Summary
हम फिजी-इमेजजे का उपयोग करके 4T1 स्तन कैंसर मॉडल में फेफड़ों के मेटास्टेसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक अधिक सुसंगत और त्वरित विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
स्तन कैंसर एक विनाशकारी द्रोह है, ४०,००० महिला मौतों और संयुक्त राज्य अमेरिका में नई महिला कैंसर निदान के 30% के लिए लेखांकन अकेले २०१९ में । स्तन कैंसर से संबंधित मौतों का प्रमुख कारण मेटास्टैटिक बोझ है। इसलिए, स्तन कैंसर के लिए प्रीक्लिनिकल मॉडल को चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक होने के लिए मेटास्टैटिक बोझ का विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है। 4T1 स्तन कैंसर मॉडल चरण चतुर्थ मानव स्तन कैंसर के लिए एक अनायास-मेटास्टेसिंग, मात्रात्मक माउस मॉडल प्रदान करता है । हालांकि, अधिकांश 4T1 प्रोटोकॉल ऊतक संस्कृति प्लेटों पर मैन्युअल रूप से दाग वाली कॉलोनियों की गणना करके मेटास्टैटिक बोझ की मात्रा निर्धारित करते हैं। हालांकि यह कम मेटास्टैटिक बोझ वाले ऊतकों के लिए पर्याप्त है, मैनुअल गिनती में मानव त्रुटि असंगत और चर परिणाम का कारण बनती है जब प्लेटें भ्रमित होती हैं और गिनती करना मुश्किल होता है। यह विधि मानव गणना त्रुटि के लिए एक कंप्यूटर आधारित समाधान प्रदान करता है। यहां, हम फेफड़ों, 4T1 मॉडल में एक अत्यधिक मेटास्टैटिक ऊतक का उपयोग कर प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करते हैं। मेथिलीन नीले दाग प्लेटों की छवियां फिजी-इमेजजे में विश्लेषण के लिए अधिग्रहीत और अपलोड की गई हैं। फिजी-इमेजजे तब छवि के चयनित क्षेत्र का प्रतिशत निर्धारित करता है जो नीला है, जो मेटास्टैटिक बोझ के साथ प्लेट के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। यह कंप्यूटर-आधारित दृष्टिकोण अत्यधिक मेटास्टैटिक ऊतकों के लिए मैनुअल गिनती या हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन की तुलना में अधिक सुसंगत और त्वरित परिणाम प्रदान करता है। फिजी-इमेजजे परिणामों की स्थिरता छवि की गुणवत्ता पर निर्भर करती है। छवियों के बीच परिणामों में मामूली भिन्नताएं हो सकती हैं, इस प्रकार यह सिफारिश की जाती है कि कई छवियां ली जाती हैं और परिणाम औसत होते हैं। अपनी न्यूनतम सीमाओं के बावजूद, यह विधि लगातार और तेजी से परिणाम देकर फेफड़ों में मेटास्टैटिक बोझ की मात्रा निर्धारित करने में सुधार है।
Introduction
आठ महिलाओं में से एक अपने जीवनकाल में स्तन कैंसर के साथ का निदान किया जाएगा, और अभी तक कई उपचार के विकल्प के बावजूद स्तन कैंसर अमेरिकी महिलाओं में कैंसर से संबंधित मौतों का दूसरा प्रमुख कारण है1। ये महिलाएं अपने स्तन में प्राथमिक ट्यूमर से नहीं मर रही हैं। इसके बजाय, मेटास्टैटिक बोझ इस बीमारी की मृत्यु दर के लिए जिम्मेदार है क्योंकि यह आमतौर पर फेफड़े, हड्डी, मस्तिष्क, यकृत और लिम्फ नोड्स2में फैलता है। इस वजह से, स्तन कैंसर मॉडल इस बीमारी की मृत्यु दर को रोकने में योगदान करने के लिए मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने की जरूरत है । 4T1 murine स्तन कैंसर मॉडल इसे पूरा करने के लिए एक शानदार प्रोटोकॉल है। यहां वर्णित विधि फिजी-इमेजजे का उपयोग करके फेफड़ों के मेटास्टेसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए 4T1 मॉडल में सुधार प्रदान करती है, जो लगातार और त्वरित परिणाम पैदा करती है।
4T1 मॉडल अच्छी तरह से स्थापित है, जिसमें अधिकांश प्रयोगशालाएं प्रोटोकॉल का उपयोग कर रही हैं जैसे कि पुलस्की और ओस्ट्रैंड-रोसेनबर्ग द्वारा 20013में वर्णित हैं। 4T1 सेल लाइन 6-थिओगुआनिन (6TG) प्रतिरोधी और स्टेज IV, ट्रिपलनिगेटिव ब्रेस्ट कैंसर3,4,5का प्रतिनिधि है। यह चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक है क्योंकि यह एक आर्थोटोपिक मॉडल है और अनायास ही अंगों को मेटास्टेसाइज करता है जैसा कि मानव स्तन कैंसरमें 3, 4,4. 4T1 कोशिकाएं अनायास ही3,4कोशिकाओं की मात्रा के आधार पर अनुमानित दर पर मेटास्टेसाइज करती हैं . महत्वपूर्ण बात, यहां इस्तेमाल चूहों के बीच आनुवंशिक मतभेद मेटास्टैटिक बोझ में अपेक्षित अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का कारण बना। मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने के लिए, ऊतकों को 6TG चयन और मेथिलीन ब्लू धुंधला का उपयोग करके दूर की साइटों में कैंसर कोशिकाओं को इकट्ठा करने और निर्धारित करने के लिए काटा जाता है। परिणाम मेटास्टैटिक उपनिवेशों का प्रतिनिधित्व करने वाले नीले बिंदुओं के साथ ऊतक संस्कृति प्लेटों का संग्रह है। हालांकि, पुलस्की और ओस्ट्रैंड-रोसेनबर्ग प्रोटोकॉल मैन्युअल रूप से उन्हें गिनकर मेटास्टैटिक उपनिवेशों का मात्रा बताते हैं, और इसलिए यह इस मॉडल में मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने का मानक साधन रहा है। हालांकि यह कम मेटास्टैटिक बोझ वाले ऊतकों के लिए आसान है, फेफड़ों जैसे ऊतक अक्सर मेटास्टेस से लदे होते हैं। चूंकि फेफड़ों की प्लेटें अत्यधिक संकुचित हो सकती हैं, सही और सटीक रूप से मैनुअल गिनती द्वारा मेटास्टैटिक उपनिवेशों को मात्राबद्ध करना मुश्किल है और मानवीय त्रुटि से ग्रस्त है। मेटास्टैटिक बोझ को बेहतर तरह से निर्धारित करने के लिए, हम मानव गणना त्रुटि के कंप्यूटर-आधारित समाधान के लिए फिजी-इमेजजे का उपयोग करने का वर्णन करते हैं। हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन (एच एंड ई) धुंधला के साथ हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण फेफड़ों के मेटास्टेस को निर्धारित करने का एक और साधन है, और दिलचस्प रूप से फिजी-इमेजजे सॉफ्टवेयर6,7के साथ भी सुधार किया गया है। हालांकि, क्योंकि हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण फेफड़ों का एक टुकड़ा देखता है, यह गलत और प्रतिनिधि हो सकता है। इसका कारण यह है कि 4T1 मॉडल पूरे अंग में कई मेटास्टैटिक घावों का कारण बनता है जो समान रूप से वितरित नहीं होते हैं। जबकि हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण और मैनुअल गिनती के बीच समग्र रुझान समान8हो सकते हैं, व्यक्तिगत मूल्य अलग हो सकते हैं और इसलिए हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण को मात्राकरण के एकमात्र साधन के रूप में उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। हम हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण और विभिन्न काउंटरों के बीच मैनुअल गिनती में विसंगतियों की तुलना में लाभ प्रदर्शित करते हैं, जबकि फिजी-इमेजजे का उपयोग करने की निरंतरता का भी प्रदर्शन करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम बताते हैं कि यह विधि इनक्यूबेशन समय को 10-14 दिनों से घटाकर 5 दिनों तक कर सकती है, जिसका अर्थ है कि शोधकर्ता मैनुअल गिनती पर भरोसा करते समय अपने अध्ययन से डेटा का विश्लेषण कर सकते हैं।
यह विधि पुलस्की और ओस्ट्रैंड-रोसेनबर्ग प्रोटोकॉल3के लिए सरल समायोजन का संग्रह है। क्योंकि 4T1 मॉडल व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है, और क्योंकि फेफड़ों के मेटास्टेसिस पूर्व नैदानिक मॉडल में मापने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, हमारा मानना है कि इस विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जा सकता है और स्तन कैंसर शोधकर्ताओं के लिए अत्यधिक मूल्यवान है। केवल अतिरिक्त आपूर्ति की आवश्यकता एक कैमरा और फिजी-इमेजजे के साथ कंप्यूटर तक पहुंच है, जो छवि विश्लेषण9में अक्सर उपयोग किया जाने वाला एक मुफ्त सॉफ्टवेयर है। यह विधि विशेष रूप से फेफड़ों के मेटास्टेसिस पर केंद्रित है, लेकिन इसका उपयोग महत्वपूर्ण मेटास्टैटिक बोझ वाले अन्य ऊतकों के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को वर्जीनिया टेक की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार । इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त संस्थानों से अनुमति और सभी उपयुक्त दिशा-निर्देशों का पालन करने की आवश्यकता होती है ।
1. सेल कल्चर
- पूर्ण संस्कृति मीडिया (RPMI + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम + 1% पेन स्ट्रेप) बनाओ। एटीसीसी प्रोटोकॉल 10 के अनुसार4T1 कोशिकाओं को पुनर्जीवित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और टी-25 फ्लास्क में 5% सीओ2 को कॉन्फ्ल्यूंट तक। मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए पुनर्जीवित करने के बाद मीडिया दिन बदलें, और फिर अगर मीडिया से पहले खर्च किया जाता है कोशिकाओं को पारित करने के लिए पर्याप्त संकुचित कर रहे हैं ।
- एक बार टी-25 फ्लास्क को मिलाल, मीडिया को त्यागकर टी-75 फ्लास्क में जाने वाली कोशिकाएं, 1x Dulbecco के फॉस्फेट बफर खारा (डीपीबीएस) के 5 एमएल के साथ फ्लास्क धोने, और ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 500 μL जोड़ना। कोशिकाओं को अलग करने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- एक बार अलग होने के बाद, कोशिकाओं में गर्म पूर्ण संस्कृति मीडिया के 5 एमएल जोड़ें। 5 एमएल को गर्म पूर्ण संस्कृति मीडिया के 15 एमएल वाले टी-75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
- टी-७५ में पैसेज सेल कम से कम चार बार फ्लास्क करते हैं। ऐसा एक बार फ्लास्क 1x डीपीबीएस के 8 एमएल के साथ धोने से संकुचित हो जाता है, कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 1 एमसीएल को जोड़ना, कोशिकाओं को गर्म मीडिया के 10 एमएल जोड़ना, और 1:6-1:8 को एक नए टी-75 फ्लास्क में पतला करना जिसमें 20 एमएल गर्म पूर्ण संस्कृति मीडिया होता है।
- चूहों की संख्या के लिए गर्म पूर्ण संस्कृति मीडिया के 40 एमएल युक्त टी-150 फ्लास्क की उचित संख्या तक मार्ग कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाना है। अधिकांश अध्ययनों को इंजेक्शन के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए कई टी-150 फ्लास्क की आवश्यकता होगी।
- जब चूहों को इंजेक्शन देने के लिए तैयार होते हैं (8 सप्ताह पुराने या 20 ग्राम से अधिक वजन, IACUC या संस्थागत प्रोटोकॉल के आधार पर), मीडिया को त्यागकर फसल कोशिकाएं, 1x डीपीबीएस के 10 एमएल के साथ प्रत्येक फ्लास्क को धोने और ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 2 एमसीएल जोड़ना। कोशिकाओं को अलग करने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- पूर्ण मीडिया के 10 एमएल के साथ फ्लास्क धोएं और सभी सामग्री (मीडिया के 10 एमएल + 2 मिलीएल ट्राइप्सिन-ईडीटीए सेल मिश्रण) को अगले फ्लास्क में स्थानांतरित करें। मीडिया की अत्यधिक मात्रा का उपयोग करने से बचने के लिए मीडिया के समान 10 एमएल का उपयोग करके प्रत्येक फ्लास्क से कोशिकाओं को धोना और इकट्ठा करना जारी रखें।
