Summary
نحن نصف طريقة أكثر اتساقا وسرعة لتحديد الانبثاث الرئوي في نموذج سرطان الثدي 4T1 باستخدام فيجي-ImageJ.
Abstract
يعد سرطان الثدي من الأمراض الخبيثة المدمرة، حيث يمثل 40,000 حالة وفاة للإناث و30٪ من تشخيصات سرطان الإناث الجديدة في الولايات المتحدة في عام 2019 وحده. السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بسرطان الثدي هو العبء النقيلي. ولذلك، تحتاج النماذج قبل السريرية لسرطان الثدي لتحليل العبء النقيلي لتكون ذات صلة سريريا. نموذج سرطان الثدي 4T1 يوفر نموذج الماوس تلقائيا- الانبثاث, كميا للمرحلة الرابعة سرطان الثدي البشري. ومع ذلك، فإن معظم بروتوكولات 4T1 تحدد العبء النقيلي من خلال عد المستعمرات الملطخة يدويًا على لوحات زراعة الأنسجة. في حين أن هذا يكفي للأنسجة ذات العبء النقيلي المنخفض ، فإن الخطأ البشري في العد اليدوي يسبب نتائج غير متناسقة ومتغيرة عندما تكون اللوحات نقاشًا ويصعب عدها. تقدم هذه الطريقة حلاً يستند إلى الكمبيوتر إلى خطأ العد البشري. هنا، نقوم بتقييم البروتوكول باستخدام الرئة، وهو نسيج النقيلي للغاية في نموذج 4T1. يتم الحصول على صور للوحات الميثيلين ذات اللون الأزرق وتحميلها للتحليل في فيجي -ImageJ. ثم يحدد Fiji-ImageJ النسبة المئوية للمنطقة المحددة من الصورة التي تكون زرقاء، وتمثل النسبة المئوية للصفيحة ذات العبء النقيلي. هذا النهج القائم على الكمبيوتر يقدم نتائج أكثر اتساقا وأسرع من العد اليدوي أو التقييم الهسجولوجي للأنسجة النقيلي عالية. يعتمد اتساق نتائج فيجي-ImageJ على جودة الصورة. يمكن أن تحدث اختلافات طفيفة في النتائج بين الصور ، وبالتالي يوصى بأن يتم التقاط صور متعددة ومتوسط النتائج. على الرغم من الحد الأدنى من القيود، وهذا الأسلوب هو تحسين لتحديد حجم العبء النقيلي في الرئة من خلال تقديم نتائج متسقة وسريعة.
Introduction
وسيتم تشخيص واحدة من كل ثماني نساء بسرطان الثدي في حياتها, وحتى الآن على الرغم من خيارات العلاج المتعددة سرطان الثدي هو السبب الرئيسي الثاني للوفيات المرتبطة بالسرطان في النساء الأميركيات1. هؤلاء النساء لا يموتون من الورم الأساسي في ثديهم. بدلا من ذلك، فإن العبء النقيلي هو المسؤول عن وفيات هذا المرض لأنه ينتشر عادة إلى الرئة والعظام والدماغ والكبد والغدد الليمفاوية2. وبسبب هذا، تحتاج نماذج سرطان الثدي إلى تقييم الانبثاث للمساهمة في الحد من وفيات هذا المرض. نموذج سرطان الثدي 4T1 مورين هو بروتوكول رائع لتحقيق ذلك. الطريقة الموصوفة هنا تقدم تحسنا لنموذج 4T1 باستخدام فيجي-ImageJ لتحديد ورم خبيث الرئة، مما يؤدي إلى نتائج متسقة وسريعة.
نموذج 4T1 هو راسخ, مع معظم مختبرات استخدام بروتوكولات مثل تلك التي وصفها بولاسكي و Ostrand روزنبرغ في 20013. خط الخلية 4T1 هو 6-Thioguanine (6TG) مقاومة وممثل للمرحلة الرابعة، وسرطان الثدي الثلاثي السلبية3،4،5. وهو ذو صلة سريريا كما هو نموذج تقويم العظام و الانبثاث تلقائيا إلى نفس الأجهزة كما هو الحال في سرطان الثدي البشري3,4. الخلايا 4T1 تلقائياً نقّل بمعدل يمكن التنبؤ به استناداً إلى كمية الخلايا المحقونة3,4. والأهم من ذلك، أن الاختلافات الجينية بين الفئران المستخدمة هنا تسببت في حدوث تقلب متوقع بين الأفراد في العبء النقيلي. لتقييم الانبثاث، يتم حصاد الأنسجة لجمع وتحديد الخلايا السرطانية في مواقع بعيدة باستخدام اختيار 6TG وتلطيخ الميثيلين الأزرق. والنتيجة هي مجموعة من لوحات ثقافة الأنسجة مع النقاط الزرقاء التي تمثل المستعمرات النقيلي. ومع ذلك، فإن بروتوكول بولاسكي وأوستراند روزنبرغ يحددان كمياً المستعمرات النقيلية عن طريق عدها يدوياً، وبالتالي كان هذا هو الوسيلة القياسية لتقييم الانبثاث في هذا النموذج. في حين أن هذا سهل للأنسجة ذات العبء النقيلي المنخفض ، فإن الأنسجة مثل الرئتين غالباً ما تكون محملة بالنقائل. كما يمكن أن تكون لوحات الرئة اثقا جدا، بدقة ودقة تحديد حجم المستعمرات النقيلي عن طريق العد اليدوي من الصعب وعرضة للخطأ البشري. لقياس العبء النقيلي بشكل أفضل، فإننا نصف استخدام فيجي-ImageJ لحل يستند إلى الكمبيوتر لخطأ العد البشري. تحليل الهستوباتولوجي مع الدم و eosin (H & E) تلطيخ وسيلة أخرى لتحديد الانبثاث الرئة، ومن المثير للاهتمام كما تم تحسين مع فيجي-ImageJ البرمجيات6،7. ومع ذلك، لأن التحليل الهستوولوجي يلاحظ شريحة واحدة من الرئة، يمكن أن تكون غير دقيقة وغير تمثيلية. وذلك لأن نموذج 4T1 يسبب العديد من الآفات النقيلي في جميع أنحاء الجهاز التي لا توزع بالتساوي. في حين أن الاتجاهات العامة بين التحليل الهدولوجي والعد اليدوي يمكن أن تكون مماثلة8، يمكن أن تختلف القيم الفردية ، وبالتالي لا ينبغي استخدام التحليل الهستوولوجي كوسيلة وحيدة للكمية. نحن نبرهن على الفائدة مقارنة مع التحليل الهستوولوجي والتناقضات في العد اليدوي بين العدادات المختلفة ، مع إظهار اتساق استخدام فيجي ImageJ. بالإضافة إلى ذلك، نُظهر أن هذه الطريقة يمكن أن تقلل وقت الحضانة من 10-14 يومًا إلى 5 أيام، مما يعني أن الباحثين يمكنهم تحليل البيانات من دراستهم في وقت أقرب بكثير من الاعتماد على العد اليدوي.
