Summary
Describimos un método más consistente y expeditivo para cuantificar la metástasis pulmonar en el modelo de cáncer de mama 4T1 mediante Fiji-ImageJ.
Abstract
El cáncer de mama es una tumoral devastadora, que representa 40.000 muertes femeninas y el 30% de los nuevos diagnósticos de cáncer femenino en los Estados Unidos solo en 2019. La principal causa de muertes relacionadas con el cáncer de mama es la carga metastásica. Por lo tanto, los modelos preclínicos para el cáncer de mama deben analizar la carga metastásica para que sea clínicamente relevante. El modelo de cáncer de mama 4T1 proporciona un modelo de ratón cuantificable y cuantificador de forma espontánea para el cáncer de mama humano en estadio IV. Sin embargo, la mayoría de los protocolos 4T1 cuantifican la carga metastásica contando manualmente las colonias manchadas en placas de cultivo de tejidos. Si bien esto es suficiente para los tejidos con menor carga metastásica, el error humano en el conteo manual causa resultados inconsistentes y variables cuando las placas son confluentes y difíciles de contar. Este método ofrece una solución basada en computadora para el error de recuento humano. Aquí, evaluamos el protocolo usando el pulmón, un tejido altamente metastásico en el modelo 4T1. Las imágenes de placas teñidas de azul de metileno se adquieren y se cargan para su análisis en Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ determina a continuación el porcentaje del área seleccionada de la imagen que es azul, lo que representa el porcentaje de la placa con carga metastásica. Este enfoque basado en computadora ofrece resultados más consistentes y expeditivos que el conteo manual o la evaluación histopatológica para tejidos altamente metastásicos. La consistencia de los resultados de Fiji-ImageJ depende de la calidad de la imagen. Pueden producirse ligeras variaciones en los resultados entre las imágenes, por lo que se recomienda que se tomen varias imágenes y se promedan los resultados. A pesar de sus limitaciones mínimas, este método es una mejora para cuantificar la carga metastásica en el pulmón al ofrecer resultados consistentes y rápidos.
Introduction
Una de cada ocho mujeres será diagnosticada con cáncer de mama en su vida, y sin embargo, a pesar de múltiples opciones de tratamiento, el cáncer de mama es la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en mujeres estadounidenses1. Estas mujeres no están muriendo por el tumor primario en su mama. En su lugar, la carga metastásica es responsable de la mortalidad de esta enfermedad, ya que comúnmente se propaga al pulmón, hueso, cerebro, hígado, y los ganglios linfáticos2. Debido a esto, los modelos de cáncer de mama necesitan evaluar la metástasis para contribuir a frenar la mortalidad de esta enfermedad. El modelo de cáncer de mama murino 4T1 es un excelente protocolo para lograr esto. El método descrito aquí ofrece una mejora en el modelo 4T1 mediante el uso de Fiji-ImageJ para cuantificar la metástasis pulmonar, produciendo resultados consistentes y rápidos.
El modelo 4T1 está bien establecido, con la mayoría de los laboratorios utilizando protocolos como los descritos por Pulaski y Ostrand-Rosenberg en 20013. La línea celular 4T1 es 6-Thioguanine (6TG) resistente y representativa de la etapa IV, triple cáncer de mama negativo3,4,5. Es clínicamente relevante ya que es un modelo ortotópico y espontáneamente metástasis a los mismos órganos que en el cáncer de mama humano3,4. Las células 4T1 hacen metástasis espontáneas a una velocidad predecible basada en la cantidad de células inyectadas3,4. Es importante destacar que las diferencias genéticas entre ratones utilizados aquí causaron la variabilidad interinsular esperada en la carga metastásica. Para evaluar la metástasis, los tejidos se cosechan para recolectar y cuantificar las células cancerosas en sitios distantes utilizando la selección de 6TG y la tinción azul de metileno. El resultado es una colección de placas de cultivo de tejido con puntos azules que representan colonias metastásicas. Sin embargo, el protocolo Pulaski y Ostrand-Rosenberg cuantifica las colonias metastásicas contándolas manualmente, y por lo tanto este ha sido el medio estándar de evaluar la metástasis en este modelo. Si bien esto es fácil para los tejidos con baja carga metastásica, los tejidos como los pulmones a menudo están cargados de metástasis. Como las placas pulmonares pueden ser altamente confluentes, cuantificar con precisión y precisión las colonias metastásicas mediante el recuento manual es difícil y propenso a errores humanos. Para cuantificar mejor la carga metastásica, describimos el uso de Fiji-ImageJ para una solución informática al error de recuento humano. El análisis histopatológico con tinción de hematoxilina y eosina (H&E) es otro medio para cuantificar metástasis pulmonares, y curiosamente también se ha mejorado con el software Fiji-ImageJ6,7. Sin embargo, debido a que el análisis histopatológico observa una sola porción del pulmón, puede ser inexacto y poco representativo. Esto se debe a que el modelo 4T1 causa varias lesiones metastásicas en todo el órgano que no se distribuyen uniformemente. Si bien las tendencias generales entre el análisis histopatológico y el recuento manual pueden ser similares8, los valores individuales pueden diferir y, por lo tanto, el análisis histopatológico no debe utilizarse como único medio de cuantificación. Demostramos el beneficio en comparación con el análisis histopatológico y las incoherencias en el recuento manual entre diferentes contadores, al tiempo que demostramos la coherencia del uso de Fiji-ImageJ. Además, mostramos que este método puede reducir el tiempo de incubación de 10-14 días a 5 días, lo que significa que los investigadores pueden analizar los datos de su estudio mucho antes que cuando se basa en el conteo manual.