- एक बार जब सभी फ्लास्क एकत्र हो जाते हैं, तो सामग्री को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में गिनती के लिए 10 माइक्रोल नमूना लें और 5 मिनट के लिए 125 x ग्राम पर 50 एमएल शंकु नली को सेंट्रलाइज करें।
- जबकि कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र किया जा रहा है, सेल नमूने के 10 माइक्रोन नीले रंग के 10 माइक्रोन जोड़ें । हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। एक बार कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित हो जाने के बाद, चूहों को 1.2 x 106 कोशिकाओं प्रति माउस (प्रति 100 माइक्रोल) के लिए इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की एकाग्रता की गणना करें।
- अपकेंद्रित्र के बाद, 1.2 x 106 कोशिकाओं प्रति 100 माइक्रोन के लिए बाँझ 1x डीपीबीएस की सही मात्रा में डिकेंट मीडिया और रिसिपेंड सेल पेलेट। इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को एस्पिरेटिंग करते समय सिरिंज के साथ आसान पहुंच के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्प्लिट सेल/डीपीबीएस मिश्रण । बर्फ पर कोशिकाओं को रखें और उसके तुरंत बाद इंजेक्ट करें क्योंकि कोशिकाएं समय की विस्तारित अवधि के लिए बर्फ पर होने के बाद मरना शुरू कर देंगी।
2. इंजेक्शन
- कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को टैप करके या धीरे-धीरे मिलाकर इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को तैयार करें, और फिर 1 मिलीएल सिरिंज में 600 माइक्रोन को एस्पिरेट करें। सिरिंज को ऊपर की ओर घुमाएं और सिरिंज खोलने से कोशिकाओं को दूर लाने के लिए प्लंजर को नीचे खींचें। हवा के बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए सिरिंज पर टैप करें।
- सुई को ऊपर रखें और कोशिकाओं को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में वापस वितरित करें जब तक कि सिरिंज में केवल 500 माइक्रोल न रहें। बर्फ पर सिरिंज फ्लैट रखो।
नोट: 4T1 कोशिकाएं निलंबन से जल्दी बाहर गिर जाती हैं। इसलिए, कोशिकाओं को बार-बार टैप करके निलंबन में वापस मिलाना महत्वपूर्ण है। - एनेस्थेटाइज 8 सप्ताह पुराने/>20 g मादा BALB/c माउस आइसोफ्लुरेन या अन्य अनुमोदित एनेस्थेटिक एजेंट का उपयोग करते हुए । संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करने के लिए माउस की श्वास की निगरानी करें।
- एक बार जब माउस को कॉर्नियल पलटा की कमी से संकेत के रूप में ठीक से एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है, तो माउस को अपनी पीठ पर रखें। अंगूठे, सूचक और मध्यमा उंगली का उपयोग करके, धीरे-धीरे माउस को पकड़ें। इसके पीछे के बाएं पैर के लिए माउस के ऊपरी शरीर और अंगूठे को पकड़ने के लिए सूचक और मध्यम उंगलियों का उपयोग करें। कोमल लेकिन दृढ़ रहें।
- सुई के बेवेल के साथ, माउस के बाएं पेट के स्तन वसा पैड में 100 माइक्रोन कोशिकाओं को चमड़े के साथ इंजेक्ट करें। एक अच्छा bleb और किसी भी रिसाव के लिए मॉनिटर, और माउस जाग और इंजेक्शन के बाद आसानी से चलता है सुनिश्चित करें ।
- प्रत्येक माउस के बीच सुई बदलें।
नोट: सुई को पेरिटोनियल गुहा में प्रवेश करने की अनुमति न दें। यह कैंसर जल्दी फैलने के लिए और मॉडल के प्रतिनिधि नहीं होने का कारण होगा । एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए, धीरे सुई पर ऊपर की ओर खींच जब बाएं पेट स्तन वसा पैड में डाला । यदि सुई आसानी से ऊपर की ओर उठा लिया जाता है, तो यह सही ढंग से चमड़े के नीचे तैनात है।
- प्रत्येक माउस के बीच सुई बदलें।
3. निगरानी
- वजन, शरीर की स्थिति स्कोर, ट्यूमर का आकार, ट्यूमर की स्थिति, श्वसन, गतिविधि स्तर, उपस्थिति, और आंदोलन के लिए सप्ताह में कम से कम 3 बार चूहों की निगरानी करें। एक बार ट्यूमर व्यास में 0.7-0.8 सेमी तक पहुंच जाता है, दैनिक निगरानी शुरू करते हैं।
- इच्छामृत्यु पर विचार करें जब ट्यूमर का आकार 1.5 सेमी तक पहुंच जाता है, या वजन घटाने 20% तक पहुंच जाता है, या शरीर की स्थिति स्कोर में गंभीर नैदानिक गिरावट, ट्यूमर की स्थिति, श्वसन, गतिविधि स्तर, उपस्थिति, या आंदोलन संस्थागत दिशानिर्देशों के आधार पर मनाया जाता है।
नोट: शरीर की स्थिति स्कोर के रूप में शरीर के वजन में वृद्धि हो सकती है के रूप में शरीर के वजन में वृद्धि हो सकती है की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है, रोग के बोझ के कारण शरीर की हालत हानि नकार । सटीक निगरानी प्रोटोकॉल अनुमोदित आईएसीयूसी या संस्थागत प्रोटोकॉल पर निर्भर करेगा।
- इच्छामृत्यु पर विचार करें जब ट्यूमर का आकार 1.5 सेमी तक पहुंच जाता है, या वजन घटाने 20% तक पहुंच जाता है, या शरीर की स्थिति स्कोर में गंभीर नैदानिक गिरावट, ट्यूमर की स्थिति, श्वसन, गतिविधि स्तर, उपस्थिति, या आंदोलन संस्थागत दिशानिर्देशों के आधार पर मनाया जाता है।
4. नेक्रॉप्सी
- संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए सीओ2 का उपयोग करके माउस को इच्छामृत्यु दें।
- कीटाणुरहित करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे करें। शरीर गुहा को बेनकाब करने के लिए माउस के वेंट्रल मिडलाइन को चीरा दें।
- किडनी निकाल ें। जब तक डायाफ्राम दिखाई न दे तब तक मिडलाइन को काटते रहें। फेफड़ों को डिफ्लेट करने के लिए डायाफ्राम को पंचर करने के लिए कैंची का प्रयोग करें। गुहा तक बेहतर पहुंच प्राप्त करने के लिए डायाफ्राम को ट्रिम करें।
- रिबकेज के केंद्र को काटने के लिए कुंद कैंची का उपयोग करें। पिन रिबकेज वापस फेफड़ों और दिल का पर्दाफाश करने के लिए।
