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Neuroscience

Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

Este protocolo detalla un método adaptado para derivar, expandir y criopreservar las células endoteliales microvasculares cerebrales obtenidas diferenciando las células madre pluripotentes inducidas por humanos, y para estudiar las propiedades de la barrera hematoencefálica en un modelo ex vivo.

Abstract

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) para desarrollar modelos celulares ex vivo para estudiar la función de barrera hematoencefálica (BBB). Este protocolo modificado proporciona pasos detallados para derivar, expandir y criopreservar BMECs de iPSCs humanos utilizando un donante y reactivos diferentes a los notificados en protocolos anteriores. Los iPSC se tratan con esencial 6 medios durante 4 días, seguido de 2 días de cultivo endotelial humano libre de suero medio complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico, ácido retinoico, y suplemento B27. En el día 6, las células se sub-cultivan en una matriz de colágeno / fibronectina durante 2 días. La inmunocitoquímica se realiza en el día 8 para el análisis de marcadores BMEC utilizando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 y SLC2A1. La hinchazón occidental se realiza para confirmar la expresión del marcador BMEC y la ausencia de SOX17, un marcador endodérmico. El potencial angiogénico se demuestra con un ensayo que brota. La resistencia eléctrica transdotelial (TEER) se mide utilizando electrodos de palillo y voltohmómetro a partir del día 7. La actividad del transportador Efflux para la subfamilia de casete de enlace ATP miembro B 1 y miembro C del cassette de unión ATP se mide utilizando un lector multiplaque en el día 8. La derivación exitosa de BMECs se confirma mediante la presencia de marcadores celulares relevantes, bajos niveles de SOX17, potencial angiogénico, actividad transportadora y valores TEER ~2000 Ω x cm2. Los BMECs se expanden hasta el día 10 antes de pasar a placas de colágeno/fibronectina recién recubiertas o criopreservadas. Este protocolo demuestra que los BMECs derivados de iPSC se pueden ampliar y pasar al menos una vez. Sin embargo, se observaron valores TEER más bajos y una localización más pobre de los marcadores BMEC después de la criopreservación. BMECs se puede utilizar en experimentos de co-cultivo con otros tipos de células (neuronas, glia, pericitos), en modelos cerebrales tridimensionales (organ-chip e hidrogel), para la vascularización de organoides cerebrales, y para el estudio de la disfunción BBB en trastornos neuropsiquiátricos.

Introduction

Función de barrera hematoencefálica
La barrera hematoencefálica (BBB) forma un límite que limita el movimiento de sustancias desde la sangre hasta el cerebro. El BBB se compone de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) que forman una monocapa que recubre la vasculatura. Los BMECs, junto con astrocitos, neuronas, pericitos, microglia y matriz extracelular, forman la unidad neurovascular. Los BMECs tienen una estructura paracelular estrictamente regulada que permite al BBB mantener una alta resistencia eléctrica transdotelial (TEER), que limita la difusión pasiva y sirve como indicador de la integridad de la barrera1,2. Los BMECs también tienen proteínas que ayudan con el movimiento transcelular como la endocitosis, la transcitosis y la transmigración, así como la extravasación de leucocitos durante una respuesta inmune3. Los BMECs dependen de la afluencia y los transportadores de eflujo para la alimentación y eliminación de productos de desecho, con el fin de mantener un equilibrio homeostatico en el cerebro3. Por ejemplo, solute carrier family 2 member 1 (SLC2A1) es un transportador de afluencia responsable del movimiento de glucosa a través del BBB4, mientras que los transportadores de efflux como el miembro B de casete de encuadernación ATP 1 (ABCB1) y el miembro C de la subfamilia de casete de unión ATP 1 (ABCC1) son responsables de devolver los sustratos de vuelta al torrente sanguíneo3,5,6,7. Los sustratos ABCB1 incluyen morfina, verapamil4,y antipsicóticos como olanzapina y risperidona8,mientras que el transportador ABCC1 tiene una variedad de sustratos incluyendo conjugados de sulfato, vincristina, y glucuronida conjuga4.

Aplicación de modelos BBB en trastornos psiquiátricos
La disfunción del BBB se ha implicado en una serie de trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluyendo esquizofrenia y trastorno bipolar9,10. Recientemente, los modelos celulares ex vivo derivados de iPSC están siendo utilizados para interrogar los fundamentos celulares y moleculares de los trastornos psiquiátricos, pero estos modelos actualmente no tienen en cuenta el papel potencial desempeñado por la neurovasculatura11,12,13. Se presume que las citoquinas inflamatorias periféricas que circulan en la sangre pueden afectar negativamente al BBB14,15,16,17,pero también hay evidencia para paracelular18,19,20,21,22, transcelular23,24,25,26,27,28,29, y matriz extracelular20,29,30,31,32 anomalías que contribuyen a la disfunción BBB. La interrupción del BBB puede resultar en el contenido de la sangre que entra en el parénquima cerebral y la activación de astrocitos y/o microglia para liberar citoquinas proinflamatorias, que a su vez inician una respuesta inflamatoria33 que puede tener efectos perjudiciales en el cerebro34. Los BMECs son el componente principal del BBB y examinar la estructura y la función de estas células puede mejorar la comprensión de la disfunción del BBB en trastornos neurológicos y psiquiátricos.

Modelos ALTERNATIVOS BMEC
Antes del desarrollo de protocolos eficientes para derivar BMECs de iPSCs1,6,35,36,los investigadores habían empleado BMECsinmortalizados 37 para estudiar la función BBB. Sin embargo, muchos de estos modelos no lograron fenotipos BBB deseables, tal rango fisiológico de valores TEER38,39. La utilización de iPSCs tiene la ventaja de conservar el fondo genético del individuo del que se derivan las células. Los científicos están trabajando activamente en el establecimiento de modelos de microambientes ex vivo derivados de iPSC que recapitulan la estructura y la función del cerebro humano. Los investigadores han desarrollado métodos para derivar BMECs que son estructural y fisiológicamente similares a los BMECs encontrados in vivo. Los métodos para obtener poblaciones purificadas de BMECs derivados de iPSC requieren una serie de pasos diferentes con protocolos optimizados en los últimos años1,6,35,36. Generalmente, los BMECs derivados de iPSC se cultivan en el medio esencial 6 (E6) durante 4 días, seguido de 2 días en el medio libre de suero endotelial humano (hESFM) complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico (bFGF), ácido retinoico (RA), y suplemento B27. A continuación, las células se cultivan en una matriz de colágeno IV (COL4) y fibronectina (FN) para obtener >90% BMECs homogéneos1.