هذه الطريقة هي مجموعة من التعديلات البسيطة على بروتوكول بولاسكي وأوستراند روزنبرغ3. نظرًا لأن نموذج 4T1 مستخدم على نطاق واسع ، ولأن الانبثاث الرئوي هو معلمة حاسمة لقياس في النماذج قبل الظهر ، نعتقد أن هذه الطريقة يمكن استخدامها على نطاق واسع وذات قيمة عالية للباحثين في سرطان الثدي. الإمدادات الإضافية الوحيدة اللازمة هي الكاميرا والوصول إلى جهاز كمبيوتر مع فيجي ImageJ، وهو برنامج مجاني يستخدم بشكل متكرر في تحليل الصور9. تركز هذه الطريقة على وجه التحديد على الانبثاث الرئوي، ولكن يمكن استخدامه للأنسجة الأخرى ذات العبء النقيلي الكبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت على جميع الأساليب المذكورة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة فرجينيا للتكنولوجيا، ووفقا للدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. ويتطلب تنفيذ هذا البروتوكول إذنا من المؤسسات المناسبة والالتزام بجميع المبادئ التوجيهية المناسبة.
1. خلية ثقافة
- جعل وسائل الإعلام ثقافة كاملة (دورة في الدقيقة + 10٪ مصل البقرة الجنينية +1٪ القلم). إحياء خلايا 4T1 وفقا لبروتوكول ATCC10 واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في قارورة T-25 حتى التقاء. تغيير وسائل الإعلام في اليوم التالي إحياء لإزالة الخلايا الميتة، ومرة أخرى إذا كان يتم إنفاق الوسائط قبل الخلايا هي التقاء بما فيه الكفاية للمرور.
- مرة واحدة في قارورة T-25 هو التقاء, مرور الخلايا إلى قارورة T-75 عن طريق التخلص من وسائل الإعلام, غسل قارورة مع 5 مل من 1x الفوسفات الفوسفات المالحة (DPBS), وإضافة 500 ميكرولتر من تريبسين-EDTA. احتضان لمدة 5-10 دقائق في 37 درجة مئوية حتى الخلايا فصل.
- بمجرد فصل، إضافة 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة كاملة الدافئة إلى الخلايا. التعرق ونقل 5 مل إلى قارورة T-75 تحتوي على 15 مل من وسائل الإعلام ثقافة كاملة الدافئة.
- خلايا المرور في قارورة T-75 أربع مرات على الأقل. القيام بذلك مرة واحدة يتم التقاء القارورة عن طريق الغسيل مع 8 مل من 1X DPBS، مضيفا 1 مل من تريبسين-EDTA لفصل الخلايا، مضيفا 10 مل من وسائل الإعلام الدافئة إلى الخلايا، وتمييع 1:6-1:8 في قارورة T-75 جديدة تحتوي على 20 مل من وسائل الإعلام الثقافة كاملة الدافئة.
- الخلايا ممر يصل إلى العدد المناسب من قارورة T-150 التي تحتوي على 40 مل من وسائل الإعلام ثقافة كاملة الدافئة لعدد الفئران التي سيتم حقنها. معظم الدراسات تتطلب قارورة T-150 متعددة لضمان خلايا كافية للحقن.
- عندما الفئران على استعداد للحقن (8 أسابيع من العمر أو وزنها أكثر من 20 غرام، اعتمادا على IACUC أو بروتوكولات مؤسسية)، حصاد الخلايا عن طريق التخلص من وسائل الإعلام، وغسل كل قارورة مع 10 مل من 1X DPBS وإضافة 2 مل من تريبسين-EDTA. احتضان لمدة 5-10 دقائق في 37 درجة مئوية حتى الخلايا فصل.
- غسل قارورة مع 10 مل من وسائل الإعلام كاملة ونقل جميع المحتويات (10 مل من وسائل الإعلام + 2 مل من تريبسين-EDTA خلية الخليط) إلى القارورة المقبل. الاستمرار في غسل وجمع الخلايا من كل قارورة باستخدام نفس 10 مل من وسائل الإعلام لتجنب استخدام كمية مفرطة من وسائل الإعلام.
