Summary
Vi beskriver en mer konsekvent och snabb metod för att kvantifiera lungcancer metastasering i 4T1 bröstcancer modellen genom att använda fijianska-ImageJ.
Abstract
Bröstcancer är en förödande malignitet, står för 40.000 kvinnliga dödsfall och 30% av nya kvinnliga cancerdiagnoser i USA bara under 2019. Den främsta orsaken till bröstcancer relaterade dödsfall är den metastaserande bördan. Därför prekliniska modeller för bröstcancer behöver analysera metastaserande börda vara kliniskt relevant. 4T1 bröstcancer modellen ger en spontant-metastaserande, kvantifierbara mus modell för steg IV mänskliga bröstcancer. De flesta 4T1-protokoll kvantifierar dock den metastaserande bördan genom att manuellt räkna färgade kolonier på vävnadskulturplattor. Medan detta är tillräckligt för vävnader med lägre ögonbevarande börda, mänskliga fel i manuell räkning orsakar inkonsekvent och varierande resultat när plattorna är konfluenta och svåra att räkna. Den här metoden erbjuder en datorbaserad lösning på fel i mänskligt räknefel. Här utvärderar vi protokollet med hjälp av lungan, en mycket metastaserande vävnad i 4T1-modellen. Bilder av metylenblå-färgade plattor förvärvas och laddas upp för analys i Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bestämmer sedan procentandelen av det markerade området i bilden som är blått, vilket representerar den procentuella andelen av plattan med metastaserande börda. Denna datorbaserade metod erbjuder mer konsekventa och snabbt resultat än manuell räkning eller histopatologisk utvärdering för mycket metastaserande vävnader. Konsekvensen av Fiji-ImageJ resultat beror på kvaliteten på bilden. Små variationer i resultat mellan bilderna kan förekomma, alltså rekommenderas att flera bilder tas och resultat i genomsnitt. Trots dess minimala begränsningar, denna metod är en förbättring av kvantifiera ögonbevarande börda i lungan genom att erbjuda konsekvent och snabba resultat.
Introduction
En av åtta kvinnor kommer att diagnostiseras med bröstcancer under sin livstid, och ändå trots flera behandlingsalternativ bröstcancer är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall hos amerikanska kvinnor1. Dessa kvinnor dör inte av den primära tumören i bröstet. Istället, den metastaserande bördan är ansvarig för dödligheten i denna sjukdom som det vanligen sprider sig till lunga, ben, hjärna, lever, och lymfkörtlar2. På grund av detta, bröstcancer modeller måste utvärdera metastasering att bidra till att bromsa dödligheten i denna sjukdom. Den 4T1 murine bröstcancer modell är ett utmärkt protokoll för att åstadkomma detta. Den metod som beskrivs här erbjuder en förbättring av 4T1-modellen genom att använda Fiji-ImageJ för att kvantifiera lung metastasering, producera konsekvent och snabba resultat.
4T1-modellen är väletablerad, där de flesta labb använder protokoll som de som beskrivs av Pulaski och Ostrand-Rosenberg 20013. Den 4T1 cellinje är 6-Thioguanine (6TG) resistenta och representativa för steg IV, trippel negativ bröstcancer3,4,5. Det är kliniskt relevant eftersom det är en ortopisk modell och spontant metastasizes till samma organ som i mänskliga bröstcancer3,4. 4T1-cellerna metastaserar spontant i en förutsägbar takt baserat på mängden celler som injiceras3,4. Viktigt, genetiska skillnader mellan möss som används här orsakade förväntade inter-individuella variationer i metastaserande börda. För att utvärdera metastasering, vävnader skördas för att samla in och kvantifiera cancerceller i avlägsna platser med hjälp av 6TG urval och metylenblått färgning. Resultatet är en samling vävnadskulturplattor med blå prickar som representerar metastaserande kolonier. Däremot kvantifierar Pulaski- och Ostrand-Rosenberg-protokollet metastatiska kolonier genom att manuellt räkna dem, och därför har detta varit standardmedlet för att utvärdera metastasering i denna modell. Även om detta är lätt för vävnader med låg metastaserande börda, vävnader som lungorna är ofta lastad med metastaser. Som lungplattor kan vara mycket sammanflytande, exakt och exakt kvantifiera ögonbevarande kolonier genom manuell räkning är svårt och benägna att mänskliga fel. För att bättre kvantifiera metastatisk börda, beskriver vi med fijianska-ImageJ för en datorbaserad lösning på mänskliga räkna fel. Histopatologisk analys med hematoxylin och eosin (H&E) färgning är ett annat medel för att kvantifiera lung metastaser, och intressant har också förbättrats med Fiji-ImageJ programvara6,7. Men eftersom histopatologisk analys observerar en enda del av lungan, kan det vara felaktiga och icke-representativa. Detta beror på att 4T1-modellen orsakar flera ögonbevarande skador i hela organet som inte är jämnt fördelade. Medan övergripande trender mellan histopatologisk analys och manuell räkning kan vara liknande8, kan enskilda värden skilja sig åt och därför bör inte histopatologisk analys användas som enda medel för kvantifiering. Vi visar nyttan jämfört med histopatologisk analys och inkonsekvenserna i manuell räkning mellan olika räknare, samtidigt som vi visar på konsekvensen i att använda Fiji-ImageJ. Dessutom visar vi att denna metod kan minska inkubationstiden från 10-14 dagar till 5 dagar, vilket innebär att forskare kan analysera data från sina studier mycket tidigare än när de förlitar sig på manuell räkning.