Este método es una colección de ajustes simples al protocolo Pulaski y Ostrand-Rosenberg3. Debido a que el modelo 4T1 es ampliamente utilizado, y debido a que la metástasis pulmonar es un parámetro crítico para medir en modelos preclínicos, creemos que este método puede ser ampliamente utilizado y es muy valioso para los investigadores de cáncer de mama. Los únicos suministros adicionales necesarios son una cámara y el acceso a un ordenador con Fiji-ImageJ, un software gratuito utilizado con frecuencia en el análisis de imágenes9. Este método se centra específicamente en la metástasis pulmonar, pero podría utilizarse para otros tejidos con una carga metastásica significativa.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) de Virginia Tech y de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La realización de este protocolo requiere el permiso de las instituciones apropiadas y el cumplimiento de todas las directrices apropiadas.
1. Cultivo celular
- Hacer medios de cultivo completos (RPMI + 10% Suero Bovino Fetal +1% Pluma Strep). Reavice 4T1 células de acuerdo con el ProtocoloATCC 10 e incubar a 37oC y 5% co2 en un matraz T-25 hasta que se confluencia. Cambie los medios el día después de revivir para eliminar las células muertas, y de nuevo si los medios se gastan antes de que las células sean lo suficientemente confluentes como para pasarlas.
- Una vez que el matraz T-25 es confluente, pasaje de células a un matraz T-75 desechando los medios, lavando el matraz con 5 ml de 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), y añadiendo 500 l de Trypsin-EDTA. Incubar durante 5-10 minutos a 37 oC hasta que las células se desprenden.
- Una vez separado, agregue 5 mL de medios de cultivo completos calentados a las células. Aspirar y transferir los 5 ml a un matraz T-75 que contenga 15 ml de medios de cultivo completos calentados.
- Células de paso en matraces T-75 al menos cuatro veces. Haga esto una vez que el matraz sea confluente lavando con 8 ml de 1x DPBS, añadiendo 1 ml de trypsin-EDTA para separar las células, añadiendo 10 ml de medios calentados a las células y diluyendo 1:6-1:8 en un nuevo matraz T-75 que contiene 20 ml de medios de cultivo caliente completos.
- Células de paso hasta el número adecuado de matraces T-150 que contienen 40 ml de medios de cultivo completos calentados para el número de ratones que se van a inyectar. La mayoría de los estudios requerirán varios matraces T-150 para asegurar suficientes células para la inyección.
- Cuando los ratones estén listos para ser inyectados (8 semanas de edad o pesando más de 20 g, dependiendo de los protocolos institucionales o IACUC), cosecha las células desechar los medios, lavando cada matraz con 10 ml de 1x DPBS y añadiendo 2 ml de trippsina-EDTA. Incubar durante 5-10 minutos a 37 oC hasta que las células se desprenden.
- Lavado del matraz con 10 ml de soporte completo y transferir todo el contenido (10 ml de medios + 2 ml de mezcla celular de trippsina-EDTA) al siguiente matraz. Continúe lavando y recogiendo células de cada matraz utilizando los mismos 10 ml de medios para evitar el uso de una cantidad excesiva de medios.
- Una vez recogidos todos los matraces, transfiera el contenido a un tubo centrífugo de 50 ml. Recoger una muestra de 10 ml para el recuento en un tubo de microcentrífuga y centrifugar el tubo cónico de 50 ml a 125 x g durante 5 minutos.
- Mientras que las células están siendo centrifugadas, agregue 10 l de azul de Trypan a 10 l de muestra de celda. Cuenta las células usando un hemocitoómetro. Una vez que se determina el número total de células, calcule la concentración de células necesarias para inyectar ratones durante 1,2 x 106 células por ratón (por 100 l).
