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Neuroscience

Dérivation, expansion, cryopréservation et caractérisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

Ce protocole détaille une méthode adaptée pour dériver, étendre, et cryopréserver des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau obtenues en différeciant les cellules souches pluripotentes induites par l’homme, et pour étudier des propriétés de barrière de cerveau de sang dans un modèle ex vivo.

Abstract

Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (BMECs) peuvent être différenciées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (IPSC) pour développer des modèles cellulaires ex vivo pour étudier la fonction de barrière céphalo-encéphalique (BBB). Ce protocole modifié fournit des étapes détaillées pour tirer, étendre et cryopréserver les CPE des IPSC humains à l’aide d’un donneur et d’un reagents différents de ceux rapportés dans les protocoles précédents. Les iPSC sont traités avec le milieu essentiel de 6 pendant 4 jours, suivis de 2 jours de milieu humain endothélial de culture sérum-libre complété avec le facteur de croissance fibroblaste de base, l’acide rétinoïque, et le supplément de B27. Au jour 6, les cellules sont sous-cultivés sur une matrice collagène/fibronectine pendant 2 jours. L’immunocytochimie est effectuée au jour 8 pour l’analyse des marqueurs BMEC à l’aide de CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 et SLC2A1. Le ballonnement occidental est exécuté pour confirmer l’expression de marqueur de BMEC, et l’absence de SOX17, un marqueur endodermal. Le potentiel angiogénique est démontré avec un essai de germination. La résistance électrique trans-endothéliale (TEER) est mesurée à l’aide d’électrodes baguettes et de voltohmmètres à partir du jour 7. L’activité transporteur Efflux pour la sous-famille de cassettes de liaison ATP B membre 1 et la sous-famille de cassettes de liaison ATP C membre 1 est mesurée à l’aide d’un lecteur multi-plaques au jour 8. La dérivation réussie des BMEC est confirmée par la présence de marqueurs cellulaires pertinents, de faibles niveaux de SOX17, de potentiel angiogénique, d’activité de transporteur et de valeurs TEER ~2000 Ω x cm2. Les BMEC sont élargis jusqu’au jour 10 avant de passer sur des plaques de collagène/fibronectine fraîchement enrobées ou cryopréservées. Ce protocole démontre que les BMEC dérivés de l’iPSC peuvent être élargis et adoptés au moins une fois. Cependant, des valeurs TEER plus faibles et une localisation plus faible des marqueurs BMEC ont été observées après cryopréservation. Les BMEC peuvent être utilisés dans des expériences de co-culture avec d’autres types de cellules (neurones, gliales, péricytes),dans des modèles cérébraux tridimensionnels (puce d’organe et hydrogel), pour la vascularisation des organoïdes cérébraux, et pour étudier le dysfonctionnement de BBB dans les désordres neuropsychiatriques.

Introduction

Fonction barrière céphalo-cérébrale
La barrière céphalo-encéphalique (BBB) forme une limite qui limite le mouvement des substances du sang vers le cerveau. Le BBB est composé de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMECs) qui forment un monocouche tapissant la vascularisation. Les BMEC, ainsi que les astrocytes, les neurones, les péricytes, les microglies et la matrice extracellulaire, forment l’unité neurovasculaire. Les BMEC ont une structure paracellulaire étroitement régulée qui permet au BBB de maintenir une résistance électrique trans-endothéliale élevée (TEER), ce qui limite la diffusion passive et sert d’indicateur del’intégrité de la barrière 1,2. Les BMEC ont également des protéines qui aident au mouvement transcellulaire tel que l’endocytose, la transcytose, et la transmigration, aussi bien que l’extravasation des leucocytes pendant une réponse immunisée3. Les BMEC comptent sur l’afflux et les transporteurs d’efflux pour nourrir et enlever les déchets, afin de maintenir un équilibre homéostatique dans lecerveau 3. Par exemple, solute transporteur famille 2 membre 1 (SLC2A1) est un transporteur d’afflux responsable du mouvement du glucose à travers le BBB4, tandis que les transporteurs efflux tels que la sous-famille de cassettes de liaison ATP B membre 1 (ABCB1) et la sous-famille de cassettes de liaison ATP C membre 1 (ABCC1) sont responsables du retour des substrats dans le fluxsanguin 3,5,6,7. Les substrats ABCB1 comprennent la morphine, le verapamil4et les antipsychotiques tels que l’olanzapine et la rispéridone8,tandis que le transporteur ABCC1 a une variété de substrats, y compris les conjugués de sulfate, la vincristine et les conjugués au glucuronide4.

Application de modèles BBB dans les troubles psychiatriques
Le dysfonctionnement de BBB a été impliqué dans un certain nombre de désordres neurologiques et psychiatriques, y compris la schizophrénie et le désordrebipolaire 9,10. Récemment, des modèles cellulaires ex vivo dérivés de l’iPSC sont utilisés pour interroger les fondements cellulaires et moléculaires des troubles psychiatriques, mais ces modèles ne prennent actuellement pas en compte le rôle potentiel joué par la neurovasculature11,12,13. On émet l’hypothèse que les cytokines inflammatoires périphériques circulant dans le sang peuvent avoir un impact négatif sur le BBB14,15,16,17, mais il ya aussi des preuves pour paracellulaire18,19,20,21,22, transcellulaire23,24,25,26,27,28,29,et la matrice extracellulaire20,29,30,31,32 anomalies contribuant au dysfonctionnement BBB. La perturbation du BBB peut avoir comme conséquence le contenu du sang entrant dans le parenchyme de cerveau et activant des astrocytes et/ou des microglies pour libérer des cytokines proinflammatory, qui à leur tour initient une réponseinflammatoire 33 qui peut avoir des effets préjudiciables surle cerveau 34. Les BMEC sont la composante principale du BBB et l’examen de la structure et de la fonction de ces cellules peut améliorer la compréhension du dysfonctionnement de BBB dans les désordres neurologiques et psychiatriques.