La identidad de los BMECs se confirma mediante la inmunofluorescencia que muestra la coexpresión de las proteínas BMEC, incluida la molécula de adhesión de células plaquetarias-endoteliales-1 (PECAM1), SLC2A1 y proteínas de unión estrechas como la proteína de unión estrecha 1 (TJP1), la ocludina (OCLN) y claudin-5 (CLDN5)6. Los ensayos de brotes se han utilizado para confirmar el potencial angiogénico de los BMECs derivados de iPSC. 6 La integridad BBB de los BMECs se evalúa mediante la presencia de valores FIsiológicos in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 y actividad medible para transportadores de eflujo como ABCB1 y ABCC11,6,36. Los recientes avances metodológicos del grupo Lippmann han dado lugar a protocolos BMEC derivados de iPSC con menor variabilidad experimental y reproducibilidad mejorada1. Sin embargo, no se sabe si se pueden ampliar y pasar más allá de la etapa de sub-culto. Nuestro protocolo modificado tiene como objetivo abordar este problema pasando los BMECs derivados de iPSC más allá del día 8 y evaluando si se pueden ampliar aún más para conservar las propiedades de BBB después de la criopreservación. Aunque ningún estudio ha descrito la transferencia de BMECs derivados de iPSC, existe un protocolo para la criopreservación BMEC que retiene las propiedades fisiológicas de BBB después de someterse a un ciclo de congelación-deshielo40. Sin embargo, no se sabe después de la criopreservación BMECs se puede pasar y retener propiedades BBB.

Los BMECs derivados de iPSC utilizando el protocolo Lippmann se han utilizado para modelar la interrupción del BBB en trastornos neurológicos como la enfermedad de Huntington7. Estos BMECs derivados de iPSC también se han utilizado para investigar los efectos de la infección bacteriana como Neisseria meningitidis o Streptococcus del Grupo B en la interrupción de la barrera de la FSC en sangre y BBB respectivamente41,42. Además, utilizando BMECs derivados del iPSC de pacientes con síndrome de eliminación de 22q con esquizofrenia, los investigadores observaron un aumento de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), una molécula de adherencia importante en BMECs que ayudan con el reclutamiento y la extravasación de leucocitos en el cerebro43. En conjunto, estos estudios demuestran la utilidad de los BMECs derivados de iPSC para estudiar la interrupción del BBB en trastornos neuropsiquiátricos complejos.

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Protocol

Los iPSC humanos fueron reprogramados de los fibroblastos de donantes sanos utilizando un protocolo aprobado por las Juntas de Revisión Institucional del Hospital General de Massachusetts y el Hospital McLean, y caracterizados como descritos en estudios anteriores44,45,46.

NOTA: Brevemente, los fibroblastos fueron reprogramados a iPSC a través de la reprogramación genética basada en ARNM47. Los iPSC se mantuvieron en el medio de células madre (SCM) (ver lista de materiales) y se almacenaron a una densidad de ~1.2 x 102 células/ml con 1 ml de SCM, 10 μM con inhibidor de la proteína quinasa asociada a rho (ROCKi) Y-27632, y 10% (v/v) sulfuro de dimetil (DMSO), en viales criopreservados en nitrógeno líquido a -160 °C. Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un gabinete de bioseguridad a menos que se indique lo contrario.

1. Dilución de la matriz de membrana del sótano y recubrimiento de placas

  1. El factor de crecimiento diluido (1:50) redujo la matriz de membrana del sótano purificada a partir del tumor en engelbreth-Holm-Swarm en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco sin fenol rojo.
  2. Cubra las placas de cultivo celular con la cantidad adecuada de matriz de membrana del sótano diluida (es decir, placa de 6 pozos = 1 ml, placa de 12 pozos = 0,5 ml) e incuba estas placas a 37 °C durante al menos 1 hora.

2. Mantenimiento de iPSC

NOTA: La confluencia máxima por pozo en una placa de fondo plano de 6 pozos es ~1.2 x 106 celdas.

  1. Descongelar iPSCs criopreservados en SCM con 10 μM Y-27632 y placa en una placa de 6 pozos recubierta con factor de crecimiento diluido reducido matriz de membrana del sótano.
  2. Mantenga los iPSCs en SCM con 10 μM Y-27632 durante las primeras 24 horas después del deshielo. Cambie a un medio fresco después de 24 horas.
  3. Mantenga los iPSCs en SCM hasta que las células alcancen el 80-90% de la confluencia antes de pasar.
    1. Calcule cuántos iPSC serán necesarios para la diferenciación multiplicando la densidad deseada para la diferenciación (15.600 celdas/cm2)por el área superficial del pozo. Para una placa de fondo plano de 6 pozos, multiplique 15.600 celdas/cm2 por 9,6 cm2 para un total de 149.760 celdas/pozo.
  4. Para pasar, lave las células con la Solución de Sal Equilibrada (HBBS) de Hanks. A continuación, incubar las células con ácido etilenodiaminetetraacetic no enzimático (EDTA) (ver lista de materiales) durante 5 minutos a 37 °C.
    1. Utilice un rascador de células para levantar suavemente las células. Recoger celdas en SCM fresco.
    2. Placas de las células sobre placas de cultivo celular recubiertas con SCM diluidas y mantener las células como se describe en el paso 2.3 o almacenarlas a ~1.2 x 106 células/ml en 1 ml de SCM, 10 μM Y-27632, y 10% DMSO (v/v) en viales criopreservados en nitrógeno líquido a una temperatura de -160 °C.

