Summary
Vi beskriver en mer konsekvent og rask metode for å kvantifisere lungemetastase i 4T1 brystkreftmodellen ved hjelp av Fiji-ImageJ.
Abstract
Brystkreft er en ødeleggende malignitet, som står for 40.000 kvinnelige dødsfall og 30% av nye kvinnelige kreftdiagnoser i USA i 2019 alene. Den ledende årsaken til brystkreftrelaterte dødsfall er den metastatiske byrden. Derfor må prekliniske modeller for brystkreft analysere metastatisk byrde for å være klinisk relevant. 4T1 brystkreft modellen gir en spontant metastaserende, kvantifiserbar musemodell for stadium IV menneskelig brystkreft. Imidlertid kvantifiserer de fleste 4T1-protokoller den metastatiske byrden ved å telle fargede kolonier manuelt på vevskulturplater. Selv om dette er tilstrekkelig for vev med lavere metastatisk byrde, forårsaker menneskelig feil i manuell telling inkonsekvente og variable resultater når platene er samløpet og vanskelig å telle. Denne metoden tilbyr en datamaskinbasert løsning på menneskelig tellingsfeil. Her evaluerer vi protokollen ved hjelp av lungene, et svært metastatisk vev i 4T1-modellen. Bilder av metylen blåfargede plater er anskaffet og lastet opp for analyse i Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bestemmer deretter prosentandelen av det valgte området av bildet som er blått, som representerer prosentandelen av platen med metastatisk byrde. Denne databaserte tilnærmingen gir mer konsistente og raske resultater enn manuell telling eller histopatologisk evaluering for svært metastatisk vev. Konsistensen av Fiji-ImageJ resultater avhenger av kvaliteten på bildet. Små variasjoner i resultatene mellom bildene kan oppstå, og dermed anbefales det at flere bilder tas og resultatene er i gjennomsnitt. Til tross for sine minimale begrensninger, er denne metoden en forbedring for å kvantifisere metastatisk byrde i lungene ved å tilby konsistente og raske resultater.
Introduction
En av åtte kvinner vil bli diagnostisert med brystkreft i hennes levetid, og likevel til tross for flere behandlingstilbud brystkreft er den nest ledende årsaken til kreftrelaterte dødsfall hos amerikanskekvinner 1. Disse kvinnene dør ikke av den primære svulsten i brystet. I stedet er den metastatiske byrden ansvarlig for dødeligheten av denne sykdommen, da den vanligvis sprer seg til lunge, bein, hjerne, lever og lymfeknuter2. På grunn av dette må brystkreftmodeller evaluere metastase for å bidra til å dempe dødeligheten av denne sykdommen. 4T1 murine brystkreft modellen er en ypperlig protokoll for å oppnå dette. Metoden beskrevet her gir en forbedring av 4T1-modellen ved hjelp av Fiji-ImageJ for å kvantifisere lungemetastase, noe som gir konsistente og raske resultater.
4T1-modellen er veletablert, med de fleste laboratorier ved hjelp av protokoller som de som er beskrevet av Pulaski og Ostrand-Rosenberg i 20013. 4T1 cellelinjen er 6-Thioguanine (6TG) resistent og representativ for stadium IV, trippel negativ brystkreft3,4,5. Det er klinisk relevant da det er en ortopisk modell og spontant metastaserer til de samme organene som i human brystkreft3,4. 4T1-cellene metastaserer spontant med en forutsigbar hastighet basert på mengden celler injisert3,4. Viktigere, genetiske forskjeller mellom mus som brukes her forårsaket forventet inter-individuell variasjon i metastatisk byrde. For å evaluere metastase høstes vev for å samle og kvantifisere kreftceller i fjerne steder ved hjelp av 6TG-valg og metylenblå farging. Resultatet er en samling av vevskulturplater med blå prikker som representerer metastatiske kolonier. Pulaski- og Ostrand-Rosenberg-protokollen kvantifiserer imidlertid metastatiske kolonier ved å telle dem manuelt, og derfor har dette vært standardmet for å evaluere metastase i denne modellen. Mens dette er lett for vev med lav metastatisk byrde, vev som lungene er ofte lastet med metastaser. Siden lungeplater kan være svært samløpet, nøyaktig og nøyaktig kvantifisere metastatiske kolonier ved manuell telling er vanskelig og utsatt for menneskelig feil. For bedre å kvantifisere metastatisk byrde beskriver vi bruk av Fiji-ImageJ for en databasert løsning på menneskelig tellefeil. Histopatologisk analyse med hematoksylin og eosin (H&E) farging er et annet middel for å kvantifisere lungemetastaser, og interessant har også blitt forbedret med Fiji-ImageJ programvare6,7. Men fordi histopatologisk analyse observerer en enkelt bit av lungene, kan det være unøyaktig og urepresentativt. Dette skyldes at 4T1-modellen forårsaker flere metastatiske lesjoner i hele orgelet som ikke er jevnt fordelt. Mens generelle trender mellom histopatologisk analyse og manuell telling kan værelik 8,kan individuelle verdier variere, og derfor bør histopatologisk analyse ikke brukes som eneste kvantifiseringsmidler. Vi viser fordelen i forhold til histopatologisk analyse og uoverensstemmelser i manuell telling mellom ulike tellere, samtidig som vi viser konsistensen av å bruke Fiji-ImageJ. I tillegg viser vi at denne metoden kan redusere inkubasjonstiden fra 10-14 dager til 5 dager, noe som betyr at forskere kan analysere data fra studien mye raskere enn når de er avhengige av manuell telling.