- दिल के शीर्ष में सुई डालकर गैर-बाँझ 1x डीपीबीएस के 2 एमएल के साथ दिल को तब तक पर ध्यान दें जब तक कि यह पेट की गुहा में पूल न हो जाए जहां गुर्दे को हटा दिया गया था।
- दिल और फेफड़ों को हटाने के लिए मुंह कुंद कैंची का इस्तेमाल कर सीधे दिल से ऊपर घेघा और श्वासनली को काटा जा सके। संदंश का उपयोग करना, दिल को शरीर से दूर खींचना शुरू करें और इसे संलग्न रखते हुए किसी भी संयोजी ऊतक पर काट लें। फेफड़े दिल के साथ बाहर आ जाएंगे।
- मल्टी-लॉबेड (दाएं) और सिंगल-लोबेड (बाएं) फेफड़ों की पहचान करें। संदर्भ के लिए दिल संलग्न रखें, लेकिन एक बार फेफड़ों की पहचान कर रहे हैं, दिल दूर काट ।
- प्रत्येक कुएं में 1x हैंक के संतुलित नमकीन समाधान (एचबीएसएस) युक्त 12 अच्छी तरह से प्लेट लेबल करें। प्रत्येक माउस को 2 कुओं की आवश्यकता होती है। मेटास्टेसिस मूल्यांकन के लिए 12 अच्छी तरह से प्लेट में बहु-lobed (दाएं) फेफड़े रखें और बर्फ पर रखें। पड़ोसी को अभी के लिए अच्छी तरह से खाली रखें।
नोट: प्रत्येक नमूने के आकार में करीब है सुनिश्चित करने के लिए हर माउस से एक ही फेफड़े (बहु-lobed) का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। एकल-लोबेड फेफड़ों का उपयोग हिस्टोपैथोलॉजी जैसे अन्य विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
नोट: नमूने बर्फ पर या कुछ घंटों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हैं।
5. ऊतकों को संसाधित करना
नोट: इस खंड में सभी कदम बाँझ तकनीक का उपयोग कर किया जाना चाहिए।
- लेबल 1 15 एमएल शंकु नली प्रति माउस और प्रत्येक ट्यूब के लिए टाइप IV कोलेजनेस मिश्रण के 2.5 एमएल और इलास्टेज की 30 इकाइयां जोड़ें। टाइप IV कोलेजन मिश्रण बनाने के लिए, 2 मिलीग्राम टाइप IV कोलेजनस प्रति एमएल 1x एचबीएसएस और बाँझ फिल्टर को भंग करें। इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर 12 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है और जरूरत पड़ने पर गल सकता है।
- उस नमूने के लिए फेफड़ों को दूसरे, साफ 1x एचबीबीएस को अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। किसी भी शेष रक्त को हटाने के लिए संदंश का उपयोग कर भंवर। खाली 3.5 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेट के लिए स्वच्छ फेफड़ों को स्थानांतरित करें। कैंची के साथ कीमा फेफड़े। 1x HBSS के 2.5 एमएल के साथ कुल्ला प्लेट, 1x एचबीबीएस और फेफड़ों के टुकड़ों को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें पहले से ही कोलेजनेस/इलास्टेज कॉकटेल (5 एमएल कुल) होता है।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 75 मिनट के लिए इनक्यूबेट। इस समय के दौरान नमूनों को मिलाना जारी रखें, इसलिए ट्यूबों को घुमाव या घूर्णन पहिया पर रखें। इस इनक्यूबेशन स्टेप के दौरान, प्रत्येक माउस के लिए 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब और 10 सेमी टिश्यू कल्चर प्लेट्स लेबल करें। यदि एक कमजोर पड़ने कर रही है, कमजोर पड़ने के लिए पर्याप्त 10 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेटों लेबल ।
नोट: ऊतक संस्कृति प्लेटों के ढक्कन लेबल । यदि प्लेट को लेबल किया जाता है, तो लेखन फिजी-इमेजजे विश्लेषण में हस्तक्षेप करेगा। - 1x एचबीएसएस के साथ कुल 10 एमएल तक प्रत्येक ट्यूब की मात्रा लाएं। प्रत्येक नमूने के लिए एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में एक 70 माइक्रोन सेल छलनी पर सामग्री डालो। एक 1 मिलीएल सिरिंज के प्लंजर का उपयोग धीरे छलनी के माध्यम से नमूना पीसने के लिए और अधिक कोशिकाओं के माध्यम से फिल्टर करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 350 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्यागें और 1x एचबीएसएस के 10 एमएल के साथ गोली धोएं। इस स्टेप को दो बार दोहराएं।
- 60 μM 6TG पूर्ण संस्कृति मीडिया, या तो RPMI या IMDM के 10 मिलीएल में पुनः खर्च गोली। 10 सेमी सेल कल्चर प्लेटों में प्लेट के नमूने, यदि वांछित हो तो कमजोर पड़ने की योजना का उपयोग करते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5 दिन के लिए 5% सीओ2।
नोट: 1:2, 1:10, और 1:100 आम कमजोर पड़ने की आवश्यकता है कि अनुभवजन्य अध्ययन मापदंडों के आधार पर निर्धारित करने की आवश्यकता होगी ।
सावधानी: 6TG विषाक्त है। निपटान के लिए सभी पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशानिर्देशों को संभालते समय सावधानी बरतें और उनका पालन करें।
6. स्टेनिंग प्लेटें
- उचित अपशिष्ट कंटेनर में प्लेटों से संस्कृति मीडिया डालो । प्रति प्लेट 5 एमएल अन पतला मेथनॉल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें और आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, जिससे मेथनॉल को चक्कर लगाना सुनिश्चित हो ताकि यह पूरी प्लेट को कवर करे।
सावधानी: मेथनॉल खतरनाक है अगर निगलना, साँस लेना, या त्वचा पर है। इस कदम के लिए एक धूम हुड का प्रयोग करें। - उचित अपशिष्ट कंटेनर में प्लेटों से मेथनॉल डालो। प्लेट प्रति आसुत पानी के 5 एमएल के साथ प्लेटों को कुल्ला करें और उचित अपशिष्ट कंटेनर में पानी डालें। 0.03% मेथिलीन ब्लू प्रति प्लेट के 5 मिलियनल जोड़ें और आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, जिससे मेथिलीन नीले समाधान को फिराना सुनिश्चित करें ताकि यह पूरी प्लेट को कवर करे।
