Summary
אנו מתארים שיטה עקבית ומזרזת יותר לכמת גרורות ריאות במודל סרטן השד 4T1 באמצעות Fiji-ImageJ.
Abstract
סרטן השד הוא ממאירות הרסנית, המהווה 40,000 מקרי מוות של נשים ו -30% מאבחוני סרטן הנשים החדשים בארצות הברית בשנת 2019 בלבד. הגורם המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן השד הוא הנטל גרורתי. לכן, מודלים פרה-קליניים לסרטן השד צריכים לנתח נטל גרורתי כדי להיות רלוונטיים מבחינה קלינית. מודל סרטן השד 4T1 מספק באופן ספונטני גרורות, מודל העכבר לכימות עבור שלב IV סרטן השד האנושי. עם זאת, רוב פרוטוקולי 4T1 לכמת את הנטל גרורתי על ידי ספירה ידנית מושבות מוכתמות על צלחות תרבות הרקמות. אמנם זה מספיק עבור רקמות עם נטל גרורתי נמוך יותר, טעות אנוש בספירה ידנית גורמת לתוצאות לא עקביות ומשתנות כאשר צלחות הן confluent וקשה לספור. שיטה זו מציעה פתרון מבוסס מחשב לשגיאת ספירה אנושית. כאן, אנו מעריכים את הפרוטוקול באמצעות הריאה, רקמה גרורתית מאוד במודל 4T1. תמונות של לוחות מוכתמים בכחול מתילן נרכשים ומועלים לניתוח בפיג'י-ImageJ. פיג'י-ImageJ קובע את אחוז האזור הנבחר בתמונה הכחול, המייצג את אחוז הלוח בעומס גרורתי. גישה מבוססת מחשב זו מציעה תוצאות עקביות ומזרזות יותר מאשר ספירה ידנית או הערכה היסטופתולוגית לרקמות גרורתיות ביותר. העקביות של תוצאות Fiji-ImageJ תלויה באיכות התמונה. ניתן לבצע שינויים קלים בתוצאות בין תמונות, ולכן מומלץ לנקוט במספר תמונות ולתוצאות ממוצעות. למרות המגבלות המינימליות שלה, שיטה זו היא שיפור לכמת נטל גרורתי בריאה על ידי מתן תוצאות עקביות ומהירות.
Introduction
אחת מכל שמונה נשים תאובחנו עם סרטן השד בחייה, ובכל זאת למרות אפשרויות טיפול מרובות סרטן השד הוא הגורם המוביל השני של מקרי מוות הקשורים לסרטן אצל נשיםאמריקאיות 1. הנשים האלה לא מתות מהגידול העיקרי בשד שלהן. במקום זאת, הנטל גרורתי אחראי על התמותה של מחלה זו כפי שהוא מתפשט בדרך כלל לריאות, עצם, מוח, כבד, ובלוטותהלימפה 2. בגלל זה, מודלים סרטן השד צריך להעריך גרורות לתרום לריסון התמותה של מחלה זו. מודל סרטן השד 4T1 מורין הוא פרוטוקול מעולה כדי להשיג זאת. השיטה המתוארת כאן מציעה שיפור לדגם 4T1 באמצעות Fiji-ImageJ לכימות גרורות ריאות, תוך הפקת תוצאות עקביות ומזרזות.
מודל 4T1 מבוסס היטב, כאשר רוב המעבדות משתמשות בפרוטוקולים כגון אלה שתוארו על ידי פולסקי ואוסטראן-רוזנברג בשנת 20013. קו התא 4T1 הוא 6-Thioguanine (6TG) עמיד ונציג של שלב IV, סרטן השדשלילי משולש 3,4,5. זה רלוונטי מבחינה קלינית כפי שהוא מודל אורתוטופי באופן ספונטני גרורות לאותם איברים כמו בסרטן השד האנושי3,4. תאי 4T1 שולחים גרורות באופן ספונטני בקצב צפוי בהתבסס על כמות התאים שהוזרקו3,4. חשוב לציין, הבדלים גנטיים בין עכברים המשמשים כאן גרמו שונות בין-אינדיבידואלית צפויה בנטל גרורתי. כדי להעריך גרורות, רקמות נקצרות כדי לאסוף ולכמת תאים סרטניים באתרים מרוחקים באמצעות בחירת 6TG וכתמים כחולים מתילן. התוצאה היא אוסף של צלחות תרבות רקמה עם נקודות כחולות המייצגות מושבות גרורתיות. עם זאת, פרוטוקול פולסקי ואוסטראן-רוזנברג מכמת מושבות גרורתיות על ידי ספירה ידנית שלהן, ולכן זה היה האמצעי הסטנדרטי להערכת גרורות במודל זה. אמנם זה קל עבור רקמות עם נטל גרורתי נמוך, רקמות כמו הריאות הם לעתים קרובות עמוס גרורות. כמו לוחות ריאות יכול להיות מאוד confluent, מדויק ובדיוק כימות מושבות גרורתיות על ידי ספירה ידנית קשה נוטה לטעות אנוש. כדי לכמת טוב יותר את העומס גרורתי, אנו מתארים שימוש בפיג'י-ImageJ לפתרון מבוסס מחשב לשגיאת ספירה אנושית. ניתוח היסטופתולוגי עם hematoxylin ו eosin (H&E) כתמים הוא אמצעי נוסף לכמת גרורות ריאות, ומעניין גם שופרה עם פיג'י-ImageJתוכנה 6,7. עם זאת, מכיוון שניתוח היסטופתולוגי מתבונן בפרוסה אחת של הריאה, הוא יכול להיות לא מדויק ולא מיוצג. הסיבה לכך היא כי מודל 4T1 גורם מספר נגעים גרורתיים לאורך האיבר כי הם לא מופצים באופן שווה. בעוד המגמות הכוללות בין ניתוח היסטופתולוגי וספירהידנית יכול להיות דומה 8, ערכים בודדים יכולים להיות שונים ולכן ניתוח היסטופתולוגי לא צריך לשמש כאמצעי היחיד לכמת. אנו מדגימים את התועלת בהשוואה לניתוח ההיסטופתולוגי ולאי העקביות בספירה ידנית בין מונים שונים, תוך הפגנת העקביות של השימוש בפיג'י-ImageJ. בנוסף, אנו מראים כי שיטה זו יכולה להפחית את זמן הדגירה מ 10-14 ימים עד 5 ימים, כלומר חוקרים יכולים לנתח נתונים מהמחקר שלהם הרבה יותר מוקדם מאשר כאשר מסתמכים על ספירה ידנית.
