-27632로 보충 된 hESFM으로 매체를 전환하십시오.
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Representative Results
BMEC 차별화
이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계를 정확하게 따라야합니다(그림 1). 1일째에 E6 배지 사용은 여러세포주(36)에걸쳐 재현 가능한 결과를 산출하는 비교적 짧은 기간 내에 iPSC로부터 신경 절제술 혈통을 유도하는 데 자주 사용되기 때문에 중요하다. 또 다른 중요한 단계는 E6 배지를 희석 (1:200) B27, 20 ng /mL bFGF 및 10 μM RA로 hESFM로 전환하여 iPSC 유래 BMEC를 확장하는 차별화의 4 일째에 있습니다. B27 보충제의 첨가는 혈청이 없는 세포 배양1을지원하기 위해 소 혈청에 대한 대안으로 사용되며, bFGF는 iPSC 유래 BMEC6의성장을 용이하게 하기 위해 첨가되며, RA는 BBB 표현형35의개발을 용이하게 하기 위해 사용된다. 마지막 중요한 단계는 정화 단계를 포함, 여기서 일 6 iPSC 파생 BMEC는 iPSC 파생 BMEC를 선택하기 위해 COL4 / FN 코팅 플레이트에 하위 배양된다1,6,35,36. 그림 2는 iPSC에서 BMEC로의 형태학적 전환을 보여 줍니다. E6 배지의 하루 후 (1 일), 세포 형태는 iPSCs의 것과 유사합니다. E6의 4일째에, 세포는 iPSCs와 눈에 띄게 구별되는 나타나기 시작하고 우물의 대부분을 커버하기 시작합니다 (~90% 연결성). 6일째까지, 희석 (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF 및 10 μM RA와 hESFM에서 배양하는 동안, 세포 형태는 길쭉하고 조약돌 외관이 있기 시작합니다. 8일째에, 각 개별 세포는 큰 조약돌 패턴에서 구별됩니다. 발아 분석은 VEGFA165치료(도 3)의3일 후에 튜브와 같은 구조를 초래한 iPSC 유래 BMEC의 혈관신생 잠재력을 입증하기 위해 수행되었다.
그림 1: 인간 iPSC를 BMEC로 차별화하기 위한 개요입니다. 인간 iPSC는 처음에 10 μM Y-27632를 포함하는 줄기 세포 배지에서 24시간 동안 배양되었다. 4일째, 배지는 2일 동안 B27 보충제, 20ng/mL bFGF, 10μM RA로 hESFM으로 변경되었다. 6일째, 세포는 COL4/FN 코팅 플레이트에 하위 배양되었다. 7일째, 배지는 bFGF와 RA 및 TEER 없이 B27 보충제를 사용하여 hESFM으로 변경되었다. 8일째, ICC와 efflux 수송 활동 에세이가 수행되었습니다. iPSC 유래 BMEC는 10일까지 확장된 후 각각 TEER 측정 및 ICC 분석을 위한 트랜스 웰 플레이트 또는 24웰 플랫 바닥 플레이트로 통과되었다. 8일째 BMEC는 발아 분석(묘사되지 않음)에 사용되었습니다. iPSC 유래 BMEC의 6웰 플레이트 2웰은 -160oC에서 장기 저장을 위해 10% DMSO 및 30% FBS를 hESFM에 수집및 저장하였다. 12일째, ICC가 수행된 확장된 iPSC-파생 BMEC에서 TEER 값의 피크가 관찰되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: iPSC를 BMEC로 차별화하는 밝은 필드 이미지입니다. E6 배지에서 문화의 하루 후, iPSC는 자신의 특성 형태를 유지합니다. E6 배지에서 4일째에, 세포 형태학은 iPSCs와 확연히 다른 것처럼 보입니다. 6일째에, 세포 형태학은 길쭉하고 조약돌 외관에 변경됩니다. 8일째에는 세포가 크고 조약돌 패턴으로 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: iPSC 유래 BMEC의 혈관신생 잠재력. 정제된 iPSC 유래 BMEC는 hESFM에서 지하 막 매트릭스에 100,000 셀/cm2에 시드되었고(1:200) B27 보충제와 40ng/mL VEGFA165. 튜브 와 같은 구조는 VEGFA165 치료의 3 일 후에 나타났다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
정제된 iPSC 유래 BMEC는 hESFM에서 지하 막 매트릭스에 100,000 셀/cm2에 시드되었고(1:200) B27 보충제와 40ng/mL VEGFA165. 튜브 와 같은 구조는 VEGFA165 치료의 3 일 후에 나타났다.