- उचित अपशिष्ट कंटेनर में मेथिलीन नीले डालो। प्लेट प्रति 5 एमएल आसुत पानी के साथ फिर से प्लेटें कुल्ला। प्लेटों को उल्टा करें और अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए पेपर तौलिया के खिलाफ दाग दें। इसके ढक्कन पर प्लेट रखें और आर टी में रात भर हवा सूखी चलो ।
नोट: मेटास्टैटिक कॉलोनियां नीली होंगी। एक बार प्लेटें सूख जाने के बाद, उन्हें अनिश्चित काल के लिए आरटी में संग्रहीत किया जा सकता है।
7. छवि विश्लेषण
- नमूनों की स्पष्ट पहचान सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखते हुए प्लेटों से लेबल किए गए ढक्कन हटाएं। एक छवि में प्लेटों के सभी की एक तस्वीर लेने के लिए एक साफ, प्रकाश सतह पर सभी दाग फेफड़ों प्लेटों लाइन ।
- एक अच्छी तरह से जलाया क्षेत्र में प्लेटों के संग्रह की एक तस्वीर ले लो, प्रतिबिंब को कम करने के लिए सुनिश्चित कर के रूप में प्लेटें बहुत चिंतनशील हैं । प्लेटों में प्रतिबिंब छवि विश्लेषण को प्रभावित करेगा और इसलिए इससे बचने की आवश्यकता है।
नोट: फिजी-इमेजजे में 2 गीगापिक्सेल की ऊपरी सीमा है। ज्यादातर आधुनिक स्मार्ट फोन में पर्याप्त कैमरे होंगे। 8 मेगापिक्सल से कम कैमरे का इस्तेमाल न करें। इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया कैमरा गूगल पिक्सल 2 पर 12.2 मेगापिक्सल का था। - प्लेटों को शामिल करने के लिए छवि को क्रॉप करें, लेकिन छवि की पृष्ठभूमि में ढक्कन या कुछ और बाहर करें। फिजी-इमेजजे में फसली छवि अपलोड करें।
- निम्नलिखित आदेशों का उपयोग करके छवि को काले और सफेद रंग में बदलें: छवि, समायोजित, रंग सीमा, थ्रेसहोल्ड विधि: डिफ़ॉल्ट, थ्रेसहोल्ड रंग: बी एंड डब्ल्यू, थ्रेसहोल्ड स्पेस: लैब. डार्क बैकग्राउंड बॉक्स को अनसेलेक्ट करें। छवि अब काले और सफेद होना चाहिए। काला प्रकाश पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व करता है, और सफेद नीले मेटास्टैटिक उपनिवेशों का प्रतिनिधित्व करता है।
- फिजी-इमेजजे टूलबार पर सर्कल टूल का उपयोग करके, विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र का चयन करें। प्रत्येक प्लेट को एक ही आकार के क्षेत्र के लिए विश्लेषण किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए सभी प्लेटों के लिए उपयोग करने के लिए एक सर्कल ड्रा करें। प्लेटों के किनारे पर दिखाई देने वाले पृष्ठभूमि शोर को कम करते हुए प्लेटों पर विश्लेषण किए गए क्षेत्र को अधिकतम करने वाला आकार चुनें। आकार टूलबार में दिखाई देता है क्योंकि यह खींचा जाता है, इसलिए सर्कल के रूप में ऊंचाई और चौड़ाई की निगरानी करके एक आदर्श सर्कल बनाना संभव है।
- चयनित सर्कल का विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए कि क्षेत्र का कितना प्रतिशत सफेद है, जो प्लेट के उस क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें नीली मेटास्टैटिक कॉलोनियां हैं। निम्नलिखित आदेशों का उपयोग करें:
कणों, आकार (पिक्सेल2):0-इन्फिनिटी, सर्कुलरिटी: 0.00-1.00 का विश्लेषण, विश्लेषण करें: कुछ भी नहीं, और सारांश बॉक्स की जांच करें। ठीक मारो। - % क्षेत्र परिणाम रिकॉर्ड करें। यह चयनित क्षेत्र का प्रतिशत है जो सफेद है, और इसलिए मेटास्टैटिक बोझ का प्रतिनिधित्व करता है।
नोट: यह या तो फिजी-ImageJ में परिणामों को बचाने या कॉपी/एक अलग दस्तावेज़ में पूरे परिणाम पृष्ठ पेस्ट करने की सिफारिश की है । यदि% क्षेत्र के परिणाम अप्रत्याशित या संदिग्ध हैं, तो यह देखना संभव है कि क्या अन्य मापों में से कोई भी संदिग्ध था या यदि% क्षेत्र गलत तरीके से दर्ज किया गया था। - सर्कल को अपने केंद्र में हथियाने के बिना, तस्वीर में अगली प्लेट में बदलें। तस्वीर में सभी प्लेटों के लिए चरण 7.6 और 7.7 दोहराएं।
- कम से कम दो और छवियों पर चरण 7.1 - 7.8 दोहराएं। एक बार सभी प्लेटों और छवियों का विश्लेषण किया गया है, औसत प्रत्येक प्लेट के लिए विभिन्न छवियों के बीच% क्षेत्र परिणाम चित्रों के बीच किसी भी विसंगतियों को कम करने के लिए।
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Representative Results
इस विधि में पुलस्की और ओस्ट्रैंड-रोसेनबर्ग 4T1 प्रोटोकॉल3 से सरल समायोजन शामिल हैं और चित्र 1में कल्पना की जा सकती है। जब 3 अलग शोधकर्ताओं ने मैन्युअल रूप से 12 फेफड़ों की प्लेटों (1:10 कमजोर पड़ने) के लिए मेटास्टैटिक कॉलोनियों की गणना की, तो परिणाम विभिन्न काउंटरों(चित्रा 2A) केबीच बहुत असंगत थे। सभी शोधकर्ताओं को "मेटास्टैटिक कालोनियों को गिनने का निर्देश दिया गया था जो नीले बिंदुओं के रूप में दिखाई देते हैं", फिर भी विसंगतियां मैन्युअल रूप से उच्च-मेटास्टैटिक प्लेटों की गिनती के साथ इस मुद्दे को प्रदर्शित करती हैं। शोधकर्ताओं ने 4T1 मॉडल के साथ अनुभव के स्तर को अलग किया था । एक बोर्ड-प्रमाणित पशु चिकित्सा पैथोलॉजिस्ट ने फिजी-इमेजजे फेफड़ों की प्लेट विश्लेषण(चित्रा 2B)की तुलना करने के लिए एक और विधि के रूप में मेटास्टेसिस के लिए एच एंड ई दाग फेफड़ों की स्लाइड का विश्लेषण किया।
