Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Afledning, ekspansion, kryopræservering og karakterisering af hjernemikrobielle endotelceller fra menneskeskabte pluripotente stamceller

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, 1,3,4,5
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Summary

Denne protokol beskriver en tilpasset metode til at udlede, udvide og kryopreserve hjernens mikrovaskulære endotelceller opnået ved at differentiere humane inducerede pluripotente stamceller og til at studere blodhjernebarriereegenskaber i en ex vivo-model.

Abstract

Hjernemikrobielle endotelceller (BMECs) kan skelnes fra menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSCs) for at udvikle ex vivo cellulære modeller til undersøgelse af blod-hjerne-barriere (BBB) funktion. Denne ændrede protokol indeholder detaljerede trin til at udlede, udvide og kryopræservere BMEC'er fra menneskelige iPSC'er ved hjælp af en anden donor og reagenser end dem, der er rapporteret i tidligere protokoller. IPSCs behandles med essentielle 6 medium i 4 dage, efterfulgt af 2 dage af menneskelige endotel serum-fri kultur medium suppleret med grundlæggende fibroblast vækstfaktor, retinosyre, og B27 supplement. På dag 6, er celler sub-dyrket på en kollagen / fibronectin matrix i 2 dage. Immunocytochemistry udføres på dag 8 for BMEC-markøranalyse ved hjælp af CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 og SLC2A1. Vestlig blotting udføres for at bekræfte BMEC-markørudtryk og fravær af SOX17, en endodermal markør. Angiogent potentiale demonstreres med en spirende analyse. Trans-endotel elektrisk modstand (TEER) måles ved hjælp af spisepindeelektroder og voltohmmeter fra dag 7. Efflux transportøraktivitet for ATP-bindingskassetteunderfamilie B-medlem 1 og ATP-bindende kassetteunderfamilie C-medlem 1 måles ved hjælp af en flerpladelæser på dag 8. En vellykket afledning af BMECs bekræftes af tilstedeværelsen af relevante cellemarkører, lave niveauer af SOX17, angiogent potentiale, transportaktivitet og TEER-værdier ~2000 Ω x cm2. BMECs udvides indtil dag 10, før de passerer på friskbelagte kollagen / fibronectin plader eller cryopreserved. Denne protokol viser, at iPSC-afledte BMEC'er kan udvides og passeres mindst én gang. Der blev dog observeret lavere TEER-værdier og dårligere lokalisering af BMEC-markører efter kryopræservering. BMECs kan bruges i co-kultur eksperimenter med andre celletyper (neuroner, glia, pericytes), i tre-dimensionelle hjerne modeller (organ-chip og hydrogel), for vaskularisering af hjernen organoider, og for at studere BBB dysfunktion i neuropsykiatriske lidelser.

Introduction

Blod-hjerne barriere funktion
Blod-hjerne barrieren (BBB) danner en grænse, der begrænser bevægelse af stoffer fra blodet til hjernen. BBB består af hjerne mikrovaskulære endotelceller (BMECs), der danner et monolag foring vaskulaturen. BMECs, sammen med astrocytter, neuroner, pericytes, microglia, og ekstracellulær matrix, danner neurovaskulær enhed. BMECs har en stramt reguleret paracellulær struktur, der gør det muligt for BBB at opretholde høj trans-endotel elektrisk modstand (TEER), som begrænser passiv diffusion og fungerer som en indikator for barriereintegritet1,2. BMECs har også proteiner, der hjælper med transcellulær bevægelse såsom endokytose, transcytose og transmigration samt ekstravasation af leukocytter under et immunrespons3. BMECs er afhængige af tilstrømning og efflux transportører til næring og fjernelse af affaldsprodukter, for at opretholde en homeostatic balance i hjernen3. F.eks. solute carrier family 2 member 1 (SLC2A1) er en tilstrømning transportør ansvarlig for flytning af glukose på tværs af BBB4, mens efflux transportører såsom ATP bindende kassette subfamily B medlem 1 (ABCB1) og ATP bindende kassette subfamily C medlem 1 (ABCC1) er ansvarlige for at returnere substrater tilbage i blodet3,5,6,7. ABCB1 substrater omfatter morfin, verapamil4, og antipsykotika såsom olanzapine og risperidone8, mens ABCC1 transportør har en række substrater, herunder sulfat konjugater, vincristine, og glucuronide konjugater4.

Anvendelse af BBB-modeller i psykiatriske lidelser
BBB dysfunktion har været impliceret i en række neurologiske og psykiatriske lidelser, herunder skizofreni og bipolar lidelse9,10. For nylig bruges iPSC-afledte ex vivo cellulære modeller til at afhøre det cellulære og molekylære fundament af psykiatriske lidelser, men disse modeller tager i øjeblikket ikke højde for den potentielle rolle, som neurovasculature11,12,13. Det er hypotese, at perifere inflammatoriske cytokiner, der cirkulerer iblodet,kan have en negativ indvirkning på BBB14,15,16,17, men der er også tegn på paracellulær18,19,20,21,122, transcellulær23,24,25,26,27,28,29og ekstracellulær matrix20,29,30,31,32 abnormiteter, der bidrager til BBB-dysfunktion. Forstyrrelse af BBB kan resultere i, at indholdet af blodet kommer ind i hjernen parenchyma og aktiverer astrocytter og / eller mikroglia for at frigive proinflammatoriske cytokiner, som igen indleder en inflammatoriskreaktion 33, der kan have skadelige virkninger på hjernen34. BMECs er den primære komponent i BBB og undersøge strukturen og funktionen af disse celler kan forbedre forståelsen af BBB dysfunktion i neurologiske og psykiatriske lidelser.