BMEC 특성화는 세포 별 마커에 대한 면역 세포 화학을 사용하여 수행되었다. iPSC 유래 BMEC는 폐, 간 및신장(18)에서뇌 내피 세포3 및 내피 세포의 단단한 접합부에서 일반적으로 발현되는 단단한 접합 단백질(OCLN, TJP1 및 CLDN5)의 존재를 위해 평가되었다. PECAM1 및 SLC2A1과 같은 다른 마커는 이전에 정제 된 BMEC6의마커로 사용되었습니다. PECAM13 및 SLC2A4는 모두 BBB의 혈관 내피 세포에서 발현된다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 iPSC 유래 BMEC는 이들 마커 의 다섯 가지 모두를 공동 발현하였다(도4).
그림 4: iPSC-파생 BMEC의 마커 분석. 인간 iPSC 유래 BMEC는 단단한 접합(OCLN, TJP1, CLDN5), 유입 수송기(SLC2A1), 및 부착 접합(PECAM1) 단백질에 대해 염색하였다. OCLN, TJP1 및 CLDN5 단백질은 주로 세포막에서 국소화된다. SLC2A1 및 PECAM1은 핵과 세포막 모두에서 국소화된다. Hoechst 33342 트리하이드로클로리드 삼수화물은 핵 염색에 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
BMEC의 BBB 기능을 특성화하기 위해, TEER는 서브 배양 후 24시간(7일)을 측정하고 배지는 bFGF 및 RA 없이 희석(1:200) B27로 hESFM으로 변경되었다. TEER 측정은 7일째부터 분화(TEER 측정0일)부터 수득되었으며, BMEC(도5)를배양한 후 8일 또는 48시간에 ~2000 Ω x cm2로 정점을 찍었다. 이러한 TEER 값은 쥐 기본성상세포(37)를가진 공동 배양 된 iPSC 유래 BMEC에 대해 설명된 범위 내에 있다. iPSC 라인은 낮은 TEER 값에 따라 식별 할 수있는 BBB 함수를 갖지 못했습니다.
그림 5: iPSC-파생 BMEC의 TEER 측정. TEER 값은 COL4/FN 행렬(분화 8일째)에서 1일 하위 배양 후 최고조에 달했습니다. TEER 측정은 기술적(웰당 3측정) 및 생물학적 복제(세포주당 3개 우물)에서 수득하였다. 빈 우물의 기술 평균 값은 원시 TEER 값에서 빼되었습니다. 이러한 값은 매일 평균화되고 1.12cm 2(12-트랜스웰 인서트의 표면적)를 곱하였다. 오류 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ABCB1 및 ABCC1 efflux 수송기 활성을 평가하기 위해, ABCB1 및 ABCC1에 대해 채택된 형광기의 양은 각각의 억제제로 배양 후 정량화되었다. 예상대로, PSC833(ABCB1 억제제) 또는 MK-571(ABCC1 억제제)을 가진 ABCB1 및 ABCC1 efflux 수송기의 억제는 로다민 123(R123) 또는 2'7'-디클로로디하이드로플루오제(H2DCFDA) 각각6도의증가로 이어졌다. 이 증거는 이 프로토콜을 사용하여 파생된 BMEC가 efflux 수송기 활동이 있음을 시사합니다.