Denne metoden er en samling av enkle justeringer i Pulaski og Ostrand-Rosenberg protokoll3. Fordi 4T1-modellen er mye brukt, og fordi lungemetastase er en kritisk parameter for å måle i prekliniske modeller, tror vi denne metoden kan brukes mye og er svært verdifull for brystkreftforskere. De eneste ekstra forsyningene som trengs er et kamera og tilgang til en datamaskin med Fiji-ImageJ, en gratis programvare som brukes ofte i bildeanalyse9. Denne metoden fokuserer spesielt på lungemetastase, men den kan brukes til andre vev med betydelig metastatisk byrde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) av Virginia Tech og i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av laboratoriedyr. Å utføre denne protokollen krever tillatelse fra de aktuelle institusjonene og overholdelse av alle nødvendige retningslinjer.
1. Cellekultur
- Lag komplette kulturmedier (RPMI + 10% Fetal Bovine Serum +1% Pen Strep). Gjenopplive 4T1-celler i henhold tilATCC-protokoll 10 og inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i en T-25 kolbe til samløpet. Endre media dagen etter gjenopplive for å fjerne døde celler, og igjen hvis media er brukt før cellene er samløpet nok til å passere.
- Når T-25 kolben er samløpet, passasje celler til en T-75 kolbe ved å kaste media, vaske kolbe med 5 ml av 1x Dulbecco's Fosfat bufret saltvann (DPBS), og legge til 500 μL trypsin-EDTA. Inkuber i 5-10 minutter ved 37 °C til cellene løsner.
- Når det er løsrevet, legg til 5 ml oppvarmet komplett kulturmedia til celler. Aspirer og overfør 5 ml til en T-75 kolbe som inneholder 15 ml oppvarmet komplett kulturmedia.
- Passasjeceller i T-75 flasker minst fire ganger. Gjør dette når kolben er samløpet ved å vaske med 8 ml 1x DPBS, legge til 1 ml Trypsin-EDTA for løsrivelsesceller, legge til 10 ml oppvarmet media til celler, og fortynne 1:6-1:8 inn i en ny T-75 kolbe som inneholder 20 ml oppvarmet komplett kulturmedia.
- Passasjeceller opp til riktig antall T-150 flasker som inneholder 40 ml oppvarmet komplett kulturmedia for antall mus som skal injiseres. De fleste studier vil kreve flere T-150 flasker for å sikre nok celler til injeksjon.
- Når mus er klare til å injiseres (8 uker gammel eller veier over 20 g, avhengig av IACUC eller institusjonelle protokoller), høste celler ved å kaste medier, vaske hver kolbe med 10 ml 1x DPBS og legge til 2 ml trypsin-EDTA. Inkuber i 5-10 minutter ved 37 °C til cellene løsner.
- Vask kolbe med 10 ml komplette medier og overfør alt innhold (10 ml media + 2 ml trypsin-EDTA celleblanding) til neste kolbe. Fortsett å vaske og samle celler fra hver kolbe ved hjelp av samme 10 ml medier for å unngå å bruke en overdreven mengde medier.
- Når alle flasker er samlet inn, overfør innholdet til et 50 ml sentrifugerør. Samle en 10 μL prøve for telling i et mikrocentrifuge rør og sentrifuge 50 ml konisk rør på 125 x g i 5 minutter.