3. Diferenciación de iPSC a BMECs

NOTA: EDTA no enzimática separa las células en grupos. EDTA enzimática (ver Tabla de Materiales)separa las células en suspensión de una sola célula. El ácido retinoico (AR) debe protegerse de la luz.

  1. Lave iPSCs una vez con la solución salina del tampón de fosfato (DPBS) de Dulbecco. Incubar con EDTA enzimática (1 ml para placa de 6 pozos, 0,5 ml para placa de 12 pozos y 0,25 ml para placa de 24 pozos) durante aproximadamente 5 minutos a 37 °C para producir una sola suspensión celular.
  2. Recoge células y centrífugas a 300 x g (fuerza centrífuga relativa) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Pellets de células resuspend en SCM que contienen 10 μM Y-27632.
  3. Determine la densidad celular mediante trypan blue y contador de celdas automatizado o un dispositivo hemocítómetro. Células de placa a una densidad de 15.600 células/cm2 o 149.760 células/pozo de una placa plana de 6 pozos (con una superficie de 9,6 cm2/pozo) en SCM que contiene 10 μM Y-27632 durante 24 horas.
  4. Inicie la diferenciación después de 24 horas cambiando SCM a medio E6. Cambie el medio E6 diariamente durante los próximos 4 días.
  5. En el día 4 de diferenciación, reemplace el medio E6 por hESFM complementado con suplemento diluido (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF y 10 μM RA. No cambie este medio durante las próximas 48 horas.
  6. Preparar 200 ml de hESFM con diluido (1:200) B27, mezclar 1 ml de suplemento B27 concentrado de 50x a 199 ml de hESFM.
  7. Preparar 20 ng/mL de bFGF reconstituyendo 50 μg de bFGF en 250 μL de tampón Tris (Tris de 5 mM, pH 7.6, 150 mM NaCl) para hacer 200 μg/mL solución de stock. Preparar 200 ml de hESFM que contenga 20 ng/mL bFGF mezclando 20 μL de 200 μg/mL bFGF con 200 ml de hESFM.
  8. Preparar 10 μM RA haciendo primero una solución de 40 mg/ml de caldo ra añadiendo 2,5 ml de DMSO a 100 mg de polvo de AR. Diluir esta concentración a 3 mg/ml para hacer solución de stock de 10 mM. Preparar 200 ml de hESFM que contenga 10 μM RA mezclando 200 μL de 10μM RA en 200 mL hESFM.

4. Recubrimiento de colágeno IV (COL4) y matriz de fibronectina (FN) para purificación de BMEC derivado de iPSC

  1. Añadir 2 ml de agua estéril a 2 mg de FN para hacer 1 mg/mL FN solución de stock. Añadir 5 ml de agua estéril a 5 mg de COL4 para hacer una solución de stock COL4 de 1 mg/ml.
    1. Permita que el FN se disuelva durante al menos 30 minutos a 37 °C y que el COL4 se disuelva a temperatura ambiente.
  2. Diluir la solución de stock de FN en agua estéril a una concentración final de 100 μg/mL y col4 solución de stock a una concentración final de 400 μg/mL.
  3. Cubra las placas deseadas (placa de 6 pozos = 1 ml de solución COL4/FN, placa de 12 pozos = 0,5 ml, placa de 24 pozos= 0,25 ml y placa filtrada de 12 trastos = 0,25 ml) con la mezcla de 400 μg/mL COL4 y 100 μg/mL FN.
  4. Incubar placas durante un mínimo de 2 horas o durante la noche a 37 °C; para las placas filtradas Transwell, se recomienda un mínimo de 4 horas.

5. Subcultura y purificación de BMECs derivados de iPSC

NOTA: La incubación con EDTA enzimática puede tardar más de 15 minutos dependiendo de la confluencia de las células el día 6 de la diferenciación.

  1. En el día 6 de diferenciación, lave las células dos veces con DPBS. Incubar con 1 ml de EDTA enzimática durante al menos 15 minutos a 37 °C hasta que se obtenga una sola suspensión celular.
  2. Recoger las células a través de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Pellets de células resuspend con hESFM fresco con suplemento diluido (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF, y 10 μM RA.
  3. Células de semillas sobre placas recubiertas con una mezcla de 400 μg/mL COL4 y 100 células FN de μg/ml utilizando una proporción de 1 pozo de una placa de 6 pozos a 3 pozos de una placa de 12 pozos, 3 pozos de una placa filtrada de 12 ciclos, o 6 pozos de una placa de 24 pozos.
  4. Semilla iPSCs indiferenciadas de la misma línea celular en la placa filtrada col4/FN recubierta de 12 ciclos como control negativo para el análisis TEER.
  5. Después de 24 horas de sub-culturing, cambiar medio a hESFM con suplemento B27 solamente. No se necesitan cambios medios después de este paso.

6. Ensayo de brotes

  1. Recoger BMECs derivados del iPSC día 8 y sembrarlos a 100.000 células/pozo en una placa de fondo plano de 24 pozos recién recubierta con 200 μL/cm2 de matriz de membrana del sótano.
  2. Tratar estas células con hESFM con diluido (1:200) B27 y 40 ng/mL del factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA165).
  3. Observe las células cada 24 horas y cambie el medio cada dos días.

7. Inmunocitoquímica (ICC)

NOTA: Icc se lleva a cabo en placas planas de 24 pozos.