Denna metod är en samling enkla justeringar av Pulaski och Ostrand-Rosenbergsprotokoll3. Eftersom 4T1-modellen används i stor utsträckning, och eftersom lungmetastas är en kritisk parameter att mäta i prekliniska modeller, tror vi att denna metod kan användas i stor utsträckning och är mycket värdefull för bröstcancerforskare. Den enda ytterligare leveranser som behövs är en kamera och tillgång till en dator med Fiji-ImageJ, en fri programvara som används ofta i bildanalys9. Denna metod fokuserar specifikt på lung metastasering, men det skulle kunna användas för andra vävnader med betydande metastaserande börda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) av Virginia Tech och i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av laboratoriedjur. För att utföra detta protokoll krävs tillstånd från lämpliga institutioner och anslutning till alla lämpliga riktlinjer.
1. Cellodling
- Gör komplett kultur media (RPMI + 10% Fetala Bovin Serum +1% Pen Strep). Återuppliva 4T1-celler enligt ATCC-protokoll10 och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i en T-25-kolv tills den konfluent. Byt media dagen efter återuppliva för att ta bort döda celler, och igen om media spenderas innan celler är sammanflytande nog att passage.
- När T-25-kolven är sammanflytande, passageceller till en T-75-kolv genom att medier kasseras, tvättkolv med 5 mL 1x Dulbeccos fosfatbuffrad salin (DPBS) och tillsats av 500 μL Trypsin-EDTA. Inkubera i 5-10 minuter vid 37 °C tills cellerna lossnar.
- När lossnat, tillsätt 5 mL värmt komplett odlingsmedia till celler. Aspirera och överför 5 mL till en T-75 kolv som innehåller 15 mL värmt komplett odlingsmedier.
- Passageceller i T-75 kolvar minst fyra gånger. Gör detta när kolven är sammanflytande genom att tvätta med 8 mL av 1x DPBS, lägga till 1 mL Trypsin-EDTA för lossande celler, lägga 10 mL värmt media till celler, och späda 1:6-1:8 i en ny T-75 kolv som innehåller 20 mL av värmde komplett kultur media.
- Passageceller upp till lämpligt antal T-150 kolvar som innehåller 40 mL värmt komplett odlingsmedier för det antal möss som ska injiceras. De flesta studier kommer att kräva flera T-150 kolvar för att säkerställa tillräckligt med celler för injektion.
- När möss är redo att injiceras (8 veckor gamla eller väger över 20 g, beroende på IACUC eller institutionella protokoll), skördeceller genom att kassera media, tvätta varje kolv med 10 mL 1x DPBS och lägga till 2 mL trypsin-EDTA. Inkubera i 5-10 minuter vid 37 °C tills cellerna lossnar.
- Tvätta kolv med 10 mL komplett media och överför allt innehåll (10 mL media + 2 mL trypsin-EDTA-cellblandning) till nästa kolv. Fortsätt att tvätta och samla in celler från varje kolv med samma 10 ml media för att undvika att använda en överdriven mängd media.
- När alla kolvar har samlats in, överför du innehållet till ett centrifugrör på 50 mL. Samla ett 10 μL-prov för räkning i ett mikrocentrifugrör och centrifugera det koniska röret på 50 mL vid 125 x g i 5 minuter.