שיטה זו היא אוסף של התאמות פשוטות לפרוטוקול פולסקי ואוסטראן-רוזנברג3. מכיוון שמודל 4T1 נמצא בשימוש נרחב, ומכיוון שגרוריות ריאות הן פרמטר קריטי למדידה במודלים פרה-קליניים, אנו מאמינים כי שיטה זו יכולה להיות בשימוש נרחב ובעלת ערך רב לחוקרי סרטן השד. האספקה הנוספים היחידה הדרושה היא מצלמה וגישה למחשב עם Fiji-ImageJ, תוכנה חופשית המשמשת לעתים קרובות בניתוח תמונה9. שיטה זו מתמקדת במיוחד גרורות ריאות, אבל זה יכול לשמש עבור רקמות אחרות עם נטל גרורתי משמעותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של וירג'יניה טק ובהתאם למדריך הלאומי של מכוני הבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. ביצוע פרוטוקול זה דורש אישור מהמוסדות המתאימים ודבקות בכל ההנחיות המתאימות.
1. תרבות התאים
- הפוך מדיה תרבותית מלאה (RPMI + 10% סרום חזיר עוברי +1% עט סטרפטוקומפ). להחיות תאים 4T1 על פי פרוטוקול ATCC10 ו דגירה ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 בבקבוק T-25 עד confluent. שנה את המדיה יום לאחר ההחייאה כדי להסיר תאים מתים, ושוב אם המדיה מבוזבזת לפני שהתאים נוחים מספיק למעבר.
- לאחר בקבוק T-25 הוא confluent, לעבור תאים לבקבוק T-75 על ידי השלכת מדיה, שטיפת בקבוק עם 5 מ"ל של 1x פוספט אגירה מלוחים (DPBS), והוספת 500 μL של טריפסין-EDTA. דגירה במשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד התאים להתנתק.
- לאחר הניתק, הוסף 5 מ"ל של מדיה תרבותית שלמה מחוממת לתאים. שאפו והעבירו את ה-5 מ"ל לבקבוק T-75 המכיל 15 מ"ל של מדיה תרבותית שלמה מחוממת.
- תאי מעבר בבקבוקי T-75 לפחות ארבע פעמים. לעשות זאת פעם הבקבוק הוא confluent על ידי כביסה עם 8 מ"ל של 1x DPBS, הוספת 1 מ"ל של טריפסין-EDTA עבור ניתוק תאים, הוספת 10 מ"ל של מדיה מחוממת לתאים, ודילול 1:6-1:8 לתוך דש T-75 חדש המכיל 20 מ"ל של מדיה תרבותית מלאה מחוממת.
- תאי מעבר עד למספר המתאים של בקבוקונים T-150 המכיל 40 מ"ל של מדיה תרבותית מלאה מחוממת עבור מספר העכברים להיות מוזרק. רוב המחקרים ידרשו מספר רב של בקבוקונים T-150 כדי להבטיח מספיק תאים להזרקה.
- כאשר עכברים מוכנים להזרקה (בני 8 שבועות או שוקלים מעל 20 גרם, בהתאם לפרוטוקולים IACUC או מוסדי), קציר תאים על ידי השלכת מדיה, שטיפת כל בקבוקון עם 10 מ"ל של 1x DPBS והוספת 2 מ"ל של טריפסין-EDTA. דגירה במשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד התאים להתנתק.
- לשטוף בקבוק עם 10 מ"ל של מדיה מלאה ולהעביר את כל התוכן (10 מ"ל של מדיה + 2 מ"ל של תערובת תא טריפסין-EDTA) לבקבוק הבא. המשך לשטוף ולאסוף תאים מכל בקבוקון באמצעות אותו 10 מ"ל של מדיה, כדי למנוע שימוש בכמות מוגזמת של מדיה.
- לאחר איסוף כל הבקבוקים, העבר את התוכן לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאסוף מדגם 10 μL לספירה בצינור microcentrifuge צנטריפוגה צינור חרוט 50 מ"ל ב 125 x גרם במשך 5 דקות.