Alternative BMEC-modeller
Forud for udviklingen af effektive protokoller for at udlede BMECs fra iPSCs1, 6,35,36, forskere havde ansat udødeliggjort BMECs37 at studere BBB funktion. Mange af disse modeller opnåede imidlertid ikke ønskelige BBB-fænotyper, et sådant fysiologisk interval af TEER-værdier38,39. Brug af iPSCs har den fordel at bevare den genetiske baggrund af den person, hvorfra cellerne er afledt. Forskere arbejder aktivt på at etablere iPSC-afledte ex vivo mikromiljømodeller, der opsummerer strukturen og funktionen af den menneskelige hjerne. Forskere har udviklet metoder til at udlede BMECs, der er strukturelt og fysiologisk ligner BMECs findes in vivo. Metoder til opnåelse af rensede populationer af iPSC-afledte BMEC'er kræver en række forskellige trin , hvor protokollerne er optimeret i de seneste år1,6,35,36. Generelt er iPSC-afledte BMECs dyrket i Essential 6 (E6) medium i 4 dage, efterfulgt af 2 dage i humant endotel serumfrit medium (hESFM) suppleret med grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF), retinosyre (RA) og B27 supplement. Cellerne er derefter dyrket på en kollagen IV (COL4) og fibronectin (FN) matrix for at opnå >90% homogenE BMECs1.

BMEC'ernes identitet bekræftes af immunfluorescens, der viser co-ekspressionen af BMEC-proteiner, herunder blodplade-endotelcelle vedhæftningsmolekyle-1 (PECAM1), SLC2A1 og stramme krydsproteiner som stramt krydsprotein 1 (TJP1), occludin (OCLN) og claudin-5 (CLDN5)6. Spirende assays er blevet brugt til at bekræfte det angiogene potentiale i iPSC-afledte BMECs. 6 BBB-integriteten af BMEC'er vurderes ved tilstedeværelsen af fysiologiske IN VITRO TEER-værdier (~2000Ω x cm2)37 og målelig aktivitet for effluxtransportører som ABCB1 og ABCC11,6,36. Lippmann-gruppens seneste metodologiske fremskridt har ført til iPSC-afledte BMEC-protokoller med reduceret eksperimentel variation og forbedret reproducerbarhed1. Det vides dog ikke, om de kan udvides og passeres ud over underkulturfasen. Vores ændrede protokol har til formål at løse dette problem ved at videregive iPSC-afledte BMECs efter dag 8 og vurdere, om de kan udvides yderligere til at bevare BBB-egenskaber efter kryopræservering. Mens ingen undersøgelser har beskrevet passaging af iPSC-afledte BMECs, findes der en protokol for BMEC cryopreservation, der bevarer fysiologiske BBB-egenskaber efter at have gennemgået en fryse-optøningscyklus40. Det er dog ikke kendt, at BMEC'er efter kryopræservering kan passeres og bevare BBB-egenskaber.

BMECs afledt af iPSC'er ved hjælp af Lippmann-protokollen er blevet brugt til at modellere BBB-forstyrrelser i neurologiske lidelser som Huntingtons Sygdom7. Sådanne iPSC-afledte BMEC'er er også blevet anvendt til at undersøge virkningerne af bakteriel infektion som Neisseria meningitidis eller Gruppe B Streptococcus på afbrydelse af blod-CSF-barrieren og BBB henholdsvis41,42. Også ved hjælp af iPSC-afledte BMECs fra 22q sletning syndrom patienter med skizofreni, forskere observeret en stigning i intercellulær vedhæftning molekyle-1 (ICAM-1), en stor vedhæftning molekyle i BMECs, der hjælper med rekruttering og ekstravasation af leukocytter i hjernen43. Tilsammen viser disse undersøgelser nytten af iPSC-afledte BMECs til at studere BBB-forstyrrelser i komplekse neuropsykiatriske lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Human iPSCs blev omprogrammeret fra fibroblaster af raske donorer ved hjælp af en protokol godkendt af Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital og McLean Hospital, og karakteriseret som beskrevet i tidligere undersøgelser44,45,46.

BEMÆRK: Kort, fibroblaster blev omprogrammeret til iPSC via mRNA-baserede genetiske omprogrammering47. IPSC'erne blev opretholdt i stamcellemedium (SCM) (se materialelisten) og opbevaret med en tæthed på ~ 1,2 x 102 celler / mL med 1 mL SCM, 10 μM med rho-associeret proteinkinasehæmmer (ROCKi) Y-27632 og 10% (v/v) dimethylsulfid (DMSO) i kryopreserverede hætteglas i flydende nitrogen ved -160 °C. Alle følgende procedurer nedenfor udføres i et biosikkerhedsskab, medmindre andet er angivet.

1. Kælder membranmatrix fortynding og pladebelægning

  1. Fortyndet (1:50) vækstfaktor reduceret kælder membran matrix renset fra Engelbreth-Holm-Swarm tumor i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uden phenol rød.
  2. Coat cellekulturplader med passende mængde fortyndet kældermembranmatrix (dvs. 6-brønds plade = 1mL, 12-brønds plade = 0,5 mL) og inkuber disse plader ved 37 °C i mindst 1 time.

2. vedligeholdelse af iPSC

BEMÆRK: Den maksimale sammenløb per brønd i en 6-godt flad-bund plade er ~ 1,2 x 106 celler.

  1. Optø kryopreserverede iPSC'er til SCM med 10 μM Y-27632 og plade på en 6-brønds plade belagt med fortyndet vækstfaktor reduceret kældermembranmatrix.
  2. IPSC'er i SCM opbevares i SCM med 10 μM Y-27632 i de første 24 timer efter optøning. Skift til frisk medium efter 24 timer.
  3. Vedligehold iPSC'er i SCM, indtil cellerne når 80-90 % sammenløb, før de passerer.
    1. Beregn, hvor mange iPSC'er der vil være behov for til differentiering ved at multiplicere den ønskede tæthed for differentiering (15.600 celler/cm2) med brøndens overfladeareal. For en 6-brønds fladbundet plade multipliceres 15.600 celler/cm2 med 9,6 cm2 for i alt 149.760 celler/brønd.
  4. Til passage, vask cellerne med Hanks 'Balanced Salt Solution (HBBS). Derefter inkuberes cellerne med ikke-enzymatisk ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) (se materialelisten) i 5 minutter ved 37 °C.
    1. Brug en celleskraber til forsigtigt at løfte cellerne af. Indsaml celler i frisk SCM.
    2. Pladeceller på cellekulturplader belagt med fortyndet SCM og vedligehold celler som beskrevet i trin 2.3, eller opbevar dem ved ~1,2 x 106 celler/mL i 1 mL SCM, 10 μM Y-27632 og 10% DMSO (v/v) i kryopreserverede hætteglas i flydende nitrogen ved temperaturer på -160 °C.