- Mens celler blir sentrifugert, legg til 10 μL Trypan blå til 10 μL celleprøve. Telle celler ved hjelp av et hemocytometer. Når det totale antallet celler er bestemt, beregne konsentrasjonen av celler som trengs for å injisere mus for 1,2 x 106 celler per mus (per 100 μL).
- Etter sentrifugering, dekanteringsmedier og resuspendcellepellet i riktig mengde sterile 1x DPBS for 1,2 x 106 celler per 100 μL. Del celle/DPBS-blanding i mikrocentrifugerør for enkel tilgang med sprøyten når de aspirerer celler til injeksjon. Hold cellene på is og injiser kort tid etter som cellene vil begynne å dø etter å ha vært på is i lengre perioder.
2. Injeksjoner
- Forbered celler til injeksjon ved å tappe eller forsiktig blande mikrocentrifuge røret for å gjenbruke cellene, og deretter aspirere 600 μL i en 1 ml sprøyte. Vri sprøyten oppover og trekk stempelet ned for å få cellene bort fra sprøyteåpningen. Bank sprøyten for å kvitte den med luftbobler.
- Fest nålekanten opp og dispenser celler tilbake i mikrocentrifugerøret til det bare er 500 μL igjen i sprøyten. Sett sprøyten flatt på is.
MERK: 4T1-celler faller raskt ut av suspensjonen. Derfor er det viktig å blande celler tilbake til suspensjon ved å trykke ofte. - Bedøve 8 uker gammel/>20 g kvinnelig BALB/c mus ved hjelp av isofluran eller annet godkjent bedøvelsesmiddel. Overvåk musens pust for å vurdere anestesidybden.
- Når musen er riktig bedøvet som indikert av mangel på hornhinnerefleks, plasser musen på ryggen. Bruk tommelen, pekeren og langfingeren til å holde musen forsiktig nede. Bruk pekeren og mellomfingrene til å holde nede musens overkropp og tommel for det bakre venstre benet. Vær forsiktig, men fast.
- Med nålens skråkant opp, injiser 100 μL celler subkutant inn i musens venstre abdominale brystfettpute. Overvåk for en god bleb og eventuell lekkasje, og sørg for at musen våkner opp og beveger seg lett etter injeksjon.
- Bytt nåler mellom hver mus.
MERK: Ikke la nålen komme inn i bukhulen. Dette ville føre til at kreften sprer seg raskt og ikke være representativ for modellen. For å sikre en subkutan injeksjon, trekk forsiktig oppover på nålen når den settes inn i venstre abdominal brystfettpute. Hvis nålen lett løftes oppover, er den riktig plassert subkutant.
- Bytt nåler mellom hver mus.
3. Overvåking
- Overvåk mus minst 3 ganger i uken for vekt, kroppstilstandscore, tumorstørrelse, tumortilstand, respirasjon, aktivitetsnivå, utseende og bevegelse. Når svulsten når 0, 7-0, 8 cm i diameter, begynner å overvåke daglig.
- Vurder eutanasi når tumorstørrelsen når 1,5 cm, eller vekttap når 20%, eller alvorlig klinisk nedgang i kroppstilstandscore, tumortilstand, respirasjon, aktivitetsnivå, utseende eller bevegelse observeres basert på institusjonelle retningslinjer.
MERK: Kroppstilstand score er avgjørende for å overvåke som kroppsvekt kan øke som svulsten øker i størrelse, negating kroppstilstand tap på grunn av sykdom byrde. Nøyaktige overvåkingsprotokoller vil avhenge av godkjente IACUC- eller institusjonelle protokoller.
- Vurder eutanasi når tumorstørrelsen når 1,5 cm, eller vekttap når 20%, eller alvorlig klinisk nedgang i kroppstilstandscore, tumortilstand, respirasjon, aktivitetsnivå, utseende eller bevegelse observeres basert på institusjonelle retningslinjer.
4. Necropsy
- Euthanize mus ved hjelp av CO2 etter institusjonelle retningslinjer.
- Spray mus med 70% etanol for å desinfisere. Lag et snitt opp den ventrale midtlinjen av musen for å avsløre kroppshulen.
- Fjern nyrene. Fortsett å kutte opp midtlinjen til membranen er synlig. Bruk saks til å punktere membranen for å tømme lungene. Trim membranen for å få bedre tilgang til hulrommet.
- Bruk sløv saks for å kutte opp midten av brystkassen. Pin ribcage tilbake for å eksponere lunge og hjerte.
- Perfuse hjertet med 2 ml ikke-sterile 1x DPBS ved å sette en nål inn i toppen av hjertet til det bassenger i bukhulen der nyrene ble fjernet.