그림 6: iPSC-파생 BMEC의 Efflux 트랜스포터 활동. BMEC에서 의 Efflux 수송 활동은 로다민 123 (R123) 또는 2'7'-디클로로디하이드로플루오레세아제신의 축적을 정량화하여 결정되었다 (H2DCFDA) PSC833(ATP 결합 카세트 서브패밀리 B 부재 1(ABCB1) 억제제 또는 MK-571(ATP 결합 카세트 서브패밀리 C 부재 1(ABCC1) 억제제의 유무). 기술 적 삼중은 각 조건 (N =1)에 대해 수행되었다. 대조군 조건(즉, 억제제 없이)으로부터의 형광 값은 원시 형광 값에서 공제되었다. 이러한 형광 축적은 각 기술적 복제에 대해 세포별 기준으로 정규화되었다. 통계적 유의성은 세 가지 기술 복제에서 학생 t-테스트를 사용하여 결정되었다. ABCB1 억제제(t-stat= -1.66, p=0.11)의 유의와 없이 R123의 축적 사이에는 통계적 유의가 관찰되지 않았다. 통계적 유의성은 ABCC1 억제제(t-stat=-7.23, p=0.04)의 유동과 없이 H2DCFDA의 축적 사이에서 관찰되었다. *p&0.05. 오류 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
iPSC-파생 BMEC 의 패시징, 확장 및 냉동 보존
또 다른 목표는 iPSC 에서 파생된 BMEC가 하위 배양 후에 통과되고 냉동 보존될 수 있는지 여부를 조사하는 것이었습니다. 이를 위해, 7일째 iPSC 유래 BMEC는 10일째까지 확장이 허용되었고, 이를 새로 코팅한 COL4/FN 12-트랜스웰 여과플레이트에 전달하여 TEER 측정을 위한 플레이트와 ICC 분석을 위한 24웰 플랫 바닥플레이트(그림 7)를허용했다. 이러한 조건을 이용하여 iPSC 유래 BMEC는 계속 증식하고, OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 및 PECAM1(도8)의발현을 유지하고, 패세후 적절한 TEER 값(피크~2000 Ω xcm2)을유지하였다(도9). 냉동 보존 BME는 나중에 해동, 확장 및 통과되었다(그림 7). BMEC의 TEER 측정은 해동 후 24시간, 그 후 며칠 후에 수주되었습니다. 이러한 해동 후 BMEC의 TEER 측정은 새로 파생된 BMEC와 비교할 때 감소(800 Ω x cm2로정수). 사후 해동 BMEC의 두 번째 패싱은 더 낮은 TEER 값 (200-300 Ω x cm2에서피크)(도 9)및 꽉 접합 형성의 마모 및 / 또는 주근깨 패턴을 보였다(도 10). 서양 블롯분석(48)은 iPSC가 주로 내피 마커(SOX17)49 및 일부 단단한 접합 마커(OCLN)를 발현하지만 다른 BMEC 관련 마커(TJP1, CLDN5 및 SLC2A1)를 발현한 것으로나타났다(도 11). BMEC는 주로 내피 성 마커 (TJP1, CLDN5, OCLN 및 SLC2A1)를 발현했으며 내피 마커, SOX17의 낮은 수준을 가진.