3. Differentiering af iPC'er til BMECs

BEMÆRK: Ikke-enzymatisk EDTA adskiller celler i klumper. Enzymatisk EDTA (se Materialetabel)adskiller celler i suspension af en enkelt celle. Retinosyre (RA) bør beskyttes mod lys.

  1. Vask iPSCs én gang med Dulbecco's Fosfat Buffer Saline (DPBS). Inkuber med enzymatisk EDTA (1 mL for 6-brønds plade, 0,5 mL for 12-brønds plade og 0,25 mL for 24-brønds plade) i ca. 5 minutter ved 37 °C for at give en enkelt cellesuspension.
  2. Opsamle celler og centrifuge ved 300 x g (relativ centrifugalkraft) i 5 minutter ved stuetemperatur. Genanvendelige cellepiller i SCM indeholdende 10 μM Y-27632.
  3. Bestem celletætheden ved hjælp af Trypan Blue og automatiseret celletæller eller en hæmocytometerenhed. Pladeceller med en densitet på 15.600 celler/cm2 eller 149.760 celler/brønd af en 6-brønds fladbundet plade (med et overfladeareal på 9,6 cm2/brønd) i SCM indeholdende 10 μM Y-27632 i 24 timer.
  4. Igangsætte differentiering efter 24 timer ved at ændre SCM til E6 medium. Skift E6 medium dagligt for de næste 4 dage.
  5. På differentieringens dag 4 skal E6-mediet erstattes med hESFM suppleret med fortyndet (1:200) B27-tillæg, 20 ng/mL bFGF og 10 μM RA. Skift ikke dette medie i de næste 48 timer.
  6. Forbered 200 mL hESFM med fortyndet (1:200) B27, bland 1 mL af 50x koncentreret B27 supplement til 199 mL hESFM.
  7. Der fremstilles 20 ng/ml bFGF ved at rekonstruere 50 μg bFGF i 250 μL Tris buffer (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) for at fremstille 200 μg/mL bestandsopløsning. Der fremstilles 200 mL hESFM indeholdende 20 ng/mL bFGF ved at blande 20 μL af 200 μg/mL bFGF med 200 mL hESFM.
  8. Der fremstilles 10 μM RA ved først at fremstille en 40 mg/mL RA-stamopløsning ved at tilsætte 2,5 ml DMSO til 100 mg RA-pulver. Denne koncentration fortyndes til 3 mg/mL for at fremstille 10 mM stamopløsning. Der fremstilles 200 mL hESFM indeholdende 10 μM RA ved at blande 200 μL 10μM RA i 200 mL hESFM.

4. Coating kollagen IV (COL4) og fibronectin (FN) Matrix til rensning af iPSC-afledt BMEC

  1. Der tilsættes 2 ml sterilt vand til 2 mg FN for at fremstille 1 mg/mL FN-stamopløsning. Der tilsættes 5 ml sterilt vand til 5 mg COL4 for at fremstille en 1 mg/mL COL4-stamopløsning.
    1. FN opløses i mindst 30 minutter ved 37 °C, og COL4 opløses ved stuetemperatur.
  2. FN-stamopløsning fortyndes i sterilt vand til en endelig koncentration på 100 μg/mL og COL4-stamopløsning til en endelig koncentration på 400 μg/mL.
  3. Coat de ønskede plader (6-brønds plade = 1 ml COL4/FN-opløsning, 12-brønds plade = 0,5 ml, 24-brønds plade= 0,25 ml og 12-transwell filtreret plade = 0,25 ml) med blandingen af 400 μg/mL COL4 og 100 μg/mL FN.
  4. Inkubatplader i mindst 2 timer eller natten over ved 37 °C for Transwell-filtrerede plader anbefales mindst 4 timer.

5. Delkultur og rensning af iPSC-afledte BMEC'er

BEMÆRK: Inkubation med enzymatisk EDTA kan tage længere end 15 minutter afhængigt af sammenløbet af cellerne på dag 6 af differentiering.

  1. På dag 6 af differentiering, vask celler to gange med DPBS. Inkuber med 1 mL enzymatisk EDTA i mindst 15 minutter ved 37 °C, indtil der opnås en enkelt cellesuspension.
  2. Opsamle celler via centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Genbrugte cellepiller med frisk hESFM med fortyndet (1:200) B27-tillæg, 20 ng/mL bFGF og 10 μM RA.
  3. Frøceller på plader belagt med en blanding af 400 μg/mL COL4 og 100 μg/mL FN. Frøceller med et forhold på 1 brønd af en 6-brønds plade til 3 brønde af en 12-brønds plade, 3 brønde af en 12-transwell filtreret plade eller 6 brønde af en 24-brønds plade.
  4. Frø udifferentieret iPSCs fra samme celle linje på COL4/FN belagt 12-transwell filtreret plade som negativ kontrol for TEER analyse.
  5. Efter 24 timers sub-dyrkning, ændre medium til hESFM med B27 tillæg alene. Der er ikke behov for mellemstore ændringer efter dette trin.

6. Spirende analyse

  1. Saml dag 8 iPSC-afledte BMECs og frø dem ved 100.000 celler / godt på en 24-godt fladbundet plade frisklakeret med 200 μL / cm2 af kælderen membran matrix.
  2. Disse celler behandles med hESFM med fortyndet (1:200) B27 og 40 ng/mL vaskulær endotelvækstfaktor A (VEGFA165).
  3. Overhold celler hver 24. time og skift mediet hver anden dag.

7. Immunokytokemi (ICC)

BEMÆRK: ICC udføres på 24-brønds fladbundede plader.