- בעוד תאים להיות צנטריפוגה, להוסיף 10 μL של טריפאן כחול ל 10 μL של דגימת תא. לספור תאים באמצעות המוציטומטר. לאחר שנקבע המספר הכולל של תאים, לחשב את ריכוז התאים הדרושים כדי להזריק עכברים עבור 1.2 x 106 תאים לכל עכבר (לכל 100 μL).
- לאחר צנטריפוגה, מדיה decant ו גלולת תא resuspend בכמות הנכונה של DPBS סטרילי 1x עבור 1.2 x 106 תאים לכל 100 μL. לפצל את תערובת התא / DPBS לתוך צינורות microcentrifuge לגישה קלה עם המזרק בעת שאפת תאים להזרקה. שמור תאים על קרח ולהזריק זמן קצר לאחר מכן כמו תאים יתחילו למות לאחר היותו על קרח במשך פרקי זמן ממושכים.
2. זריקות
- הכן תאים להזרקה על ידי הקשה או ערבוב עדין של צינור microcentrifuge כדי לנצל מחדש את התאים, ולאחר מכן שאף 600 μL למזרק 1 מ"ל. להפוך את המזרק כלפי מעלה ולמשוך את הבוכנה למטה כדי להביא תאים מפתיחת המזרק. הקש על המזרק כדי להיפטר מבועות אוויר.
- חבר את המחט משופע ולחלק תאים בחזרה לתוך צינור microcentrifuge עד רק 500 μL להישאר במזרק. שים מזרק שטוח על קרח.
הערה: תאי 4T1 נופלים מההשעיה במהירות. לכן, חשוב לערבב תאים בחזרה להשעיה על ידי הקשה לעתים קרובות. - הרדמה 8 שבוע ישן / >20 גרם נקבה BALB / c עכבר באמצעות isoflurane או סוכן הרדמה מאושר אחר. לפקח על הנשימה של העכבר כדי להעריך את עומק ההרדמה.
- לאחר העכבר הוא הרדמה כראוי כפי שצוין על ידי חוסר רפלקס הקרנית, מניחים את העכבר על גבו. באמצעות האגודל, המצביע והאצבע האמצעית, החזק בעדינות את העכבר לחוץ. השתמשו במצביע ובאצבעות האמצעיות כדי להחזיק את פלג הגוף העליון והאגודל של העכבר לרגלו השמאלית האחורית. תהיה עדין אבל תקיף.
- עם שפוע של המחט למעלה, להזריק 100 μL של תאים תת עורית לתוך כרית שומן חלב הבטן השמאלית של העכבר. לפקח על bleb טוב וכל דליפה, ולהבטיח את העכבר מתעורר וזז בקלות לאחר ההזרקה.
- להחליף מחטים בין כל עכבר.
הערה: אין לאפשר למחט להיכנס לחלל ההנצחה. זה יגרום לסרטן להתפשט במהירות ולא להיות נציג של המודל. כדי להבטיח זריקה תת עורית, בעדינות למשוך כלפי מעלה על המחט כאשר מוכנס כרית שומן חלב הבטן השמאלית. אם המחט מורמת בקלות כלפי מעלה, היא ממוקמת כראוי תת עורית.
- להחליף מחטים בין כל עכבר.
3. ניטור
- לפקח על עכברים לפחות 3 פעמים בשבוע עבור משקל, ציון מצב הגוף, גודל הגידול, מצב הגידול, נשימה, רמת פעילות, מראה, ותנועה. לאחר הגידול מגיע 0.7-0.8 ס"מ קוטר, להתחיל לפקח מדי יום.
- שקול המתת חסד כאשר גודל הגידול מגיע 1.5 ס"מ, או ירידה במשקל מגיע 20%, או ירידה קלינית חמורה ציון מצב הגוף, מצב הגידול, הנשימה, רמת הפעילות, המראה, או התנועה נצפו על סמך הנחיות מוסדיות.
הערה: ציון מצב הגוף הוא חיוני כדי לפקח כמו משקל הגוף עשוי להגדיל כמו הגידול עולה בגודל, שליל אובדן מצב הגוף עקב נטל המחלה. פרוטוקולי ניטור מדויקים יהיו תלויים בפרוטוקולי IACUC או המוסדי המאושרים.
- שקול המתת חסד כאשר גודל הגידול מגיע 1.5 ס"מ, או ירידה במשקל מגיע 20%, או ירידה קלינית חמורה ציון מצב הגוף, מצב הגידול, הנשימה, רמת הפעילות, המראה, או התנועה נצפו על סמך הנחיות מוסדיות.
4. נקרופסיה
- המתת לחץ לחץ באמצעות CO2 בעקבות הנחיות מוסדיות.
- לרסס עכבר עם 70% אתנול כדי לחטא. בצע חתך במעלה קו האמצע הגחוני של העכבר כדי לחשוף את חלל הגוף.
- הסר את הכליה. המשך לחתוך את קו האמצע עד הסרעפת גלוי. השתמש במספריים כדי לנקב את הסרעפת כדי לנפח את הריאות. חתוך את הסרעפת כדי לקבל גישה טובה יותר לחלל.
- השתמש במספריים קהים כדי לחתוך את מרכז בית החזה. הצמד את בית החזה בחזרה כדי לחשוף את הריאה והלב.