- For å fjerne hjerte og lunger, bruk stump saks for å kutte spiserøret og luftrøret rett over hjertet. Ved hjelp av tang, begynner å trekke hjertet bort fra kroppen og kutte bort på noen bindevev holde den festet. Lungene vil komme ut med hjertet.
- Identifiser de flerfappede (høyre) og en-lobed (venstre) lungene. Hold hjertet festet for referanse, men når lungene er identifisert, kutt hjertet bort.
- Merk en 12 brønnplate som inneholder 1x Hanks balanserte saltløsning (HBSS) i hver brønn. Hver mus trenger 2 brønner. Plasser den multi-lobed (høyre) lunge i 12 brønnplaten for metastase evaluering og holde på is. Hold nabobrønnen tom for nå.
MERK: Det er viktig å bruke samme lunge (multi-lobed) fra hver mus for å sikre at hver prøve er nær i størrelse. Den enflikne lungen kan deretter brukes til annen analyse, som histopatologi.
MERK: Prøvene er stabile på is eller ved 4 °C i noen timer.
5. Behandling av vev
MERK: Alle trinnene i denne delen bør gjøres ved hjelp av steril teknikk.
- Etikett 1 15 ml konisk rør per mus og tilsett 2,5 ml type IV kollagenaseblanding og 30 enheter elase til hvert rør. For å lage type IV kollagenaseblanding, oppløs 2 mg av type IV kollagenase per ml 1x HBSS og sterilt filter. Dette kan oppbevares opptil 12 måneder ved -20 °C og tines ved behov.
- Overfør lungen til den andre, rene 1x HBSS godt for den prøven. Virvle ved hjelp av tang for å fjerne gjenværende blod. Overfør ren lunge til tom 3,5 cm vev kultur plate. Kjøttdeig lunge med saks. Skyll platen med 2,5 ml 1x HBSS, overfør 1x HBSS og lungestykker til et konisk 15 ml konisk rør som allerede inneholder kollagenase/elaastasecocktail (5 ml totalt).
- Inkuber i 75 minutter ved 4 °C. Fortsett å blande prøver i løpet av denne tiden, så plasser rør på en vippe eller roterende hjul. Under dette inkubasjonstrinnet merker du 50 ml sentrifugerør og 10 cm vevskulturplater for hver mus. Hvis du gjør en fortynning, etikett nok 10 cm vev kultur plater for fortynninger.
MERK: Merk lokket på vevskulturplatene. Hvis du merker selve platen, vil skrivingen forstyrre Fiji-ImageJ-analysen. - Ta med volum av hvert rør opp til 10 ml totalt med 1x HBSS. Hell innholdet over en 70 μm cellesil i et konisk 50 ml konisk rør for hver prøve. Bruk stempelet på en 1 ml sprøyte til å slipe prøven forsiktig gjennom silen slik at flere celler kan filtrere gjennom.
- Sentrifuge i 5 minutter ved 350 x g ved romtemperatur (RT). Kast den overnaturlige og vask pelleten med 10 ml 1x HBSS. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Resuspend pellet i 10 ml 60 μM 6TG komplett kultur media, enten RPMI eller IMDM. Plateprøver i 10 cm cellekulturplater, ved hjelp av en fortynningsordning om ønskelig. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 5 dager.
MERK: 1:2, 1:10 og 1:100 er vanlige fortynninger som må bestemmes empirisk basert på studieparametere.
FORSIKTIG: 6TG er giftig. Vær forsiktig når du håndterer og følger alle retningslinjer for miljøhelse og sikkerhet for avhending.
6. Farging plater
- Hell kulturmedier av plater i riktig avfallsbeholder. Fest celler ved å legge til 5 ml ufortynnet metanol per plate og inkuber i 5 minutter ved RT, og sørg for å virvle metanol slik at den dekker hele platen.
FORSIKTIG: Metanol er farlig ved innånding, inhalert eller er på huden. Bruk en røykhette for dette trinnet. - Hell metanol av plater i riktig avfallsbeholder. Skyll platene med 5 ml destillert vann per plate og hell vann i riktig avfallsbeholder. Tilsett 5 ml metylenblå per plate og inkuber i 5 minutter ved RT, og sørg for å virvle metylenblå oppløsning slik at den dekker hele platen.
- Hell metylenblått i riktig avfallsbeholder. Skyll platene igjen med 5 ml destillert vann per plate. Snu platene opp ned og blot mot et papirhåndkle for å fjerne overflødig væske. Plasser platen på lokket og la luften tørke over natten ved RT.
MERK: Metastatiske kolonier vil være blå. Når platene er tørket, kan de lagres på RT på ubestemt tid.
7. Bildeanalyse
- Fjern merkede lokk fra platene, pass på å sikre klar identifisering av prøver. Linje opp alle beisede lungeplater på en ren, lys overflate for å ta et bilde av alle platene i ett bilde.
- Ta et bilde av samlingen av plater i et godt opplyst område, og sørg for å minimere refleksjoner som platene er svært reflekterende. Refleksjoner i platene vil påvirke bildeanalyse og må derfor unngås.
MERK: Fiji-ImageJ har en øvre grense på 2 gigapixels. De fleste moderne smarttelefoner vil ha tilstrekkelige kameraer. Ikke bruk et kamera mindre enn 8 megapiksler. Kameraet som ble brukt i dette eksperimentet var en 12,2 megapiksler på en Google Pixel 2. - Beskjær bildet for å inkludere platene, men ekskluder lokkene eller noe annet i bakgrunnen av bildet. Last opp det beskårne bildet til Fiji-ImageJ.
- Endre bildet til svart-hvitt ved hjelp av følgende kommandoer: Bilde, Juster, Fargeterskel, Terskelmetode: Standard, Terskelfarge: B&W, Terskelplass: Lab. Fjern merket for Mørk bakgrunn-boksen. Bildet skal nå være svart-hvitt. Svart representerer lysbakgrunnen, og hvitt representerer de blå metastatiske koloniene.
- Bruk Sirkelverktøyet på verktøylinjen Fiji-ImageJ til å velge området som skal analyseres. Tegn en sirkel som skal brukes til alle platene for å sikre at hver plate analyseres for det samme området. Velg en størrelse som maksimerer analysert område på platene samtidig som du minimerer bakgrunnsstøyen som vises på kanten av platene. Størrelsen vises på verktøylinjen som den tegnes, så det er mulig å lage en perfekt sirkel ved å overvåke høyden og bredden som sirkelen tegnes.
- Analyser den valgte sirkelen for å bestemme hvilken prosentandel av området som er hvit, som representerer området av platen som har blå metastatiske kolonier. Bruk følgende kommandoer:
Analyser, analyser partikler, størrelse(piksel 2):0-uendelig, sirkulæritet: 0,00-1,00, Vis: Ingenting, og merk av for Summer. Trykk OK. - Registrer resultatet for % område. Dette er prosentandelen av det valgte området som er hvitt, og representerer derfor den metastatiske byrden.
MERK: Det anbefales å lagre resultatene i Fiji-ImageJ eller kopiere/lime inn hele resultatsiden i et eget dokument. Hvis resultatene for % området er uventede eller mistenkelige, er det da mulig å se om noen av de andre målingene også var mistenkelige, eller om % Area ble registrert feil. - Flytt sirkelen, uten å endre størrelsen ved å ta den i midten, til neste plate i bildet. Gjenta trinn 7.6 og 7.7 for alle platene på bildet.
- Gjenta trinn 7.1 – 7.8 på minst to bilder til. Når alle plater og bilder er analysert, gjennomsnittlig % Area resultater mellom ulike bilder for hver plate for å redusere eventuelle uoverensstemmelser mellom bildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden inneholder enkle justeringer fra Pulaski- og Ostrand-Rosenberg 4T1-protokollen3 og kan visualiseres i figur 1. Når 3 separate forskere manuelt telte metastatiske kolonier for 12 lungeplater (1:10 fortynning), var resultatene svært inkonsekvente mellom forskjellige tellere (figur 2A). Alle forskere ble rettet mot å "telle de metastatiske koloniene som vises som blå prikker", men uoverensstemmelsene viser problemet med manuelt å telle svært metastatiske plater. Forskerne hadde varierende erfaring med 4T1-modellen. En board-sertifisert veterinær patolog analysert H & E farget lunge lysbilder for metastase som en annen metode for å sammenligne med Fiji-ImageJ lungeplate analyse (Figur 2B).
Ved hjelp av Fiji-ImageJ-analysen analyserte 3 separate forskere 3 separate bilder av samlingen av 12 plater (1:2 fortynning). Bilder ble tatt i to separate laboratorierom med litt forskjellig belysning. Arrangementet av platene eller vinkelen som bildet ble tatt fra, var forskjellig mellom hvert bilde. I motsetning til de manuelle tellingsresultatene var Fiji-ImageJ-resultatene konsistente mellom tellere for hvert av de 3 bildene (figur 3A). For å finne ut om det var uoverensstemmelser mellom de 3 bildene, ble resultatene fra de 3 bildene og de 3 tellerne kombinert per lungeplate (figur 3B). Det er forskjeller mellom bilder for noen plater, men de generelle trendene er like, og det gir mer konsistens enn manuell telling. For å ta høyde for variasjonene mellom de 3 forskjellige bildene, ble resultatene fra hvert bilde i gjennomsnitt for hver plate (figur 3C). Disse gjennomsnittene ga konsistente resultater mellom tellere som nøyaktig og nøyaktig analyserer metastatisk byrde. Derfor foreslår denne protokollen å ta minst 3 bilder av platesamlingen i forskjellige ordninger, fra forskjellige vinkler, eller i litt forskjellige lysinnstillinger, og deretter analysere og gjennomsnitte resultatene. Kontrasten mellom manuell telling og Fiji-ImageJ-analyse visualiseres når man sammenligner figur 2A med figur 3C.
En annen måte å demonstrere forbedringene som tilbys av denne protokollen er å sammenligne rangeringen av platene fra de fleste til minst metastatiske byrden mellom tellere, basert på tellingene fra figur 2 og figur 3. Manuell telling avtalt på den mest sammenføyde platen, men alle følgende rekker var inkonsekvent mellom tellere (figur 4A). Kontrasterende, rekkene fra Fiji-ImageJ analyse for hvert bilde var mye mer konsekvent mellom tellere (Figur 4B). Konsistensen ses også når resultatene fra hvert bilde for hver plate ble gjennomsnittlig (figur 4C). Vi erkjenner at denne protokollen ikke gir fullstendig konsistens mellom tellere, men det er en forbedring fra manuell telling når du sammenligner figur 4A med figur 4C. Histopatologisk analyse var forskjellig fra både manuell og Fiji-ImageJ telling (Figur 4D).
For å demonstrere viktigheten av å unngå refleksjoner i bildene, vises et bilde med en refleksjon av en hånd og den påfølgende Fiji-ImageJ-analysen (venstre) i motsetning til samme plate uten refleksjon (høyre) (Figur 5A). Andre mørke uredder fra en skitten bakgrunnsoverflate eller blodprøverester på platene kan også påvirke Fiji-ImageJ-analysen negativt. Blodplaten i figur 5B har bare 2 metastatiske kolonier (bemerket av hvite piler), men de mørke rester (bemerket av svarte piler) forårsaket Fiji-ImageJ å vurdere det som 31,6% metastatisk. Derfor er det viktig å ha en ren, lys overflate og å ikke bruke denne metoden for blodprøver som blodprøver vil vanligvis forlate gjenværende mørke flekker på platen som ikke er metastatiske kolonier.
Figur 1: Protokollskjematisk. Denne protokollen fokuserer utelukkende på å analysere lungemetastase i 4T1-modellen. Den generelle flyten av denne protokollen inkluderer voksende 4T1-celler i kultur, injisere BALB / c kvinnelige mus med 4T1 celler i venstre abdominal mammary fett pad, overvåking mus i henhold til IACUC og institusjonelle protokoller, ofre mus og samle lungen, samle celler fra lungeprøver, plating og inkubere celler i 6TG utvalg media, fikse og farging celler etter 5 dager, ta bilder av platene, og analysere ved hjelp av Fiji-ImageJ. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Manuell telling av metastatiske celler og histopatologisk analyse har inkonsekvente resultater. A. 12 lungeplater med en 1:10 fortynning ble manuelt talt av 3 separate forskere instruert til å telle metastatiske kolonier på samme måte, selv om erfaring med modellen varierte mellom forskere. Antall metastatiske kolonier talte varierte sterkt mellom forskere. B. Histopatologisk analyse identifiserte og kvantifiserte individuelle tumorcelleaggregater, klassifisert som metastaser, tilstede i H&E-fargede lungesklier. Bilder med høy, middels og lav forstørrelse av ett representativt lysbilde vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fiji-ImageJ-analysen er nøyaktig og presis for å bestemme metastatisk byrde. A. 12 lungeplater med en 1:2 fortynning ble analysert av 3 separate forskere i 3 separate bilder av de 12 lungeplatene. B. Resultatene fra hvert av de 3 bildene av hver av de 3 forskerne ble kombinert. C. Resultatene fra hver lungeplate fra de 3 bildene ble i gjennomsnitt. Enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest fastslo ingen signifikante forskjeller mellom tellere for hver lungeplate. Data vises som gjennomsnittet + SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Fiji-ImageJ-analysen gir mer konsekvent rangering av metastatisk byrde sammenlignet med manuell telling og histopatologisk analyse. A. De samme lungeplatene fra figur 2 ble rangert fra de fleste til minst metastatiske basert på manuelle tellinger fra figur 2. B. De samme 12 lungeplatene fra figur 3 ble rangert fra de fleste til minst metastatiske basert på Fiji-ImageJ-analysen fra figur 3A. C. Gjennomsnittene fra figur 3C ble rangert fra de fleste til minst metastatiske. D. Lungesklier ble rangert fra de fleste til minst metastatiske basert på histopatologisk evaluering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Refleksjoner og ikke-metastatiske mørke flekker vil påvirke resultatene negativt. A. Et bilde med en refleksjon av en hånd som tar bildet forstyrrer Fiji-Image J-analysen, som vist i sammenligning av refleksjon Fiji-ImageJ-analysen (venstre) med riktig Fiji-ImageJ-analyse (høyre) B. Blodplater forlater ofte rester flekker (svarte piler) på platene som ikke er metastatiske kolonier (hvite piler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som demonstrert, manuelt telle metastatiske kolonier på hver lungeplate kan være en unøyaktig og upresis metode for å kvantifisere lungemetastase, viser behovet for en bedre kvantifisering (Figur 2). Histopatologisk analyse skilte seg litt fra både manuell telling og Fiji-ImageJ analyse (Figur 2B og 4D), sannsynligvis fordi H & E lysbildene ikke er et representativt utvalg av hele orgelet. Protokollen høster en hel lunge, og er derfor mer representativ for total lungemetastase, og er mer konsekvent enn manuell telling. Flere forskjellige tilnærminger til Fiji-ImageJ-analysen ble forsøkt og diskutert nedenfor, men protokollen skissert ovenfor ser ut til å være den overlegne metoden.
Lunge-, blod- og hjerneprøver ble samlet inn for denne studien. Blod- og hjerneprøvene hadde imidlertid svært få metastatiske kolonier, om noen i det hele tatt. Vi fastslo at manuell telling av metastatiske kolonier er optimal for disse mindre metastatiske vevene, og derfor ble blod- og hjernedata ikke inkludert. Når den metastatiske byrden er lett å telle manuelt (f.eks. ti eller tjue metastatiske kolonier i motsetning til tusenvis), er det opprinnelige spørsmålet om menneskelig feil ikke relevant, og derfor er denne protokollen ikke nødvendig. Blodprøver kan også etterlate mørke flekker på platene etter fiksering, noe som forstyrrer Fiji-ImageJ-analysen (figur 5). Viktigere, mengden av celler injisert kan påvirke den metastatiske byrden. For eksempel, hvis færre celler injiseres og musene kan overleve lenger, har kreften mer tid til å spre seg til de tradisjonelt mindre metastatiske stedene som hjernen3,4. Derfor kan denne protokollen endres for å inkludere den metastatiske byrden av andre vev hvis de får tid til å bli svært metastatisk. Hvis du prøver 4T1-modellen for første gang eller endrer mengden celler injisert, anbefaler vi at du prøver minst to fortynninger når du plating celler. For denne studien brukte vi en 1:2 og 1:10 fortynning. 1:2 fortynning ville ha vært vanskelig å telle manuelt, men ble talt lett i Fiji-ImageJ. 1:10 fortynningen var fortsatt vanskelig å telle manuelt og førte derfor til inkonsekvente resultater. Fortynninger kan endres basert på de spesifikke studieparametrene.