- بمجرد أن يتم جمع جميع القارورة، قم بنقل المحتويات إلى أنبوب طرد مركزي 50 مل. جمع عينة 10 ميكرولتر للعد في أنبوب microcentrifuge والطرد المركزي أنبوب مخروطي 50 مل في 125 × ز لمدة 5 دقائق.
- في حين يجري الطرد من الخلايا، إضافة 10 ميكرولتر من الأزرق Trypan إلى 10 ميكرولتر من عينة الخلية. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. وبمجرد تحديد العدد الإجمالي للخلايا، حساب تركيز الخلايا اللازمة لحقن الفئران ل1.2 × 106 خلايا لكل فأر (لكل 100 ميكرولتر).
- بعد الطرد المركزي، وسائل الإعلام decant و resuspend بيليه خلية في كمية صحيحة من DPBS 1x العقيمة ل1.2 × 106 الخلايا لكل 100 ميكرولتر. انقسام خلية / DPBS خليط في أنابيب microcentrifuge لسهولة الوصول مع حقنة عند خلايا التعرق للحقن. إبقاء الخلايا على الجليد وحقن قريبا بعد ذلك كما الخلايا سوف تبدأ في الموت بعد أن يجري على الجليد لفترات طويلة من الزمن.
2. الحقن
- إعداد الخلايا للحقن عن طريق التنصت أو خلط بلطف أنبوب microcentrifuge لثني الخلايا، ومن ثم pirate 600 ميكرولتر في حقنة 1 مل. بدوره حقنة صعودا وسحب المكبس إلى أسفل لجلب الخلايا بعيدا عن فتح الحقنة. اضغط على حقنة لتخليصه من فقاعات الهواء.
- قم بتوصيل الإبرة المشطوة إلى الأعلى وينال الخلايا مرة أخرى إلى أنبوب الطرد الدقيق حتى يبقى 500 ميكرولتر فقط في الحقنة. وضع حقنة مسطحة على الجليد.
ملاحظة: تسقط خلايا 4T1 من التعليق بسرعة. ولذلك، فمن المهم لخلط الخلايا مرة أخرى إلى تعليق عن طريق التنصت في كثير من الأحيان. - تخدير 8 أسابيع من العمر / > 20 ز أنثى BALB / ج الماوس باستخدام ايزوفلوران أو غيرها من وكيل التخدير المعتمدة. مراقبة التنفس الماوس لتقييم عمق التخدير.
- مرة واحدة يتم تخدير الماوس بشكل صحيح كما هو مبين من عدم وجود انعكاس القرنية، ووضع الماوس على ظهره. باستخدام الإبهام، المؤشر، والإصبع الأوسط، اضغط برفق باستمرار على الماوس. استخدم المؤشر والأصابع الوسطى للاحتفاظ بأعلى جسم الماوس وإبهامه لساقه اليسرى الخلفية. كن لطيفًا ولكن حازمًا.
- مع شطبة من الإبرة، وحقن 100 ميكرولتر من الخلايا تحت الجلد في لوحة الدهون الثديية في البطن الأيسر للماوس. مراقبة لبليب جيدة وأي تسرب، وضمان الماوس يستيقظ ويتحرك بسهولة بعد الحقن.
- تغيير الإبر بين كل فأر.
ملاحظة: لا تسمح الإبرة لدخول تجويف البريتوني. وهذا من شأنه أن يسبب السرطان ينتشر بسرعة وليس ممثل النموذج. لضمان الحقن تحت الجلد، اسحب بلطف إلى أعلى على الإبرة عند إدخالها في وسادة الدهون الثديية في البطن الأيسر. إذا تم رفع الإبرة بسهولة إلى الأعلى ، يتم وضعها بشكل صحيح تحت الجلد.
- تغيير الإبر بين كل فأر.
3- الرصد
- مراقبة الفئران على الأقل 3 مرات في الأسبوع للوزن، ودرجة حالة الجسم، وحجم الورم، وحالة الورم، والتنفس، ومستوى النشاط، والمظهر، والحركة. بمجرد أن يصل الورم إلى 0.7-0.8 سم في القطر ، ابدأ في المراقبة يوميًا.
- النظر في القتل الرحيم عندما يصل حجم الورم إلى 1.5 سم، أو فقدان الوزن يصل إلى 20٪، أو الانخفاض السريري الشديد في درجة حالة الجسم، حالة الورم، التنفس، مستوى النشاط، المظهر، أو الحركة لوحظ استنادا إلى المبادئ التوجيهية المؤسسية.
ملاحظة: درجة حالة الجسم أمر بالغ الأهمية لمراقبة وزن الجسم قد يزيد مع زيادة الورم في الحجم، مما يلغي فقدان حالة الجسم بسبب عبء المرض. وستعتمد بروتوكولات الرصد الدقيق على البروتوكولات المعتمدة أو على البروتوكولات المؤسسية.
- النظر في القتل الرحيم عندما يصل حجم الورم إلى 1.5 سم، أو فقدان الوزن يصل إلى 20٪، أو الانخفاض السريري الشديد في درجة حالة الجسم، حالة الورم، التنفس، مستوى النشاط، المظهر، أو الحركة لوحظ استنادا إلى المبادئ التوجيهية المؤسسية.
4. نكروبسى
- القتل الرحيم الماوس باستخدام CO2 اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية.
- رش الماوس مع 70٪ الإيثانول لتطهير. جعل شق يصل خط الوسط البطني من الماوس لفضح تجويف الجسم.
- إزالة الكلى. استمر في قطع خط الوسط حتى يظهر الحجاب الحاجز. استخدم المقص لثقب الحجاب الحاجز لتفريغ الرئتين. تقليم الحجاب الحاجز للحصول على وصول أفضل إلى تجويف.