  1. Después de 48 horas de sub-culturing (día 8), lave las células dos veces con DPBS. Corrija las células con un 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 minutos.
  2. Lave las células tres veces con DPBS, 5 minutos por lavado. Celdas prebloqueadas durante 1 hora a temperatura ambiente en DPBS con 5% suero de burro y 0.3% Tritón X-100 (v/v).
  3. Incubar con anticuerpos primarios: ratón anti-humano-PECAM1 (1:100, stock 0,5 mg/mL), conejo anti-humano-TJP1 (1:200, stock 0,53 mg/mL), ratón anti-humano-CLDN5 (1:200, 0,5 mg/ml), ratón anti-humano-OCLN (1:200, stock 0,5 mg/mL), y conejo anti-humano-SLC2A1(1:100, stock 0,2 mg/mL) en DPBS que contiene un 5% de suero de burro durante la noche a 4°C.
    1. Enjuague las células una vez con DPBS y luego lave cinco veces durante 5 minutos por lavado con DPBS.
  4. Incubar células con anticuerpos secundarios: burro-anti-conejo Alexa Fluor 555 (1:200) y burro-anti-ratón 488 (1:200) en DPBS que contiene 5% suero de burro durante 1 hora.
  5. Después de esta incubación, agregue Hoechst 33342 trihidroclorida trihidrato diluido (1:1000) en DPBS durante 10 minutos.
    1. Retire la solución Hoechst 33342 y enjuague una vez con DPBS y lave cuatro veces con DPBS durante 5 minutos por lavado.
  6. Visualice las células en microscopios de fluorescencia para buscar la expresión y localización de los fabricantes de células.

8. Medición y análisis del TEER

NOTA: Las placas filtradas Corning 12-Transwell están equipadas con filtros que consisten en membranas de tereftalato de polietileno de 1,12 cm2 y 0,4 micrómetros. Las mediciones TEER se obtienen en réplicas técnicas (3 por pozo) y biológicas (3 pozos por línea celular y/o condición).

  1. 24 horas después de la sub-culturing (día 7), mida EL TEER usando electrodos de palillo y un voltohmmeter cada 24 horas. Consulte el manual del usuario de voltohmmeter para obtener instrucciones específicas sobre cómo obtener mediciones.
    1. Para medir EL TEER, cargue el instrumento del voltohmímetro la noche anterior. Limpie ligeramente el instrumento y los electrodos de palillo con un 70% de etanol antes de colocarlos en el capó de seguridad.
    2. Encienda y calibrar el medidor ohmio según lo recomendado por el fabricante.
    3. Conecte los electrodos de palillo y enjuague los electrodos con un 70% de etanol seguido de DPBS.
    4. Coloque el electrodo final más corto en la plaquita trans-pozo (la cámara apical) y el extremo más largo en la cámara basolateral.
    5. Primero mida un pozo en blanco que esté recubierto únicamente con COL4/FN. Entonces mida los otros pozos.
    6. Enjuague rápidamente los electrodos de palillo con un 70% de etanol seguido de DPBS al medir diferentes condiciones (es decir, medir diferentes líneas celulares).
  2. Después de que se hayan registrado todas las mediciones (en Ω), enjuague los electrodos de palillo con un 70% de etanol y luego agua estéril. Limpie suavemente el electrodo y deje que se seque al aire en la capucha de seguridad.
  3. Promediar los valores TEER triplicado (en Ω) del pozo en blanco y restar este valor medio de cada valor TEER sin procesar por condición.
    1. Promedia los valores restados y multiplícalos por 1,12 cm2 (el área de superficie de la plaquita de 12 trasposados).
    2. Utilice valores transformados desde el paso 6 para generar el gráfico que muestra el valor TEER y los errores estándar para cada día de medición teer.

9. Actividad y análisis del transportador de Efflux

NOTA: El ensayo de actividad del transportador Efflux se realiza en una placa de fondo plano de 24 pozos. Los transportistas de interés de Efflux incluyen ABCB1 y ABCC1. Se recomienda que cada condición se realice en triplicato con pozos de control (es decir, pozos en blanco sin los respectivos inhibidores).

  1. Después de 48 horas de sub-cultivo (día 8), incubar células con 10 μM Valspodar (inhibidor ABCB1) o 10 μM MK571 (inhibidor ABCC1) durante 1 hora a 37 °C.
    1. Preparar 10 mM de caldo valspodar disolviendo 5 mg de polvo (1214,64 g/mol) en 412 μL de DMSO y diluir a una concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 ml de hESFM con 10 μM Valspodar, mezcle 10 μL de 10 mM de caldo Valspodar con 10 ml de hESFM.
    2. Preparar 10 mM MK571 stock disolviendo 5 mg de polvo (537,07 g/mol) en 931 μL y diluir a una concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 mL de hESFM con 10 μM MK571, mezcle 10 μL de 10 mM MK571 con 10 ml de hESFM.
  2. Después de 1 hora, incubar células con 10 μM de rhodamina 123 (sustrato ABCB1) o 10 μM 2',7'-diclorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, sustrato ABCC1) con o sin sus respectivos inhibidores durante 1 hora a 37 °C.
    1. Preparar 10 mM rhodamina 123 disolviendo 10 mg de polvo (380,82 g/mol) en 875 μL de DMSO y diluir a una concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 ml de hESFM con 10 μM rhodamina 123, mezclar 10 μL de 10 mM rhodamine 123 stock con 10 ml de hESFM.
    2. Preparar 10 mM H2DCFDA disolviendo 50 mg de polvo (487,29 g/mol) en 10,26 ml de DMSO y diluir a la concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 ml de hESFM con 10 μM rhodamina 123, mezclar 10 μL de 10 mM rhodamine 123 stock con 10 ml de hESFM.
  3. Lave las células dos veces con 0,5 ml de DPBS y lilas utilizando DPBS que contenga el 5% de Triton-X (v/v).
  4. Mida la fluorescencia de las células liadas utilizando un lector multiplaca o microplaca (ver lista de materiales).
    1. Ajuste el instrumento lector de placas fluorescentes a 485 nanómetros de excitación y 530 nanómetros de emisión y mida la fluorescencia en estas longitudes de onda.
    2. Para pozos no utilizados en el ensayo transportador, lave las células dos veces con DPBS antes de fijarlas con 4% PFA para cuantificación de núcleos celulares.
  5. Incubar células con Hoechst 33342 trihidroclorida trihidrato diluido (1:1000) en DPBS durante 10 minutos. Imagen de múltiples campos visuales en cada pozo para calcular el recuento promedio de núcleos celulares utilizando microscopios de fluorescencia.
  6. Contar núcleos utilizando Fiji y normalizar los valores de fluorescencia por célula a estos recuentos.
    1. Calcule la acumulación media de fluorescencia restando el valor de acumulación de fluorescencia cruda para cada condición de su respectivo valor en blanco.
    2. Valores restados promedio para cada condición.
    3. Divida los valores medios del paso 9.6.1 por el recuento promedio de celdas. Utilice estos valores para normalizar los valores de fluorescencia por célula.
    4. Utilice valores normalizados para generar una representación gráfica para cada condición inhibitoria y realizar cualquier análisis estadístico necesario.