  1. Efter 48 timers sub-dyrkning (dag 8), vask celler to gange med DPBS. Fix celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter.
  2. Vask celler tre gange med DPBS, 5 minutter pr vask. Pre-blok celler i 1 time ved stuetemperatur i DPBS med 5% æsel serum og 0,3% Triton X-100 (v / v).
  3. Inkuber med primære antistoffer: mus anti-human-PECAM1 (1:100, bestand 0,5 mg/mL), kanin anti-human-TJP1 (1:200, bestand 0,53 mg/mL), mus anti-human-CLDN5 (1:200, 0,5 mg/mL), mus anti-human-OCLN (1:200, lager 0,5 mg/mL) og kanin anti-human-SLC2A1(1:100, bestand 0,2 mg/mL) i DPBS indeholdende 5% æsel serum natten over ved 4 °C.
    1. Skyl cellerne én gang med DPBS og vask derefter fem gange i 5 minutter pr. vask med DPBS.
  4. Inkuber celler med sekundære antistoffer: æsel-anti-kanin Alexa Fluor 555 (1:200) og æsel-anti-mus 488 (1:200) i DPBS indeholder 5% æsel serum i 1 time.
  5. Efter denne inkubation tilsættes Hoechst 33342 trihydrochloridtrihydrat fortyndet (1:1000) i DPBS i 10 minutter.
    1. Fjern Hoechst 33342 opløsning og skyl en gang med DPBS og vask fire gange med DPBS i 5 minutter pr vask.
  6. Visualiser celler på fluorescensmikroskoper for at se efter udtryk og lokalisering af celleproducenter.

8. TEER Måling og analyse

BEMÆRK: Corning 12-Transwell filtrerede plader er udstyret med filtre bestående af 1,12 cm2 polyethylen terephthalatmembraner og 0,4 mikrometer porer. TEER-målinger opnås i tekniske (3 pr. brønd) og biologiske replikater (3 brønde pr. cellelinje og/eller tilstand).

  1. 24 timer efter subkultering (dag 7) måles TEER ved hjælp af spisepindeelektroder og et voltohmmeter hver 24. time. Se brugervejledningen til voltohmmeter for at få specifikke instruktioner om at opnå målinger.
    1. Hvis du vil måle TEER, skal du oplade voltohmmeterinstrumentet aftenen før. Tør instrumentet og spisepindeelektroderne let med 70% ethanol, før de placeres i sikkerhedshætten.
    2. Tænd for strømmen, og kalibrer ohmmåleren som anbefalet af producenten.
    3. Tilslut spisepindeelektroder og skyl elektroder med 70% ethanol efterfulgt af DPBS.
    4. Placer den kortere endeelektrode i transbrøndindsatsen (det apikale kammer) og den længere ende ind i basolateralkammeret.
    5. Mål først en tom brønd, der kun er belagt med COL4/FN. Mål derefter de andre brønde.
    6. Skyl hurtigt spisepindeelektroder med 70% ethanol efterfulgt af DPBS ved måling af forskellige forhold (dvs. måling af forskellige cellelinjer).
  2. Når alle målinger (i Ω) er registreret, skylles spisepindeelektroder med 70% ethanol og derefter sterilt vand. Tør forsigtigt elektroden af og lad den lufttørre i sikkerhedshætten.
  3. Beskæmp de tredoblings-TEER-værdier (i Ω) fra den tomme brønd, og træk denne gennemsnitsværdi fra hver rå TEER-værdi efter betingelse.
    1. Gennemsnit de subtraktive værdier, og gang dem med 1,12 cm2 (overfladearealet på 12-transwellindsatsen).
    2. Brug transformerede værdier fra trin 6 til at generere grafen, der viser TEER-værdi og standardfejl for hver dag i TEER-målingen.

9. Efflux Transporter Aktivitet og analyse

BEMÆRK: Efflux transporter aktivitetsanalyse udføres på en 24-godt fladbundet plade. Efflux transportører af interesse omfatter ABCB1 og ABCC1. Det anbefales, at hver betingelse udføres i tre eksemplarer med kontrolbrønde (dvs. tomme brønde uden de respektive hæmmere).

  1. Efter 48 timers subkultering (dag 8) inkuberes celler med 10 μM Valspodar (ABCB1-hæmmer) eller 10 μM MK571 (ABCC1-hæmmer) i 1 time ved 37 °C.
    1. Der fremstilles 10 mM Valspodar-bestand ved opløsning af 5 mg pulver (1214,64 g/mol) i 412 μL DMSO og fortyndes til arbejdskoncentration på 10 μM. For eksempel at lave 10 mL hESFM med 10 μM Valspodar, bland 10 μL af 10 mM Valspodar lager med 10 mL hESFM.
    2. Der fremstilles 10 mM MK571-bestand ved opløsning af 5 mg pulver (537,07 g/mol) i 931 μL og fortyndes til arbejdskoncentration på 10 μM. For eksempel at lave 10 mL hESFM med 10 μM MK571 blandes 10 μL af 10 mM MK571 lager med 10 mL hESFM.
  2. Efter 1 time inkuberes celler med 10 μM rhodamin 123 (ABCB1-substrat) eller 10 μM 2',7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat (H2DCFDA, ABCC1-substrat) med eller uden deres respektive hæmmere i 1 time ved 37 °C.
    1. Der fremstilles 10 mM rhodamin 123 ved opløsning af 10 mg pulver (380,82 g/mol) i 875 μL DMSO og fortyndes til arbejdskoncentration på 10 μM. For eksempel at gøre 10 mL hESFM med 10 μM rhodamin 123, bland 10 μL af 10 mM rhodamin 123 bestand med 10 mL hESFM.
    2. Der fremstilles 10 mM H2DCFDA ved opløsning af 50 mg pulver (487,29 g/mol) i 10,26 mL DMSO og fortyndes til arbejdskoncentration på 10 μM. For eksempel at gøre 10 mL hESFM med 10 μM rhodamin 123, bland 10 μL af 10 mM rhodamin 123 bestand med 10 mL hESFM.
  3. Vask celler to gange med 0,5 mL DPBS og lyse ved hjælp af DPBS, der indeholder 5% Triton-X (v/v).
  4. Fluorescensen af lyscellerne måles ved hjælp af en multiplade- eller mikropladelæser (se materialelisten).
    1. Sæt fluorescerende pladelæserinstrument til 485 nanometer excitation og 530 nanometer emission, og mål fluorescens ved disse bølgelængder.
    2. For brønde, der ikke anvendes i transportøranalysen, vaskes celler to gange med DPBS, før de fastgøres med 4% PFA til cellekernekvantificering.
  5. Inkuber celler med Hoechst 33342 trihydrochloridtrihydrat fortyndet (1:1000) i DPBS i 10 minutter. Billede flere visuelle felter i hver brønd til at beregne gennemsnitlige cellekerner tæller ved hjælp af fluorescens mikroskoper.
  6. Tæl kerner ved hjælp af Fiji, og normaliser fluorescensværdier pr. celle i forhold til disse tællinger.
    1. Beregn gennemsnitlig akkumulering af fluorescens ved at trække akkumuleringsværdi for rå fluorescens for hver betingelse fra den respektive tomme værdi.
    2. Gennemsnitlige subtraktive værdier for hver betingelse.
    3. Divider gennemsnitsværdier fra trin 9.6.1 med det gennemsnitlige antal celler. Brug disse værdier til at normalisere fluorescensværdier pr. celle.
    4. Brug normaliserede værdier til at generere en grafisk repræsentation for hver inhibitortilstand og udføre alle nødvendige statistiske analyser.