그림 7: 확장 및 저온 보존 iPSC 파생 BME의 밝은 필드 이미지. A) 10일(초기 하위 배양 후 4일) 세포가 최대 합류에 도달하였다. B) 11일, 24시간 후 COL4/FN 코팅 24웰 플레이트. C) Day12, 48 시간 후 COL4/FN 코팅 24 웰 플레이트; 피크 TEER 값이 관찰되었고 ICC가 수행되었다. D) 48 시간 COL4/FN 코팅 6 웰 플레이트에 해동 후 iPSC 유래 BMEC; 세포는 이전에 1.2 x 102 세포/mL에서 냉동 보존하였다. E) 해동 후 iPSC 유래 BMEC가 COL4/FN 코팅 6웰 플레이트에 파기된 후 24시간 후에. F) 해동 후 iPSC 유래 BMEC가 통과된 후 48시간 후에 통과되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 통과 후 iPSC 파생 BMEC의 ICC. BMEC는 TEER 값이 최고조에 달한 12일까지 COL4/FN 행렬에서 통과되고 유지관리되었습니다. 12일 BMEC는 단단한 접합(OCLN, TJP1, CLDN5), 유입 수송기(SLC2A1) 및 부착 접합(PECAM1) 단백질에 대해 염색하였다. 식 패턴 및 지역화는 도 4에 도시된 바와 같이 패시징이 수행되지 않은 조건에서 관찰된 패턴과 유사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: iPSC, 비통로 BMEC, 통로 BME, 저온 보존 BC 및 냉동 보존 및 통로 BMEC에서 TEER 측정을 비교합니다. 1일째에는 TEER 값이 비통로 및 통로형 BMEC에 피크가 되었지만 iPSC 나 냉동 보존 BME는 정점에 달했습니다. 냉동 보존 BME는 3일과 7일 사이에 적당한 TEER 값을 가지고 있었으며, 냉동 보존 및 통로 BME의 TEER 값도 더 낮았습니다. iPSC는 0일과 9일 사이에 측정 가능한 TEER 값을 보여주지 않았습니다. TEER 측정은 기술(웰당 3측정) 및 생물학적 복제(세포주당 3개)로 수득하였다. 빈 우물의 기술 평균 값은 원시 TEER 값에서 빼되었습니다. 이러한 값은 매일 평균화되고 1.12cm 2(12-트랜스웰 인서트의 표면적)를 곱하였다. 오류 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 저온 보존 및 통로 BME의 ICC. BMEC는 최고 TEER 값이 관찰될 때까지 COL4/FN에서 통과되고 유지관리되었습니다. BMEC는 단단한 접합 (OCLN, TJP1, CLDN5), 유입 수송기 (SLC2A1) 및 부착 접합 (PECAM1) 단백질에 대해 염색되었다. 팽팽한 접합 마커의 발현 패턴은 비통로 BMEC(도4)및 통로 BMEC(도8)와비교했을 때 마모 및/또는 주근깨가 나타났다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: iPSC, 비통로 BMEC, 통로 BMEC 및 저온 보존 및 통로 BME의 서부 얼룩 분석. TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 및 로딩 제어(GAPDH)의 수준을 보여주는 웨스턴 블롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
수정 및 문제 해결
본 프로토콜에서, 우리는 BMEC의 파생을 위해 iPSC 배양 하는 동안 일반적으로 사용되는 세포 외 매트릭스 및 세포 배양 매체를 사용 하 여 몇 가지 수정을 했다(그림 1). 이러한 변화는 Lippmann 프로토콜1에설명된 바와 같이 인간 iPSC로부터 BMECS를 파생하는 기능에 영향을 미치지 않았다. 다른 건강한 기증자의 iPSC 라인은 이 수정된 프로토콜이 다른 라인1과이전 연구와 유사한 결과를 나타낸다는 것을 보여주기 위해 사용되었습니다. 냉동 보존을 위해, B27 보충 대신에 사용 되었다 1% 혈소판 가난한 혈장 유래 혈청 (PDS)40,하지만이 후속 배양에 BMEC 충실도 영향을. 문제 해결과 관련하여 TEER 값은 안정화되기 전에 빠르게 변동할 수 있습니다. 이러한 변동은 플레이트가 37°C에서 실온37로이동할 때 발생하는 온도 변화로 인해 발생할 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해 측정을 신속하고 효율적이며 일관되게 수행해야 합니다. 필요한 경우, 온도 효과는 2009년49에서 제공하는 수학적 공식을 사용하여 온도 보정 TEER 값을 획득함으로써 고려될 수 있다.