- לנטרל את הלב עם 2 מ"ל של DPBS 1x לא סטרילי על ידי החדרת מחט לתוך לשיא הלב עד שהוא בריכות בחלל הבטן שבו הכליה הוסרה.
- כדי להסיר את הלב והריאות, השתמש במספריים קהים כדי לחתוך את הוושט ואת קנה הנשימה ישירות מעל הלב. באמצעות מדפים, להתחיל למשוך את הלב מהגוף לחתוך בכל רקמת חיבור שמירה על זה מחובר. הריאות יצאו עם הלב.
- זהה את הריאות מרובות השפתיים (מימין) והריונות החד-קרקעיות (השמאליות). שמור את הלב מחובר לעיון, אבל ברגע שהריאות מזוהות, לחתוך את הלב משם.
- תייג צלחת 12 באר המכילה פתרון מלוחים מאוזן (HBSS) של האנק 1x בכל באר. כל עכבר צריך 2 בארות. מניחים את הריאה מרובת השפתיים (מימין) בצלחת 12 היטב להערכת גרורות ולשמור על קרח. שמור על באר השכנה ריקה לעת עתה.
הערה: חשוב להשתמש באותה ריאה (מרובת אונים) מכל עכבר כדי להבטיח שכל דגימה קרובה בגודלה. לאחר מכן ניתן להשתמש בריאה החד-קרקעית לניתוח אחר, כמו היסטופתולוגיה.
הערה: דגימות יציבות על קרח או ב 4 °C (60 °F) במשך כמה שעות.
5. עיבוד רקמות
הערה: יש לעשות את כל השלבים בסעיף זה בטכניקה סטרילית.
- תווית 1 צינור חרוט 15 מ"ל לכל עכבר ולהוסיף 2.5 מ"ל של סוג IV קולגן תערובת 30 יחידות של אלסטאז לכל צינור. כדי להפוך את סוג IV קולגנס תערובת, להמיס 2 מ"ג של קולגן מסוג IV לכל mL 1x HBSS ומסנן סטרילי. זה יכול להיות מאוחסן עד 12 חודשים ב -20 °C (69 °F) ומופשר בעת הצורך.
- העבר את הריאה השני, נקי 1x HBSS היטב עבור מדגם זה. מערבולת באמצעות מדפים כדי להסיר את כל הדם שנותר. מעבירים ריאה נקייה לצלחת תרבות רקמה ריקה של 3.5 ס"מ. ריאות טחון עם מספריים. יש לשטוף צלחת עם 2.5 מ"ל של 1x HBSS, להעביר 1x HBSS וחתיכות ריאות לתוך צינור חרוט 15 מ"ל כבר המכיל קוקטייל קולגנס / אלסטאז (5 מ"ל בסך הכל).
- דגירה במשך 75 דקות ב 4 °C (60 °F). המשך ערבוב דגימות במהלך תקופה זו, כך למקם צינורות על נדנדה או גלגל מסתובב. במהלך שלב דגירה זה, תווית צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל ו 10 ס"מ רקמות צלחות תרבות עבור כל עכבר. אם עושים דילול, תווית מספיק 10 ס"מ רקמות צלחות תרבות עבור דילול.
הערה: סמן את המכסה של לוחות תרבות הרקמה. אם תיוג הלוח עצמו, הכתיבה תפריע לניתוח פיג'י-ImageJ. - הביאו נפח של כל צינור עד 10 מ"ל בסך הכל עם HBSS 1x. יוצקים תוכן מעל מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מ"ל עבור כל מדגם. השתמש הבוכנה של מזרק 1 מ"ל לטחון בעדינות את המדגם דרך מסננת כדי לאפשר תאים נוספים לסנן דרך.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 350 x גרם בטמפרטורת החדר (RT). השלך את גלולת העל לשטוף עם 10 מ"ל של 1x HBSS. חזור על שלב זה פעמיים.
- גלולה resuspend ב 10 מ"ל של 60 מיקרומטר 6TG מדיה תרבות מלאה, או RPMI או IMDM. דגימות צלחת ב 10 ס"מ צלחות תרבות התא, באמצעות ערכת דילול אם תרצה. דגירה ב 37 °C (69 °F, 5% CO2 במשך 5 ימים.
הערה: 1:2, 1:10 ו- 1:100 הם דילולים נפוצים שיש לקבוע באופן אמפירי בהתבסס על פרמטרי המחקר.
התרגם: 6TG רעיל. נקוט זהירות בעת טיפול ופעל בהתאם לכל הנחיות הבריאות והבטיחות הסביבתית לסילוק.
6. צלחות מכתים
- יוצקים מדיה תרבותית מצלחות לתוך מיכל פסולת מתאים. לתקן תאים על ידי הוספת 5 מ"ל של מתנול לא מזוהה לכל צלחת דגירה במשך 5 דקות ב RT, הקפדה על מערבולת מתנול, כך שהוא מכסה את הצלחת כולה.
התריעה: מתנול מסוכן אם הוא נבלע, שואף או על העור. השתמש ברדס אדים לשלב זה. - יוצקים מתנול מהצלחות לתוך מיכל פסולת מתאים. שוטפים צלחות ב-5 מ"ל מים מזוקקים לצלחת ויוצקים מים לתוך מיכל פסולת מתאים. מוסיפים 5 מ"ל של 0.03% מתילן כחול לצלחת ודגירה במשך 5 דקות ב RT, הקפדה על פתרון כחול מתילן מערבולת כך שהוא מכסה את הצלחת כולה.