10. Passaging, udvidelse og Cryopreserving BMECs

  1. Genopfyld dag 8 BMEC kulturer med frisk hESFM suppleret med fortyndet (1:200) B27 og lad cellerne udvide i yderligere to dage på COL4 / FN matrix.
  2. Coat en ny 12-Transwell filtreret plade og en 24-godt fladbundet plade med 400 μg/mL COL4 og 100 μg/mL FN og inkuber i 4 timer.
  3. På dag 10 vaskes celler med DPBS og inkuberes med 1 mL enzymatisk EDTA i mindst 15 minutter ved 37 °C, indtil der opnås en enkelt celleaffjedring.
  4. Opsamle celler via centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    1. For at kryopreservere disse celler, resuspend celle pellets med friske hESFM med 30% FSTR (FBS) og 10% DMSO.
    2. IPSC-afledte BMEC'er opbevares i kryopreserverede hætteglas i en isopropanolbeholder i de første 24 timer ved -80 °C, hvorefter de anbringes i flydende nitrogen til langtidsopbevaring ved -160 °C.
    3. For at passere disse celler, resuspend celle pellets med friske hESFM suppleret med fortyndet (1:200) B27.
  5. Frøceller på belagte plader tilberedt i trin 10.2. Frøceller ved hjælp af et forhold på 1 brønd af en 6-brønds plade til 3 brønde af en 12-transwell filtreret plade og til 6 brønde af en 24-brønds plade. Tillad celler at vokse og udvide i 24 timer.
  6. På dag 11 skal du måle TEER ved at følge trinnene i trin 8.
  7. På dag 12 skal du udføre ICC ved at følge trinnene i trin 9.
  8. For at optø kryopreserverede BMEC'er skal du placere de kryopreserverede hætteglas i et varmt vand eller perlebad ved 37oC. Derefter overføres de optøede BMECs til 5 mL hESFM suppleret med fortyndet (1:200) B27.
    1. Opsamle celler via centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspend cellerne i hESFM suppleret med fortyndet (1:200) B27, 10 μM RA og 10 μM Y-27632.
    2. Efter 24 timer skiftes medium til hESFM suppleret med fortyndet (1:200) B27 og 10 μM Y-27632 uden RA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BMEC Differentiering
Et par kritiske skridt i denne protokol bør følges præcist (figur 1). E6 medium brug på dag 1 er vigtig, da det ofte bruges til at udlede neuroectoderm afstamning fra iPSCs inden for en relativt kort periode giver reproducerbare resultater på tværs af flere cellelinjer36. Et andet vigtigt skridt er på dag 4 i differentiering, hvor E6-medium skal skiftes til hESFM med fortyndet (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF og 10 μM RA for at udvide iPSC-afledte BMEC'er. Tilsætningen af B27-tillægget anvendes som et alternativ til kvægserum til støtte for serumfri celledyrkning1, bFGF tilsættes for at lette væksten af iPSC-afledte BMEC'er6, og RA bruges til at lette udviklingen af BBB-fænotype35. Det sidste vigtige skridt omfatter rensningsfasen, hvor dag 6 iPSC-afledte BMEC'er subkultureres på en COL4/FN-belagt plade for at vælge iPSC-afledte BMECs1,6,35,36. Figur 2 viser den morfologiske overgang fra iPSC'er til BMECs. Efter en dag med E6 medium (dag 1), cellulære morfologi svarer til iPSCs. Ved dag 4 af E6, celler begynder at fremstå synligt adskilt fra iPSCs og dækker det meste af brønden (~ 90% sammenløb). Ved dag 6, mens dyrket i hESFM med fortyndet (1:200) B27, 20 ng / mL bFGF og 10 μM RA, cellulære morfologi begynder at have en langstrakt og brosten udseende. På dag 8 er hver enkelt celle forskellig i et stort brostensmønster. Der blev foretaget en spireanalyse for at påvise det angiogene potentiale hos iPSC-afledte BMEC'er, som resulterede i rørlignende strukturer efter 3 dages VEGFA165-behandling (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Skitse til differentiering af humane iPSC'er til BMECs. Humane iPSC'er blev oprindeligt dyrket i stamcellemedium indeholdende 10 μM Y-27632 i 24 timer, før de skiftede medium til E6 i 4 dage. På dag 4 blev mediet ændret til hESFM med (1:200) B27-tillæg, 20 ng/mL bFGF og 10 μM RA i 2 dage. På dag 6 blev cellerne subkultureret på COL4/FN-belagte plader. På dag 7 blev mediet ændret til hESFM med B27-tillæg uden bFGF, og RA og TEER blev målt. På dag 8 blev der udført ICC- og efflux-transportaktivitetsanalyser. iPSC-afledte BMEC'er blev udvidet indtil dag 10, før de blev passeret til henholdsvis en transbrøndplade eller en 24-brønds flad bundplade til TEER-måling og ICC-analyse. Dag 8 BMECs blev brugt til spiring assay (ikke afbildet). 2 brønde af en 6-brønds plade af iPSC-afledte BMEC'er blev indsamlet og opbevaret i hESFM med 10% DMSO og 30% FBS ved -80 °C og derefter i flydende nitrogen til langtidsopbevaring ved -160oC. På dag 12 blev der observeret et højdepunkt i TEER-værdien i udvidede iPSC-afledte BMECs, på hvilket tidspunkt ICC blev udført. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Billeder i det lyse felt, der viser differentiering af iPSC'er til BMECs. Efter en dag med kultur i E6 medium, bevarer iPSCs deres karakteristiske morfologi. På dag 4 i E6 medium, cellulære morfologi synes tydeligt forskellig fra iPSCs. På dag 6 ændres cellulær morfologi til et langstrakt og brostensbelagt udseende. På dag 8 vises celler store og med et brostensbelagt mønster. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Angiogent potentiale i iPSC-afledte BMEC'er. Rensede iPSC-afledte BMEC'er blev seedet ved 100.000 celle/cm2 på kældermembranmatrix i hESFM med (1:200) B27-tillæg og 40ng/mL VEGFA165. Tube-lignende strukturer dukkede op efter 3 dages VEGFA165 behandling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Rensede iPSC-afledte BMEC'er blev seedet ved 100.000 celle/cm2 på kældermembranmatrix i hESFM med (1:200) B27-tillæg og 40ng/mL VEGFA165. Tube-lignende strukturer dukkede op efter 3 dages VEGFA165 behandling.