- Medan celler centrifugeras, tillsätt 10 μL Trypan blå till 10 μL cellprov. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. När det totala antalet celler har bestämts beräknar du koncentrationen av celler som behövs för att injicera möss för 1,2 x 106 celler per mus (per 100 μL).
- Efter centrifugering, dekantera media och resuspend cell pellet i korrekt mängd av steril 1x DPBS för 1,2 x 106 celler per 100 μL. Split cell/DPBS blandning i mikrocentrifugrör för enkel åtkomst med sprutan vid aspirerande celler för injektion. Håll celler på is och injicera snart därefter som celler kommer att börja dö efter att ha varit på is under längre perioder.
2. Injektioner
- Förbered celler för injektion genom att knacka eller försiktigt blanda mikrocentrifugröret för att återanvända cellerna, och aspirera sedan 600 μL i en 1 mL-spruta. Vänd sprutan uppåt och dra ner kolven för att få bort celler från sprutöppningen. Knacka på sprutan för att bli av med luftbubblor.
- Sätt fast nålen avfasas uppåt och dosera ut cellerna i mikrocentrifugröret igen tills endast 500 μL finns kvar i sprutan. Lägg sprutan platt på is.
OBS: 4T1 celler faller ut ur suspension snabbt. Därför är det viktigt att blanda celler tillbaka till suspension genom att knacka ofta. - Söva 8 veckor gammal/>20 g kvinnlig BALB/c-mus med isofluran eller annat godkänt anestetiskt medel. Övervaka musens andning för att bedöma anestesidjup.
- När musen är ordentligt sövd som indikeras av brist på rekonklisent reflex, placera musen på ryggen. Med hjälp av tummen, pekaren och långfingret håller du försiktigt ned musen. Använd pekaren och långfingrarna för att hålla ned musens överkropp och tumme för dess bakre vänstra ben. Var mild men fast.
- Med avfasningen av nålen upp, injicera 100 μL celler subkutant i musens vänstra buken bröstfett pad. Övervaka för en bra bleb och eventuella läckage, och se till att musen vaknar och rör sig lätt efter injektion.
- Ändra nålar mellan varje mus.
OBS: Låt inte nål komma in i peritonealhålan. Detta skulle orsaka cancern att sprida sig snabbt och inte vara representativ för modellen. För att säkerställa en subkutan injektion, dra försiktigt uppåt på nålen när den sätts in i vänster buken bröstfett pad. Om nålen enkelt lyfts uppåt, är den korrekt placerad subkutant.
- Ändra nålar mellan varje mus.
3. Övervakning
- Övervaka möss minst 3 gånger i veckan för vikt, kroppstillstånd poäng, tumörstorlek, tumör tillstånd, andning, aktivitetsnivå, utseende, och rörelse. När tumören når 0,7-0,8 cm i diameter, börja övervaka dagligen.
- Överväg dödshjälp när tumörstorlek når 1,5 cm, eller viktminskning når 20%, eller allvarlig klinisk nedgång i kroppen skick poäng, tumör tillstånd, andning, aktivitetsnivå, utseende, eller rörelse observeras baserat på institutionella riktlinjer.
OBS: Kroppstillstånd poäng är avgörande för att övervaka som kroppsvikt kan öka som tumören ökar i storlek, negating kroppstillstånd förlust på grund av sjukdomsbörda. Exakta övervakningsprotokoll kommer att vara beroende av de godkända IACUC eller institutionella protokollen.
- Överväg dödshjälp när tumörstorlek når 1,5 cm, eller viktminskning når 20%, eller allvarlig klinisk nedgång i kroppen skick poäng, tumör tillstånd, andning, aktivitetsnivå, utseende, eller rörelse observeras baserat på institutionella riktlinjer.
4. Obduktion
- Avliva musen med hjälp av CO2 efter institutionella riktlinjer.
- Spraya mus med 70% etanol för att desinficera. Gör ett snitt upp den ventrala mittlinjen av musen för att exponera kroppshålan.
- Ta bort njuren. Fortsätt skära upp mittlinjen tills membranet är synligt. Använd sax för att punktera membranet för att tömma lungorna. Trimma membranet för att få bättre tillgång till hålrummet.
- Använd trubbig sax för att skära upp mitten av bröstkorgen. Pin bröstkorg tillbaka för att exponera lungan och hjärtat.
- Genomsyra hjärtat med 2 mL av icke-sterila 1x DPBS genom att sätta in en nål i hjärthpexet tills det pooler i bukhålan där njuren avlägsnades.