- استخدام مقص حاد لقطع مركز القفص الصدري. دبوس القفص الصدري مرة أخرى لفضح الرئة والقلب.
- اثقب القلب بـ 2 مل من 1x DPBS غير المعقم عن طريق إدخال إبرة في قمة القلب حتى تتجمع في تجويف البطن حيث تمت إزالة الكلى.
- لإزالة القلب والرئتين، استخدم المقص الحاد لقطع المريء والقصبة الهوائية فوق القلب مباشرة. باستخدام ملقط، تبدأ لسحب القلب بعيدا عن الجسم وقطع بعيدا في أي نسيج الضام حفظه تعلق. الرئتين سوف يخرج مع القلب.
- تحديد الرئتين المتعددة الفصوص (يمين) والفردية الفصوص (اليسرى). إبقاء القلب تعلق للرجوع اليها، ولكن بمجرد تحديد الرئتين، وقطع القلب بعيدا.
- تسمية لوحة 12 بئر تحتوي على 1x هانك محلول ملحي متوازن (HBSS) في كل بئر. كل فأر يحتاج 2 آبار. ضع الرئة متعددة الفصوص (يمين) في لوحة 12 بئرًا لتقييم الانبثاث والاحتفاظ بالجليد. إبقاء المجاورة فارغة جيدا في الوقت الراهن.
ملاحظة: من المهم استخدام نفس الرئة (متعددة الفصوص) من كل فأرة لضمان أن يكون حجم كل عينة قريباً. ويمكن بعد ذلك استخدام الرئة المفردة في تحليل آخر، مثل علم الأنسجة.
ملاحظة: العينات مستقرة على الجليد أو عند 4 درجات مئوية لبضع ساعات.
5. تجهيز الأنسجة
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ كافة الخطوات في هذا المقطع باستخدام تقنية معقمة.
- تسمية 15 مل أنبوب مخروطي لكل ماوس وإضافة 2.5 مل من نوع IV الكولاجين خليط و 30 وحدة من elastase إلى كل أنبوب. لجعل خليط الكولاجين من النوع الرابع، تذوب 2 ملغ من الكولاجين من النوع الرابع لكل مل 1x HBSS ومرشح معقمة. ويمكن تخزين هذا حتى 12 شهرا في -20 درجة مئوية وذوبانها عند الحاجة.
- نقل الرئة إلى الثانية، نظيفة HBSS 1x جيدا لتلك العينة. دوامة باستخدام ملقط لإزالة أي الدم المتبقية. نقل رئة نظيفة إلى فارغة 3.5 سم لوحة ثقافة الأنسجة. رئة مفرومة بمقص. شطف لوحة مع 2.5 مل من 1x HBSS، ونقل 1x HBSS وقطع الرئة في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي بالفعل على كوكتيل الكولاجين /elastase (5 مل مجموع).
- احتضان لمدة 75 دقيقة عند 4 درجة مئوية. مواصلة خلط العينات خلال هذا الوقت، حتى وضع أنابيب على عجلة الروك أو الدورية. خلال هذه الخطوة الحضانة، تسمية أنابيب أجهزة الطرد المركزي 50 مل و 10 سم لوحات ثقافة الأنسجة لكل فأرة. إذا كان القيام تخفيف, تسمية ما يكفي من 10 لوحات ثقافة الأنسجة سم لتخفيف.
ملاحظة: تسمية غطاء لوحات زراعة الأنسجة. إذا وضع علامة على اللوحة نفسها ، فإن الكتابة ستتداخل مع تحليل Fiji-ImageJ. - جلب حجم كل أنبوب يصل إلى 10 مل مجموع مع 1X HBSS. صب محتويات على مصفاة 70 ميكرومتر خلية في أنبوب مخروطي 50 مل لكل عينة. استخدام المكبس من حقنة 1 مل لطحن بلطف العينة من خلال مصفاة للسماح لمزيد من الخلايا لتصفية من خلال.
- جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 350 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT). تجاهل افرا وغسل بيليه مع 10 مل من 1x HBSS. كرر هذه الخطوة مرتين.
- Resuspend بيليه في 10 مل من 60 μM 6TG وسائل الإعلام ثقافة كاملة، إما RPMI أو IMDM. عينات لوحة في 10 سم لوحات ثقافة الخلية، وذلك باستخدام مخطط التخفيف إذا رغبت في ذلك. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 5 أيام.
ملاحظة: 1:2، 1: 10، و 1:100 هي التخفيفات الشائعة التي سوف تحتاج إلى أن يتم تحديد تجريبيا استنادا إلى معلمات الدراسة.
تنبيه: 6TG سام. توخ الحذر عند التعامل مع جميع إرشادات الصحة والسلامة البيئية للتخلص منها.
6. تلطيخ لوحات
- صب وسائل الإعلام الثقافة قبالة لوحات في حاوية النفايات المناسبة. قم بإصلاح الخلايا بإضافة 5 مل من الميثانول غير المخفف لكل لوحة واحتضان لمدة 5 دقائق في RT ، مع التأكد من دوامة الميثانول بحيث يغطي اللوحة بأكملها.
تنبيه: الميثانول خطير إذا تم تناوله أو استنشاقه أو على الجلد. استخدام غطاء الدخان لهذه الخطوة. - صب الميثانول قبالة لوحات في حاوية النفايات المناسبة. شطف لوحات مع 5 مل من الماء المقطر في كل لوحة وصب الماء في حاوية النفايات المناسبة. إضافة 5 مل من 0.03٪ الميثيلين الأزرق لكل لوحة واحتضان لمدة 5 دقائق في RT، مع التأكد من دوامة الميثيلين حل الأزرق بحيث يغطي لوحة كاملة.