BMEC karakterisering blev udført ved hjælp af immunocytochemistry for celle-specifikke markører. iPSC-afledte BMEC'er blev vurderet for tilstedeværelsen af stramme krydsproteiner (OCLN, TJP1 og CLDN5), som almindeligvis udtrykkes i de stramme knudepunkter i hjernens endotelceller3 og endotelceller i lungerne, leveren ognyrerne 18. Andre markører såsom PECAM1 og SLC2A1 er tidligere blevet brugt som markører for rensede BMECs6. PECAM13 og SLC2A4 udtrykkes begge i vaskulære endotelceller i BBB. De iPSC-afledte BMEC'er, der blev genereret ved hjælp af denne protokol, var med til at udtrykke alle fem af disse markører (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Markøranalyse af iPSC-afledte BMEC'er. Humane iPSC-afledte BMECs blev farvet til stramt kryds (OCLN, TJP1, CLDN5), tilstrømning transporter (SLC2A1), og tilhængere krydset (PECAM1) proteiner. OCLN-, TJP1- og CLDN5-proteiner er primært lokaliseret i cellemembranen. SLC2A1 og PECAM1 er lokaliseret i både kerner og cellemembran. Hoechst 33342 trihydrochloridtrihydrat blev brugt til nuklear farvning. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at karakterisere BBB-funktionen af BMECs blev TEER målt 24 timer (dag 7) efter subkultering, og mediet blev ændret til hESFM med fortyndet (1:200) B27 uden bFGF og RA. Teer-målingerne blev opnået fra dag 7 af differentiering (dag 0 i TEER-måling) og toppede ved ~2000 Ω x cm2 på dag 8 eller 48 timer efter subkultering af BMECs(Figur 5). Disse TEER-værdier ligger inden for det område, der er beskrevet for iPSC-afledte BMEC-afledte BMEC'er med rotte-primære astrocytter37. IPSC-linjen havde ingen mærkbar BBB-funktion i henhold til deres lave TEER-værdier.

Figure 5
Figur 5: TEER-målinger i iPSC-afledte BMEC'er. TEER-værdierne toppede efter en dag med subkultering på COL4/FN-matrix (på dag 8 i differentiering). TEER-målinger blev opnået i tekniske (3 foranstaltninger pr. brønd) og biologiske replikater (3 brønde pr. cellelinje). Den tekniske gennemsnitsværdi fra en tom brønd blev trukket fra rå TEER-værdier. Disse værdier blev gennemsnit for hver dag og ganget med 1,12 cm2 (overfladeareal af 12-transwellindsatsen). Fejllinjer repræsenterer standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at evaluere ABCB1 og ABCC1 efflux transporter aktivitet, mængden af fluorescerende substrat taget op for ABCB1 og ABCC1 blev kvantificeret efter inkubation med deres respektive hæmmere. Som forventet førte hæmning af ABCB1- og ABCC1 efflux-transportører med PSC833 (ABCB1-hæmmer) eller MK-571 (ABCC1-hæmmer) til en stigning i henholdsvis rhodamin 123 (R123) eller 2',7'-dichlordidihydrofluoresceindiacetat (H2DCFDA) (figur 6). Dette tyder på, at BMEC'er, der udledes ved hjælp af denne protokol, har en effektiv transportaktivitet.