- För att ta bort hjärta och lungor, använd trubbig sax för att skära matstrupen och luftstrupen direkt ovanför hjärtat. Använda tärningar, börja dra hjärtat bort från kroppen och skär bort vid någon bindväv hålla den fäst. Lungorna kommer ut med hjärtat.
- Identifiera de flerlikiga (högra) och enbeniga (vänstra) lungorna. Håll hjärtat fäst som referens, men när lungorna identifieras, skär hjärtat bort.
- Märk en 12 brunnsplatta innehållande 1x Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) i varje brunn. varje mus behöver 2 brunnar. Placera den multiflikiga (högra) lungan i 12 brunnsplattan för metastasutvärdering och håll på is. Håll grannen väl tom så länge.
OBS: Det är viktigt att använda samma lunga (multi-flikiga) från varje mus för att säkerställa att varje prov är nära i storlek. Den enflikiga lungan kan sedan användas för annan analys, som histopatologi.
OBS: Proverna är stabila på is eller vid 4 °C i några timmar.
5. Bearbetning av vävnader
OBS: Alla steg i detta avsnitt ska göras med steril teknik.
- Etikett 1 15 mL koniskt rör per mus och tillsätt 2,5 mL av typ IV kollagenasblandning och 30 enheter av elastase till varje rör. För att göra typ IV kollagenasblandning, lös 2 mg av typ IV kollagenas per mL 1x HBSS och sterilt filter. Denna kan lagras upp till 12 månader vid -20 °C och tinas när det behövs.
- Överför lungan till den andra, rengör 1x HBSS väl för det provet. Virvel med hjälp av forceps för att avlägsna eventuellt kvarvarande blod. Överför ren lunga till tömd 3,5 cm vävnadsodlingsplatta. Färslunga med sax. Sköljplatta med 2,5 mL 1x HBSS, överför 1x HBSS och lungstycken till ett koniskt rör på 15 mL som redan innehåller kollagenas/elastascocktail (5 mL totalt).
- Inkubera i 75 minuter vid 4 °C. Fortsätt att blanda prover under denna tid, så placera rör på en vipp eller roterande hjul. Under detta inkuberingssteg, etikett 50 mL centrifugrör och 10 cm vävnadskulturplattor för varje mus. Om du gör en utspädning, etikett tillräckligt 10 cm vävnad kulturplattor för utspädningar.
OBS: Märk locket på vävnadskulturplattorna. Om märkning av plattan själv, kommer skrivandet störa Fiji-ImageJ analys. - Ta med volym på varje rör upp till 10 mL totalt med 1x HBSS. Häll innehåll över en 70 μm cellsil i ett 50 mL koniskt rör för varje prov. Använd kolven i en 1 mL-spruta för att försiktigt slipa provet genom silen för att låta fler celler filtrera igenom.
- Centrifugera i 5 minuter vid 350 x g vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 10 mL av 1x HBSS. Upprepa det här steget två gånger.
- Resuspend pellet i 10 mL av 60 μM 6TG komplett kultur media, antingen RPMI eller IMDM. Tallriksprover i 10 cm cellodlingsplattor, med hjälp av ett utspädningsschema om så önskas. Inkubera vid 37 °C, 5%CO 2 i 5 dagar.
OBS: 1:2, 1:10 och 1:100 är vanliga utspädningar som kommer att behöva fastställas empiriskt utifrån studieparametrar.
VAR FÖRSIKTIG: 6TG är giftigt. Var försiktig vid hantering och följ alla miljöhälso- och säkerhetsriktlinjer för kassering.
6. Färgning plattor
- Häll odlingsmedia av plattor i lämplig avfallsbehållare. Fixera celler genom att tillsätta 5 mL outspädd metanol per platta och inkubera i 5 minuter vid RT, se till att virvla metanol så att den täcker hela plattan.
FÖRSIKTIGHET: Metanol är farligt vid förtäring, inhaleras, eller är på huden. Använd en draghuv för detta steg. - Häll metanol av plattor i lämplig avfallsbehållare. Skölj plattor med 5 mL destillerat vatten per platta och häll vatten i lämplig avfallsbehållare. Tillsätt 5 mL 0,03 % metylenblått per platta och inkubera i 5 minuter vid RT, se till att snurra metylenblåttlösning så att den täcker hela plattan.