- صب الميثيلين الأزرق في حاوية النفايات المناسبة. شطف لوحات مرة أخرى مع 5 مل من الماء المقطر في لوحة. بدوره لوحات رأسا على عقب ولطخة ضد منشفة ورقية لإزالة السائل الزائد. ضع لوحة على غطاءها ودع الهواء يجف بين عشية وضحاها في RT.
ملاحظة: ستكون المستعمرات النقيلي زرقاء. مرة واحدة يتم تجفيف لوحات، ويمكن تخزينها في RT إلى أجل غير مسمى.
7. تحليل الصور
- إزالة الأغطية المسمى من لوحات، مع الحرص على ضمان تحديد واضح للعينات. صف جميع لوحات الرئة الملطخة على سطح نظيف وخفيف لالتقاط صورة لجميع اللوحات في صورة واحدة.
- التقاط صورة من مجموعة من لوحات في منطقة مضاءة جيدا، مع التأكد من تقليل انعكاسات لوحات هي عاكسة جدا. سوف انعكاسات في لوحات تؤثر على تحليل الصورة، وبالتالي يجب تجنبها.
ملاحظة: لدى Fiji-ImageJ حد أعلى من 2 جيجابكسل. معظم الهواتف الذكية الحديثة لديها كاميرات كافية. لا تستخدم كاميرا أقل من 8 ميغابكسل. كانت الكاميرا المستخدمة في هذه التجربة 12.2 ميجابيكسل على Google Pixel 2. - احصد الصورة لتضمين اللوحات، لكن استبعد الأغطية أو أي شيء آخر في خلفية الصورة. تحميل الصورة المقتصة في فيجي-ImageJ.
- تغيير الصورة إلى بالأسود والأبيض باستخدام الأوامر التالية: صورة، ضبط، لون عتبة، أسلوب العتبة: الافتراضي، لون العتبة: B&W، مساحة العتبة: Lab. إلغاء تحديد مربع الخلفية الداكنة. يجب أن تكون الصورة الآن بالأبيض والأسود. يمثل الأسود خلفية الضوء، والأبيض يمثل المستعمرات النقيلي الأزرق.
- باستخدام أداة Circle على شريط أدوات Fiji-ImageJ، حدد المنطقة التي سيتم تحليلها. رسم دائرة واحدة لاستخدامها لجميع لوحات لضمان تحليل كل لوحة للمنطقة ذات الحجم نفسه. اختر حجمًا يزيد من المساحة التي تم تحليلها على اللوحات مع تقليل الضوضاء الخلفية التي تظهر على حافة اللوحات. يظهر الحجم في شريط الأدوات كما يتم رسمها، لذلك فمن الممكن لجعل دائرة مثالية عن طريق مراقبة الارتفاع والعرض كما يتم رسم الدائرة.
- تحليل الدائرة المحددة لتحديد النسبة المئوية للمنطقة البيضاء، والتي تمثل مساحة اللوحة التي تحتوي على مستعمرات نقائل زرقاء. استخدم الأوامر التالية:
تحليل، تحليل الجسيمات، الحجم (بكسل2):0-اللانهاية، دائري: 0.00-1.00، إظهار: لا شيء، والتحقق من مربع تلخيص. ضرب موافق. - تسجيل نتيجة ٪ناحية. هذه هي النسبة المئوية للمنطقة المحددة التي تكون بيضاء، وبالتالي تمثل العبء النقيلي.
ملاحظة: من المستحسن إما حفظ النتائج في Fiji-ImageJ أو نسخ/لصق صفحة النتائج بأكملها في مستند منفصل. إذا كانت نسبة ٪ من نتائج المنطقة غير متوقعة أو مريبة، فمن الممكن معرفة ما إذا كان أي من القياسات الأخرى مريبًا أيضًا أو إذا تم تسجيل ٪ Area بشكل غير صحيح. - تحريك الدائرة ، دون تغيير حجمها عن طريق الاستيلاء عليها في وسطها ، إلى لوحة المقبل في الصورة. كرر الخطوتين 7.6 و 7.7 لكافة اللوحات في الصورة.
- كرر الخطوات من 7.1 إلى 7.8 على صورتين إضافيتين على الأقل. بمجرد تحليل جميع اللوحات والصور، متوسط نسبة النتائج بين الصور المختلفة لكل لوحة للتخفيف من أي تناقضات بين الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذه الطريقة تحتوي على تعديلات بسيطة من بولاسكي وأوستراند روزنبرغ 4T1 بروتوكول3 ويمكن تصورها في الشكل 1. عندما 3 الباحثين منفصلة عد يدويا مستعمرات النقيلي ل 12 لوحات الرئة (1:10 تخفيف)، وكانت النتائج غير متناسقة جدا بين عدادات مختلفة (الشكل 2A). تم توجيه جميع الباحثين إلى "عد المستعمرات النقيلي التي تظهر كنقاط زرقاء" ، ومع ذلك فإن التناقضات توضح المشكلة مع عد اللوحات عالية الانبثاث يدويًا. كان لدى الباحثين مستويات متفاوتة من الخبرة مع نموذج 4T1. قام أخصائي أمراض بيطري معتمد من المجلس بتحليل شرائح الرئة الملطخة H & E للتشليل كوسيلة أخرى للمقارنة مع تحليل لوحة الرئة في فيجي-ImageJ (الشكل 2B).