10. Pasar, expandir y criopreservar BMECs

  1. Reponga los cultivos BMEC del día 8 con hESFM fresco complementado con B27 diluido (1:200) y permita que las células se expandan durante dos días más en la matriz COL4/FN.
  2. Cubra una nueva placa filtrada de 12 transcillos y una placa de fondo plano de 24 pozos con 400 μg/mL COL4 y 100 μg/mL FN e incubar durante 4 horas.
  3. El día 10, lave las células con DPBS e incuba con 1 ml de EDTA enzimática durante al menos 15 minutos a 37°C hasta que se obtenga una sola suspensión celular.
  4. Recoger las células a través de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    1. Para criopreservar estas células, resuspend pellets celulares con hESFM fresco con 30% Suero Bovino Fetal (FBS) y 10% DMSO.
    2. Almacene los BMECs derivados de iPSC en viales criopreservados en un recipiente de isopropanol durante las primeras 24 horas a -80 °C y, a continuación, colóquelo en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo a -160 °C.
    3. Para pasar estas células, pellets celulares resuspend con hESFM fresco complementado con diluido (1:200) B27.
  5. Células de semillas sobre placas recubiertas preparadas en el Paso 10.2. Células de semillas que utilizan una proporción de 1 pozo de una placa de 6 pozos a 3 pozos de una placa filtrada de 12 ciclos y a 6 pozos de una placa de 24 pozos. Permita que las células crezcan y se expandan durante 24 horas.
  6. El día 11, mida el TEER siguiendo los pasos enumerados en el paso 8.
  7. El día 12, realice ICC siguiendo los pasos enumerados en el Paso 9.
  8. Para descongelar los BMECs criopreservados, coloque los viales criopreservados en un baño de agua tibia o cuentas a 37oC. A continuación, transfiera los BMECs descongelados a 5 ml de hESFM complementados con B27 diluido (1:200).
    1. Recoger las células a través de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Resuspend las células en hESFM complementadas con diluido (1:200) B27, 10 μM RA y 10 μM Y-27632.
    2. Después de 24 horas, cambie de medio a hESFM complementado con diluido (1:200) B27 y 10 μM Y-27632 sin AR.

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Representative Results

Diferenciación BMEC
Algunos pasos críticos en este protocolo deben seguirse con precisión (Figura 1). E6 uso medio en el día 1 es importante, ya que se utiliza a menudo para derivar linaje neuroectoderm de iPSCs dentro de un período relativamente corto de tiempo que produce resultados reproducibles a través de múltiples líneas celulares36. Otro paso importante es el día 4 de la diferenciación, donde el medio E6 debe cambiarse a hESFM con B27 diluido (1:200), bfgf de 20 ng/ml y RA de 10 μM para expandir BMECs derivados de iPSC. La adición de suplemento B27 se utiliza como una alternativa al suero bovino para apoyar la culturing celular libre de suero1,bFGF se añade para facilitar el crecimiento de BMECs derivados de iPSC6,y RA se utiliza para facilitar el desarrollo del fenotipo BBB35. El último paso importante consiste en la etapa de purificación, donde los BMECs derivados del iPSC del día 6 se subculen en una placa recubierta COL4/FN para seleccionar BMECs derivados de iPSC1,6,35,36. La Figura 2 muestra la transición morfológica de iPSC a BMECs. Después de un día de medio E6 (día 1), la morfología celular es similar a la de los iPSCs. Para el día 4 de E6, las células comienzan a aparecer visiblemente distintas de los iPSC y cubren la mayor parte del pozo (~90% de confluencia). Para el día 6, mientras se cultiva en hESFM con B27 diluido (1:200), 20 ng/mL bFGF y 10 μM RA, la morfología celular comienza a tener un aspecto alargado y adoquín. En el día 8, cada célula individual es distinta en un patrón de adoquín grande. Se realizó un ensayo de germinación para demostrar el potencial angiogénico de los BMECs derivados de iPSC, que dio lugar a estructuras similares a tubos después de 3 días de tratamiento VEGFA165(Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Esquema para la diferenciación de iPSC humanos a BMECs. Los iPSC humanos se cultivaban inicialmente en medios de células madre que contenían 10 μM Y-27632 durante 24 horas antes de cambiar de medio a E6 durante 4 días. El día 4, el medio se cambió a hESFM con (1:200) suplemento B27, 20 ng/mL bFGF, y 10 μM RA durante 2 días. El día 6, las células fueron subculturadas en placas recubiertas col4/FN. El día 7, medio se cambió a hESFM con suplemento B27 sin bFGF y RA y TEER se midió. El día 8, se realizaron ensayos de actividad de transporte icc y efflux. Los BMECs derivados de iPSC se ampliaron hasta el día 10 antes de ser pasados a una placa de pozo trans o a una placa inferior plana de 24 pozos para la medición TEER y el análisis ICC, respectivamente. Día 8 BMECs se utilizaron para el ensayo de brotes (no representado). Se recogieron y almacenaron 2 pozos de una placa de 6 pozos de BMECs derivados de iPSC en hESFM con un 10% de DMSO y un 30% de FBS a -80 °C y luego en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo a -160oC. El día 12, se observó un pico en el valor del TEER en los BMECs derivados de iPSC ampliados en cuyo momento se realizó icc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes de campo brillante que representan la diferenciación de iPSC a BMECs. Después de un día de cultivo en el medio E6, los iPSC conservan su morfología característica. El día 4 en el medio E6, la morfología celular parece claramente diferente de los iPSCs. El día 6, la morfología celular cambia a una apariencia alargada y adoquinada. Para el día 8, las células aparecen grandes y con un patrón de adoquín. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Potencial angiogénico de BMECs derivados de iPSC. Los BMECs derivados de iPSC purificados se sembraron a 100.000 células/cm2 en la matriz de membrana del sótano en hESFM con (1:200) suplemento B27 y VEGFA165 de 40ng/mL. Estructuras similares a tubos aparecieron después de 3 días de tratamiento VEGFA165. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los BMECs derivados de iPSC purificados se sembraron a 100.000 células/cm2 en la matriz de membrana del sótano en hESFM con (1:200) suplemento B27 y VEGFA165 de 40ng/mL. Estructuras similares a tubos aparecieron después de 3 días de tratamiento VEGFA165.