- Häll metylenblått i lämplig avfallsbehållare. Skölj plattorna igen med 5 mL destillerat vatten per platta. Vänd tallrikar upp och ner och blot mot en pappershandduk för att avlägsna överflödig vätska. Placera plattan på locket och låt lufttorka över natten på RT.
OBS: Metastaserande kolonier kommer att vara blå. När plattorna torkas, kan de förvaras på RT på obestämd tid.
7. Bildanalys
- Ta bort märkta lock från plattor, var noga med att säkerställa tydlig identifiering av prover. Rada upp alla färgade lungplattor på en ren, ljus yta för att ta en bild av alla plattor i en bild.
- Ta en bild av samlingen av plattor i ett väl upplyst område, se till att minimera reflektioner som plattorna är mycket reflekterande. Reflektioner i plattorna kommer att påverka bildanalys och därför måste undvikas.
OBS: Fiji-ImageJ har en övre gräns på 2 gigapixlar. De flesta moderna smarta telefoner kommer att ha tillräckligt med kameror. Använd inte en kamera mindre än 8 megapixel. Kameran som användes i detta experiment var en 12,2 megapixel på en Google Pixel 2. - Beskär bilden så att den inkluderar plattorna, men uteslut locken eller något annat i bakgrunden på bilden. Ladda upp den beskurna bilden i Fiji-ImageJ.
- Ändra bilden till svartvitt med följande kommandon: Bild, Justera, Färgtröskel, Tröskelmetod: Standard, Tröskelfärg: B&W, Tröskelutrymme: Labb. Avmarkera rutan Mörk bakgrund. Bilden ska nu vara svartvit. Svart representerar den ljusa bakgrunden, och vitt representerar de blå metastaserade kolonierna.
- Med hjälp av cirkelverktyget i fijianskt-ImageJ-verktygsfältet markerar du området som ska analyseras. Rita en cirkel att använda för alla plattor för att säkerställa att varje platta analyseras för samma storlek område. Välj en storlek som maximerar analyserat område på plattorna samtidigt som du minimerar bakgrundsljudet som visas på plattornas kant. Storleken visas i verktygsraden när den ritas, så det är möjligt att göra en perfekt cirkel genom att övervaka höjden och bredden när cirkeln ritas.
- Analysera den valda cirkeln för att bestämma hur stor andel av området som är vitt, vilket representerar området för plattan som har blå metastaserande kolonier. Använd följande kommandon:
Analysera, Analysera partiklar, Storlek (pixel2): 0-Infinity, Cirkuläritet: 0,00-1,00, Visa: Ingenting och markera rutan Sammanfatta. Slå OK. - Registrera %-områdesresultatet. Det här är procentandelen av det valda området som är vitt, och representerar därför den metastaserande bördan.
OBS: Det rekommenderas att antingen spara resultaten i Fiji-ImageJ eller kopiera / klistra in hela resultatsidan i ett separat dokument. Om % Arearesultat är oväntade eller misstänkta går det sedan att se om någon av de andra mätningarna också var misstänkta eller om % Area registrerades felaktigt. - Flytta cirkeln, utan att ändra dess storlek genom att ta tag i den i dess centrum, till nästa platta i bilden. Upprepa steg 7.6 och 7.7 för alla plattor på bilden.
- Upprepa steg 7.1 – 7.8 på minst två bilder till. När alla plattor och bilder har analyserats, medelvärde % Area resultat mellan olika bilder för varje platta för att mildra eventuella inkonsekvenser mellan bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod innehåller enkla justeringar från protokollet Pulaski och Ostrand-Rosenberg 4T13 och kan visualiseras i figur 1. När 3 separata forskare manuellt räknade metastaserade kolonier för 12 lungplattor (1:10 utspädning) var resultaten mycket inkonsekventa mellan olika räknare (Figur 2A). Alla forskare var riktade att "räkna de metastaserande kolonierna som visas som blå prickar", men inkonsekvenserna visar problemet med att manuellt räkna hög-metastaserande plattor. Forskarna hade varierande erfarenhetsnivåer med 4T1-modellen. En styrelse-certifierad veterinärmedicinska patolog analyserade H & E färgas lungbilder för metastasering som en annan metod för att jämföra med Fiji-ImageJ lungplåt analys (Figur 2B).