- יוצקים כחול מתילן לתוך מיכל פסולת מתאים. לשטוף צלחות שוב עם 5 מ"ל של מים מזוקקים לכל צלחת. הופכים צלחות וכתמים על מגבת נייר כדי להסיר נוזל עודף. מניחים צלחת על המכסה שלה ולתת אוויר להתייבש לילה ב RT.
הערה: מושבות גרורתיות יהיו כחולות. לאחר צלחות מיובשות, הם יכולים להיות מאוחסנים ב RT ללא הגבלת זמן.
7. ניתוח תמונה
- הסר מכסים המסווים מהצלחות, תוך הקפדה על זיהוי ברור של דגימות. בשורה את כל לוחות הריאות מוכתמים על משטח נקי וקל כדי לצלם את כל הצלחות בתמונה אחת.
- צלם תמונה של אוסף הצלחות באזור מואר היטב, הקפד למזער השתקפויות מכיוון שהצלחות מחזירות אור מאוד. השתקפויות בצלחות ישפיעו על ניתוח התמונה ולכן יש להימנע.
הערה: פיג'י-ImageJ יש גבול עליון של 2 ג'יגה-פיקסל. רוב הטלפונים החכמים המודרניים יהיו מספיק מצלמות. אין להשתמש במצלמה בפחות מ-8 מגה-פיקסל. המצלמה ששימשה בניסוי זה הייתה 12.2 מגה פיקסל על פיקסל 2 של גוגל. - חותכים את התמונה כך שתכלול את הלוחות, אך לא כוללים את המכסים או כל דבר אחר ברקע התמונה. העלה את התמונה החתוכה לתוך פיג'י-ImageJ.
- שנה את התמונה לשחור-לבן באמצעות הפקודות הבאות: תמונה, התאמה, סף צבע, שיטת סף: ברירת מחדל, צבע סף: B&W, רווח סף: Lab. בטלו את הבחירה בתיבת הרקע הכהה. התמונה צריכה להיות עכשיו שחור ולבן. שחור מייצג את רקע האור, ולבן מייצג את המושבות גרורתיות כחולות.
- באמצעות הכלי עיגול בסרגל הכלים פיג'י-ImageJ, בחר את האזור שיש לנתח. ציירו עיגול אחד לשימוש עבור כל הלוחות כדי להבטיח שכל לוח ינותח עבור אותו אזור בגודל. בחרו גודל שמגדיל את האזור המנותח על הלוחות תוך מזעור רעשי הרקע המופיעים בקצה הלוחות. הגודל מופיע בסרגל הכלים בעת ציורו, כך שניתן ליצור עיגול מושלם על-ידי ניטור הגובה והרוחב בעת ציור העיגול.
- נתח את העיגול הנבחר כדי לקבוע איזה אחוז מהאזור הוא לבן, המייצג את אזור הלוח הכולל מושבות גרורתיות כחולות. השתמש בפקודות הבאות:
לנתח, לנתח חלקיקים, גודל(פיקסל 2): 0-אינסוף, מעגליות: 0.00-1.00, הצג: כלום, וסמן את התיבה לסכם. הכה בסדר. - רשום את התוצאה % אזור. זהו אחוז האזור שנבחר שהוא לבן, ולכן מייצג את הנטל גרורתי.
הערה: מומלץ לשמור את התוצאות בפיג'י-ImageJ או להעתיק/להדביק את דף התוצאות כולו במסמך נפרד. אם % תוצאות האזור אינן צפויות או חשודות, ניתן לראות אם אחת מהמידות האחרות הייתה גם חשודה או אם % Area נרשם באופן שגוי. - הזז את העיגול, מבלי לשנות את גודלו על ידי תפיסתו במרכזו, לצלחת הבאה בתמונה. חזור על שלבים 7.6 ו- 7.7 עבור כל הלוחות בתמונה.
- חזור על שלבים 7.1 – 7.8 בשתי תמונות נוספות לפחות. לאחר שניתחו את כל הלוחות והתמונות, ממוצע תוצאות % אזור בין תמונות שונות עבור כל לוח כדי לצמצם את חוסר העקביות בין התמונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו מכילה התאמות פשוטות מפרוטוקול פולסקי ואוסטראן-רוזנברג 4T13 ו ניתן לדמיין אותן איור 1. כאשר 3 חוקרים נפרדים ספרו ידנית מושבות גרורתיות עבור 12 צלחות ריאה (דילול של 1:10), התוצאות היו מאוד לא עקביות בין מונים שונים (איור 2A). כל החוקרים הופנו "לספור את המושבות גרורתיות המופיעות כנקודות כחולות", אך חוסר העקביות מדגים את הבעיה עם ספירה ידנית של לוחות גרורתיים מאוד. לחוקרים היו רמות שונות של ניסיון עם מודל 4T1. פתולוג וטרינרי מוסמך ניתח שקופיות ריאה מוכתמות H&E עבור גרורות כשיטה נוספת להשוואה לניתוח לוחית הריאות פיג'י-ImageJ (איור 2B).