Modèles alternatifs BMEC
Avant l’élaboration de protocoles efficaces pour l’exploitation des BMECs à partir d’iPSC1,6,35,36, les chercheurs avaient utilisé des BMECsimmortalisés 37 pour étudier la fonction BBB. Cependant, beaucoup de ces modèles n’ont pas atteint les phénotypes souhaitables de BBB, une telle gamme physiologique des valeurs de TEER38,39. L’utilisation d’iPSCs a l’avantage de conserver le contexte génétique de l’individu à partir duquel les cellules sont dérivées. Les scientifiques travaillent activement à l’établissement de modèles de microenvironnement ex vivo dérivés de l’iPSC qui récapitulent la structure et la fonction du cerveau humain. Les chercheurs ont mis au point des méthodes pour obtenir des BMEC qui sont structurellement et physiologiquement similaires aux BMECs trouvés in vivo. Les méthodes d’obtention de populations purifiées de BMEC dérivés de l’iPSC nécessitent un certain nombre d’étapes différentes avec des protocoles optimisés au cours desdernières années 1,6,35,36. Généralement, les BMECs iPSC-dérivés sont cultivés dans le milieu essentiel 6 (E6) pendant 4 jours, suivis de 2 jours dans le milieu sans sérum endothélial humain (hESFM) complété avec le facteur de croissance fibroblaste de base (bFGF), l’acide rétinoïque (RA), et le supplément de B27. Les cellules sont ensuite cultivés sur une matrice de collagène IV (COL4) et de fibronectine (FN) pour obtenir >90% homogène BMECs1.

L’identité des BMEC est confirmée par immunofluorescence montrant la co-expression des protéines BMEC, y compris la molécule d’adhérence des cellules plaquettaire-endothéliales-1 (PECAM1), SLC2A1, et les protéines de jonction serrées telles que la protéine de jonction serrée 1 (TJP1), l’occludine (OCLN) et la claudin-5 (CLDN5)6. Des analyses de germination ont été employées pour confirmer le potentiel angiogenic des BMECs iPSC-dérivés. 6 L’intégrité BBB des BMEC est évaluée par la présence de valeurs physiologiques in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 et d’activité mesurable pour les transporteurs d’efflux tels que ABCB1 et ABCC11,6,36. Les progrès méthodologiques récents du groupe Lippmann ont conduit à des protocoles BMEC dérivés de l’iPSC avec une variabilité expérimentale réduite et une reproductibilitéaccrue 1. Cependant, on ne sait pas s’ils peuvent être étendus et transmis au-delà de l’étape de la sous-culture. Notre protocole modifié vise à résoudre ce problème en réussissant les BMEC dérivés de l’iPSC au-delà du jour 8 et en évaluant s’ils peuvent être encore élargis pour conserver les propriétés BBB après cryopréservation. Bien qu’aucune étude n’ait décrit le passage des BMECs iPSC-dérivés, un protocole existe pour la cryopréservation de BMEC qui retient des propriétés physiologiques de BBB après avoir subi un cycle de gel-dégel40. Cependant, il n’est pas connu après la cryopréservation BMECs peuvent être adoptés et conserver les propriétés BBB.

Les BMECs dérivés d’iPSCs utilisant le protocole Lippmann ont été utilisés pour modéliser la perturbation bbb dans les troubles neurologiques tels que la maladie de Huntington7. Ces BMECs iPSC-dérivés ont également été utilisés pour étudier les effets de l’infection bactérienne telle que Neisseria meningitidis ou Streptococcus de groupe B sur la perturbation de la barrière de sang-CSF et BBBrespectivement 41,42. En outre, utilisant des BMECs iPSC-dérivés des patients de syndrome de suppression de 22q présentant la schizophrénie, les chercheurs ont observé une augmentation de molécule d’adhérence intercellulaire-1 (ICAM-1), une molécule importante d’adhérence dans les BMECs qui aident au recrutement et à l’extravasation des leucocytes dans lecerveau 43. Prises ensemble, ces études démontrent l’utilité des BMECs iPSC-dérivés pour étudier la perturbation de BBB dans les désordres neuropsychiatriques complexes.

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Protocol

Les iPSCs humains ont été reprogrammés à partir des fibroblastes de donneurs en bonne santé à l’aide d’un protocole approuvé par les commissions d’examen institutionnel du Massachusetts General Hospital et de l’Hôpital McLean, et caractérisé comme décrit dans des étudesantérieures 44,45,46.

REMARQUE : En bref, les fibroblastes ont été reprogrammés à l’iPSC par reprogrammation génétique basée surl’ARNm 47. Les iPSC ont été maintenus dans le milieu des cellules souches (SCM) (voir liste des matériaux) et stockés à une densité de ~1,2 x 102 cellules/mL avec 1 mL de SCM, 10 μM avec inhibiteur de kinase protéique rho-associé (ROCKi) Y-27632, et 10% (v/v) sulfure de diméthyle (DMSO), dans les flacons cryopréservés dans l’azote liquide à -160 °C. Toutes les procédures suivantes ci-dessous sont effectuées dans un cabinet de biosécurité, sauf indication contraire.

1. Dilution de matrice de membrane de sous-sol et revêtement de plaque

  1. Le facteur de croissance dilué (1:50) a réduit la matrice de membrane de sous-sol purifiée de la tumeur d’Engelbreth-Holm-Swarm dans dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) sans rouge phénol.
  2. Plaques de culture de cellules de couche avec la quantité appropriée de matrice diluée de membrane de sous-sol (c.-à-d., plaque de 6 puits = 1mL, plaque de 12 puits = 0.5 mL) et incuber ces plaques à 37 °C pendant au moins 1 heure.

2. maintenance iPSC

REMARQUE : La confluence maximale par puits dans une plaque à fond plat de 6 puits est de ~1,2 x 106 cellules.

  1. Décongeler les iPSCs cryopréservés en MCS avec 10 μM Y-27632 et plaque sur une plaque de 6 puits recouverte d’une matrice de membrane de sous-sol réduite par facteur de croissance diluée.
  2. Maintenez les iPSC en MCS avec 10 μM Y-27632 pendant les 24 premières heures suivant le dégel. Passer à un milieu frais après 24 heures.
  3. Maintenir les iPSC dans le SCM jusqu’à ce que les cellules atteignent 80-90% de confluence avant de passer.
    1. Calculer le nombre d’iPSC nécessaires à la différenciation en multipliant la densité souhaitée pour la différenciation (15 600 cellules/cm2)par la surface du puits. Pour une plaque à fond plat de 6 puits, multipliez 15 600 cellules/cm2 par 9,6 cm2 pour un total de 149 760 cellules/puits.
  4. Pour passer, lavez les cellules avec la solution de sel équilibré (HBBS) de Hanks. Ensuite, incuber les cellules avec de l’acide éthylèneediaminetetraacetic non enzymatique (EDTA) (voir liste des matériaux) pendant 5 minutes à 37 °C.
    1. Utilisez un grattoir cellulaire pour soulever doucement les cellules. Recueillir les cellules dans le SCM frais.
    2. Plaquez les cellules sur des plaques de culture cellulaire recouvertes de MCS dilué et maintenez les cellules décrites à l’étape 2.3 ou stockez-les à ~1,2 x10 6 cellules/mL dans 1 mL de MCS, 10 μM Y-27632 et 10 % DMSO (v/v) en flacons cryopréservés dans de l’azote liquide à une température de -160 °C.