La caracterización bmec se realizó utilizando inmunocitoquímica para marcadores específicos de células. Los BMECs derivados de iPSC se evaluaron para la presencia de proteínas de unión estrechas (OCLN, TJP1 y CLDN5), que se expresan comúnmente en las estrechas uniones de las células endoteliales cerebrales3 y las células endoteliales en el pulmón, el hígado y el riñón18. Otros marcadores tales como PECAM1 y SLC2A1, se han utilizado previamente como marcadores para BMECs purificados6. PECAM13 y SLC2A4 se expresan en células endoteliales vasculares del BBB. Los BMECs derivados de iPSC generados mediante este protocolo co-expresaron los cinco marcadores (Figura 4).

Figure 4
Figura 4: Análisis de marcadores de BMECs derivados de iPSC. Los BMECs derivados de iPSC humanos fueron manchados para proteínas de unión estrecha (OCLN, TJP1, CLDN5), transportador de afluencia (SLC2A1) y unión de adherentes (PECAM1). Las proteínas OCLN, TJP1 y CLDN5 se localizan principalmente en la membrana celular. SLC2A1 y PECAM1 se localizan tanto en los núcleos como en la membrana celular. Hoechst 33342 trihidrocloruro trihidrato se utilizó para la tinción nuclear. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para caracterizar la función BBB de los BMECs, el TEER se midió 24 horas (día 7) después de la sub-cultivo y el medio se cambió a hESFM con B27 diluido (1:200) sin bFGF y RA. Las mediciones de TEER se obtuvieron a partir del día 7 de diferenciación (día 0 de medición teer) y alcanzaron un máximo de ~2000 Ω x cm2 el día 8 o 48 horas después de sub-culturing BMECs (Figura 5). Estos valores TEER se encuentran dentro del rango descrito para BMECs derivados de iPSC co-cultivados con astrocitos primariosde rata 37. La línea iPSC no tenía ninguna función BBB discernible de acuerdo con sus bajos valores TEER.

Figure 5
Figura 5: Mediciones TEER en BMECs derivados de iPSC. Los valores TEER alcanzaron su punto máximo después de un día de sub-culturing en la matriz COL4/FN (en el día 8 de diferenciación). Las mediciones teer se obtuvieron en las réplicas técnicas (3 medidas por pozo) y biológicas (3 pozos por línea celular). El valor medio técnico de un pozo en blanco se restó de los valores TEER sin procesar. Estos valores fueron promediados por cada día y multiplicados por 1,12 cm2 (superficie del inserto de 12 trasposes). Las barras de error representan un error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para evaluar la actividad del transportador de eflujo ABCB1 y ABCC1, la cantidad de sustrato fluorescente tomado para ABCB1 y ABCC1 se cuantificó después de la incubación con sus respectivos inhibidores. Como era de esperar, la inhibición de los transportadores de eflujo ABCB1 y ABCC1 con PSC833 (inhibidor ABCB1) o MK-571 (inhibidor abcc1) condujo a un aumento de la rhodamina 123 (R123) o 2',7'-diclorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA), respectivamente (Figura 6). Esta evidencia sugiere que los BMECs derivados mediante este protocolo tienen actividad transportadora de eflujo.

Figure 6
Figura 6: Actividad del transportador de Efflux en BMECs derivados de iPSC. La actividad transportadora de Efflux en BMECs se determinó cuantificando la acumulación de rhodamina 123 (R123) o diacetato de diclorodihidrodihidrofluoresceína (H2D) o 2',7'-diclorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA) en presencia o ausencia de inhibidor PSC833 (miembro B de casete de encuadernación ATP 1 (ABCB1) o MK-571 (miembro C subfamilia de casete de unión ATP 1 (ABCC1). Se realizaron triplicatos técnicos para cada condición (N=1). Los valores de fluorescencia de la condición de control (es decir, sin inhibidores) se deduciron de los valores de fluorescencia crudos. Esta acumulación de fluorescencia se normalizó por célula para cada réplica técnica. La importancia estadística se determinó utilizando la prueba t del estudiante a partir de las tres réplicas técnicas. No se observó ninguna significación estadística entre la acumulación de R123 con y sin inhibidor ABCB1 (t-stat= -1.66, p=0.11). Se observó una significación estadística entre la acumulación de H2DCFDA con y sin inhibidor ABCC1 (t-stat=-7.23, p=0.04). *p<0.05. Las barras de error representan un error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

BMECs derivados de iPSC de passaging, expanding y cryopreserving
Otro objetivo era investigar si los BMECs derivados de iPSC podían ser aprobados y criopreservados después de la sub-cultión. Para ello, se permitió que los BMECs derivados del iPSC del día 7 se expandieran hasta el día 10 antes de pasarlos a placas filtradas COL4/FN 12-transwell recién recubiertas para la medición del TEER y una placa de fondo plano de 24 pozos para el análisis ICC (Figura 7). Usando esta condición, los BMECs derivados de iPSC continuaron proliferando, mantuvieron la expresión de OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 y PECAM1 (Figura 8),y continuaron sosteniendo los valores teer adecuados (pico en~2000 Ω x cm2)después del passaging (Figura 9). Los BMECs criopreservados fueron posteriormente descongelados, expandidos y luego aprobados(Figura 7). Las mediciones teer de BMECs se obtuvieron 24 horas después del deshielo y varios días más después de eso. Se redujeron las mediciones TEER de estos BMECs post-descongelados (alcanzando un pico de sólo 800 Ω x cm2)en comparación con los BMECs recién derivados. Un segundo passaging de BMECs post descongelados exhibió valores TEER aún más bajos (alcanzando un pico de sólo 200-300 Ω x cm2) (Figura 9) y mostró patrones deshilachados y/o pecas de la formación de unión estrecha (Figura 10). El análisis de manchas occidentales48 reveló que los iPSC expresaban principalmente un marcador endodérmico (SOX17)49 y algunos marcadores de unión estrechos (OCLN), pero no otros marcadores relacionados con BMEC (TJP1, CLDN5 y SLC2A1) (Figura 11). Los BMECs expresaron principalmente marcadores relacionados endoteliales (TJP1, CLDN5, OCLN y SLC2A1), con bajos niveles del marcador endodérmico, SOX17.

Figure 7
Figura 7: Imágenes de campo brillante de BMECs derivados de iPSC expandidos y criopreservados. A) Las células del día 10 (4 días después de la subcultura inicial) alcanzaron la máxima confluencia. B) Día 11, 24 horas después de pasar a col4 / FN cubierto placa de 24 pozos. C) Día 12, 48 horas después de pasar a col4 / FN cubierto placa de 24 pozos; se observaron los valores máximos del TEER y se realizó icc. D) 48 horas de BMECs derivados de iPSC post-descongelados en placas col4/FN recubiertas de 6 pozos; células fueron previamente criopreservadas a 1,2 x 102 células/ml. E) 24 horas después de que los BMECs derivados de iPSC post-descongelados fueran pasados a la placa col4/FN recubierta de 6 pozos. F) 48 horas después de que se pasaran los BMECs derivados de iPSC post-descongelados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: ICC de BMECs derivados de iPSC después del passaging. Los BMECs fueron aprobados y mantenidos en la matriz COL4/FN hasta el día 12, cuando los valores TEER alcanzaron su punto máximo. Los BMECs en el día 12 fueron manchados para las proteínas de unión estrecha (OCLN, TJP1, CLDN5), transportador de afluencia (SLC2A1) y unión de adherentes (PECAM1). El patrón de expresión y la localización se asemejan a los observados en condiciones en las que no se realizó la passaging, como se muestra en la figura 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Comparación de mediciones TEER en iPSC, BMECs no aprobados, BMECs aprobados, BMECs criopreservados y BMECs criopreservados y aprobados. El día 1, los valores TEER alcanzaron su punto máximo para los BMECs no aprobados y aprobados, pero no para los iPSC o los BMECs criopreservados. Los BMECs criopreservados tenían valores TEER moderados entre el día 3 y el 7, con valores TEER aún más bajos para los BMECs criopreservados y aprobados. Los iPSC no demostraron ningún valor TEER medible entre el día 0 y el 9. Las mediciones teer se obtuvieron en técnicas (3 mediciones por pozo) y réplicas biológicas (3 por línea celular). El valor medio técnico de un pozo en blanco se restó de los valores TEER sin procesar. Estos valores fueron promediados por cada día y multiplicados por 1,12 cm2 (superficie del inserto de 12 trasposes). Las barras de error representan un error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: CPI de BMECs criopreservados y aprobados. Los BMECs fueron aprobados y mantenidos en COL4/FN hasta que se observaron los valores máximos de TEER. Los BMECs fueron manchados para proteínas de unión estrecha (OCLN, TJP1, CLDN5), transportador de afluencia (SLC2A1) y adherentes de las proteínas de unión (PECAM1). El patrón de expresión de marcadores de unión estrechos parecía deshilachado y/o pecas en comparación con los BMECs no pasados (Figura 4) y los BMECs de paso (Figura 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Análisis de manchas occidentales de iPSC, BMECs no aprobados, BMECs aprobados y BMECs criopreservados y aprobados. Manchas occidentales que muestran niveles de TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 y control de carga (GAPDH). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Modificaciones y solución de problemas

En este protocolo, hicimos algunas modificaciones en el uso de una matriz extracelular de uso común y medios de cultivo celular durante la culturing iPSC para la derivación de BMECs (Figura 1). Estos cambios no afectaron a la capacidad de derivar BMECS de iPSC humanos como se describe en el Protocolo Lippmann1. Se utilizó una línea iPSC de un donante sano diferente para demostrar que este protocolo modificado muestra resultados comparables a estudios anteriores con otras líneas1. Para la criopreservación, Suplemento B27 se utilizó en lugar de 1% plaquetario pobre suero derivado del plasma (PDS)40,pero esto afectó la fidelidad BMEC en la culta posterior. Con respecto a la solución de problemas, los valores TEER pueden fluctuar rápidamente antes de estabilizarse. Esta fluctuación puede deberse a cambios de temperatura que se producen cuando las placas se mueven de 37 °C a temperatura ambiente37. Para superar este problema, las mediciones deben tomarse de forma rápida, eficiente y consistente. Si es necesario, los efectos de temperatura se pueden tener en cuenta mediante el uso de una fórmula matemática proporcionada por Blume et al. 200949 para obtener valores TEER corregidos por temperatura.

Limitaciones del presente Protocolo

A pesar de obtener BMECs con un fenotipo BBB robusto (es decir, alto valor TEER), mantener esta propiedad BBB durante un período prolongado de tiempo sigue siendo un desafío importante. Como se muestra aquí, los valores máximos de TEER (~2000 Ω x cm2)utilizando este protocolo fueron mucho más bajos que los valores TEER máximos reportados anteriormente (~8000 Ω x cm2)1. A pesar de esta observación, los valores TEER se enmarcan dentro del rango habitual (2000-8000 Ω x cm2)de los valores notificados anteriormente1. Una segunda limitación es la variabilidad en los valores máximos de TEER que resulta de diferentes líneas iPSC utilizadas, que se ha observado en otras versiones de este protocolo36. La variación entre las diferentes líneas celulares puede deberse a la tasa de crecimiento y expansión de cada línea iPSC, que se ve afectada por los factores ambientales51. Otra limitación está relacionada con la criopreservación, ya que nuestro protocolo no mantuvo la fidelidad de BMEC. Es posible que el 1% PDS40 proporcione una mayor estabilidad de los BMECs durante la criopreservación.

Importancia con respecto a los métodos existentes

Los BMECs derivados del iPSC proporcionan células que tienen el fondo genético de individuos específicos, lo cual es valioso en la utilización de estas células para el estudio de la biología de la enfermedad. Este no es el caso cuando se utilizan modelos animales o cultivos primarios bmec extraídos de otros animales37. Además, los cultivos BMEC primarios in vitro muestran valores TEER bajos (~100 Ω x cm237),mucho más bajos que los alcanzados con BMECs humanos derivados de iPSC con el protocolo descrito aquí. Este protocolo modificado proporciona un método detallado para obtener BMECs humanos de iPSC, con el potencial de expandirlos y mantenerlos para su uso más largo. La capacidad de pasar y almacenar BMECs diferenciados puede proporcionar versatilidad y flexibilidad en el diseño experimental, especialmente cuando se estudian varias líneas celulares a la vez. Sobre la base de estos resultados, los BMECs derivados de iPSC se pueden ampliar y pasar después del paso inicial de sub-culturing(Figura 7, Figura 8 y Figura 9),pero la criopreservación necesita una investigación adicional. Este protocolo también se puede utilizar junto con otros modelos celulares basados en células madre para desarrollar enfoques innovadores como la vascularización de organoides cerebrales. Los métodos actuales para generar organoides cerebrales resultan en una reconstitución incompleta de los tipos celulares del cerebro humano ya que carecen de células endoteliales y elementos críticos de la unidad neurovascular que comprenden el BBB52,53. El protocolo descrito aquí puede proporcionar un enfoque manejable y reproducible utilizando sistemas bidimensionales transwell/co-culturing que es menos costoso y más fácil de implementar que los modelos 3D.

Futuras aplicaciones de este protocolo

Este protocolo se puede utilizar para estudiar el papel de la neurovasculatura y BBB en trastornos neuropsiquiátricos como la esquizofrenia y el trastorno bipolar, donde se han hipotetizado déficits en la neurovasculatura para desempeñar un papel9,10,20,54,55. Las versiones anteriores de este protocolo36 se habían utilizado para derivar BMECs de líneas iPSC de pacientes con síndrome de deleción de la enfermedad de Huntington7 y 22q pacientes con esquizofrenia43. Ambos estudios7,43 demostraron una utilización exitosa de este método para investigar la función paracelular y/o transcelular relacionada con el BBB. Se han planteado algunas preocupaciones sobre los posibles efectos confusos del suero animal en protocolos anteriores1. El protocolo sin suero utilizado aquí elimina esta preocupación al tiempo que produce resultados similares a los protocolos anteriores para derivar BMECs.

Pasos críticos para diferenciar y ampliar los BMECs

Hay cuatro pasos críticos al implementar este protocolo. En primer lugar, sembrar iPSCs a una densidad óptima (es decir, sembrar a ~15,600 celdas/cm2)es importante para la diferenciación eficiente de BMEC. Si la densidad celular es demasiado alta o demasiado baja para el día 4 de diferenciación, los cultivos pueden mostrar mayores tasas de heterogeneidad celular56. Un segundo paso importante es la inducción de la diferenciación entre el día 1 y el día 4, donde el medio E6 se utiliza para iniciar la diferenciación. E6 se utiliza en lugar del "medio no acondicionado" que se utilizó en protocolos anteriores6,35. E6 medio reduce el tiempo de diferenciación de 13 días a 8 días, sino que también promueve la expresión de proteínas de unión estrechas (TJP1, OCLN, CLDN5) y marcadores BMEC (PECAM1 y SLC2A1)36. El uso del medio E6 también dio lugar a valores TEER adecuados (Figura 5) y ABCB1 y ABCC1 actividad transportadora de eflujo (Figura 6)6,35. En tercer lugar, el uso de B27 en lugar de suero bovino permitió una condición libre de suero, lo que mejoró la consistencia y fiabilidad de la diferenciaciónBMEC 1. Por último, en términos de expansión de los BMECs derivados de iPSC, las células deben pasarse cuando alcanzan ~100% de confluencia. Sobre la base de este protocolo, los BMECs derivados de iPSC se pueden ampliar y pasar después de la fase inicial de sub-cultivo (Figura 7, Figura 8 y Figura 9).

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por un Premio R01MH113858 del Instituto Nacional de Investigación Biobehavioral de Salud Mental para Nuevos Científicos Innovadores (BRAINS) R01MH113858 (a R.K.), premio KL2 TR002542 (PL) de los Institutos Nacionales de Salud. un Premio del Instituto Nacional de Desarrollo Científico Clínico de Salud Mental K08MH086846 (a R.K.), una Beca de la Fundación R Baer Jr de Sídney (a P.L.) el Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (a R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (a R.K.), la Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (a R.K.), el Instituto de Células Madre de Harvard (a R.K.) y por Steve Willis y Elissa Freud (a R.K.). Agradecemos a la Dra. Annie Kathuria por su lectura crítica y comentarios sobre el manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

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Neurociencia Número 165 Células madre pluripotentes inducidas por humanos células endoteliales microvasculares cerebrales barrera hematoencefálica resistencia eléctrica transdotelial actividad transportadora microvascular esquizofrenia trastorno bipolar passaging expansión criopreservación
Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos
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Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

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