באמצעות ניתוח פיג'י-ImageJ, 3 חוקרים נפרדים ניתחו 3 תמונות נפרדות של האוסף של 12 צלחות (1:2 דילול). התמונות צולמו בשני חללי מעבדה נפרדים עם תאורה שונה במקצת. סידור הלוחות או הזווית שממנה צולמה התמונה היו שונים בין כל תמונה. בניגוד לתוצאות הספירה הידנית, תוצאות פיג'י-ImageJ היו עקביות בין מונים לכל אחת מ-3 התמונות (איור 3A). כדי לקבוע אם היו חוסר עקביות בין 3 התמונות, התוצאות מ-3 התמונות ו-3 המונים שולבו לכל לוח ריאות (איור 3B). ישנם הבדלים בין תמונות עבור צלחות מסוימות, אך המגמות הכלליות דומות והוא מציע עקביות רבה יותר מאשר ספירה ידנית. כדי להסביר את הווריאציות בין 3 התמונות השונות, התוצאות מכל תמונה היו ממוצעות עבור כל לוח (איור 3C). ממוצעים אלה סיפקו תוצאות עקביות בין מונים המנתחים במדויק ובדייקנות נטל גרורתי. לכן, פרוטוקול זה מציע לצלם לפחות 3 תמונות של אוסף הלוחות בסידורים שונים, מזוויות שונות, או בהגדרות אור שונות במקצת, ולאחר מכן לנתח את התוצאות ולתן להן ממוצע. הניגוד בין ספירה ידנית לניתוח פיג'י-ImageJ הוא חזותי בעת השוואת איור 2A לאיור 3C.
דרך נוספת להדגמת השיפורים שמציע פרוטוקול זה היא השוואת דירוג הלוחות מהעומס גרורתי הנמוך ביותר בין המונים, בהתבסס על הספירות מאיור 2 ואיור 3. ספירה ידנית הסכימה על הצלחת המבלבלת ביותר, אך כל השורות הבאות לא היו עקביות בין מונים (איור 4A). לעומת זאת, השורות מניתוח פיג'י-ImageJ עבור כל תמונה היו הרבה יותר עקביות בין מונים (איור 4B). העקביות נראית גם כאשר התוצאות מכל תמונה עבור כל לוח היו ממוצעות (איור 4C). אנו מכירים בכך שפרוטוקול זה אינו מציע עקביות מלאה בין מונים, אך הוא שיפור מספירה ידנית בעת השוואת איור 4A לאיור 4C. הניתוח ההיסטופתולוגי היה שונה הן מספירה ידנית והן מספירת פיג'י-ImageJ (איור 4D).
כדי להדגים את החשיבות של הימנעות מהשתקפויות בתמונות, מוצגת תמונה עם השתקפות של יד וניתוח פיג'י-ImageJ (משמאל) המתנגד לאותו לוח ללא השתקפות (מימין) (איור 5A). פגמים כהים אחרים ממשטח רקע מלוכלך או שאריות דגימת דם על הצלחות יכולים להשפיע לרעה גם על ניתוח פיג'י-ImageJ. לוחית הדם של איור 5B כוללת רק 2 מושבות גרורתיות (שצוינו על ידי חצים לבנים), אך השאריות הכהות (שצוינו על ידי חצים שחורים) גרמו לפיג'י-ImageJ לראות בו 31.6% גרורתי. לכן, חשוב שיהיה משטח נקי וקל ולא להשתמש בשיטה זו לדגימות דם כתוצאה מדגימות דם בדרך כלל ישאירו שאריות כתמים כהים על הצלחת כי הם לא מושבות גרורתיות.
איור 1: סכמטי פרוטוקול. פרוטוקול זה מתמקד אך ורק בניתוח גרורות ריאות במודל 4T1. הזרימה הכללית של פרוטוקול זה כוללת גידול תאים 4T1 בתרבות, הזרקת BALB / c עכברים נקבה עם 4T1 תאים כרית שומן חלב הבטן השמאלית, ניטור עכברים על פי IACUC ופרוטוקולים מוסדיים, הקרבת עכברים ואיסוף הריאה, איסוף תאים מדגימות הריאה, ציפוי ודגירה תאים במדיה בחירת 6TG, תיקון וכתמים תאים לאחר 5 ימים, לצלם את הצלחות, וניתוח אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: לספירה ידנית של תאים גרורתיים וניתוח היסטופתולוגי יש תוצאות לא עקביות. א. 12 צלחות ריאה בדילול של 1:10 נספרו ידנית על ידי 3 חוקרים נפרדים שהונחו לספור מושבות גרורתיות באותו אופן, אם כי הניסיון עם המודל השתנה בין החוקרים. מספר המושבות גרורתיות שנספרו השתנה מאוד בין החוקרים. ב. ניתוח היסטופתולוגי זיהה וכמת אגרגטים של תאי גידול בודדים, המסווגים כגרירות, נוכחים בשקופיות ריאות מוכתמות