3. Différenciation des IPSC en BMECs

REMARQUE : L’EDTA non enzymatique sépare les cellules en touffes. Enzymatic EDTA (voir tableau des matériaux)sépare les cellules en suspension cellulaire unique. L’acide rétinoïque (PR) doit être protégé de la lumière.

  1. Lavez les iPSC une fois avec la saline tampon de phosphate (DPBS) de Dulbecco. Incuber avec de l’EDTA enzymatique (1 mL pour la plaque de 6 puits, 0,5 mL pour la plaque de 12 puits et 0,25 mL pour la plaque de 24 puits) pendant environ 5 minutes à 37 °C pour produire une suspension à cellule unique.
  2. Recueillir les cellules et la centrifugeuse à 300 x g (force centrifuge relative) pendant 5 minutes à température ambiante. Resuspendez les granulés cellulaires dans SCM contenant 10 μM Y-27632.
  3. Déterminer la densité cellulaire à l’aide du compteur cellulaire Trypan Blue et automatisé ou d’un dispositif d’hémocytomètre. Cellules de plaque à une densité de 15.600 cellules/cm2 ou 149.760 cellules/puits d’une plaque à fond plat de 6 puits (avec une surface de 9.6 cm2/puits)dans SCM contenant 10 μM Y-27632 pendant 24 heures.
  4. Initier la différenciation après 24 heures en changeant SCM en E6 moyen. Changez E6 moyen par jour pour les 4 prochains jours.
  5. Le jour 4 de différenciation, remplacer e6 moyen par hESFM complété par dilué (1:200) supplément B27, 20 ng / mL bFGF, et 10 μM RA. Ne changez pas ce support pour les prochaines 48 heures.
  6. Préparer 200 mL de hESFM avec dilué (1:200) B27, mélanger 1 mL de 50x concentré B27 supplément à 199 mL de hESFM.
  7. Préparez 20 ng/mL de bFGF en reconstituant 50 μg de bFGF en 250 μL de tampon Tris (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) pour faire une solution de stock de 200 μg/mL. Préparer 200 mL de hESFM contenant 20 ng/mL bFGF en mélangeant 20 μL de 200 μg/mL bFGF avec 200 mL de hESFM.
  8. Préparer 10 μM RA en faisant d’abord une solution de stock de RA de 40 mg/mL en ajoutant 2,5 mL de DMSO à 100 mg de poudre de PR. Diluer cette concentration à 3 mg/mL pour faire une solution de stock de 10 mM. Préparer 200 mL de hESFM contenant 10 μM RA en mélangeant 200 μL de RA 10μM en 200 mL hESFM.

4. Revêtement collagène IV (COL4) et fibronectine (FN) Matrice pour la purification du BMEC dérivé de l’iPSC

  1. Ajouter 2 mL d’eau stérile à 2 mg de FN pour faire 1 mg/mL de solution de bouillon FN. Ajouter 5 mL d’eau stérile à 5 mg de COL4 pour faire une solution de stock COL4 de 1 mg/mL.
    1. Laisser le FN se dissoudre pendant au moins 30 minutes à 37 °C et le COL4 se dissoudre à température ambiante.
  2. Diluer la solution de stock FN dans l’eau stérile jusqu’à une concentration finale de 100 μg/mL et la solution de stock COL4 à une concentration finale de 400 μg/mL.
  3. Enrober les plaques désirées (plaque de 6 puits = 1 mL de solution COL4/FN, plaque de 12 puits = 0,5 mL, plaque de 24 puits = 0,25 mL, et plaque filtrée de 12 transwell = 0,25 mL) avec le mélange de 400 μg/mL COL4 et 100 μg/mL FN.
  4. Incuber les assiettes pendant au moins 2 heures ou toute la nuit à 37 °C; pour les plaques filtrées Transwell, un minimum de 4 heures est recommandé.

5. Sous-culture et purification des CME dérivés de l’iPSC

REMARQUE : L’incubation avec EDTA enzymatique peut prendre plus de 15 minutes selon la confluence des cellules le jour 6 de la différenciation.

  1. Le jour 6 de la différenciation, laver les cellules deux fois avec DPBS. Incuber avec 1 mL d’EDTA enzymatique pendant au moins 15 minutes à 37 °C jusqu’à ce qu’une suspension à cellule unique soit obtenue.
  2. Recueillir les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Resuspendez les granulés cellulaires avec hESFM frais avec supplément dilué (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF, et 10 μM RA.
  3. Cellules de graines sur des plaques recouvertes d’un mélange de 400 μg/mL COL4 et 100 μg/mL FN. Cellules de graines utilisant un rapport de 1 puits d’une plaque de 6 puits à 3 puits d’une plaque de 12 puits, 3 puits d’une plaque filtrée de 12 transwell, ou 6 puits d’une plaque de 24 puits.
  4. Les iPSCs indifférenciés de semences de la même lignée cellulaire sur la plaque filtrée col4/FN enduite de 12 transwells comme contrôle négatif pour l’analyse TEER.
  5. Après 24 heures de sous-culture, changer de moyen à hESFM avec supplément B27 seulement. Aucun changement moyen n’est nécessaire après cette étape.

6. Essai de germination

  1. Recueillir les BMC dérivés de l’iPSC du jour 8 et les ensemencer à 100 000 cellules/puits sur une plaque à fond plat de 24 puits fraîchement recouverte de 200 μL/cm2 de matrice membranaire du sous-sol.
  2. Traiter ces cellules avec hESFM avec dilué (1:200) B27 et 40 ng/mL de facteur vasculaire de croissance endothéliale A (VEGFA165).
  3. Observez les cellules toutes les 24 heures et changez le milieu tous les deux jours.

7. Immunocytochimie (ICC)

REMARQUE : L’ICC est réalisé sur des plaques à fond plat de 24 puits.