Figure 6
Figur 6: Efflux Transporter Aktivitet i iPSC-afledte BMECs. Efflux transportvirksomhed i BMEC'er blev bestemt ved at kvantificere akkumulering af rhodamin 123 (R123) eller 2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA) I nærværelse eller fravær af PSC833 (ATP bindende kassette underfamilie B-medlem 1 (ABCB1) hæmmer) eller MK-571 (ATP bindende kassettekassette subfamily C medlem 1 (ABCC1) hæmmer). Der blev udført tekniske tre eksemplarer for hver tilstand (N=1). Fluorescensværdier fra kontroltilstanden (dvs. uden hæmmere) blev fratrukket rå fluorescensværdier. Disse fluorescensakkumulering blev normaliseret pr. celle for hver teknisk replikat. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af studerende t-test fra de tre tekniske replikater. Der blev ikke observeret nogen statistisk signifikans mellem akkumulering af R123 med og uden ABCB1-hæmmer (t-stat= -1,66, p=0,11). Der blev observeret statistisk signifikans mellem akkumulering af H2DCFDA med og uden ABCC1-hæmmer (t-stat=-7,23, p=0,04). *p<0,05. Fejllinjer repræsenterer standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Passaging, udvidelse og Cryopreserving iPSC-afledte BMECs
Et andet mål var at undersøge, om iPSC-afledte BMEC'er kunne passeres og kryopreserveres efter subkultering. Til dette formål fik dag 7 iPSC-afledte BMEC'er lov til at udvide indtil dag 10, før de blev videregivet til nybelagte COL4/FN 12-transwell filtrerede plader til TEER-måling og 24-godt fladbundsplade til ICC-analyse (Figur 7). Ved hjælp af denne betingelse fortsatte iPSC-afledte BMEC'er med at formere sig, fastholdt udtrykket OCLN, TJP1, CLDN5, SCL2A1 og PECAM1 (Figur 8) og fortsatte med at opretholde korrekte TEER-værdier (toppe ved ~ 2000 Ω x cm2) efter passaging (Figur 9). Cryopreserved BMECs blev senere optøet, udvidet og derefter passeret (Figur 7). TEER-målinger af BMECs blev opnået 24 timer efter optøning og flere dage efter det. TEER-målingerne af disse postoptøede BMEC'er blev reduceret (toppede kun med 800 Ω x cm2)sammenlignet med nyudledte BMEC'er. En anden passaging af post optøede BMECs udstillet endnu lavere TEER værdier (toppede ved kun 200-300 Ω x cm2) (Figur 9) og viste flosset og / eller fregnede mønstre af den stramme vejkryds dannelse (Figur 10). Western blot analysis48 viste, at iPSC'er primært udtrykte en endodermal markør (SOX17)49 og nogle stramme krydsmarkører (OCLN), men ikke andre BMEC-relaterede markører (TJP1, CLDN5 og SLC2A1) (Figur 11). BMECs udtrykte primært endotelrelaterede markører (TJP1, CLDN5, OCLN og SLC2A1) med lave niveauer af endodermal markør, SOX17.

Figure 7
Figur 7: Lyse feltbilleder af udvidede og kryopræserverede iPSC-afledte BMECs. A) Dag 10 (4 dage efter den første underkultur) celler nåede maksimal sammenløb. B) Dag 11, 24 timer efter at have passeret på COL4/FN belagt 24-brønde plade. C) Dag12, 48 timer efter passaging på COL4/FN belagt 24-brønde plade; top-TEER-værdier blev observeret, og ICC blev udført. D) 48 timer efter optøede iPSC-afledte BMEC'er på COL4/FN-belagt 6-brøndes plade tidligere var kryopræserveret ved 1,2 x 102 celler/mL. E) 24 timer efter, at BMEC-afledte BMEC'er efter optøningen blev passeret på COL4/FN-belagt 6-brøndes plade. F) 48 timer efter, at der blev passeret iPSC-afledte BMEC'er efter optøningen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: ICC for iPSC-afledte BMECs efter passaging. BMECs blev passeret og vedligeholdt på COL4/FN-matrix indtil dag 12, hvor TEER-værdierne toppede. BMECs på dag 12 blev farvet for stramt kryds (OCLN, TJP1, CLDN5), tilstrømning transporter (SLC2A1) og tilhængere krydset (PECAM1) proteiner. Udtryksmønsteret og lokaliseringen ligner dem, der observeres under forhold, hvor der ikke blev udført passaging, som vist i figur 4. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Sammenligning af TEER-målinger i iPSC'er, ikke-passerede BMECs, passerede BMECs, kryopreserverede BMECs og cryopreserved & passage BMECs. På dag 1 toppede TEER-værdierne for ikke-passerede og passerede BMEC'er, men ikke iPSC'er eller kryopreserverede BMEC'er. Cryopreserved BMECs havde moderate TEER-værdier mellem dag 3 og 7 med endnu lavere TEER-værdier for de kryopreserverede og passerede BMECs. iPSC'erne viste ingen målbare TEER-værdier mellem dag 0 og 9. TEER-målinger blev opnået i tekniske (3 målinger pr. brønd) og biologiske replikater (3 pr. cellelinje). Den tekniske gennemsnitsværdi fra en tom brønd blev trukket fra de rå TEER-værdier. Disse værdier blev gennemsnit for hver dag og ganget med 1,12 cm2 (overfladeareal af 12-transwellindsatsen). Fejllinjer repræsenterer standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: ICC af kryopreserverede og passerede BMECs. BMEC'er blev passeret og opretholdt på COL4/FN, indtil de maksimale TEER-værdier blev observeret. BMECs blev farvet for stramt kryds (OCLN, TJP1, CLDN5), tilstrømning transporter (SLC2A1) og klæber krydset (PECAM1) proteiner. Udtrykket mønster af stramme krydsmarkører syntes flosset og/eller fregnede sammenlignet med ikke-passerede BMECs (Figur 4) og passerede BMECs (Figur 8). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: Western blot analyse af iPSCs, ikke-passerede BMECs, passage BMECs, og cryopreserved & passage BMECs. Vestlige blots, der viser niveauer af TJP1, OCLN, SOX17, SLC2A1, CLDN5 og lastningskontrol (GAPDH). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ændringer og fejlfinding

I denne protokol har vi foretaget nogle ændringer i brugen af en almindeligt anvendt ekstracellulær matrix og cellekultur medier under iPSC dyrkning til afledning af BMECs (Figur 1). Disse ændringer påvirkede ikke evnen til at udlede BMECS fra menneskelige iPSC'er som beskrevet i Lippmann-protokol1. Der blev anvendt en iPSC-linje fra en anden sund donor til at påvise , at denne ændrede protokol viser resultater , der kan sammenlignes med tidligere undersøgelser med andre linjer1. For kryopræservering, B27 supplement blev brugt i stedet for 1% blodplade dårlig plasma-afledt serum (PDS)40, men dette påvirkede BMEC troskab i efterfølgende dyrkning. Med hensyn til fejlfinding kan TEER-værdier svinge hurtigt, før de stabiliseres. Disse udsving kan skyldes temperaturændringer, der opstår, når pladerne flyttes fra 37 °C til stuetemperatur37. For at løse dette problem bør målingerne foretages hurtigt, effektivt og konsekvent. Hvis det er nødvendigt, kan temperatureffekter indregnes ved hjælp af en matematisk formel leveret af Blume et al. 200949 for at opnå temperatur korrigerede TEER-værdier.