फिजी-इमेजजे विश्लेषण का उपयोग करते हुए, 3 अलग शोधकर्ताओं ने 12 प्लेटों (1:2 कमजोर पड़ने) के संग्रह की 3 अलग-अलग छवियों का विश्लेषण किया। छवियों को थोड़ा अलग प्रकाश व्यवस्था के साथ दो अलग प्रयोगशाला रिक्त स्थान में लिया गया । प्लेटों की व्यवस्था या जिस एंगल से तस्वीर ली गई थी, वह हर इमेज के बीच अलग-अलग थी। मैनुअल गिनती के परिणामों के विपरीत, फिजी-इमेजजे परिणाम 3 छवियों(चित्र 3 ए)में से प्रत्येक के लिए काउंटरों के बीच संगत थे। यह निर्धारित करने के लिए कि 3 छवियों के बीच विसंगतियां थीं, 3 छवियों और 3 काउंटरों के परिणाम प्रति फेफड़ों की प्लेट(चित्रा 3B)को संयुक्त किया गया था। कुछ प्लेटों के लिए छवियों के बीच मतभेद हैं, लेकिन समग्र रुझान समान हैं और यह मैनुअल गिनती की तुलना में अधिक स्थिरता प्रदान करता है। 3 अलग-अलग छवियों के बीच विविधताओं के लिए खाते में, प्रत्येक प्लेट(चित्र 3 सी)के लिए प्रत्येक छवि के परिणाम औसत थे। इन औसतों ने काउंटरों के बीच लगातार परिणाम प्रदान किए जो मेटास्टैटिक बोझ का सटीक और सटीक विश्लेषण करते हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में विभिन्न कोणों से, या थोड़ा अलग प्रकाश सेटिंग्स में प्लेट संग्रह की कम से कम 3 छवियां लेने का सुझाव दिया गया है, और फिर परिणामों का विश्लेषण और औसत है। चित्रा 2ए की तुलना चित्रा 3 सीसे करते समय मैनुअल काउंटिंग और फिजी-इमेजजे विश्लेषण के बीच के विपरीत की कल्पना की जाती है।
इस प्रोटोकॉल द्वारा पेश किए गए सुधारों को प्रदर्शित करने का एक और तरीका प्लेटों की रैंकिंग की तुलना काउंटरों के बीच सबसे कम मेटास्टैटिक बोझ से कर रहा है, जो चित्र 2 और चित्रा 3से गिनती के आधार पर है। मैन्युअल गिनती सबसे confluent प्लेट पर सहमत हुए, लेकिन सभी निम्नलिखित रैंकों काउंटरों(चित्रा 4A) केबीच असंगत थे। इसके विपरीत, प्रत्येक छवि के लिए फिजी-इमेजजे विश्लेषण से रैंक काउंटरों(चित्र 4बी) केबीच बहुत अधिक सुसंगत थे। निरंतरता तब भी देखी जाती है जब प्रत्येक प्लेट के लिए प्रत्येक छवि के परिणाम औसत(चित्रा 4C)थे। हम स्वीकार करते हैं कि यह प्रोटोकॉल काउंटरों के बीच पूर्ण स्थिरता प्रदान नहीं करता है, लेकिन चित्रा 4ए की तुलना चित्रा 4Cसे करते समय मैनुअल गिनती से यह सुधार है। हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण मैनुअल और फिजी-इमेजजे काउंटिंग(चित्र 4डी)दोनों से भिन्न था।
छवियों में प्रतिबिंब से बचने के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए, एक हाथ के प्रतिबिंब के साथ एक छवि और उसके बाद फिजी-ImageJ विश्लेषण दिखाया गया है (बाएं) एक प्रतिबिंब(दाएं) (चित्रा 5A)के बिना एक ही थाली का विरोध किया । प्लेटों पर गंदे पृष्ठभूमि की सतह या रक्त नमूना अवशेषों से अन्य काले दाग फिजी-इमेजजे विश्लेषण को भी नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं। चित्रा 5B में रक्त प्लेट में केवल 2 मेटास्टैटिक उपनिवेश हैं (सफेद तीर द्वारा विख्यात), लेकिन अंधेरे अवशेषों (काले तीरों द्वारा नोट) के कारण फिजी-इमेजजे ने इसे 31.6% मेटास्टैटिक के रूप में माना। इसलिए, एक साफ, प्रकाश सतह होना और रक्त नमूनों के लिए इस विधि का उपयोग नहीं करना महत्वपूर्ण है क्योंकि रक्त के नमूने आमतौर पर प्लेट पर अवशिष्ट काले धब्बे छोड़ देंगे जो मेटास्टैटिक उपनिवेश नहीं हैं।
चित्रा 1: प्रोटोकॉल योजनाबद्ध। यह प्रोटोकॉल पूरी तरह से 4T1 मॉडल में फेफड़ों के मेटास्टेसिस का विश्लेषण करने पर केंद्रित है। इस प्रोटोकॉल के सामान्य प्रवाह में संस्कृति में 4T1 कोशिकाएं बढ़ना शामिल है, बाएं पेट में 4T1 कोशिकाओं के साथ BALB/c महिला चूहों इंजेक्शन, IACUC और संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों की निगरानी, चूहों का त्याग और फेफड़ों का संग्रह, फेफड़ों के नमूनों से कोशिकाओं का संग्रह, चढ़ाना और 6TG चयन मीडिया में कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग, फिक्सिंग और 5 दिनों के बाद कोशिकाओं धुंधला, प्लेटों की तस्वीरें लेने, और फिजी-ImageJ का उपयोग कर विश्लेषण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2: मैन्युअल रूप से मेटास्टैटिक कोशिकाओं और हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण की गिनती के असंगत परिणाम होते हैं। ए 1:10 कमजोर पड़ने के साथ 12 फेफड़ों की प्लेटों को मैन्युअल रूप से 3 अलग शोधकर्ताओं द्वारा गिना गया था मेटास्टेटिक कालोनियों को उसी तरह गिनने के निर्देश दिए गए थे, हालांकि मॉडल के साथ अनुभव शोधकर्ताओं के बीच विविध । मेटास्टैटिक उपनिवेशों की संख्या शोधकर्ताओं के बीच बहुत विविध गिना । B. हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण की पहचान की और मात्रा निर्धारित व्यक्तिगत ट्यूमर सेल समुच्चय, मेटास्टेस के रूप में वर्गीकृत, एच एंड ई दाग फेफड़ों स्लाइड में मौजूद है । एक प्रतिनिधि स्लाइड की उच्च, मध्यम और कम आवर्धन छवियां दिखाई जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: फिजी-इमेजजे विश्लेषण मेटास्टैटिक बोझ निर्धारित करने में सटीक और सटीक है। A. 12 फेफड़ों की प्लेटों के साथ 1:2 कमजोर पड़ने के साथ 12 फेफड़ों की प्लेटों की 3 अलग छवियों में 3 अलग शोधकर्ताओं द्वारा विश्लेषण किया गया । B. 3 शोधकर्ताओं में से प्रत्येक द्वारा 3 छवियों में से प्रत्येक से परिणाम संयुक्त थे । सी. 