H&E. מוצגות תמונות הגדלה גבוהות, בינוניות ונמוכה של שקופית מייצגת אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח פיג'י-ImageJ מדויק ומדויק בקביעת נטל גרורתי. א. 12 צלחות ריאה בדילול של 1:2 נותחו על ידי 3 חוקרים נפרדים ב-3 תמונות נפרדות של 12 לוחות הריאות. ב. תוצאות מכל אחת מ-3 התמונות של כל אחד מ-3 החוקרים שולבו. ג. התוצאות מכל צלחת ריאות מ-3 התמונות היו ממוצעות. ANOVA חד-כיוון עם בדיקת ההשוואה המרובת של Tukey לא קבע הבדלים משמעותיים בין מונים עבור כל צלחת ריאות. הנתונים מוצגים כ- mean + SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח פיג'י-ImageJ מספק דירוג עקבי יותר של נטל גרורתי בהשוואה לספירה ידנית וניתוח היסטופתולוגי. א. אותן צלחות ריאה מאיור 2 דורגו מרובן למטאטוריות פחות בהתבסס על הספירות הידנית מאיור 2. ב. אותם 12 לוחות ריאה מאיור 3 דורגו מרובם למטאטסטטיים פחות על סמך ניתוח פיג'י-ImageJ מאיור 3A. די. שקופיות הריאות דורגו מרובן לפחות גרורתיות בהתבסס על הערכה היסטופתולוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השתקפויות וכתמים כהים שאינם גרורתיים ישפיעו לרעה על התוצאות. א. תמונה עם השתקפות של יד לוקח את התמונה משבש את ניתוח פיג'י-תמונה J, כפי שמוצג בהשוואת ניתוח פיג'י-ImageJ השתקפות (שמאל) לניתוח פיג'י-ImageJ הנכון (מימין) B. לוחות דם לעתים קרובות להשאיר כתמים שאריות (חצים שחורים) על הלוחות שאינם מושבות גרורתיות (חצים לבנים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שהוכח, ספירה ידנית של המושבות גרורתיות על כל לוח ריאות יכולה להיות שיטה לא מדויקת ולא מדויקת לכימות גרורות ריאות, המדגימה את הצורך באמצעי כימות טוב יותר (איור 2). הניתוח ההיסטופתולוגי היה שונה במקצת הן מספירה ידנית והן מניתוח פיג'י-ImageJ (איור 2B ו- 4D), ככל הנראה מכיוון ששקופיות H&E אינן מדגם מייצג של האיבר כולו. הפרוטוקול קוצר ריאה שלמה, ולכן מייצג יותר את גרורות הריאות הכוללות, והוא עקבי יותר מספירה ידנית. מספר גישות שונות לניתוח פיג'י-ImageJ נוסו ונדונו להלן, אך נראה שהפרוטוקול שתואר לעיל הוא השיטה המעולה.
דגימות ריאה, דם ומחוץ נאספו למחקר זה. עם זאת, דגימות הדם והמוח היו מעט מאוד מושבות גרורתיות, אם בכלל. קבענו שספירה ידנית של המושבות גרורתיות היא אופטימלית עבור רקמות פחות גרורתיות אלה, ולכן נתוני הדם והמוח לא נכללו. כאשר קל לספור ידנית את הנטל גרורתי (למשל, עשר או עשרים מושבות גרורתיות לעומת אלפים), הנושא המקורי של טעות אנוש אינו רלוונטי, ולכן אין צורך בפרוטוקול זה. כמו כן, דגימות דם יכולות להשאיר כתמים כהים על הצלחות לאחר קיבעון, מה שמפריע לניתוח פיג'י-ImageJ (איור 5). חשוב לציין, כמות התאים מוזרק יכול להשפיע על הנטל גרורתי. לדוגמה, אם פחות תאים מוזרקים והעכברים יכולים לשרוד זמן רב יותר, לסרטן יש יותר זמן להתפשט לאתרים פחות גרורתייםבאופן מסורתי כמו המוח 3,4. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לכלול את הנטל גרורתי של רקמות אחרות אם הם מקבלים זמן להיות גרורתי מאוד. אם מנסים לראשונה את מודל 4T1 או משנים את כמות התאים שהוזרקו, מומלץ לנסות לפחות שני דילולים בעת ציפוי תאים. למחקר זה, השתמשנו 1:2 ו 1:10 דילול. 1:2 דילול היה קשה לספור באופן ידני, אבל נספר בקלות פיג'י-ImageJ. הדילול של 1:10 עדיין היה קשה לספור באופן ידני ולכן הוביל לתוצאות לא עקביות. ניתן לשנות את הדילול בהתבסס על פרמטרי המחקר הספציפיים.