Begrænsninger i denne protokol

På trods af at have opnået BMEC'er med en robust BBB-fænotype (dvs. høj TEER-værdi), er det fortsat en stor udfordring at bevare denne BBB-ejendom i en længere periode. Som vist her var de maksimale TEER-værdier (~2000 Ω x cm2) ved hjælp af denne protokol meget lavere end tidligere rapporterede top-TEER-værdier (~8000 Ω x cm2)1. På trods af denne observation faldt TEER-værdierne inden for det sædvanlige interval (2000-8000 Ω x cm2) af tidligere rapporterede værdier1. En anden begrænsning er variationen i de maksimale TEER-værdier, der er resultatet af forskellige anvendte iPSC-linjer, hvilket er observeret i andre versioner af denne protokol36. Variationen mellem de forskellige cellelinjer kan skyldes væksten og ekspansionshastigheden for hver iPSC-linje, som påvirkes af miljøfaktorer51. En anden begrænsning er relateret til kryopræservering, da vores protokol ikke bevarede BMEC-troskab. Det er muligt, at 1% PDS40 giver større stabilitet af BMECs under kryopræservering.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder

De iPSC-afledte BMECs giver celler, der har den genetiske baggrund af specifikke personer, hvilket er værdifuldt i at udnytte disse celler til studiet af sygdomsbiologi. Dette er ikke tilfældet ved anvendelse af dyremodeller eller primære BMEC-kulturer udvundet af andre dyr37. Desuden viser in vitro primære BMEC-kulturer lave TEER-værdier (~100 Ω x cm237), meget lavere end dem, der opnås med menneskelige iPSC-afledte BMECs med den protokol, der er beskrevet her. Denne ændrede protokol indeholder en detaljeret metode til at opnå menneskelige BMEC'er fra iPSC'er med potentiale til at udvide og vedligeholde dem til længere brug. Evnen til at passere og gemme differentierede BMECs kan give alsidighed og fleksibilitet i eksperimentelt design, især når man studerer flere cellelinjer på én gang. På grundlag af disse resultater kan iPSC-afledte BMEC'er udvides og passeres efter det første subkulterende trin (figur 7, figur 8 og figur 9), men kryopræservering skal undersøges nærmere. Denne protokol kan også bruges sammen med andre stamcellebaserede cellulære modeller til at udvikle innovative tilgange såsom vaskularisering af hjerneorganoider. Nuværende metoder til at generere hjerneorganoider resulterer i en ufuldstændig rekonstituering af celletyper i den menneskelige hjerne, da de mangler endotelceller og kritiske elementer i den neurovaskulære enhed, der udgør BBB52,53. Den protokol, der er beskrevet her, kan give en trækbar og reproducerbar tilgang ved hjælp af todimensionelle Transwell / co-dyrkningssystemer, der er billigere og lettere at implementere end 3D-modeller.

Fremtidige anvendelser af denne protokol

Denne protokol kan bruges til at studere neurovasculaturens og BBB's rolle i neuropsykiatriske lidelser som skizofreni og bipolar lidelse, hvor underskud i neurovasculaturen er blevet hypotese til at spille en rolle9,10,20,54,55. Tidligere versioner af denne protokol36 var blevet brugt til at udlede BMECs fra iPSC-linjer af patienter med Huntington disease7 og 22q sletning syndrom patienter med skizofreni43. Begge undersøgelser7,43 viste vellykket anvendelse af denne metode til at undersøge paracellulær og / eller transcellulær funktion relateret til BBB. Der er blevet givet udtryk for en vis bekymring over dyreserummets potentielle forvirrende virkninger i tidligere protokol1. Den serumfri protokol, der bruges her, fjerner denne bekymring, samtidig med at den giver lignende resultater som tidligere protokoller til afledning af BMEC'er.

Kritiske trin til differentiering og udvidelse af BMECs

Der er fire kritiske trin ved implementeringen af denne protokol. For det første er såning af iPSC'er med en optimal tæthed (dvs. såning ved ~ 15.600 celler / cm2) vigtig for effektiv BMEC-differentiering. Hvis celletætheden er for høj eller for lav ved dag 4 af differentiering, kan kulturer vise større satser for cellulær heterogenitet56. Et andet vigtigt skridt er induktionen af differentiering mellem dag 1 og dag 4, hvor E6 medium bruges til at indlede differentiering. E6 anvendes i stedet for det "ubetingede medium", som blev anvendt i tidligere protokol6,35. Ikke alene E6 medium skære ned differentiering tid fra 13 dage til 8 dage, men det fremmer også udtryk for stramme junction proteiner (TJP1, OCLN, CLDN5) og BMEC markører (PECAM1 og SLC2A1)36. Anvendelsen af E6-medium resulterede også i korrekte TEER-værdier (figur 5) og ABCB1 - og ABCC1-efflux-transportvirksomhed (figur 6)6,35. For det tredje gav anvendelsen af B27 i stedet for kvægserum mulighed for serumfri tilstand, hvilket forbedrede konsistensen og pålideligheden af BMEC-differentiering1. Endelig, med hensyn til at udvide iPSC-afledte BMECs, celler bør passeres, når de når ~ 100% sammenløb. På grundlag af denne protokol kan iPSC-afledte BMEC'er udvides yderligere og passeres efter den indledende underkulturfase (figur 7, figur 8 og figur 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (til R.K.), en National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). en National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (til R.K.), en Sydney R Baer Jr Foundation Grant (til P.L.) Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (til R.K.), Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (til R.K.), Phyllis & Amp; Jerome Lyle Rappaport Foundation (til R.K.), Harvard Stem Cell Institute (til R.K.) og af Steve Willis og Elissa Freud (til R.K.). Vi takker Dr. Annie Kathuria for hendes kritiske læsning og feedback på manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Neurovidenskab Problem 165 Human induceret pluripotente stamceller hjernens mikrovaskulære endotelceller blodhjernebarriere trans-endotel elektrisk modstand transportaktivitet mikrovaskulær skizofreni bipolar lidelse passaging ekspansion kryopræservering
Afledning, ekspansion, kryopræservering og karakterisering af hjernemikrobielle endotelceller fra menneskeskabte pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya,… More

Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter