استخدام تحليل الصور القائم على الكمبيوتر لتحسين القياس الكمي لنقائل الرئة في نموذج سرطان الثدي 4T1
Summary
نحن نصف طريقة أكثر اتساقا وسرعة لتحديد الانبثاث الرئوي في نموذج سرطان الثدي 4T1 باستخدام فيجي-ImageJ.
Abstract
يعد سرطان الثدي من الأمراض الخبيثة المدمرة، حيث يمثل 40,000 حالة وفاة للإناث و30٪ من تشخيصات سرطان الإناث الجديدة في الولايات المتحدة في عام 2019 وحده. السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بسرطان الثدي هو العبء النقيلي. ولذلك، تحتاج النماذج قبل السريرية لسرطان الثدي لتحليل العبء النقيلي لتكون ذات صلة سريريا. نموذج سرطان الثدي 4T1 يوفر نموذج الماوس تلقائيا- الانبثاث, كميا للمرحلة الرابعة سرطان الثدي البشري. ومع ذلك، فإن معظم بروتوكولات 4T1 تحدد العبء النقيلي من خلال عد المستعمرات الملطخة يدويًا على لوحات زراعة الأنسجة. في حين أن هذا يكفي للأنسجة ذات العبء النقيلي المنخفض ، فإن الخطأ البشري في العد اليدوي يسبب نتائج غير متناسقة ومتغيرة عندما تكون اللوحات نقاشًا ويصعب عدها. تقدم هذه الطريقة حلاً يستند إلى الكمبيوتر إلى خطأ العد البشري. هنا، نقوم بتقييم البروتوكول باستخدام الرئة، وهو نسيج النقيلي للغاية في نموذج 4T1. يتم الحصول على صور للوحات الميثيلين ذات اللون الأزرق وتحميلها للتحليل في فيجي -ImageJ. ثم يحدد Fiji-ImageJ النسبة المئوية للمنطقة المحددة من الصورة التي تكون زرقاء، وتمثل النسبة المئوية للصفيحة ذات العبء النقيلي. هذا النهج القائم على الكمبيوتر يقدم نتائج أكثر اتساقا وأسرع من العد اليدوي أو التقييم الهسجولوجي للأنسجة النقيلي عالية. يعتمد اتساق نتائج فيجي-ImageJ على جودة الصورة. يمكن أن تحدث اختلافات طفيفة في النتائج بين الصور ، وبالتالي يوصى بأن يتم التقاط صور متعددة ومتوسط النتائج. على الرغم من الحد الأدنى من القيود، وهذا الأسلوب هو تحسين لتحديد حجم العبء النقيلي في الرئة من خلال تقديم نتائج متسقة وسريعة.
Introduction
وسيتم تشخيص واحدة من كل ثماني نساء بسرطان الثدي في حياتها, وحتى الآن على الرغم من خيارات العلاج المتعددة سرطان الثدي هو السبب الرئيسي الثاني للوفيات المرتبطة بالسرطان في النساء الأميركيات1. هؤلاء النساء لا يموتون من الورم الأساسي في ثديهم. بدلا من ذلك، فإن العبء النقيلي هو المسؤول عن وفيات هذا المرض لأنه ينتشر عادة إلى الرئة والعظام والدماغ والكبد والغدد الليمفاوية2. وبسبب هذا، تحتاج نماذج سرطان الثدي إلى تقييم الانبثاث للمساهمة في الحد من وفيات هذا المرض. نموذج سرطان الثدي 4T1 مورين هو بروتوكول رائع لتحقيق ذلك. الطريقة الموصوفة هنا تقدم تحسنا لنموذج 4T1 باستخدام فيجي-ImageJ لتحديد ورم خبيث الرئة، مما يؤدي إلى نتائج متسقة وسريعة.
نموذج 4T1 هو راسخ, مع معظم مختبرات استخدام بروتوكولات مثل تلك التي وصفها بولاسكي و Ostrand روزنبرغ في 20013. خط الخلية 4T1 هو 6-Thioguanine (6TG) مقاومة وممثل للمرحلة الرابعة، وسرطان الثدي الثلاثي السلبية3،4،5. وهو ذو صلة سريريا كما هو نموذج تقويم العظام و الانبثاث تلقائيا إلى نفس الأجهزة كما هو الحال في سرطان الثدي البشري3,4. الخلايا 4T1 تلقائياً نقّل بمعدل يمكن التنبؤ به استناداً إلى كمية الخلايا المحقونة3,4. والأهم من ذلك، أن الاختلافات الجينية بين الفئران المستخدمة هنا تسببت في حدوث تقلب متوقع بين الأفراد في العبء النقيلي. لتقييم الانبثاث، يتم حصاد الأنسجة لجمع وتحديد الخلايا السرطانية في مواقع بعيدة باستخدام اختيار 6TG وتلطيخ الميثيلين الأزرق. والنتيجة هي مجموعة من لوحات ثقافة الأنسجة مع النقاط الزرقاء التي تمثل المستعمرات النقيلي. ومع ذلك، فإن بروتوكول بولاسكي وأوستراند روزنبرغ يحددان كمياً المستعمرات النقيلية عن طريق عدها يدوياً، وبالتالي كان هذا هو الوسيلة القياسية لتقييم الانبثاث في هذا النموذج. في حين أن هذا سهل للأنسجة ذات العبء النقيلي المنخفض ، فإن الأنسجة مثل الرئتين غالباً ما تكون محملة بالنقائل. كما يمكن أن تكون لوحات الرئة اثقا جدا، بدقة ودقة تحديد حجم المستعمرات النقيلي عن طريق العد اليدوي من الصعب وعرضة للخطأ البشري. لقياس العبء النقيلي بشكل أفضل، فإننا نصف استخدام فيجي-ImageJ لحل يستند إلى الكمبيوتر لخطأ العد البشري. تحليل الهستوباتولوجي مع الدم و eosin (H & E) تلطيخ وسيلة أخرى لتحديد الانبثاث الرئة، ومن المثير للاهتمام كما تم تحسين مع فيجي-ImageJ البرمجيات6،7. ومع ذلك، لأن التحليل الهستوولوجي يلاحظ شريحة واحدة من الرئة، يمكن أن تكون غير دقيقة وغير تمثيلية. وذلك لأن نموذج 4T1 يسبب العديد من الآفات النقيلي في جميع أنحاء الجهاز التي لا توزع بالتساوي. في حين أن الاتجاهات العامة بين التحليل الهدولوجي والعد اليدوي يمكن أن تكون مماثلة8، يمكن أن تختلف القيم الفردية ، وبالتالي لا ينبغي استخدام التحليل الهستوولوجي كوسيلة وحيدة للكمية. نحن نبرهن على الفائدة مقارنة مع التحليل الهستوولوجي والتناقضات في العد اليدوي بين العدادات المختلفة ، مع إظهار اتساق استخدام فيجي ImageJ. بالإضافة إلى ذلك، نُظهر أن هذه الطريقة يمكن أن تقلل وقت الحضانة من 10-14 يومًا إلى 5 أيام، مما يعني أن الباحثين يمكنهم تحليل البيانات من دراستهم في وقت أقرب بكثير من الاعتماد على العد اليدوي.
هذه الطريقة هي مجموعة من التعديلات البسيطة على بروتوكول بولاسكي وأوستراند روزنبرغ3. نظرًا لأن نموذج 4T1 مستخدم على نطاق واسع ، ولأن الانبثاث الرئوي هو معلمة حاسمة لقياس في النماذج قبل الظهر ، نعتقد أن هذه الطريقة يمكن استخدامها على نطاق واسع وذات قيمة عالية للباحثين في سرطان الثدي. الإمدادات الإضافية الوحيدة اللازمة هي الكاميرا والوصول إلى جهاز كمبيوتر مع فيجي ImageJ، وهو برنامج مجاني يستخدم بشكل متكرر في تحليل الصور9. تركز هذه الطريقة على وجه التحديد على الانبثاث الرئوي، ولكن يمكن استخدامه للأنسجة الأخرى ذات العبء النقيلي الكبير.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما هو موضح، يمكن أن يكون عد المستعمرات النقيلي يدويا على كل صفيحة الرئة طريقة غير دقيقة وغير دقيقة لتحديد نسل الرئة، مما يدل على الحاجة إلى وسيلة أفضل للقياس الكمي(الشكل 2). اختلف التحليل الهدولوجي قليلاً عن كل من الفرز اليدوي وتحليل فيجي-ImageJ(الشكل 2B و4D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل كلية فرجينيا ماريلاند للطب البيطري (IA)، ومعهد فرجينيا للتكنولوجيا الحيوية ومركز العلوم التطبيقية للصحة المهندسة (IA)، والمعاهد الوطنية للصحة R21EB028429 (IA).
Materials
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 1 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