이 프로토콜의 제한 사항
강력한 BBB 표현형(예: 높은 TEER 값)으로 BMEC를 획득했음에도 불구하고 이 BBB 속성을 장기간 유지 관리하는 것은 큰 과제입니다. 여기에 표시된 바와 같이, 이 프로토콜을 사용하는 피크 TEER 값(~2000 Ω xcm2)은이전에 보고된 피크 TEER 값(~8000 Ω xcm2)1보다훨씬 낮았다. 이러한 관찰에도 불구하고 TEER 값은 이전에 보고된 값1의일반적인 범위(2000-8000 Ω x cm2)내에 떨어졌다. 두 번째 제한은 이프로토콜(36)의다른 버전에서 관찰된 다른 iPSC 선에서 발생하는 피크 TEER 값의 가변성입니다. 상이한 세포주 간의 변이는 각 iPSC 라인의 성장 및 팽창속도에 기인할 수 있으며, 이는 환경적요인(51)에의해 영향을 받습니다. 우리의 프로토콜이 BMEC 충실도를 유지하지 않았기 때문에 또 다른 제한은 냉동 보존과 관련이 있습니다. 1% PDS40이 냉동 보존 중에 BMEC의 안정성을 높일 수 있습니다.
기존 방법에 대한 중요성
iPSC 유래 BMEC는 질병 생물학의 연구 결과에 대한 이 세포를 이용에 귀중한 특정 개별의 유전 배경이 있는 세포를 제공합니다. 다른동물(37)에서추출한 동물 모델 이나 1차 BMEC 배양을 사용할 때는 그렇지 않다. 더욱이, 시험관 내 1차 BMEC 배양은 낮은 TEER 값(~100 Ω x cm237)을나타내며, 여기에 설명된 프로토콜을 가진 인간 iPSC 유래 BMEC와 함께 달성된 것보다 훨씬 낮습니다. 이 수정된 프로토콜은 iPSC에서 인간 BME를 획득하는 세부 방법을 제공하며, 더 긴 사용을 위해 이를 확장하고 유지할 수 있습니다. 차별화된 BMEC를 통과하고 저장하는 기능은 특히 여러 세포주를 한 번에 연구할 때 실험 설계에서 다기능성과 유연성을 제공할 수 있습니다. 이러한 결과에 기초하여, iPSC 유래 BMEC는 초기 하위 배양 단계(그림7, 도 8 및 도 9)후에 확장 및 통과될 수 있지만, 냉동 보존은 추가 조사가 필요합니다. 이 프로토콜은 또한 다른 줄기 세포 기반 세포 모델과 함께 뇌 오르가노이드의 혈관화와 같은 혁신적인 접근법을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 현재 뇌 오르가노이드를 생성하는 방법은 BBB52,53을포함하는 신경 혈관 단위의 내피 세포 및 중요한 요소가 부족하기 때문에 인간 뇌의 세포 유형의 불완전한 재구성을 초래한다. 여기에 설명된 프로토콜은 3D 모델보다 저렴하고 구현하기 쉬운 2차원 Transwell/공동 배양 시스템을 사용하여 다루기 쉽고 재현 가능한 접근 방식을 제공할 수 있습니다.
이 프로토콜의 향후 응용 프로그램
이 프로토콜은 정신 분열증과 양극성 장애와 같은 신경 정신 장애에서 신경 혈관과 BBB의 역할을 연구하기 위해 활용할 수 있으며, 여기서 신경 혈관 절제술의 적자는역할 9,10,20,54,55역할을가설되었습니다. 이프로토콜(36)의 이전 버전은 헌팅턴 병 7 및 22q 삭제 증후군 환자 정신분열증(43)을 가진 환자의 iPSC 라인에서 BMEC를 파생하는 데 사용되었다. 두연구7,43 은 BBB와 관련된 세포 세포 및 / 또는 세포 간 기능을 조사하기 위해이 방법의 성공적인 활용을 입증했다. 이전 프로토콜1에서동물 혈청의 잠재적 인 혼란 효과에 대한 몇 가지 우려가 제기되었습니다. 여기에 사용되는 혈청 없는 프로토콜은 이러한 우려를 제거하는 동시에 BMEC 를 유도하기 위한 이전 프로토콜과 유사한 결과를 생성합니다.