תמונות צולמו של צלחות ריאה בודדות ו-12 צלחות ריאה יחד. לוחות בודדים נותחו בשתי דרכים: חיתוך התמונה לריבוע מרכזי של הלוח לפני ההעלאה לפיג'י-ImageJ, או שימוש בכלי בחירת העיגולים בפיג'י-ImageJ לבחירת העיגול המרכזי של הלוח בתמונה הלא קצוצה. מצאנו כי השימוש בכלי בחירת המעגלים בפיג'י-ImageJ הציע את הדרך הקלה והעקבית ביותר ליצור אזור בגודל זהה לניתוח עבור כל הלוחות. יתר על כן, ניתוח כל האוסף של צלחות ריאות באותה תמונה היה עדיף על ניתוח תמונות בודדות של לוחות ריאות בודדים. לאחר כל לוחות הריאות באותה תמונה מאפשר עיגול בגודל זהה לשמש בקלות בין צלחות הריאות. זה מבטיח את כל לוחות הריאות הם באותו מרחק מהמצלמה ולכן עיגול בגודל זהה לניתוח צריך להיות בגודל הנכון עבור כל לוחות הריאות בתמונה. זה גם עושה ניתוח מהר יותר כמו שרטוט מחדש של המעגל אינו הכרחי בין צלחות. הוא פשוט נגרר אל הלוח הבא בתמונה מבלי לשנות את גודלו, אשר מבטיח את אותו גודל משמש עבור כל הלוחות בתמונה. בעת בחירת גודל העיגול, חשוב לעשות את זה גדול מספיק כדי לנתח את רוב הצלחת בעוד קטן מספיק כדי למנוע את רעש הרקע משודי הצלחת. יתר על כן, בניסיון להציל את reagents, תאים היו גם מצופים 6 צלחות גם לעומת 10 ס"מ רקמות צלחות תרבות. תוצאות פיג'י- ImageJ מ 6 צלחות באר היו פחות עקבי ולא לתאם את מנות 10 ס"מ (נתונים לא מוצגים). הסבר אחד הוא שטח הפנים הקטן יותר מספק שטח קטן יותר לניתוח, מה שמוביל לנתונים פחות מייצגים. דבר נוסף הוא שצמצום שטח הפנים מאפשר לתאים לצמוח מהר יותר ככל שהם קרובים יותר לתאים אחרים ששרדו. לכן, איננו ממליצים להשתמש בריאגנטים של תרבות הרקמות מלבד מה שתיארנו בפרוטוקול.
כפי שהוזכר קודם לכן, הימנעות השתקפויות בעל רקע נקי, אור הם קריטיים לחלוטין לשיטה זו. איור 5A מדגים כיצד השתקפות מנותחת בפיג'י-ImageJ ולכן מראה את החשיבות הקריטית של הימנעות מהשתקפויות. כמו צלחות תרבות רקמה הם רפלקטיביים מאוד, זה מועיל לקחת את התמונה בזווית קלה, כדי למנוע השתקפויות מעצמך לצלם את התמונה או ממקורות האור לעיל. יהיה צורך להסביר את תנאי התאורה של אזור העבודה הספציפי. אנו ממליצים לצלם תמונות מרובות של הצלחות שיש לנתח, לנסות סידורים ו / או זוויות שונים במקצת, באזור מואר היטב. למד את התמונות בעוצמה עבור כל השתקפויות. אם יש חוסר עקביות בניתוח, סביר להניח שזה נובע מבעיה באיכות התמונה. כדי לפתור בעיות, השווה את התמונה הרגילה לתמונה בשחור-לבן. אם אזורים אינם כחולים בתמונה הרגילה מופיעים כלבנים בתמונה בשחור לבן, סביר להניח שיש השתקפות או פגם משנה את התוצאות.
בנוסף לעקביות, יתרון בולט נוסף של שיטה זו הוא שהיא מייצרת נתונים הרבה יותר מהר מאשר ספירה ידנית. ספירה ידנית של צלחות מרובות גוזלת זמן רב מאוד, בעוד ניתוח פיג'י-ImageJ יכול להיעשות במהירות. זה גם מאפשר זמן דגירה קצר יותר. פולסקי ואוסטראן-רוזנברג ממליצים על תקופת דגירה של 10-14 יום לתאים המצוהים, ומוסיפים כמות משמעותית של זמן למחקר3. תקופת הדגירה של 10-14 יום מאפשרת ליצור מושבות גדולות וקלות יותר לפורץ. עם זאת, צלחות ריאה רבות יכולות להיות confluent לפני כן. במקום זאת, 5 ימים של דגירה נותן מספיק זמן עבור הבחירה 6TG להרוג תאים שאינם סרטניים (הוכח על ידי עכברי שליטה בריאה אין מושבות על לוחות הריאות שלהם, נתונים לא מוצגים), ועל התאים לגדול מספיק כדי להיות מכומת בקלות עם פיג'י-ImageJ. זה מקטין באופן משמעותי את הזמן בין העכברים להיות מוקרב וניתוח נתונים גרורתיים חיוניים.
לסיכום, היתרונות של שיטה זו עולים בהרבה על המגבלות. אנו מכירים בכך ששיטה זו אינה מציעה עקביות מושלמת. אמנם זה לא השיטה האידיאלית עבור רקמות פחות גרורתי, רקמות אלה ניתן לספור בקלות באופן ידני. בעוד מקבל תמונה ללא השתקפויות יכול לדרוש קצת צילום זהיר, העקביות שנרכשה עם שיטה זו היא משמעותית. ייתכן כי שיטה זו יכולה לשמש עבור רקמות אחרות כי הם גרורתי מאוד פרוטוקולים אחרים הדורשים ספירת אובייקטים מוכתמים. עיצוב המחקר יכול גם לאפשר ניתוח קצב גרורות או השפעה של טיפולים אנטי סרטניים על גרורות. שיטה זו תספק נתוני גרורות עקביים ואמינים ביותר ותייצג עידון משמעותי למודל 4T1. היישום של מודל זה לחקר גרורות סרטן השד הקרובה הוא בעל חשיבות עליונה בהתחמשות חוקרים עם כלים להילחם נגד תמותה מסרטן השד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכללה לרפואה וטרינרית וירג'יניה-מרילנד (IA), המכון הטכנולוגי וירג'יניה לטכנולוגיה קריטית ומרכז מדע יישומי לבריאות מהונדסת (IA), והמונים הלאומיים לבריאות R21EB028429 (IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