باستخدام تحليل فيجي-ImageJ، حلل 3 باحثين منفصلين 3 صور منفصلة لمجموعة من 12 لوحة (1:2 تخفيف). تم التقاط الصور في مكانين منفصلين من المختبر مع إضاءة مختلفة قليلاً. كان ترتيب اللوحات أو الزاوية التي التقطت منها الصورة مختلفة بين كل صورة. على النقيض من نتائج الفرز اليدوي ، كانت نتائج Fiji-ImageJ متسقة بين العدادات لكل من الصور 3(الشكل 3A). لتحديد ما إذا كان هناك تناقضات بين الصور 3، تم الجمع بين النتائج من 3 صور وعدادات 3 لكل صفيحة الرئة(الشكل 3B). هناك اختلافات بين الصور لبعض لوحات، ولكن الاتجاهات العامة متشابهة، وأنه يوفر المزيد من الاتساق من العد اليدوي. لحساب الاختلافات بين الصور 3 مختلفة، وكان متوسط النتائج من كل صورة لكل لوحة(الشكل 3C). وقدمت هذه المتوسطات نتائج متسقة بين العدادات التي تحلل بدقة ودقة العبء النقيلي. لذلك، يقترح هذا البروتوكول أخذ ما لا يقل عن 3 صور من مجموعة لوحة في ترتيبات مختلفة، من زوايا مختلفة، أو في إعدادات ضوء مختلفة قليلا، ومن ثم تحليل متوسط النتائج. يتم تصور التباين بين الفرز اليدوي وتحليل فيجي-ImageJ عند مقارنة الشكل 2A إلى الشكل 3C.
طريقة أخرى لإثبات التحسينات التي يقدمها هذا البروتوكول هو مقارنة ترتيب لوحات من معظم إلى أقل الحمل النقيلي بين العدادات، استنادا إلى التهم من الشكل 2 والشكل 3. تم الاتفاق على العد اليدوي على لوحة معظم التقاء، ولكن جميع الرتب التالية كانت غير متناسقة بين العدادات (الشكل 4A). وعلى النقيض من ذلك، كانت الرتب من تحليل فيجي-ImageJ لكل صورة أكثر اتساقا بين العدادات(الشكل 4B). وينظر أيضا الاتساق عندما كانت النتائج من كل صورة لكل لوحة متوسط(الشكل 4C). ونحن نعترف بأن هذا البروتوكول لا يوفر الاتساق الكامل بين العدادات، ولكنه تحسن من العد اليدوي عند مقارنة الشكل 4A إلى الشكل 4C. اختلف التحليل الهدولوجي عن كل من الفرز اليدوي وفيجي-ImageJ (الشكل 4D).
لإثبات أهمية تجنب انعكاسات في الصور، يتم عرض صورة مع انعكاس اليد وتحليلها اللاحقة فيجي-ImageJ (يسار) تعارض نفس لوحة دون انعكاس (يمين)( الشكل 5A). يمكن أن تؤثر العيوب الداكنة الأخرى من سطح خلفية قذرة أو بقايا عينة الدم على اللوحات سلبًا على تحليل فيجي-ImageJ أيضًا. لوحة الدم في الشكل 5B لديها فقط 2 مستعمرات النقيلي (لاحظت من قبل السهام البيضاء)، ولكن بقايا الظلام (لاحظت من قبل السهام السوداء) تسبب فيجي-ImageJ للنظر في ذلك كما 31.6٪ النقيلي. ولذلك، من المهم أن يكون سطح نظيف وخفيف وعدم استخدام هذه الطريقة لعينات الدم كما عينات الدم عادة ما تترك البقع الداكنة المتبقية على لوحة التي ليست مستعمرات النقيلي.
الشكل 1: تخطيطي للبروتوكول. يركز هذا البروتوكول فقط على تحليل الانبثاث الرئوي في نموذج 4T1. التدفق العام لهذا البروتوكول يشمل نمو خلايا 4T1 في الثقافة، حقن الفئران الإناث BALB / c مع خلايا 4T1 في وسادة الدهون الثديية في البطن الأيسر ، ومراقبة الفئران وفقا ل IACUC والبروتوكولات المؤسسية ، والتضحية الفئران وجمع الرئة ، وجمع الخلايا من عينات الرئة ، والطلاء والخلايا الحامن في وسائل الإعلام اختيار 6TG ، وتحديد وتلطيخ الخلايا بعد 5 أيام ، وأخذ صور لللوحات ، وتحليل باستخدام فيجي ImageJ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عد الخلايا النقيلية يدويا وتحليل الهستوباتية لها نتائج غير متناسقة. A. 12 لوحات الرئة مع تخفيف 1:10 تم عدها يدويا من قبل 3 باحثين منفصلين تعليمات لحساب المستعمرات النقيلي بنفس الطريقة، على الرغم من أن تجربة مع النموذج تختلف بين الباحثين. عدد المستعمرات النقيلي عد تباينت بشكل كبير بين الباحثين. ب. تحليل التحلل تحديد وكمية مجاميع خلايا الورم الفردية, تصنف على أنها الانبثاث, موجودة في H & E الشرائح الرئة الملون. يتم عرض صور التكبير عالية ومتوسطة ومنخفضة لشريحة تمثيلية واحدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل فيجي-ImageJ دقيق ودقيق في تحديد العبء النقيلي. A. تم تحليل 12 صفيحت الرئة مع تخفيف 1:2 من قبل 3 باحثين منفصلين في 3 صور منفصلة للوحات الرئة 12. ب. تم الجمع بين النتائج من كل من الصور 3 من قبل كل من الباحثين 3. ج. تم متوسط النتائج من كل صفيحة الرئة من الصور 3. ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار المقارنة المتعددة من توكي لم تحدد أي اختلافات كبيرة بين العدادات لكل صفيحة الرئة. وتظهر البيانات على أنها متوسط + SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: يوفر تحليل فيجي-ImageJ ترتيباً أكثر اتساقاً للعبء النقيلي مقارنة بالعد اليدوي والتحليل الهدولوجي. أ. تم تصنيف نفس لوحات الرئة من الشكل 2 من معظم إلى أقل النقيلي على أساس العد اليدوي من الشكل 2. ب. تم تصنيف نفس 12 صفيحت الرئة من الشكل 3 من معظم إلى أقل النقيلي استنادا إلى تحليل فيجي ImageJ من الشكل 3A. ج. تم تصنيف المتوسطات من الشكل 3C من معظم إلى أقل النقيلي. د. تم تصنيف شرائح الرئة من معظم إلى أقل النقيلي على أساس التقييم الهستوولوجي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: سوف تؤثر الانعكاسات والبقع الداكنة غير النقيلي سلبا على النتائج. أ. صورة مع انعكاس يد أخذ الصورة يعطل تحليل فيجي صورة J، كما هو مبين في مقارنة التحليل فيجي-ImageJ (يسار) إلى التحليل الصحيح فيجي-ImageJ (يمين) B. لوحات الدم غالباً ما تترك بقايا البقع (السهام السوداء) على لوحات ليست مستعمرات النقيلي (السهام البيضاء). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما هو موضح، يمكن أن يكون عد المستعمرات النقيلي يدويا على كل صفيحة الرئة طريقة غير دقيقة وغير دقيقة لتحديد نسل الرئة، مما يدل على الحاجة إلى وسيلة أفضل للقياس الكمي(الشكل 2). اختلف التحليل الهدولوجي قليلاً عن كل من الفرز اليدوي وتحليل فيجي-ImageJ(الشكل 2B و4D)،على الأرجح لأن شرائح H&E ليست عينة تمثيلية للجهاز بأكمله. ويحصد البروتوكول رئة بأكملها، وبالتالي فهو أكثر تمثيلاً للنقائل الرئوية الكلية، وهو أكثر اتساقاً من العد اليدوي. وقد جرت محاولة إجراء عدة نُهج مختلفة لتحليل فيجي - إيمج جي ونوقشت أدناه، ولكن يبدو أن البروتوكول المبين أعلاه هو الأسلوب المتفوق.
تم جمع عينات الرئة والدم والدماغ لهذه الدراسة. ومع ذلك، كان عينات الدم والدماغ عدد قليل جدا من المستعمرات النقيلي، إن وجدت على الإطلاق. لقد قررنا أن العد اليدوي للمستعمرات النقيلي هو الأمثل لهذه الأنسجة أقل النقيلي، وبالتالي لم يتم تضمين بيانات الدم والدماغ. عندما يكون من السهل حساب العبء النقيلي يدوياً (مثل عشر أو عشرين مستعمرة انبثادية مقابل آلاف)، فإن المشكلة الأصلية للخطأ البشري ليست ذات صلة، وبالتالي لا توجد حاجة إلى هذا البروتوكول. أيضا، يمكن أن تترك عينات الدم البقع الداكنة على لوحات بعد التثبيت، الذي يتعارض مع تحليل فيجي-ImageJ (الشكل 5). الأهم من ذلك، يمكن أن تؤثر كمية الخلايا المحقونة على العبء النقيلي. على سبيل المثال، إذا تم حقن عدد أقل من الخلايا ويمكن للفئران البقاء على قيد الحياة لفترة أطول، والسرطان لديه المزيد من الوقت للانتشار إلى المواقع التقليدية أقل النقيلي مثل الدماغ3،4. ولذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول ليشمل العبء النقيلي للأنسجة الأخرى إذا أعطيت الوقت لتصبح عالية النقيلي. إذا كنت تحاول نموذج 4T1 للمرة الأولى أو تغيير كمية الخلايا التي يتم حقنها، نوصي بتجربة تخفيفين على الأقل عند طلاء الخلايا. لهذه الدراسة، استخدمنا تخفيف 1:2 و 1:10. كان من الصعب عد التخفيف 1:2 يدويًا ، ولكن تم عده بسهولة في فيجي - ImageJ. كان التخفيف 1:10 لا يزال من الصعب عد يدويا، وبالتالي أدى إلى نتائج غير متناسقة. يمكن تعديل عمليات التخفيف بناءً على معلمات الدراسة المحددة.