Med hjälp av Fiji-ImageJ-analysen analyserade 3 separata forskare 3 separata bilder av samlingen av 12 plattor (1:2 utspädning). Bilder togs i två separata lab utrymmen med något annorlunda belysning. Ordningen av plattorna eller vinkeln från vilken bilden togs var olika mellan varje bild. I motsats till de manuella räkneresultaten var Fiji-ImageJ-resultaten konsekventa mellan räknarna för var och en av de 3 bilderna (Bild 3A). För att avgöra om det fanns inkonsekvenser mellan de 3 bilderna, var resultaten från de 3 bilderna och de 3 räknarna kombinerade per lungplatta (Figur 3B). Det finns skillnader mellan bilder för vissa plattor, men de övergripande trenderna är liknande och det erbjuder mer konsekvens än manuell räkning. För att ta hänsyn till variationerna mellan de 3 olika bilderna, var resultat från varje bild i genomsnitt för varje platta (Figur 3C). Dessa medelvärden som konsekvent resultat mellan räknare som exakt och exakt analysera metastaserande börda. Därför föreslår detta protokoll tar minst 3 bilder av plattan samlingen i olika arrangemang, från olika vinklar, eller i något olika ljusinställningar, och sedan analysera och genomsnitt resultaten. Kontrasten mellan manuell räkning och Fiji-ImageJ-analys visualiseras vid jämförelse av figur 2A med figur 3C.
Ett annat sätt att visa de förbättringar som erbjuds av detta protokoll är att jämföra rangordningen av plattorna från de flesta till minst metastaserande börda mellan räknarna, baserat på räknarna från figur 2 och figur 3. Manuell räkning överens om den mest konfluenta plattan, men alla följande led var inkonsekvent mellan räknare (Figur 4A). Kontrasterande, leden från Fiji-ImageJ analys för varje bild var mycket mer konsekvent mellan räknare (Figur 4B). Konsistensen ses också när resultat från varje bild för varje platta var i genomsnitt (Figur 4C). Vi erkänner att detta protokoll inte erbjuder fullständig överensstämmelse mellan räknare, men det är en förbättring från manuell räkning vid jämförelse av figur 4A till figur 4C. Histopatologisk analys skilde sig från både manuell och Fiji-ImageJ räkna (Figur 4D).
För att visa hur viktigt det är att undvika reflektioner i bilderna visas en bild med en spegling av en hand och dess efterföljande Fiji-ImageJ-analys (vänster) som motsätter sig samma platta utan reflektion (höger) (Bild 5A). Andra mörka fläckar från en smutsig bakgrundsyta eller blodprovsrester på plattorna kan påverka Fiji-ImageJ-analysen negativt också. Blodplattan i figur 5B har endast 2 metastaserande kolonier (noteras av vita pilar), men de mörka rester (noteras av svarta pilar) orsakade Fiji-ImageJ att betrakta det som 31,6% metastaserande. Därför är det viktigt att ha en ren, ljus yta och att inte använda denna metod för blodprov eftersom blodprov vanligtvis kommer att lämna kvarstående mörka fläckar på plattan som inte är metastaserande kolonier.
Bild 1: Protokoll schematisk. Detta protokoll fokuserar enbart på att analysera lung metastas i 4T1-modellen. Det allmänna flödet av detta protokoll innefattar växande 4T1-celler i kultur, injicerar BALB/c honmöss med 4T1-celler i vänster bukmastemafettdyna, övervakning av möss enligt IACUC och institutionella protokoll, offra möss och samlar upp lungan, samlar in celler från lungproverna, plätering och inkubering av celler i 6TG-urvalsmedia, fixering och färgning av celler efter 5 dagar, ta bilder av plattorna och analysera med hjälp av Fiji-ImageJ. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Manuellt räkna metastaserande celler och histopatologisk analys har inkonsekventa resultat. A. 12 lungplattor med en 1:10 utspädning räknades manuellt av 3 separata forskare instruerade att räkna metastaserande kolonier på samma sätt, även om erfarenheten med modellen varierade mellan forskarna. Antalet metastaserade kolonier som räknades varierade kraftigt mellan forskarna. B. Histopatologisk analys identifieras och kvantifieras enskilda tumör cell aggregat, klassificeras som metastaser, som finns i H&E färgas lunga diabilder. Bilder med hög, medelhög och låg förstoring av en representativ bild visas. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Fiji-ImageJ analys är korrekt och exakt vid fastställandet av metastaserande börda. A. 12 lungplattor med en 1:2 utspädning analyserades av 3 separata forskare i 3 separata bilder av de 12 lungplattorna. B. Resultat från var och en av de 3 bilderna av var och en av de 3 forskarna kombinerades. C. Resultat från varje lungplatta från de 3 bilderna var i genomsnitt. Enkelriktad ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest fastställde inga signifikanta skillnader mellan räknare för varje lungplatta. Data visas som medelvärde + SD. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Fiji-ImageJ analys ger mer konsekvent rangordning av metastaserande börda jämfört med manuell räkning och histopatologisk analys. A. Samma lungplattor från figur 2 rankades från de flesta till minst metastaserande utifrån de manuella countsna från figur 2. B. Samma 12 lungplattor från figur 3 rankades från de flesta till minst metastaserande baserat på Fiji-ImageJ-analysen från figur 3A. C. Medelvärdena från figur 3C rankades från de flesta till minst metastaserande. D. Lung slides rankades från de flesta till minst ögonbevarande baserat på histopatologisk utvärdering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Reflektioner och icke-metastaserande mörka fläckar kommer att negativt påverka resultat. A. En bild med en återspegling av en hand som tar bilden stör Fiji-Image J analys, som visas i jämförelse av reflektion Fiji-ImageJ analys (vänster) till rätt Fiji-ImageJ analys (höger) B. Blodplattor ofta lämnar överblivna fläckar (svarta pilar) på plattorna som inte är ögonbevarande kolonier (vita pilar). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som visats, manuellt räkna de metastaserande kolonierna på varje lungplatta kan vara en felaktig och oprecis metod för att kvantifiera lung metastasering, vilket visar behovet av ett bättre medel för kvantifiering (Figur 2). Histopatologisk analys skilde sig något från både manuell räkning och Fiji-ImageJ-analys (Figur 2B och 4D), sannolikt eftersom H&E-objektsglasen inte är ett representativt prov av hela organet. Protokollet skördar en hel lunga, och därför är mer representativ för total lung metastasering, och är mer konsekvent än manuell räkning. Flera olika tillvägagångssätt för Fiji-ImageJ analys försökte och diskuteras nedan, men det protokoll som beskrivs ovan verkar vara den överlägsna metoden.
Lung-, blod- och hjärnprover samlades in för denna studie. Men blod och hjärnprover hade mycket få metastaserande kolonier, om någon alls. Vi bestämde att manuellt räkna de metastaserande kolonierna är optimal för dessa mindre-ögonbevarande vävnader, och därför blod och hjärnan data ingick inte. När den metastaserande bördan är lätt att manuellt räkna (t.ex. tio eller tjugo metastaserande kolonier i motsats till tusentals), är den ursprungliga frågan om mänskliga fel inte relevant, och därför behövs inte detta protokoll. Också, blodprov kan lämna mörka fläckar på plattorna efter fixering, vilket stör Fiji-ImageJ analys (Bild 5). Viktigt är att mängden celler som injiceras kan påverka den metastaserande bördan. Till exempel, om färre celler injiceras och mössen kan överleva längre, cancern har mer tid att sprida sig till traditionellt mindre metastaserande platser som hjärnan3,4. Därför skulle detta protokoll kunna ändras så att det inkluderar den metastaserande bördan av andra vävnader om de ges tid att bli mycket metastaserande. Om du provar 4T1-modellen för första gången eller ändrar mängden av celler som injiceras, rekommenderar vi att du provar minst två utspädningar vid plätering av celler. För denna studie använde vi en 1:2 och 1:10 utspädning. Den 1:2 utspädning skulle ha varit svårt att räkna manuellt, men räknades lätt i Fiji-ImageJ. Utspädningen på 1:10 var fortfarande svår att räkna manuellt och ledde därför till inkonsekventa resultat. Spädningar kan modifieras utifrån de specifika studieparametrarna.