  1. Après 48 heures de sous-culture (jour 8), laver les cellules deux fois avec DPBS. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 20 minutes.
  2. Laver les cellules trois fois avec du DPBS, 5 minutes par lavage. Prébloquez les cellules pendant 1 heure à température ambiante dans le DPBS avec 5% de sérum d’âne et 0,3% de Triton X-100 (v/v).
  3. Incuber avec des anticorps primaires : souris anti-humain-PECAM1 (1:100, stock 0,5 mg/mL), lapin anti-humain-TJP1 (1:200, stock 0,53 mg/mL), souris anti-humain-CLDN5 (1:200, stock 0,5 mg/mL), souris anti-humain-OCLN (1:200, stock 0,5 mg/mL), et lapin anti-humain-SLC2A1 (1:100, stock 0,2 mg/mL) en DPBS contenant 5% de sérum d’âne pendant la nuit à 4 °C.
    1. Rincer les cellules une fois avec DPBS, puis laver cinq fois pendant 5 minutes par lavage avec DPBS.
  4. Cellules d’incubation avec des anticorps secondaires : âne-anti-lapin Alexa Fluor 555 (1:200) et âne-anti-souris 488 (1:200) dans DPBS contenant 5% de sérum d’âne pendant 1 heure.
  5. Après cette incubation, ajouter hoechst 33342 trihydrochlorure trihydrochlorate dilué (1:1000) dans DPBS pendant 10 minutes.
    1. Retirer la solution Hoechst 33342 et rincer une fois avec le DPBS et laver quatre fois avec le DPBS pendant 5 minutes par lavage.
  6. Visualisez les cellules sur des microscopes à fluorescence pour rechercher l’expression et la localisation des fabricants de cellules.

8. Mesure et analyse TEER

REMARQUE : Les plaques filtrées Corning 12-Transwell sont équipées de filtres composés de membranes de téréphtalate de polyéthylènede 1,12 cm 2 et de 0,4 micromètre de pores. Les mesures TEER sont obtenues en répliques techniques (3 par puits) et biologiques (3 puits par lignée cellulaire et/ou état).

  1. 24 heures après la sous-culture (jour 7), mesurer TEER à l’aide d’électrodes baguettes et d’un voltohmmètre toutes les 24 heures. Se référer au manuel d’utilisation voltohmmeter pour des instructions spécifiques sur l’obtention de mesures.
    1. Pour mesurer TEER, chargez l’instrument voltohmmètre la veille. Essuyez légèrement les électrodes de l’instrument et de la baguette avec 70 % d’éthanol avant de les placer dans le capot de sécurité.
    2. Allumez la puissance et calibrez le compteur ohm tel que recommandé par le fabricant.
    3. Branchez les électrodes de baguette et rincez les électrodes avec 70% d’éthanol suivi de DPBS.
    4. Placez l’électrode d’extrémité plus courte dans l’insert trans-puits (la chambre apical) et l’extrémité plus longue dans la chambre basolateral.
    5. Mesurez d’abord un puits vierge qui est recouvert de COL4/FN seulement. Ensuite, mesurez les autres puits.
    6. Rincer rapidement les électrodes à baguette avec 70 % d’éthanol, suivies du DPBS pour mesurer différentes conditions (c.-à-d. mesurer différentes lignées cellulaires).
  2. Après que toutes les mesures (en Ω) ont été enregistrées, rincez les électrodes de baguette avec 70% d’éthanol, puis l’eau stérile. Essuyer délicatement l’électrode et la laisser sécher à l’air dans le capot de sécurité.
  3. Faire la moyenne des valeurs TEER triplicate (en Ω) du puits vierge et soustraire cette valeur moyenne de chaque valeur TEER brute par condition.
    1. Faire la moyenne des valeurs soustraites et les multiplier par 1,12 cm2 (la surface de l’insert de 12 transwells).
    2. Utilisez des valeurs transformées à partir de l’étape 6 pour générer le graphique montrant la valeur TEER et les erreurs standard pour chaque jour de mesure TEER.

9. Activité et analyse du transporteur Efflux

REMARQUE : L’essai d’activité du transporteur Efflux est effectué sur une plaque à fond plat de 24 puits. Les transporteurs Efflux d’intérêt comprennent ABCB1 et ABCC1. Il est recommandé que chaque condition soit exécutée en triplicate avec des puits de contrôle (c.-à-d. puits blancs sans les inhibiteurs respectifs).

  1. Après 48 heures de sous-culture (jour 8), incuber des cellules avec 10 μM Valspodar (inhibiteur ABCB1) ou 10 μM MK571 (inhibiteur d’ABCC1) pendant 1 heure à 37 °C.
    1. Préparer 10 mM de stock valspodar en dissolvant 5 mg de poudre (1214,64 g/mol) dans 412 μL de DMSO et diluer à la concentration de travail de 10 μM. Par exemple, pour faire 10 mL de hESFM avec 10 μM Valspodar, mélanger 10 μL de 10 mM de stock Valspodar avec 10 mL de hESFM.
    2. Préparer 10 mM de bouillon MK571 en dissolvant 5 mg de poudre (537,07 g/mol) en 931 μL et diluer à une concentration de travail de 10 μM. Par exemple, pour faire 10 mL de hESFM avec 10 μM MK571, mélanger 10 μL de 10 mM MK571 avec 10 mL de hESFM.
  2. Après 1 heure, incuber des cellules avec 10 μM rhodamine 123 (substrat ABCB1) ou 10 μM 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine diacétate (H2DCFDA, substrat ABCC1) avec ou sans leurs inhibiteurs respectifs pendant 1 heure à 37 °C.
    1. Préparer 10 mM de rhodamine 123 en dissolvant 10 mg de poudre (380,82 g/mol) dans 875 μL de DMSO et diluer à la concentration de travail de 10 μM. Par exemple, pour faire 10 mL de hESFM avec 10 μM rhodamine 123, mélanger 10 μL de 10 mM de rhodamine 123 avec 10 mL de hESFM.
    2. Préparer 10 mM H2DCFDA en dissolvant 50 mg de poudre (487,29 g/mol) dans 10,26 mL de DMSO et diluer à la concentration de travail de 10 μM. Par exemple, pour faire 10 mL de hESFM avec 10 μM rhodamine 123, mélanger 10 μL de 10 mM de rhodamine 123 avec 10 mL de hESFM.
  3. Laver les cellules deux fois avec 0,5 mL de DPBS et de lyse à l’aide de DPBS contenant 5% de Triton-X (v/v).
  4. Mesurer la fluorescence des cellules lysées à l’aide d’un lecteur multiplaque ou microplaqué (voir la liste des matériaux).
    1. Réglez l’instrument de lecteur de plaque fluorescente à l’excitation de nanomètre de 485 et à l’émission de 530 nanomètres et mesurez la fluorescence à ces longueurs d’onde.
    2. Pour les puits non utilisés dans l’analyse du transporteur, laver les cellules deux fois avec DPBS avant de les fixer avec 4% de PFA pour la quantification des noyaux cellulaires.
  5. Incuber les cellules avec hoechst 33342 trihydrochlorure trihydrate dilué (1:1000) dans DPBS pendant 10 minutes. Imagez plusieurs champs visuels dans chaque puits pour calculer le nombre moyen de noyaux cellulaires à l’aide de microscopes à fluorescence.
  6. Comptez les noyaux à l’aide des Fidji et normalisez les valeurs de fluorescence sur une base par cellule à ces comptes.
    1. Calculer l’accumulation moyenne de fluorescence en soustrayant la valeur brute d’accumulation de fluorescence pour chaque condition de sa valeur vierge respective.
    2. Valeurs soustraites moyennes pour chaque condition.
    3. Divisez les valeurs moyennes de l’étape 9.6.1 par le nombre moyen de cellules. Utilisez ces valeurs pour normaliser les valeurs de fluorescence par cellule.
    4. Utilisez des valeurs normalisées pour générer une représentation graphique de chaque condition inhibitrice et effectuer toute analyse statistique nécessaire.