تم التقاط صور للوحات الرئة الفردية ولوحات الرئة الـ 12 معًا. تم تحليل اللوحات الفردية بطريقتين: إما اقتصاص الصورة إلى مربع مركزي من اللوحة قبل تحميلها على فيجي-ImageJ، أو استخدام أداة اختيار الدائرة في فيجي-ImageJ لتحديد الدائرة المركزية لللوحة في الصورة غير المربوطة. وجدنا أن استخدام أداة اختيار الدائرة في Fiji-ImageJ يوفر أسهل طريقة وأكثرها اتساقًا لإنشاء منطقة بنفس الحجم للتحليل لجميع اللوحات. وعلاوة على ذلك، كان تحليل المجموعة الكاملة من لوحات الرئة في نفس الصورة متفوقة على تحليل الصور الفردية للوحات الرئة واحدة. وجود كل من لوحات الرئة في نفس الصورة يسمح لنفس الحجم دائرة لاستخدامها بسهولة بين لوحات الرئة. يضمن أن جميع لوحات الرئة هي نفس المسافة من الكاميرا وبالتالي فإن الدائرة نفسها للتحليل يجب أن يكون الحجم الصحيح لجميع لوحات الرئة في الصورة. كما أنه يجعل التحليل أسرع كما إعادة رسم الدائرة ليست ضرورية بين لوحات. يتم سحبها ببساطة إلى اللوحة التالية في الصورة دون تغيير حجمها ، مما يضمن استخدام نفس الحجم لجميع اللوحات في الصورة. عند تحديد حجم الدائرة، من المهم أن تجعل من كبيرة بما يكفي لتحليل غالبية لوحة في حين صغيرة بما يكفي لتجنب الضوضاء الخلفية من حواف لوحة. وعلاوة على ذلك، في محاولة لإنقاذ الكواشف، كانت الخلايا مطلية أيضا في 6 صحون من الآبار ومقارنة بلوحات زراعة الأنسجة التي يبلغ 10 سم. وكانت نتائج فيجي-ImageJ من 6 آبار أقل اتساقا ولم ترتبط بأطباق 10 سم (البيانات غير مبينة). أحد التفسيرات هو مساحة السطح الأصغر التي توفر مساحة أصغر لتحليلها، مما يؤدي إلى بيانات أقل تمثيلاً. آخر هو أن الحد من مساحة السطح يسمح للخلايا أن تنمو بسرعة أكبر لأنها أقرب إلى الخلايا الأخرى الباقية. لذلك، لا نوصي باستخدام أي الكواشف زراعة الأنسجة بخلاف ما وصفناه في البروتوكول.
كما ذكر من قبل، تجنب انعكاسات وجود نظيفة، خلفية خفيفة حاسمة للغاية لهذه الطريقة. ويبين الشكل 5 ألف كيفية تحليل التأمل في فيجي-ImageJ، وبالتالي يبين الأهمية الحاسمة لتجنب الأفكار. كما لوحات الأنسجة ثقافة هي انعكاسية للغاية، فمن المفيد لالتقاط الصورة بزاوية طفيفة لتجنب انعكاسات من نفسك إما التقاط الصورة أو من مصادر الضوء أعلاه. سوف تحتاج ظروف الإضاءة في منطقة العمل المحددة إلى أن تكون في الحسبان. نقترح التقاط صور متعددة من لوحات لتحليلها، في محاولة ترتيبات مختلفة قليلا و / أو زوايا، في منطقة مضاءة جيدا. دراسة الصور بشكل مكثف لأي انعكاسات. إذا كان هناك تناقضات في التحليل، فمن المحتمل أن يرجع ذلك إلى مشكلة جودة الصورة. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، قارن الصورة العادية بالصورة بالأبيض والأسود. إذا كانت المناطق التي لا تكون زرقاء في الصورة العادية تظهر باللون الأبيض في الصورة بالأبيض والأسود، فمن المحتمل أن يكون هناك انعكاس أو عيب يغير النتائج.
بالإضافة إلى الاتساق، فائدة بارزة أخرى من هذه الطريقة هي أنها تنتج البيانات بسرعة أكبر بكثير من العد اليدوي. عد لوحات متعددة يدويا تستغرق وقتا طويلا جدا، في حين يمكن إجراء تحليل فيجي-ImageJ بسرعة. كما أنه يسمح لفترة حضانة أقصر. بولاسكي و Ostrand روزنبرغ يوصي فترة حضانة 10-14 يوما للخلايا مطلي، مضيفا قدرا كبيرا من الوقت إلى الدراسة3. فترة الحضانة 10-14 يوما يسمح لأكبر، أسهل لعدد المستعمرات لتشكيل. ومع ذلك، يمكن أن تصبح العديد من لوحات الرئة التقاء قبل ذلك الحين. بدلا من ذلك ، 5 أيام من الحضانة يعطي ما يكفي من الوقت لاختيار 6TG لقتل الخلايا غير السرطانية (ثبت من قبل الفئران السيطرة الصحية عدم وجود أي مستعمرات على لوحات الرئة ، والبيانات غير مبينة) ، والخلايا لتنمو بما يكفي ليتم قياسها بسهولة مع فيجي ImageJ. وهذا يقلل بشكل كبير من الوقت بين الفئران التي يجري التضحية بها وتحليل البيانات النقيلي الأساسية.
في الختام، فوائد هذا الأسلوب تفوق بكثير القيود. ونحن نعترف بأن هذه الطريقة لا توفر الاتساق المثالي. في حين أن هذه ليست الطريقة المثالية للأنسجة أقل النقيلي، يمكن بسهولة أن تحسب تلك الأنسجة يدويا. في حين أن الحصول على صورة دون انعكاسات يمكن أن تتطلب بعض التصوير الدقيق ، والاتساق المكتسبة مع هذا الأسلوب هو كبير. ومن الممكن أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم للأنسجة الأخرى التي هي عالية النقيلي والبروتوكولات الأخرى التي تتطلب عد الكائنات الملون. كما يمكن أن يسمح تصميم الدراسة بتحليل معدل الانبثاث أو تأثير العلاجات المضادة للسرطان على الانبثاث. وسيوفر هذا الأسلوب بيانات انبثاثية عالية الاتساق وموثوق بها ويمثل تنقيحاً كبيراً لنموذج 4T1. تطبيق هذا النموذج على البحوث القادمة الانبثاث سرطان الثدي هو في غاية الأهمية في تسليح الباحثين مع أدوات لمكافحة وفيات سرطان الثدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل كلية فرجينيا ماريلاند للطب البيطري (IA)، ومعهد فرجينيا للتكنولوجيا الحيوية ومركز العلوم التطبيقية للصحة المهندسة (IA)، والمعاهد الوطنية للصحة R21EB028429 (IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