- Después de la centrifugación, los medios decantación y el pellet de células resuspendidas en la cantidad correcta de DPBS estéril 1x para 1,2 x 106 células por cada 100 l. Divida la mezcla de células/DPBS en tubos de microcentrífuga para facilitar el acceso con la jeringa al aspirar células para inyección. Mantenga las células en hielo e inyecte poco después, ya que las células comenzarán a morir después de estar en hielo durante largos períodos de tiempo.
2. Inyecciones
- Prepare las células para la inyección tocando o mezclando suavemente el tubo de microcentrífuga para resuspender las células, y luego aspirar 600 l en una jeringa de 1 ml. Gire la jeringa hacia arriba y tire del émbolo hacia abajo para alejar las células de la abertura de la jeringa. Toque la jeringa para deshacerse de las burbujas de aire.
- Vuelva a colocar la aguja en el bisel y dispensar las células en el tubo de microcentrífuga hasta que sólo queden 500 l en la jeringa. Ponga la jeringa sobre hielo.
NOTA: Las células 4T1 se caen de la suspensión rápidamente. Por lo tanto, es importante mezclar las células de nuevo en la suspensión tocando con frecuencia. - Anestfetizar 8 semanas de edad/>20 g ratón BALB/c hembra usando isoflurano u otro agente anestésico aprobado. Monitoree la respiración del ratón para evaluar la profundidad de la anestesia.
- Una vez que el ratón esté correctamente anestesiado como se indica por falta de reflejo corneal, coloque el ratón sobre su espalda. Con el pulgar, el puntero y el dedo medio, mantenga suavemente presionado el ratón. Utilice el puntero y los dedos medios para mantener presionada la parte superior del cuerpo y el pulgar del ratón para su pierna trasera izquierda. Sé gentil pero firme.
- Con el bisel de la aguja hacia arriba, inyecte 100 ml de células por vía subcutánea en la almohadilla de grasa mamaria abdominal izquierda del ratón. Monitor para un buen bleb y cualquier fuga, y asegúrese de que el ratón se despierta y se mueve fácilmente después de la inyección.
- Cambie las agujas entre cada ratón.
NOTA: No permita que la aguja entre en la cavidad peritoneal. Esto haría que el cáncer se propagara rápidamente y no fuera representativo del modelo. Para garantizar una inyección subcutánea, tire suavemente hacia arriba de la aguja cuando se inserte en la almohadilla de grasa mamaria abdominal izquierda. Si la aguja se levanta fácilmente hacia arriba, se coloca correctamente por vía subcutánea.
- Cambie las agujas entre cada ratón.
3. Monitoreo
- Monitoree a los ratones al menos 3 veces a la semana para detectar peso, puntuación de condición corporal, tamaño del tumor, condición del tumor, respiración, nivel de actividad, apariencia y movimiento. Una vez que el tumor alcanza 0,7-0,8 cm de diámetro, comience a monitorear diariamente.
- Considere la eutanasia cuando el tamaño del tumor alcance 1,5 cm, o la pérdida de peso alcance el 20%, o la disminución clínica grave en la puntuación de la condición corporal, la condición del tumor, la respiración, el nivel de actividad, la apariencia o el movimiento se observen en base a las pautas institucionales.
NOTA: Puntuación de condición corporal es crucial para monitorear ya que el peso corporal puede aumentar a medida que el tumor aumenta de tamaño, negando la pérdida de condición corporal debido a la carga de enfermedad. Los protocolos de monitoreo exactos dependerán de los protocolos institucionales o de la UICC aprobados.
- Considere la eutanasia cuando el tamaño del tumor alcance 1,5 cm, o la pérdida de peso alcance el 20%, o la disminución clínica grave en la puntuación de la condición corporal, la condición del tumor, la respiración, el nivel de actividad, la apariencia o el movimiento se observen en base a las pautas institucionales.
4. Necropsía
- Eutanasia el ratón utilizando CO2 siguiendo las pautas institucionales.
- Rocíe el ratón con 70% de etanol para desinfectar. Haga una incisión en la línea media ventral del ratón para exponer la cavidad corporal.
- Retire el riñón. Continúe cortando la línea media hasta que el diafragma sea visible. Usa tijeras para perforar el diafragma y desinflar los pulmones. Recorte el diafragma para obtener un mejor acceso a la cavidad.
- Utilice tijeras contundentes para cortar el centro de la caja torácica. La caja torácica de los pines vuelve a exponer el pulmón y el corazón.