10. Passaging, Expanding, and Cryopreserving BMECs

  1. Reconstituer les cultures BMEC jour 8 avec hESFM frais complété par dilué (1:200) B27 et permettre aux cellules de se développer pendant deux jours de plus sur la matrice COL4 /FN.
  2. Enrober une nouvelle plaque filtrée 12 Transwell et une plaque à fond plat de 24 puits avec 400 μg/mL COL4 et 100 μg/mL FN et incuber pendant 4 heures.
  3. Le jour 10, laver les cellules avec du DPBS et incuber avec 1 mL d’EDTA enzymatique pendant au moins 15 minutes à 37 °C jusqu’à ce qu’une seule suspension cellulaire soit obtenue.
  4. Recueillir les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
    1. Pour cryopréserver ces cellules, résuspendez les granulés cellulaires avec du hESFM frais avec 30 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 10 % de DMSO.
    2. Conservez les BMECs dérivés de l’iPSC dans des flacons cryopréservés dans un contenant d’isopropanol pendant les 24 premières heures à -80 °C, puis placez-les dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme à -160 °C.
    3. Pour passer ces cellules, resuspendez les granulés cellulaires avec hESFM frais complété par dilué (1:200) B27.
  5. Cellules de graines sur des plaques enrobées préparées à l’étape 10.2. Cellules de graines utilisant un rapport de 1 puits d’une plaque de 6 puits à 3 puits d’une plaque filtrée de 12 transwell et à 6 puits d’une plaque de 24 puits. Permettre aux cellules de croître et de se développer pendant 24 heures.
  6. Le jour 11, mesurez TEER en suivant les étapes énumérées à l’étape 8.
  7. Le jour 12, effectuez ICC en suivant les étapes énumérées à l’étape 9.
  8. Pour décongeler les BMEC cryopréservés, placez les flacons cryopréservés dans un bain d’eau chaude ou de perles à 37oC. Transférer ensuite les BMECs décongelés à 5 mL de hESFM complétés par du B27 dilué (1:200).
    1. Recueillir les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Resuspendez les cellules en hESFM complétées par dilué (1:200) B27, 10 μM RA et 10 μM Y-27632.
    2. Après 24 heures, passer moyen à hESFM complété par dilué (1:200) B27 et 10 μM Y-27632 sans RA.

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Representative Results

Différenciation BMEC
Quelques étapes critiques de ce protocole doivent être suivies avec précision (Figure 1). E6 utilisation moyenne le jour 1 est important, car il est souvent utilisé pour dériver la lignée neuroectoderm des iPSC dans un délai relativement court donnant des résultats reproductibles à travers plusieurs lignéescellulaires 36. Une autre étape importante est le jour 4 de la différenciation, où e6 moyen devrait être commuté à hESFM avec dilué (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF et 10 μM RA pour étendre iPSC dérivés BMECs. L’ajout du supplément de B27 est employé comme alternative au sérum bovin pour soutenir la culture cellulaire sérique-libre1,bFGF est ajouté pour faciliter la croissance des BMECs 6 iPSC-dérivés, et RA est employé pour faciliter le développement du phénotype35 deBBB. La dernière étape importante concerne l’étape de purification, où les BMC dérivés de l’iPSC du jour 6 sont sous-cultivés sur une plaque enduite COL4/FN pour sélectionner les BMECs dérivés de l’iPSC1,6,35,36. La figure 2 démontre la transition morphologique des IPSC vers les CPE. Après une journée de milieu E6 (jour 1), la morphologie cellulaire est similaire à celle des iPSC. Au jour 4 de l’E6, les cellules commencent à apparaître visiblement distinctes des iPSC et couvrent la majeure partie du puits (~90% de confluence). Au jour 6, alors qu’il est cultivé en hESFM avec dilué (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF et 10 μM RA, la morphologie cellulaire commence à avoir une apparence allongée et pavée. Au jour 8, chaque cellule individuelle est distincte dans un grand modèle pavé. Un essai de germination a été exécuté pour démontrer le potentiel angiogenic des BMECs iPSC-dérivés, qui ont eu comme conséquence des structures tube-comme après 3 jours de traitement de VEGFA165 (figure 3).

Figure 1
Figure 1 : Aperçu de la différenciation des IPSC humains en CPE. Les iPSCs humains ont d’abord été cultivés dans un milieu de cellules souches contenant 10 μM Y-27632 pendant 24 heures avant de passer de moyen à E6 pendant 4 jours. Le jour 4, le milieu a été changé en hESFM avec (1:200) supplément de B27, 20 ng/mL bFGF, et 10 RA de μM pendant 2 jours. Le jour 6, les cellules ont été sous-cultivés sur des plaques enduites COL4/FN. Le jour 7, le milieu a été changé en hESFM avec le supplément de B27 sans bFGF et RA et TEER a été mesuré. Le jour 8, des analyses d’activité d’activité d’ICC et de transporteur d’efflux ont été exécutées. Les BMECs dérivés de l’iPSC ont été élargis jusqu’au jour 10 avant d’être transmis à une plaque de puits trans ou à une plaque inférieure plate de 24 puits pour la mesure TEER et l’analyse ICC, respectivement. Jour 8 BMECs ont été utilisés pour l’analyse de germination (non représenté). 2 puits d’une plaque de 6 puits de BMECs dérivés de l’iPSC ont été collectés et stockés dans hESFM avec 10% DMSO et 30% FBS à -80 °C, puis dans de l’azote liquide pour le stockage à long terme à -160oC. Le jour 12, un pic de valeur TEER a été observé dans les BMECs dérivés de l’iPSC élargis, à partir duquel l’ICC a été effectué. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Images à champ lumineux représentant la différenciation des iPSC en BMECs. Après une journée de culture dans le milieu E6, les iPSC conservent leur morphologie caractéristique. Le jour 4 dans le milieu E6, la morphologie cellulaire semble nettement différente des iPSC. Le jour 6, la morphologie cellulaire change à une apparence allongée et pavée. Au jour 8, les cellules semblent grandes et avec un motif pavé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Potentiel angiogénique des CME dérivés de l’iPSC. Les BMECs purifiés dérivés de l’iPSC ont été ensemencés à 100 000 cellules/cm2 sur la matrice membranaire du sous-sol dans hESFM avec (1:200) supplément B27 et 40ng/mL VEGFA165. Des structures en forme de tube sont apparues après 3 jours de traitement VEGFA165. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les BMECs purifiés dérivés de l’iPSC ont été ensemencés à 100 000 cellules/cm2 sur la matrice membranaire du sous-sol dans hESFM avec (1:200) supplément B27 et 40ng/mL VEGFA165. Des structures en forme de tube sont apparues après 3 jours de traitement VEGFA165.

La caractérisation de BMEC a été exécutée utilisant l’immunocytochimie pour des marqueurs cellule-spécifiques. Des BMECs iPSC-dérivés ont été évalués pour la présence des protéines serrées de jonction (OCLN, TJP1, et CLDN5), qui sont généralement exprimées dans les jonctions serrées des cellules endothélialesde cerveau 3 et des cellules endothéliales dans le poumon, le foie, et le rein18. D’autres marqueurs tels que PECAM1 et SLC2A1, ont déjà été utilisés comme marqueurs pour les BMECs purifiés6. PECAM13 et SLC2A4 sont tous deux exprimés dans les cellules endothéliales vasculaires du BBB. Les BMEC dérivés de l’iPSC générés à l’aide de ce protocole ont co-exprimé ces cinq marqueurs (figure 4).

Figure 4
Figure 4 : Analyse des marqueurs des CME dérivés de l’iPSC. Les BMECs humains dérivés de l’iPSC ont été tachés pour la jonction serrée (OCLN, TJP1, CLDN5), le transporteur d’afflux (SLC2A1), et les protéines de jonction d’adhérents (PECAM1). Les protéines OCLN, TJP1 et CLDN5 sont principalement localisées dans la membrane cellulaire. SLC2A1 et PECAM1 sont localisés à la fois dans les noyaux et la membrane cellulaire. Hoechst 33342 trihydrochlorure trihydrochlorate a été utilisé pour la coloration nucléaire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Pour caractériser la fonction BBB des BMECs, TEER a été mesuré 24 heures (jour 7) après sous-culture et le milieu a été changé en hESFM avec dilué (1:200) B27 sans bFGF et RA. Les mesures TEER ont été obtenues à partir du jour 7 de différenciation (jour 0 de la mesure TEER) et ont culminé à ~2000 Ω x cm2 le jour 8 ou 48 heures après la sous-culture des BMEC (figure 5). Ces valeurs TEER se trouvent dans la fourchette décrite pour les BMEC co-cultivés dérivés de l’iPSC avec les astrocytes primaires de rat37. La ligne iPSC n’avait aucune fonction BBB discernable en fonction de leurs faibles valeurs TEER.

Figure 5
Figure 5 : Mesures TEER dans les CME dérivés de l’iPSC. Les valeurs TEER ont atteint un sommet après une journée de sous-culture sur la matrice COL4/FN (le jour 8 de la différenciation). Les mesures TEER ont été obtenues en techniques (3 mesures par puits) et biologiques (3 puits par lignée cellulaire). La valeur moyenne technique d’un puits vierge a été soustrayée des valeurs TEER brutes. Ces valeurs ont été moyennes pour chaque jour et multipliées par 1,12 cm2 (surface de l’insert de 12 transwell). Les barres d’erreur représentent l’erreur standard. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Pour évaluer l’activité du transporteur d’efflux ABCB1 et ABCC1, la quantité de substrat fluorescent prise pour ABCB1 et ABCC1 a été quantifiée après incubation avec leurs inhibiteurs respectifs. Comme prévu, l’inhibition des transporteurs d’efflux ABCB1 et ABCC1 avec PSC833 (inhibiteur d’ABCB1) ou MK-571 (inhibiteur d’ABCC1) a mené à une augmentation du diacétate de rhodamine 123 (R123) ou de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (H2DCFDA), respectivement(figure 6). Ces preuves suggèrent que les BMEC dérivés utilisant ce protocole ont l’activité de transporteur d’efflux.

Figure 6
Figure 6 : Activité du transporteur Efflux dans les CME dérivés de l’iPSC. L’activité de transporteur d’Efflux dans les BMEC a été déterminée en quantifiant l’accumulation de rhodamine 123 (R123) ou de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine détate (H2DCFDA) en présence ou en l’absence d’inhibiteur psc833 (ATP binding cassette sous-famille B membre 1 (ABCB1) ou MK-571 (ATP binding cassette sous-famille C membre 1 (ABCC1) inhibiteur). Des triplicates techniques ont été effectués pour chaque condition (N=1). Les valeurs de fluorescence de l’état de contrôle (c.-à-d. sans inhibiteurs) ont été déduites des valeurs brutes de fluorescence. Ces accumulations de fluorescence ont été normalisées par cellule pour chaque répétition technique. La signification statistique a été déterminée à l’aide du test t de l’élève à partir des trois répliques techniques. Aucune signification statistique n’a été observée entre l’accumulation de R123 avec et sans inhibiteur abcb1 (t-stat= -1,66, p=0,11). La signification statistique a été observée entre l’accumulation de H2DCFDA avec et sans inhibiteur d’ABCC1 (t-stat=-7.23, p=0.04). *p<0,05. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Passage, expansion et cryopréservation de BMECs dérivés de l’iPSC
Un autre objectif était d’examiner si les BMEC dérivés de l’iPSC pouvaient être adoptés et cryopréservés après la sous-culture. À cette fin, les BMEC dérivés de l’iPSC du jour 7 ont été autorisés à se développer jusqu’au jour 10 avant de les transmettre sur des plaques filtrées COL4/FN 12-transwell nouvellement enduites pour la mesure TEER et une plaque à fond plat de 24 puits pour l’analyse icc (figure 7). À l’aide de cette condition, les BMC dérivés de l’iPSC ont continué de proliférer, ont maintenu l’expression d’OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 et PECAM1 (figure 8) et ont continué de maintenir des valeurs TEER appropriées (maximum à~2000 Ω x cm2)après le passage (figure 9). Les CME cryopréservés ont ensuite été décongelés, élargis, puis adoptés (figure 7). Les mesures TEER des BMEC ont été obtenues 24 heures après le dégel et plusieurs jours de plus par la suite. Les mesures TEER de ces BMEC post-décongelés ont été réduites (avec un maximum de seulement 800 Ω x cm2)par rapport aux BMEC fraîchement dérivés. Un deuxième passage de BMECs post décongelés présentait des valeurs TEER encore plus faibles (avec un pic à seulement 200-300 Ω x cm2)(figure 9) et montrait des motifs effilochés et/ou taches de rousseur de la formation de jonction serrée (figure 10). L’analyse destaches occidentales 48 a révélé que les IPSC exprimaient principalement un marqueur endodermique (SOX17)49 et quelques marqueurs de jonction serrés (OCLN), mais pas d’autres marqueurs liés au BMEC (TJP1, CLDN5 et SLC2A1) (figure 11). Les BMEC ont principalement exprimé des marqueurs liés à l’endothélial (TJP1, CLDN5, OCLN et SLC2A1), avec de faibles niveaux du marqueur endodermal, SOX17.

Figure 7
Figure 7 : Images en champ lumineux de BMECs dérivés de l’iPSC élargis et cryopréservés. A) Les cellules du jour 10 (4 jours après la sous-culture initiale) ont atteint la confluence maximale. B) Jour 11, 24 heures après le passage sur col4/FN recouvert de plaque de 24 puits. C) Jour12, 48 heures après le passage sur la plaque de 24 puits enduite COL4/FN; les valeurs maximales du TEER ont été observées et l’ICC a été effectué. D) 48 heures de BMECs dérivés de l’iPSC après la décongélation sur une plaque de 6 puits recouverte de COL4/FN; les cellules ont été précédemment cryopréservées à 1.2 x 102 cellules/mL. E) 24 heures après le passage des BMC dérivés de l’iPSC après le dégel sur la plaque de 6 puits recouverte de COL4/FN. F) 48 heures après le passage des BMC dérivés de l’iPSC après le dégel. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : ICC des CME dérivés de l’iPSC après passage. Les BMEC ont été adoptés et maintenus sur la matrice COL4/FN jusqu’au jour 12, lorsque les valeurs teer ont atteint un sommet. Les BMEC le jour 12 ont été tachés pour la jonction serrée (OCLN, TJP1, CLDN5), le transporteur d’afflux (SLC2A1) et les protéines de jonction d’adhérents (PECAM1). Le modèle d’expression et la localisation ressemblent à ceux observés dans des conditions où le passage n’a pas été effectué, comme le montre la figure 4. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : Comparaison des mesures TEER dans les IPSC, les BMEC non passages, les BMEC passages, les BMECs cryopréservés et les CME cryopréservés et passages. Le jour 1, les valeurs TEER ont atteint un sommet pour les BMEC non passages et passages, mais pas les IPSC ou les BMEC cryopréservés. Les BMEC cryopréservés avaient des valeurs TEER modérées entre le jour 3 et le 7, avec des valeurs TEER encore plus faibles pour les BMEC cryopréservés et adoptés. les iPSC n’ont pas démontré de valeurs TEER mesurables entre le jour 0 et le 9. Des mesures TEER ont été obtenues en techniques (3 mesures par puits) et biologiques (3 par lignée cellulaire). La valeur moyenne technique d’un puits vierge a été soustrayée des valeurs TEER brutes. Ces valeurs ont été moyennes pour chaque jour et multipliées par 1,12 cm2 (surface de l’insert de 12 transwell). Les barres d’erreur représentent l’erreur standard. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 10
Figure 10 : ICC des CME cryopréservés et adoptés. Les BMEC ont été adoptés et maintenus sur COL4/FN jusqu’à ce que les valeurs maximales du TEER soient observées. Les BMEC ont été tachés pour la jonction serrée (OCLN, TJP1, CLDN5), le transporteur d’afflux (SLC2A1) et les protéines de jonction d’adhérents (PECAM1). Le modèle d’expression des marqueurs de jonction serrés semblait effiloché et/ou tache de rousseur par rapport aux CME non passages (figure 4) et aux CMES en passage (figure 8). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 11
Figure 11 : Analyse des taches occidentales d’iPSC, de CMES non transmis, de BMEC adoptés et de CME cryopréservés et adoptés. Taches occidentales montrant des niveaux de TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5, et le contrôle de chargement (GAPDH). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Modifications et dépannage

Dans ce protocole, nous avons apporté quelques modifications à l’utilisation d’une matrice extracellulaire couramment utilisée et de médias de culture cellulaire pendant la culture iPSC pour la dérivation des BMECs (Figure 1). Ces changements n’ont pas eu d’impact sur la capacité de tirer BMECS des iPSCs humains tels que décrits dans le protocole Lippmann1. Une lignée iPSC d’un donneur en bonne santé différente a été utilisée pour démontrer que ce protocole modifié montre des résultats comparables aux études précédentes avec d’autreslignes 1. Pour la cryopréservation, le supplément de B27 a été employé au lieu du sérum plasma-dérivé pauvre de plaquette de 1% (PDS)40,mais ceci a affecté la fidélité de BMEC dans la culture suivante. En ce qui concerne le dépannage, les valeurs TEER peuvent fluctuer rapidement avant de se stabiliser. Cette fluctuation peut résulter de changements de température se produisant lorsque les plaques sont déplacées de 37 °C à température ambiante37. Pour surmonter ce problème, les mesures doivent être prises rapidement, efficacement et de façon cohérente. Si nécessaire, les effets de température peuvent être pris en compte en utilisant une formule mathématique fournie par Blume et coll. 200949 pour obtenir des valeurs TEER corrigées de la température.