BMEC 차별화 및 확장을 위한 중요한 단계
이 프로토콜을 구현할 때 네 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 최적의 밀도(즉, ~15,600세포/cm2에서시드)로 iPSC를 파종하는 것은 효율적인 BMEC 분화에 중요하다. 세포 밀도가 4일째에 너무 높거나 너무 낮으면 배양은 세포이질성(56)의더 큰 비율을 나타낼 수 있다. 두 번째 중요한 단계는 E6 배지가 분화를 시작하는 데 사용되는 1일과 4일 간의 분화 유도입니다. E6은 이전 프로토콜6,35에서사용되었던 "무조건 매체"대신 에 활용된다. E6 배지는 13일부터 8일까지 분화 시간을 줄일 뿐만 아니라, 타이트한 접합 단백질(TJP1, OCLN, CLDN5) 및 BMEC 마커(PECAM1 및 SLC2A1)36의발현을 촉진한다. E6 배지의 사용은 또한 적절한 TEER값(그림 5)과ABCB1 및 ABCC1 efflux 수송 활성(그림6)6,35를초래하였다. 셋째, BMEC 분화1의일관성과 신뢰성을 향상 시킨 혈청 없는 조건에 허용 된 소 혈청 대신 B27의 사용. 마지막으로, iPSC 유래 BMEC를 확장하는 측면에서, 세포는 ~100% 합류에 도달하면 통과되어야 한다. 이 프로토콜에 기초하여, iPSC 유래 BMEC는 초기 하위 배양 단계(그림7, 도 8 및 도 9)후에더욱 확장및 통과될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 혁신적인 새로운 과학자에 대한 정신 건강 생물 행동 연구 상국립 연구소에 의해 지원되었다 (BRAINS) 상 R01MH113858 (R.K.), 건강의 국립 연구소 상 KL2 TR002542 (PL). 국립 정신 건강 임상 과학자 개발 상 K08MH086846 (R.K.), 시드니 R Baer Jr 재단 보조금 (P.L.) 도리스 듀크 자선 재단 임상 과학자 개발 상 (R.K.), 라이언 리히트 상 양극성 재단 (R.K.), 필리스 & 제롬 라일 라파포트 재단 (R.K.), 하버드 줄기 세포 연구소 (R.K.) 및 스티브 윌리스와 엘리사 프로이트 (R.K.에). 애니 카투리아 박사님의 비판적 독서와 원고에 대한 피드백에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100mL | |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A-31572 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb | Cell Signaling | 3528S | |
| CLDN5 (Claudin-5) | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma Aldrich | C5533-5mg | |
| Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 8670 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) | Corning | 353046 | |
| Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) | Corning | 353047 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) | Corning | 3460 | |
| Countess slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| DMEM/F12 (without phenol red) | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-50mL | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663-10ML | |
| DPBS (+/+) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 | World Precision Instruments | N/A | |
| Essential 6 Medium (Thermo Fisher) | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-2mg | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 24020-117 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human endothelial serum-free medium | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
| InCell Analyzer 6000 | General Electric | N/A | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| MK-571 | Sigma Aldrich | M7571-5MG | |
| NutriStem | Stemgent | 01-0005 | |
| Occludin | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Recombinant Human VEGF 165 | Peprotech | 100-20 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-100MG | |
| Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702-10MG | |
| SLC2A1 (GLUT-1) | ThermoFisher | PA1-21041 | |
| SOX17 | Cell Signaling | 81778S | |
| TJP-1 (ZO-1) | ThermoFisher | PA5-28869 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) | Sigma Aldrich | SML0572-5MG | |
| Versene solution | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Tocris/Thermo Fisher Scientific | 1254 |
References
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
- Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
- Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
- Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
- Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
- Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
- Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
- Pollak, T. A., et al.
- Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
- Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
- Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
- Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
- Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
- Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
- Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
- Greene, C., Hanley, N., Campbell, M.
- Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
- Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
- Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
- Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
- Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
- Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
- de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
- Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
- Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
- Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
- Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
- Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
- Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
- Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
- Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
- Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
- Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
- Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
- Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
- Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
- Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
- Warren, L., Lin, C.
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
- Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
- Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
- Pham, M. T., et al.
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
- Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
- Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
- Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).