- Perfuie el corazón con 2 ml de 1x DPBS no estéril insertando una aguja en el ápice del corazón hasta que se afique en la cavidad abdominal donde se extirpó el riñón.
- Para extirpar el corazón y los pulmones, usa tijeras contundentes para cortar el esófago y la tráquea directamente por encima del corazón. Usando fórceps, comienza a alejar el corazón del cuerpo y corta cualquier tejido conectivo manteniéndolo unido. Los pulmones saldrán con el corazón.
- Identifique los pulmones multilobulados (derecha) y monolobulados (izquierda). Mantenga el corazón unido como referencia, pero una vez que se identifiquen los pulmones, corte el corazón.
- Etiquetar una placa de 12 pozos que contenga 1x Solución Salina Equilibrada (HBSS) de Hank en cada pozo. Cada ratón necesita 2 pozos. Coloque el pulmón multilobulado (derecha) en la placa de 12 pozos para la evaluación de la metástasis y manténgalo en hielo. Mantenga el pozo vecino vacío por ahora.
NOTA: Es importante utilizar el mismo pulmón (multilobulado) de cada ratón para asegurarse de que cada muestra está cerca de su tamaño. El pulmón de un solo lóbulo se puede utilizar para otros análisis, como la histopatología.
NOTA: Las muestras son estables sobre hielo o a 4oC durante unas horas.
5. Procesamiento de tejidos
NOTA: Todos los pasos de esta sección deben realizarse utilizando una técnica estéril.
- Etiquetar 1 tubo cónico de 15 ml por ratón y añadir 2,5 ml de mezcla de colagenasa tipo IV y 30 unidades de elastasa a cada tubo. Para hacer mezcla de colágeno tipo IV, disolver 2 mg de colagenasa tipo IV por ml 1x HBSS y filtro estéril. Esto se puede almacenar hasta 12 meses a -20 oC y descongelarse cuando sea necesario.
- Transfiera el pulmón al segundo, limpie bien 1x HBSS para esa muestra. Gire usando fórceps para extraer la sangre restante. Transfiera el pulmón limpio a una placa de cultivo de tejido vacía de 3,5 cm. Pulmón picado con tijeras. Enjuagar la placa con 2,5 ml de 1x HBSS, transferir 1x HBSS y piezas pulmonares en un tubo cónico de 15 ml que ya contiene colagenasa/cóctel de elastasa (5 ml en total).
- Incubar durante 75 minutos a 4oC. Continúe mezclando muestras durante este tiempo, así que coloque tubos en una mecedora o rueda giratoria. Durante este paso de incubación, etiquete tubos centrífugos de 50 ml y placas de cultivo de tejido de 10 cm para cada ratón. Si se realiza una dilución, etiquete suficientes placas de cultivo de tejido de 10 cm para las diluciones.
NOTA: Etiquete la tapa de las placas de cultivo de tejido. Si se etiqueta la placa en sí, la escritura interferirá con el análisis Fiji-ImageJ. - Lleve el volumen de cada tubo hasta 10 ml de total con 1x HBSS. Vierta el contenido sobre un colador celular de 70 m en un tubo cónico de 50 ml para cada muestra. Utilice el émbolo de una jeringa de 1 ml para moler suavemente la muestra a través del colador para permitir que más células se filtren.
- Centrifugar durante 5 minutos a 350 x g a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 10 ml de 1x HBSS. Repita este paso dos veces.
- Resuspender el pellet en 10 mL de 60 m 6TG medios de cultivo completos, ya sea RPMI o IMDM. Muestras de placas en placas de cultivo celular de 10 cm, utilizando un esquema de dilución si se desea. Incubar a 37oC, 5%co-2 durante 5 días.
NOTA: 1:2, 1:10 y 1:100 son diluciones comunes que deberán determinarse empíricamente en función de los parámetros del estudio.
ADVERTENCIA: 6TG es tóxico. Tenga cuidado al manipular y siga todas las pautas de salud y seguridad ambiental para su eliminación.
6. Placas de tinción
- Vierta los medios de cultivo de las placas en el contenedor de residuos adecuado. Fijar las células añadiendo 5 ml de metanol sin diluir por placa e incubar durante 5 minutos en RT, asegurándose de remolino de metanol para que cubra toda la placa.
ADVERTENCIA: El metanol es peligroso si se ingiere, inhala o está en la piel. Utilice una campana de humo para este paso. - Vierta el metanol de las placas en el contenedor de residuos apropiado. Enjuague las placas con 5 ml de agua destilada por placa y vierta agua en el contenedor de residuos adecuado. Añadir 5 ml de 0,03% azul de metileno por placa e incubar durante 5 minutos en RT, asegurándose de remolino de solución azul de metileno para que cubra toda la placa.
- Vierta el azul de metileno en el recipiente de desecho adecuado. Enjuague las placas de nuevo con 5 ml de agua destilada por plato. Gire las placas al revés y borre contra una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Coloque la placa en su tapa y deje secar al aire durante la noche en RT.
NOTA: Las colonias metastásicas serán azules. Una vez que las placas se secan, se pueden almacenar en RT indefinidamente.
7. Análisis de imagen
- Retire las tapas etiquetadas de las placas, teniendo cuidado de garantizar una identificación clara de las muestras. Alinee todas las placas pulmonares manchadas en una superficie limpia y ligera para tomar una foto de todas las placas en una sola imagen.
- Tome una foto de la colección de placas en un área bien iluminada, asegurándose de minimizar los reflejos ya que las placas son muy reflectantes. Las reflexiones en las placas influirán en el análisis de la imagen y, por lo tanto, deben evitarse.
NOTA: Fiji-ImageJ tiene un límite superior de 2 gigapíxeles. La mayoría de los teléfonos inteligentes modernos tendrán suficientes cámaras. No utilice una cámara de menos de 8 megapíxeles. La cámara utilizada en este experimento era de 12,2 megapíxeles en un Google Pixel 2. - Recorte la imagen para incluir las placas, pero excluya las tapas o cualquier otra cosa en el fondo de la imagen. Cargue la imagen recortada en Fiji-ImageJ.
- Cambie la imagen a blanco y negro mediante los siguientes comandos: Imagen, Ajustar, Umbral de color, Método de umbral: Predeterminado, Color de umbral: Blanco y negro, Espacio de umbral: Laboratorio. La imagen ahora debe ser en blanco y negro. El negro representa el fondo claro, y el blanco representa las colonias metastásicas azules.
- Con la herramienta Círculo de la barra de herramientas Fiji-ImageJ, seleccione el área que desea analizar. Dibuje un círculo para utilizar para todas las placas para asegurarse de que cada placa se analiza para el mismo área del mismo tamaño. Elija un tamaño que maximice el área analizada en las placas mientras minimiza el ruido de fondo que aparece en el borde de las placas. El tamaño aparece en la barra de herramientas a medida que se dibuja, por lo que es posible hacer un círculo perfecto mediante la supervisión de la altura y la anchura a medida que se dibuja el círculo.
- Analice el círculo seleccionado para determinar qué porcentaje del área es blanca, que representa el área de la placa que tiene colonias metastásicas azules. Utilice los siguientes comandos:
Analizar, Analizar partículas, Tamaño (píxel2):0-Infinito, Circularidad: 0.00-1.00, Mostrar: Nada y marque la casilla Resumir. Golpea OK. - Registre el resultado % de área. Este es el porcentaje del área seleccionada que es blanca y, por lo tanto, representa la carga metastásica.
NOTA: Se recomienda guardar los resultados en Fiji-ImageJ o copiar/pegar toda la página de resultados en un documento independiente. Si los resultados del área % son inesperados o sospechosos, es posible ver si alguna de las otras mediciones también fue sospechosa o si % de área se registró incorrectamente. - Mueva el círculo, sin alterar su tamaño agarrándolo en su centro, a la siguiente placa de la imagen. Repita los pasos 7.6 y 7.7 para todas las placas de la imagen.
- Repita los pasos 7.1 a 7.8 en al menos dos imágenes más. Una vez analizadas todas las placas e imágenes, promediar el % de resultados de área entre diferentes imágenes para cada placa para mitigar cualquier incoherencia entre las imágenes.
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Representative Results
Este método contiene ajustes simples del protocolo Pulaski y Ostrand-Rosenberg 4T13 y se puede visualizar en la Figura 1. Cuando 3 investigadores separados contaron manualmente colonias metastásicas para 12 placas pulmonares (1:10 dilución), los resultados fueron muy inconsistentes entre diferentes contadores (Figura 2A). Todos los investigadores fueron dirigidos a "contar las colonias metastásicas que aparecen como puntos azules", sin embargo, las incoherencias demuestran el problema con el recuento manual de placas altamente metastásicas. Los investigadores tuvieron diferentes niveles de experiencia con el modelo 4T1. Un patólogo veterinario certificado por la junta analizó los portaobjetos pulmonares manchados de H&E para la metástasis como otro método para comparar con el análisis de placas pulmonares Fiji-ImageJ (Figura 2B).
Mediante el análisis Fiji-ImageJ, 3 investigadores independientes analizaron 3 imágenes separadas de la colección de 12 placas (1:2 dilución). Las imágenes fueron tomadas en dos espacios de laboratorio separados con una iluminación ligeramente diferente. La disposición de las placas o el ángulo desde el que se tomó la imagen eran diferentes entre cada imagen. A diferencia de los resultados del escrutinio manual, los resultados de Fiji-ImageJ fueron coherentes entre los contadores de cada una de las 3 imágenes (Figura 3A). Para determinar si hubo incoherencias entre las 3 imágenes, los resultados de las 3 imágenes y los 3 contadores se combinaron por placa pulmonar(Figura 3B). Hay diferencias entre las imágenes para algunas placas, pero las tendencias generales son similares y ofrece más consistencia que el conteo manual. Para tener en cuenta las variaciones entre las 3 imágenes diferentes, se promediaron los resultados de cada imagen para cada placa (Figura 3C). Estos promedios proporcionaron resultados consistentes entre contadores que analizan con precisión y precisión la carga metastásica. Por lo tanto, este protocolo sugiere tomar al menos 3 imágenes de la colección de placas en diferentes arreglos, desde diferentes ángulos, o en configuraciones de luz ligeramente diferentes, y luego analizar y promediar los resultados. El contraste entre el recuento manual y el análisis Fiji-ImageJ se visualiza al comparar la Figura 2A con la Figura 3C.
Otra forma de demostrar las mejoras que ofrece este protocolo es comparar la clasificación de las placas de la mayoría a la carga menos metastásica entre contadores, en función de los recuentos de la Figura 2 y la Figura 3. El conteo manual se acordó en la placa más confluente, pero todos los rangos siguientes eran inconsistentes entre los contadores (Figura 4A). En contraste, las filas del análisis Fiji-ImageJ para cada imagen eran mucho más coherentes entre los contadores (Figura 4B). La consistencia también se observa cuando se promediaron los resultados de cada imagen para cada placa(Figura 4C). Reconocemos que este protocolo no ofrece coherencia completa entre los contadores, pero es una mejora del recuento manual al comparar la Figura 4A con la Figura 4C. El análisis histopatológico difería tanto del conteo manual como del conteo Fiji-ImageJ(Figura 4D).
Para demostrar la importancia de evitar reflexiones en las imágenes, se muestra una imagen con un reflejo de una mano y su posterior análisis Fiji-ImageJ (izquierda) opuesto a la misma placa sin reflejo (derecha) (Figura 5A). Otras manchas oscuras de una superficie de fondo sucia o residuos de muestras de sangre en las placas también pueden afectar negativamente al análisis de Fiji-ImageJ. La placa de sangre de la Figura 5B sólo tiene 2 colonias metastásicas (observadas por flechas blancas), pero el residuo oscuro (observado por las flechas negras) hizo que Fiji-ImageJ lo considerara como 31.6% metastásico. Por lo tanto, es importante tener una superficie limpia y ligera y no utilizar este método para muestras de sangre, ya que las muestras de sangre normalmente dejarán manchas oscuras residuales en la placa que no son colonias metastásicas.
Figura 1: Esquema de protocolo. Este protocolo se centra únicamente en el análisis de metástasis pulmonar en el modelo 4T1. El flujo general de este protocolo incluye el crecimiento de 4T1 células en cultivo, la inyección de ratones hembra BALB/c con células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria abdominal izquierda, el monitoreo de ratones de acuerdo con IACUC y protocolos institucionales, el sacrificio de ratones y la recolección del pulmón, la recolección de células pulmonares de las muestras pulmonares, el enchapado e incubación de células en medios de selección 6TG, la fijación de manchas y células de tinción después de 5 días, la toma de fotos de las placas, y el análisis del uso de Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El recuento manual de células metastásicas y análisis histopatológicos tienen resultados inconsistentes. A. 12 placas pulmonares con una dilución 1:10 fueron contadas manualmente por 3 investigadores separados instruidos para contar colonias metastásicas de la misma manera, aunque la experiencia con el modelo varió entre los investigadores. El número de colonias metastásicas contadas varió mucho entre los investigadores. B. El análisis histopatológico identificó y cuantificó agregados de células tumorales individuales, clasificados como metástasis, presentes en las diapositivas pulmonares teñidas de H&E. Se muestran imágenes de aumento alto, medio y bajo de una diapositiva representativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El análisis Fiji-ImageJ es preciso y preciso para determinar la carga metastásica. A. 12 placas pulmonares con una dilución 1:2 fueron analizadas por 3 investigadores separados en 3 imágenes separadas de las 12 placas pulmonares. B. Se combinaron los resultados de cada una de las 3 imágenes de cada uno de los 3 investigadores. C. Los resultados de cada placa pulmonar de las 3 imágenes fueron promediados. ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey no determinó diferencias significativas entre los contadores para cada placa pulmonar. Los datos se muestran como media + SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El análisis Fiji-ImageJ proporciona una clasificación más coherente de la carga metastásica en comparación con el recuento manual y el análisis histopatológico. A. Las mismas placas pulmonares de la Figura 2 se clasificaron de mayor a menor metastásicas en función de los recuentos manuales de la Figura 2. B. Las mismas 12 placas pulmonares de la Figura 3 se clasificaron de mayor a menor metastásicas sobre la base del análisis Fiji-ImageJ de la Figura 3A. C. Los promedios de la Figura 3C se clasificaron de mayor a menos metastásico. D. Las diapositivas pulmonares se clasificaron de mayor a menos metastásicas según la evaluación histopatológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Las reflexiones y las manchas oscuras no metastásicas afectarán negativamente a los resultados. A. Una imagen con un reflejo de una mano tomando la foto interrumpe el análisis J de Fiji-Imagen, como se muestra al comparar el análisis Fiyi-ImageJ (izquierda) con el análisis correcto De Fiji-ImageJ (derecha) B. Las placas de sangre a menudo dejan las manchas sobrantes (flechas negras) en las placas que no son colonias metastásicas (flechas blancas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Como se ha demostrado, el recuento manual de las colonias metastásicas en cada placa pulmonar puede ser un método inexacto e impreciso para cuantificar la metástasis pulmonar, demostrando la necesidad de un mejor medio de cuantificación(Figura 2). El análisis histopatológico difería ligeramente tanto del conteo manual como del análisis Fiji-ImageJ(Figura 2B y 4D),probablemente porque las diapositivas H&E no son una muestra representativa de todo el órgano. El protocolo cosecha todo un pulmón, y por lo tanto es más representativo de la metástasis pulmonar total, y es más consistente que el conteo manual. Se intentaron varios enfoques diferentes para el análisis de Fiji-ImageJ y se examinan a continuación, pero el protocolo descrito anteriormente parece ser el método superior.
Para este estudio se recogieron muestras de pulmón, sangre y cerebro. Sin embargo, las muestras de sangre y cerebro tenían muy pocas colonias metastásicas, si las hubiera. Determinamos que contar manualmente las colonias metastásicas es óptimo para estos tejidos menos metastásicos, y por lo tanto no se incluyeron datos de sangre y cerebro. Cuando la carga metastásica es fácil de contar manualmente (por ejemplo, diez o veinte colonias metastásicas en lugar de miles), la cuestión original del error humano no es relevante, y por lo tanto este protocolo no es necesario. Además, las muestras de sangre pueden dejar manchas oscuras en las placas después de la fijación, lo que interfiere con el análisis Fiji-ImageJ (Figura 5). Es importante destacar que la cantidad de células inyectadas puede influir en la carga metastásica. Por ejemplo, si se inyectan menos células y los ratones pueden sobrevivir más tiempo, el cáncer tiene más tiempo para propagarse a los sitios tradicionalmente menos metastásicos como el cerebro3,4. Por lo tanto, este protocolo podría modificarse para incluir la carga metastásica de otros tejidos si se les da tiempo para llegar a ser altamente metastásicos. Si intenta el modelo 4T1 por primera vez o cambia la cantidad de células inyectadas, se recomienda probar al menos dos diluciones al enchapar las células. Para este estudio, usamos una dilución 1:2 y 1:10. La dilución 1:2 habría sido difícil de contar manualmente, pero se contó fácilmente en Fiji-ImageJ. La dilución 1:10 todavía era difícil de contar manualmente y por lo tanto condujo a resultados inconsistentes. Las diluciones se pueden modificar en función de los parámetros específicos del estudio.
Se tomaron fotos de placas pulmonares individuales y las 12 placas pulmonares juntas. Las placas individuales se analizaron de dos maneras: recortando la imagen a un cuadrado central de la placa antes de subirla a Fiji-ImageJ, o utilizando la herramienta de selección de círculos en Fiji-ImageJ para seleccionar el círculo central de la placa en la imagen sin recortar. Encontramos que el uso de la herramienta de selección de círculos en Fiji-ImageJ ofrecía la manera más fácil y consistente de crear un área del mismo tamaño para el análisis de todas las placas. Además, analizar toda la colección de placas pulmonares en la misma imagen fue superior al análisis de imágenes individuales de placas pulmonares individuales. Tener todas las placas pulmonares en la misma imagen permite que el círculo del mismo tamaño se utilice fácilmente entre las placas pulmonares. Asegura que todas las placas pulmonares están a la misma distancia de la cámara y, por lo tanto, el mismo círculo de tamaño para el análisis debe ser el tamaño correcto para todas las placas pulmonares de la imagen. También hace que el análisis sea más rápido ya que no es necesario redibujar el círculo entre las placas. Simplemente se arrastra a la siguiente placa de la imagen sin cambiar su tamaño, lo que garantiza que se utiliza el mismo tamaño para todas las placas de la imagen. Al seleccionar el tamaño del círculo, es importante hacerlo lo suficientemente grande como para analizar la mayoría de la placa mientras que lo suficientemente pequeño como para evitar el ruido de fondo de los bordes de la placa. Además, en un intento de salvar los reactivos, las células también fueron chapadas en placas de 6 pozos y en comparación con las placas de cultivo de tejido de 10 cm. Los resultados de Fiji-ImageJ de las 6 placas de pozos fueron menos consistentes y no se correlacionaron con los platos de 10 cm (datos no mostrados). Una explicación es que el área de superficie más pequeña proporciona un área más pequeña para analizar, lo que conduce a datos menos representativos. Otra es que la reducción del área de la superficie permite que las células crezcan más rápidamente a medida que están más cerca de otras células supervivientes. Por lo tanto, no recomendamos utilizar ningún reactivo de cultivo de tejido que no sea lo que hemos descrito en el protocolo.
Como se mencionó anteriormente, evitar los reflejos y tener un fondo limpio y ligero son absolutamente críticos para este método. La Figura 5A muestra cómo se analiza una reflexión en Fiji-ImageJ y, por lo tanto, muestra la importancia crítica de evitar reflexiones. Como las placas de cultivo de tejido son altamente reflectantes, es beneficioso tomar la foto en un ángulo ligero para evitar los reflejos de usted mismo tomando la foto o de las fuentes de luz de arriba. Deberán tenerse en cuenta las condiciones de iluminación del área de trabajo específica. Sugerimos tomar varias fotos de las placas a analizar, tratando de arreglos y/o ángulos ligeramente diferentes, en un área bien iluminada. Estudie las imágenes intensamente para cualquier reflexión. Si hay incoherencias en el análisis, es probable que se deba a un problema de calidad de imagen. Para solucionar problemas, compare la imagen normal con la imagen en blanco y negro. Si las áreas que no son azules en la imagen normal aparecen como blancas en la imagen en blanco y negro, es probable que haya un reflejo o imperfección que esté alterando los resultados.
Además de la coherencia, otra ventaja notable de este método es que produce datos mucho más rápido que el conteo manual. El recuento manual de varias placas consume mucho tiempo, mientras que el análisis Fiji-ImageJ se puede realizar rápidamente. También permite un tiempo de incubación más corto. Pulaski y Ostrand-Rosenberg recomiendan un período de incubación de 10-14 días para las células chapadas, añadiendo una cantidad sustancial de tiempo al estudio3. El período de incubación de 10-14 días permite la formación de colonias más grandes y fáciles de contar. Sin embargo, muchas placas pulmonares pueden volverse confluentes antes de eso. En su lugar, 5 días de incubación dan suficiente tiempo para que la selección de 6TG mate las células no cancerosas (probadas por ratones de control sano que no tienen colonias en sus placas pulmonares, datos no mostrados), y para que las células crezcan lo suficiente como para ser fácilmente cuantificadas con Fiji-ImageJ. Esto reduce significativamente el tiempo entre los ratones que se sacrifican y analizan los datos metastásicos esenciales.
Para concluir, los beneficios de este método superan con creces las limitaciones. Reconocemos que este método no ofrece una consistencia perfecta. Si bien este no es el método ideal para los tejidos menos metastásicos, esos tejidos se pueden contar fácilmente manualmente. Si bien obtener una imagen sin reflejos puede requerir una fotografía cuidadosa, la consistencia obtenida con este método es significativa. Es posible que este método se pueda utilizar para otros tejidos que son altamente metastásicos y otros protocolos que requieren contar objetos manchados. El diseño del estudio también podría permitir analizar la tasa de metástasis o el efecto de los tratamientos contra el cáncer en la metástasis. Este método proporcionará datos de metástasis confiables y altamente consistentes y representa un refinamiento significativo para el modelo 4T1. La aplicación de este modelo a la próxima investigación sobre metástasis del cáncer de mama es de suma importancia para armar a los investigadores con herramientas para luchar contra la mortalidad por cáncer de mama.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), el Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA), y National Institutes of Health R21EB028429 (IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
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- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
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- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
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