Bilder togs av enskilda lungplattor och de 12 lungplattorna tillsammans. Enskilda plattor analyserades på två sätt: antingen beskära bilden till en central kvadrat av plattan innan du laddar upp till Fiji-ImageJ, eller med hjälp av cirkeln markeringsverktyget i Fiji-ImageJ för att välja den centrala cirkeln av plattan i den obespänna bilden. Vi fann att använda cirkeln urvalsverktyget i Fiji-ImageJ erbjöd det enklaste, mest konsekventa sättet att skapa en samma storlek område för analys för alla plattor. Vidare, analysera hela samlingen av lungplattor i samma bild var överlägsen att analysera enskilda bilder av enstaka lungplattor. Med alla lungplattor i samma bild gör det möjligt för samma storlek cirkel som ska användas enkelt mellan lungplattorna. Det säkerställer att alla lungplattor är samma avstånd från kameran och därför bör samma storlek cirkel för analys vara rätt storlek för alla lungplattor i bilden. Det gör också analys snabbare som rita om cirkeln är inte nödvändigt mellan plattorna. Den dras helt enkelt till nästa platta i bilden utan att ändra dess storlek, vilket garanterar att samma storlek används för alla plattor på bilden. När du väljer storlek på cirkeln, är det viktigt att göra den tillräckligt stor för att analysera majoriteten av plattan medan tillräckligt liten för att undvika bakgrundsljud från kanterna av plattan. Vidare, i ett försök att spara reagens, var celler också pläterade i 6 brunnsplattor och jämfört med de 10 cm vävnadskulturplattorna. Fiji-ImageJ resultaten från 6 brunnen plattorna var mindre konsekvent och inte korrelerar till 10 cm rätter (data visas inte). En förklaring är den mindre ytan ger ett mindre område att analysera, vilket leder till mindre representativa data. En annan är att minska ytan gör att cellerna att växa snabbare eftersom de är närmare andra överlevande celler. Därför rekommenderar vi inte att använda några vävnadskultur reagenser än vad vi har beskrivit i protokollet.
Som tidigare nämnts, undvika reflektioner och ha en ren, ljus bakgrund är absolut avgörande för denna metod. Figur 5A visar hur en reflektion analyseras i Fiji-ImageJ och visar därför den kritiska betydelsen av att undvika reflektioner. Eftersom vävnadskulturplattor är mycket reflekterande är det fördelaktigt att ta bilden i en liten vinkel för att undvika reflektioner från antingen själv som tar bilden eller från ljuskällorna ovan. Ljusförhållandena för det specifika arbetsområdet kommer att behöva redovisas. Vi föreslår att ta flera bilder av plattorna som skall analyseras, försöker något olika arrangemang och / eller vinklar, i ett väl upplyst område. Studera bilderna intensivt för eventuella reflektioner. Om det finns inkonsekvenser i analysen beror det sannolikt på ett problem med bildkvaliteten. Om du vill felsöka, jämför du den normala bilden med den svartvita bilden. Om områden som inte är blå i den normala bilden visas som vita i svartvitt, finns det sannolikt en reflektion eller fläck som förändrar resultaten.
Förutom konsekvens, en annan anmärkningsvärd fördel med denna metod är att den producerar data mycket snabbare än manuell räkning. Manuellt räkna flera plattor är mycket tidskrävande, medan Fiji-ImageJ analys kan göras snabbt. Det möjliggör också en kortare inkubationstid. Pulaski och Ostrand-Rosenberg rekommenderar en inkubationstid på 10-14 dagar för de pläterade cellerna, vilket tillför en betydande tid tillstudien 3. Inkubationstiden på 10-14 dagar gör det möjligt för större, lättare att räkna kolonier att bildas. Men många lungplattor kan bli konfluenta innan dess. Istället ger 5 dagars inkubation tillräckligt med tid för 6TG-urvalet för att döda icke-cancerceller (bevisat av friska kontrollmöss som inte har några kolonier på sina lungplattor, data som inte visas), och för att cellerna ska växa tillräckligt för att lätt kunna kvantifieras med Fiji-ImageJ. Detta minskar avsevärt tiden mellan mössen som offras och analyserar viktiga metastaserande data.
Som avslutning uppväger fördelarna med denna metod långt begränsningarna. Vi erkänner denna metod inte erbjuder perfekt konsekvens. Även om detta inte är den idealiska metoden för mindre metastaserande vävnader, dessa vävnader kan lätt räknas manuellt. Samtidigt få en bild utan reflektioner kan kräva några noggrann fotografering, konsekvensen vunnits med denna metod är betydande. Det är möjligt att denna metod skulle kunna användas för andra vävnader som är mycket-ögonbevarande och andra protokoll som kräver räknar färgade objekt. Studien design kan också möjliggöra analys av graden av metastasering eller effekten av anti-cancer behandlingar på metastasering. Denna metod kommer att ge mycket konsekvent, tillförlitlig metastasering data och representerar en betydande förfining till 4T1-modellen. Tillämpningen av denna modell till kommande bröstcancer metastasering forskning är av yttersta vikt i beväpning forskare med verktyg för att kämpa mot bröstcancer dödlighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), Virginia Tech Institute for Critical Technology och Applied Science Center for Engineered Health (IA), och National Institutes of Health R21EB028429 (IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