3 छवियों से प्रत्येक फेफड़ों की थाली से परिणाम औसत थे । Tukey के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA प्रत्येक फेफड़ों की थाली के लिए काउंटरों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित किया है । डेटा को मतलब + एसडी के रूप में दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4: फिजी-इमेजजे विश्लेषण मैनुअल गिनती और हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण की तुलना में मेटास्टैटिक बोझ की अधिक सुसंगत रैंकिंग प्रदान करता है। A. चित्रा 2 से एक ही फेफड़ों की प्लेटों को चित्रा 2 से मैनुअल गिनती के आधार पर सबसे कम मेटास्टैटिक स्थान पर रखा गया था। B. चित्रा 3 से एक ही 12 फेफड़ों की प्लेटों को सबसे कम मेटास्टैटिक से फिजी-ImageJ विश्लेषण के आधार पर चित्र 3 ए से स्थान दिया गया था । सी चित्रा 3 सी से औसत सबसे कम मेटास्टेटिक स्थान पर थे । डी. फेफड़ों की स्लाइड को हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन के आधार पर सबसे कम मेटास्टैटिक स्थान दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: प्रतिबिंब और गैर-मेटास्टैटिक डार्क स्पॉट परिणामों को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेंगे। A. तस्वीर लेने वाले हाथ के प्रतिबिंब के साथ एक छवि फिजी-इमेज जे विश्लेषण को बाधित करती है, जैसा कि प्रतिबिंब फिजी-इमेजजे विश्लेषण (बाएं) की तुलना सही फिजी-इमेजजे विश्लेषण (दाएं) बी ब्लड प्लेट्स अक्सर प्लेटों पर बचे हुए दाग (काले तीर) को छोड़ देते हैं जो मेटास्टैटिक उपनिवेश (सफेद तीर) नहीं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, प्रत्येक फेफड़ों की प्लेट पर मेटास्टैटिक उपनिवेशों की मैन्युअल रूप से गिनती फेफड़ों के मेटास्टेसिस को निर्धारित करने के लिए एक गलत और सटीक विधि हो सकती है, जो मात्राकरण(चित्र 2)के बेहतर साधनों की आवश्यकता का प्रदर्शन करती है। हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण मैनुअल गिनती और फिजी-इमेजजे विश्लेषण(चित्र 2बी और 4डी)दोनों से थोड़ा भिन्न था, क्योंकि एच एंड ई स्लाइड पूरे अंग का प्रतिनिधि नमूना नहीं हैं। प्रोटोकॉल एक पूरे फेफड़ों की फसल, और इसलिए कुल फेफड़ों मेटास्टेसिस का अधिक प्रतिनिधि है, और मैनुअल गिनती की तुलना में अधिक सुसंगत है। फिजी-इमेजजे विश्लेषण के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोणों का प्रयास किया गया था और नीचे चर्चा की गई थी, लेकिन ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल बेहतर तरीका प्रतीत होता है।
इस अध्ययन के लिए फेफड़े, रक्त और मस्तिष्क के नमूने एकत्र किए गए थे। हालांकि, रक्त और मस्तिष्क के नमूनों में बहुत कम मेटास्टैटिक उपनिवेश थे, यदि कोई हो। हमने निर्धारित किया है कि मैन्युअल रूप से मेटास्टैटिक उपनिवेशों की गिनती इन कम मेटास्टैटिक ऊतकों के लिए इष्टतम है, और इसलिए रक्त और मस्तिष्क डेटा शामिल नहीं थे। जब मेटास्टैटिक बोझ मैन्युअल रूप से गिनती करना आसान होता है (उदाहरण के लिए, हजारों के विपरीत दस या बीस मेटास्टैटिक उपनिवेश), मानव त्रुटि का मूल मुद्दा प्रासंगिक नहीं है, और इसलिए इस प्रोटोकॉल की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, रक्त के नमूने निर्धारण के बाद प्लेटों पर काले धब्बे छोड़ सकते हैं, जो फिजी-इमेजजे विश्लेषण(चित्र 5)में हस्तक्षेप करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इंजेक्शन वाली कोशिकाओं की मात्रा मेटास्टैटिक बोझ को प्रभावित कर सकती है। उदाहरण के लिए, यदि कम कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है और चूहे लंबे समय तक जीवित रह सकते हैं, तो कैंसर के पास मस्तिष्क3,4जैसी पारंपरिक रूप से कम मेटास्टैटिक साइटों में फैलने के लिए अधिक समय है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को अन्य ऊतकों के मेटास्टैटिक बोझ को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है यदि उन्हें अत्यधिक मेटास्टैटिक बनने के लिए समय दिया जाता है। यदि पहली बार 4T1 मॉडल की कोशिश करना या इंजेक्शन की कोशिकाओं की मात्रा को बदलना है, तो हम कोशिकाओं को चढ़ाना करते समय कम से कम दो कमजोर पड़ने की कोशिश करने की सलाह देते हैं। इस अध्ययन के लिए, हम एक 1:2 और 1:10 कमजोर पड़ने का इस्तेमाल किया । 1:2 कमजोर पड़ने को मैन्युअल रूप से गिनना मुश्किल होता, लेकिन फिजी-इमेजजे में आसानी से गिना जाता था। 1:10 कमजोर पड़ने अभी भी मैन्युअल रूप से गिनती करने के लिए मुश्किल था और इसलिए असंगत परिणाम के लिए नेतृत्व किया । विशिष्ट अध्ययन मापदंडों के आधार पर कमजोर करने को संशोधित किया जा सकता है।
तस्वीरें व्यक्तिगत फेफड़ों की प्लेटों और 12 फेफड़ों की प्लेटों के एक साथ लिया गया । व्यक्तिगत प्लेटों का विश्लेषण दो तरीकों से किया गया: या तो फिजी-इमेजजे पर अपलोड करने से पहले प्लेट के एक केंद्रीय वर्ग में छवि को क्रॉप करना, या फिजी-इमेजजे में सर्कल चयन उपकरण का उपयोग करके बिना क्रॉप की गई छवि में प्लेट के केंद्रीय सर्कल का चयन करने के लिए। हमने पाया कि फिजी-इमेजजे में सर्कल चयन उपकरण का उपयोग करके सभी प्लेटों के लिए विश्लेषण के लिए एक समान आकार का क्षेत्र बनाने का सबसे आसान, सबसे सुसंगत तरीका पेश किया। इसके अलावा, एक ही छवि में फेफड़ों की प्लेटों के पूरे संग्रह का विश्लेषण एकल फेफड़ों की प्लेटों की व्यक्तिगत छवियों का विश्लेषण करने के लिए बेहतर था । एक ही छवि में फेफड़ों की प्लेटों के सभी होने के लिए एक ही आकार के सर्कल के लिए अनुमति देता है फेफड़ों की प्लेटों के बीच आसानी से इस्तेमाल किया जाएगा । यह सुनिश्चित करता है कि सभी फेफड़ों की प्लेटें कैमरे से एक ही दूरी हैं और इसलिए विश्लेषण के लिए समान आकार का सर्कल छवि में सभी फेफड़ों की प्लेटों के लिए सही आकार होना चाहिए। यह विश्लेषण को जल्दी बनाता है क्योंकि प्लेटों के बीच सर्कल को फिर से तैयार करना आवश्यक नहीं है। यह बस अपने आकार को बदलने के बिना छवि में अगली प्लेट के लिए घसीटा है, जो एक ही आकार की गारंटी देता है तस्वीर में सभी प्लेटों के लिए प्रयोग किया जाता है । सर्कल के आकार का चयन करते समय, प्लेट के अधिकांश का विश्लेषण करने के लिए इसे काफी बड़ा बनाना महत्वपूर्ण है, जबकि प्लेट के किनारों से पृष्ठभूमि शोर से बचने के लिए पर्याप्त छोटा है। इसके अलावा, अभिकर् स को बचाने के प्रयास में, कोशिकाओं को 6 अच्छी तरह से प्लेटों में भी चढ़ाया गया था और 10 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेटों की तुलना में। 