Limites de ce protocole

Malgré l’obtention de BMECs avec un phénotype BBB robuste (c.-à-d. une valeur TEER élevée), l’entretien de cette propriété BBB pendant une longue période de temps continue d’être un défi majeur. Comme indiqué ici, les valeurs teer maximales (~2000 Ω x cm2)utilisant ce protocole étaient beaucoup plus faibles que les valeurs teer maximales précédemment signalées (~8000 Ω x cm2)1. Malgré cette observation, les valeurs TEER se sont tombées dans la fourchette habituelle (2000-8000 Ω x cm2) des valeurs précédemment déclarées1. Une deuxième limitation est la variabilité des valeurs teer de pointe qui résulte des différentes lignées iPSC utilisées, qui a été observée dans d’autres versions de ce protocole36. La variation entre les différentes lignées cellulaires peut être due au taux de croissance et d’expansion de chaque lignée iPSC, qui est affectée par des facteursenvironnementaux 51. Une autre limitation est liée à la cryopréservation, car notre protocole n’a pas maintenu la fidélité BMEC. Il est possible que 1% PDS40 offre une plus grande stabilité des BMECs pendant la cryopréservation.

Importance en ce qui concerne les méthodes existantes

Les BMECs dérivés de l’iPSC fournissent des cellules qui ont l’arrière-plan génétique d’individus spécifiques, ce qui est précieux dans l’utilisation de ces cellules pour l’étude de la biologie des maladies. Ce n’est pas le cas lors de l’utilisation de modèles animaux ou de cultures BMEC primaires extraites d’autresanimaux 37. En outre, les cultures primaires in vitro de BMEC montrent de faibles valeurs teer (~100 Ω x cm237),beaucoup plus faibles que celles réalisées avec les BMECs humains iPSC-dérivés avec le protocole décrit ici. Ce protocole modifié fournit une méthode détaillée pour l’obtention de BMECs humains auprès des IPSC, avec le potentiel de les étendre et de les maintenir pour une utilisation plus longue. La capacité de passer et de stocker des BMEC différenciés peut offrir polyvalence et flexibilité dans la conception expérimentale, en particulier lors de l’étude de plusieurs lignées cellulaires à la fois. Sur la base de ces résultats, les CME dérivés de l’iPSC peuvent être élargis et adoptés après l’étape initiale de sous-culture (figure 7, figure 8 et figure 9), mais la cryopréservation doit faire l’objet d’une enquête plus approfondie. Ce protocole peut également être utilisé conjointement avec d’autres modèles cellulaires à base de cellules souches pour développer des approches novatrices telles que la vascularisation des organoïdes cérébraux. Les méthodes actuelles pour générer des organoïdes cérébraux entraînent une reconstitution incomplète des types de cellules du cerveau humain car ils manquent de cellules endothéliales et d’éléments critiques de l’unité neurovasculaire qui composent le BBB52,53. Le protocole décrit ici peut fournir une approche tractable et reproductible à l’aide de systèmes transwell/co-culture bidimensionnels moins coûteux et plus faciles à implémenter que les modèles 3D.

Applications futures de ce protocole

Ce protocole peut être utilisé pour étudier le rôle de la neurovasculature et bbb dans les troubles neuropsychiatriques tels que la schizophrénie et le trouble bipolaire, où les déficits dans la neurovasculature ont été supposés jouer unrôle 9,10,20,54,55. Les versions précédentes dece protocole 36 avaient été employées pour dériver des BMECs des lignes d’iPSC des patients présentant la maladie de Huntington7 et les patients de syndrome de suppression de 22q présentant la schizophrénie43. Les deuxétudes 7,43 ont démontré l’utilisation réussie de cette méthode pour étudier la fonction paracellulaire et/ou transcellulaire liée au BBB. Certaines préoccupations ont été soulevées au sujet des effets confusionnels potentiels du sérum animal dans les protocoles antérieurs1. Le protocole sans sérum utilisé ici élimine cette préoccupation tout en produisant des résultats similaires aux protocoles antérieurs pour la dérivant des BMECs.

Étapes cruciales pour la différenciation et l’expansion des CME

Il y a quatre étapes cruciales dans la mise en œuvre de ce protocole. Premièrement, l’ensemencement d’iPSC à une densité optimale (c.-à-d. l’ensemencement à ~15 600 cellules/cm2)est important pour une différenciation efficace du BMEC. Si la densité cellulaire est trop élevée ou trop faible au jour 4 de la différenciation, les cultures peuvent afficher des taux plus élevés d’hétérogénéitécellulaire 56. Une deuxième étape importante est l’induction de la différenciation entre le jour 1 et le jour 4, où le milieu E6 est utilisé pour initier la différenciation. E6 est utilisé à la place du « milieu non conditionné » qui a été utilisé dans les protocoles antérieurs6,35. Non seulement e6 moyen réduire le temps de différenciation de 13 jours à 8 jours, mais il favorise également l’expression de protéines de jonction serrée (TJP1, OCLN, CLDN5) et marqueurs BMEC (PECAM1 et SLC2A1)36. L’utilisation du support E6 a également donné lieu à des valeurs TEER appropriées (figure 5) et abcb1 et ABCC1 efflux transporteur activité (Figure 6)6,35. Troisièmement, l’utilisation du B27 à la place du sérum bovin a permis un état sans sérum, ce qui a amélioré la cohérence et la fiabilité de la différenciation BMEC1. Enfin, en ce qui concerne l’expansion des BMECs dérivés de l’iPSC, les cellules doivent être déplacées lorsqu’elles atteignent une confluence d’environ 100 %. Sur la base de ce protocole, les CME dérivés de l’iPSC peuvent être élargis et adoptés après l’étape initiale de sous-culture (figure 7, figure 8 et figure 9).

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été appuyés par un Prix national de recherche biocomportemental de l’Institut national de santé mentale pour les nouveaux scientifiques innovateurs (BRAINS) Prix R01MH113858 (à R.K.), un National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). un National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (à R.K.), une subvention de la Sydney R Baer Jr Foundation Grant (à P.L.) le Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (à R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (à R.K.), le Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (à R.K.), le Harvard Stem Cell Institute (à R.K.) et par Steve Willis et Elissa Freud (à R.K.). Nous remercions la Dre Annie Kathuria pour sa lecture critique et ses commentaires sur le manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neurosciences Numéro 165 Cellules souches pluripotentes induites par l’homme cellules endothéliales microvasculaires cérébrales barrière céphalo-cérébrale résistance électrique trans-endothéliale activité transporteur microvasculaire schizophrénie trouble bipolaire passage expansion cryopréservation
Dérivation, expansion, cryopréservation et caractérisation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme
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Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

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