Bilder ble tatt av individuelle lungeplater og de 12 lungeplatene sammen. Individuelle plater ble analysert på to måter: enten beskjære bildet til en sentral firkant av platen før du laster opp til Fiji-ImageJ, eller ved hjelp av sirkelvalgverktøyet i Fiji-ImageJ for å velge den sentrale sirkelen av platen i det ubesveede bildet. Vi fant ut at bruk av sirkelvalgverktøyet i Fiji-ImageJ tilbød den enkleste, mest konsekvente måten å skape et område i samme størrelse for analyse for alle plater. Videre var analyse av hele samlingen av lungeplater i samme bilde bedre enn å analysere individuelle bilder av enkeltlungeplater. Å ha alle lungeplatene i samme bilde gjør det mulig å bruke den samme sirkelen lett mellom lungeplatene. Det sikrer at alle lungeplater er samme avstand fra kameraet, og derfor bør den samme sirkelen for analyse være riktig størrelse for alle lungeplater i bildet. Det gjør også analyse raskere som redrawing sirkelen er ikke nødvendig mellom plater. Det er rett og slett dratt til neste plate i bildet uten å endre størrelsen, noe som garanterer samme størrelse brukes for alle platene i bildet. Når du velger størrelsen på sirkelen, er det viktig å gjøre den stor nok til å analysere mesteparten av platen mens den er liten nok til å unngå bakgrunnsstøy fra kantene på platen. Videre, i et forsøk på å redde reagenser, ble cellene også belagt i 6 brønnplater og sammenlignet med de 10 cm vevskulturplatene. Fiji-ImageJ resultatene fra 6 brønnplater var mindre konsekvente og korrelerte ikke med 10 cm retter (data som ikke vises). En forklaring er at det mindre overflatearealet gir et mindre område å analysere, noe som fører til mindre representative data. En annen er at å redusere overflatearealet gjør at cellene kan vokse raskere når de er nærmere andre overlevende celler. Derfor anbefaler vi ikke å bruke noen vevskulturreagenser enn det vi har beskrevet i protokollen.
Som nevnt tidligere, unngå refleksjoner og å ha en ren, lys bakgrunn er helt avgjørende for denne metoden. Figur 5A viser hvordan en refleksjon analyseres i Fiji-ImageJ og viser derfor den kritiske betydningen av å unngå refleksjoner. Som vev kultur plater er svært reflekterende, er det gunstig å ta bildet i en liten vinkel for å unngå refleksjoner fra enten deg selv å ta bildet eller fra lyskildene ovenfor. Lysforholdene i det spesifikke arbeidsområdet må gjøres rede for. Vi foreslår at du tar flere bilder av platene som skal analyseres, prøver litt forskjellige ordninger og / eller vinkler, i et godt opplyst område. Studer bildene intenst for eventuelle refleksjoner. Hvis det er uoverensstemmelser i analysen, skyldes det sannsynligvis et bildekvalitetsproblem. Hvis du vil feilsøke, sammenligner du det vanlige bildet med det svarte og hvite bildet. Hvis områder som ikke er blå i det normale bildet, vises som hvite i det svarte og hvite bildet, er det sannsynligvis en refleksjon eller lyte som endrer resultatene.
I tillegg til konsistens, er en annen bemerkelsesverdig fordel med denne metoden at den produserer data mye raskere enn manuell telling. Manuell telling av flere plater er svært tidkrevende, mens Fiji-ImageJ-analyse kan gjøres raskt. Det gir også en kortere inkubasjonstid. Pulaski og Ostrand-Rosenberg anbefaler en 10-14 dagers inkubasjonsperiode for de belagte cellene, og legger til en betydelig mengde tid til studien3. Inkubasjonsperioden på 10-14 dager gjør det mulig for større, enklere å telle kolonier å danne. Imidlertid kan mange lungeplater bli samløpet før da. I stedet gir 5 dager med inkubasjon nok tid til at 6TG-valget dreper ikke-kreftceller (bevist av friske kontrollmus som ikke har noen kolonier på lungeplatene, data som ikke vises), og for cellene å vokse nok til å bli lett kvantifisert med Fiji-ImageJ. Dette reduserer tiden mellom musene som ofres og analyserer essensielle metastatiske data betydelig.
For å konkludere, fordelene med denne metoden langt oppveier begrensningene. Vi erkjenner at denne metoden ikke tilbyr perfekt konsistens. Selv om dette ikke er den ideelle metoden for mindre metastatisk vev, kan disse vevene lett telles manuelt. Mens du får et bilde uten refleksjoner kan kreve litt forsiktig fotografering, er konsistensen oppnådd med denne metoden betydelig. Det er mulig at denne metoden kan brukes til andre vev som er svært metastatiske og andre protokoller som krever telling av beisede objekter. Studiedesignen kan også tillate analyse av metastase eller effekt av anti-kreftbehandlinger på metastase. Denne metoden vil gi svært konsistente, pålitelige metastasedata og representerer en betydelig forbedring til 4T1-modellen. Anvendelsen av denne modellen til kommende brystkreft metastase forskning er av største betydning i bevæpne forskere med verktøy for å kjempe mot brystkreft dødelighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) og National Institutes of Health R21EB028429 (IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