6 अच्छी प्लेटों से फिजी-इमेजजे परिणाम कम सुसंगत थे और 10 सेमी व्यंजन (डेटा नहीं दिखाए गए) से सहसंबंधित नहीं थे। एक स्पष्टीकरण है कि छोटे सतह क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए एक छोटे क्षेत्र प्रदान करता है, जिससे कम प्रतिनिधि डेटा होता है। एक और यह है कि सतह क्षेत्र को कम करने से कोशिकाओं को अधिक तेजी से बढ़ने की अनुमति देता है क्योंकि वे अन्य जीवित कोशिकाओं के करीब होते हैं। इसलिए, हम प्रोटोकॉल में वर्णित के अलावा किसी भी ऊतक संस्कृति अभिकर्णों का उपयोग करने की सलाह नहीं देते हैं।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, प्रतिबिंब से बचना और एक साफ, प्रकाश पृष्ठभूमि इस विधि के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण है। चित्रा 5A दर्शाता है कि फिजी-इमेजजे में एक प्रतिबिंब का विश्लेषण कैसे किया जाता है और इसलिए प्रतिबिंब से बचने के महत्वपूर्ण महत्व को दर्शाता है। के रूप में ऊतक संस्कृति प्लेटें अत्यधिक चिंतनशील हैं, यह एक मामूली कोण पर तस्वीर लेने के लिए या तो अपने आप को तस्वीर लेने या ऊपर प्रकाश स्रोतों से प्रतिबिंब से बचने के लिए फायदेमंद है । विशिष्ट कार्य क्षेत्र की प्रकाश व्यवस्था की स्थिति का हिसाब देने की आवश्यकता होगी। हम प्लेटों की कई तस्वीरें लेने का सुझाव विश्लेषण किया जा करने के लिए, थोड़ा अलग व्यवस्था और/ किसी भी प्रतिबिंब के लिए तीव्रता से चित्रों का अध्ययन करें। यदि विश्लेषण में विसंगतियां हैं, तो यह एक तस्वीर गुणवत्ता के मुद्दे के कारण होने की संभावना है। समस्या निवारण के लिए, सामान्य तस्वीर की तुलना काले और सफेद चित्र से करें। यदि क्षेत्रों है कि सामांय तस्वीर में नीले रंग नहीं कर रहे है काले और सफेद तस्वीर में सफेद के रूप में दिखाई दे रहे हैं, वहां की संभावना एक प्रतिबिंब या धब्बा है कि परिणामों में फेरबदल कर रहा है ।
स्थिरता के अलावा, इस विधि का एक और उल्लेखनीय लाभ यह है कि यह मैनुअल गिनती की तुलना में बहुत अधिक तेजी से डेटा पैदा करता है। मैन्युअल रूप से कई प्लेटों की गिनती बहुत समय लेने वाली है, जबकि फिजी-इमेजजे विश्लेषण जल्दी से किया जा सकता है। यह भी एक कम इनक्यूबेशन समय के लिए अनुमति देता है । पुलस्की और ओस्ट्रैंड-रोसेनबर्ग प्लेटेड कोशिकाओं के लिए 10-14 दिन इनक्यूबेशन अवधि की सलाह देते हैं, जिससे अध्ययन में पर्याप्त समय3 होताहै। 10-14 दिन इनक्यूबेशन अवधि बड़े, आसान-से-गिनती कॉलोनियों को बनाने की अनुमति देती है। हालांकि, कई फेफड़ों की प्लेटें तब से पहले ही कॉन्फ्ल्यूरेंट बन सकती हैं । इसके बजाय, इनक्यूबेशन के 5 दिन गैर-कैंसर कोशिकाओं को मारने के लिए 6TG चयन के लिए पर्याप्त समय देता है (स्वस्थ नियंत्रण चूहों द्वारा साबित उनके फेफड़ों की प्लेटों पर कोई उपनिवेश नहीं है, डेटा नहीं दिखाया गया है), और कोशिकाओं के लिए फिजी-इमेजजे के साथ आसानी से मात्रा निर्धारित करने के लिए पर्याप्त विकसित होना चाहिए। यह चूहों के बलिदान और आवश्यक मेटास्टैटिक डेटा का विश्लेषण करने के बीच का समय काफी कम हो जाता है।
अपनी बात समाप्त करने के लिए, इस विधि के लाभ सीमाओं से कहीं अधिक हैं। हम स्वीकार करते हैं कि यह विधि सही स्थिरता प्रदान नहीं करती है। हालांकि यह कम मेटास्टैटिक ऊतकों के लिए आदर्श विधि नहीं है, उन ऊतकों को आसानी से मैन्युअल रूप से गिना जा सकता है। जबकि प्रतिबिंब के बिना एक तस्वीर हो रही कुछ सावधान फोटोग्राफी की आवश्यकता हो सकती है, इस विधि के साथ प्राप्त स्थिरता महत्वपूर्ण है । यह संभव है कि इस विधि का उपयोग अन्य ऊतकों के लिए किया जा सकता है जो अत्यधिक मेटास्टैटिक और अन्य प्रोटोकॉल हैं जिन्हें दाग दार वस्तुओं की गिनती की आवश्यकता होती है। अध्ययन डिजाइन मेटास्टेसिस की दर या मेटास्टेसिस पर कैंसर विरोधी उपचार के प्रभाव का विश्लेषण करने की भी अनुमति दे सकता है। यह विधि अत्यधिक सुसंगत, विश्वसनीय मेटास्टेसिस डेटा प्रदान करेगी और 4T1 मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण शोधन का प्रतिनिधित्व करेगी। आगामी स्तन कैंसर मेटास्टेसिस अनुसंधान के लिए इस मॉडल के आवेदन स्तन कैंसर मृत्यु दर के खिलाफ लड़ाई के लिए उपकरणों के साथ शोधकर्ताओं को हथियार बनाने में अत्यंत महत्वपूर्ण है ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को वर्जीनिया-मैरीलैंड कॉलेज ऑफ वेटरनरी मेडिसिन (आईए), वर्जीनिया टेक इंस्टीट्यूट फॉर क्रिटिकल टेक्नोलॉजी और एप्लाइड साइंस सेंटर फॉर इंजीनियर हेल्थ (आईए) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ R21EB028429 (आईए) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
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- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
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