Summary
Biz Fiji-ImageJ kullanarak 4T1 meme kanseri modelinde akciğer metastazı ölçmek için daha tutarlı ve hızlı bir yöntem açıklar.
Abstract
Meme kanseri yıkıcı bir malignitedir, sadece 2019 yılında ABD'de 40.000 kadın ölümü ve yeni kadın kanseri teşhislerinin %30'u için hesap. Meme kanserine bağlı ölümlerin önde gelen nedeni metastatik yüktür. Bu nedenle meme kanseri için preklinik modellerin klinik olarak ilgili olması için metastatik yükü analiz etmesi gerekir. 4T1 meme kanseri modeli evre IV insan meme kanseri için kendiliğinden metastaz, ölçülebilir fare modeli sağlar. Ancak, çoğu 4T1 protokolleri doku kültür plakaları üzerinde el ile lekeli koloniler sayarak metastatik yükü ölçmek. Bu düşük metastatik yüke sahip dokular için yeterli olmakla birlikte, manuel sayma insan hatası plakalar confluent ve saymak zor olduğunda tutarsız ve değişken sonuçlara neden olur. Bu yöntem, insan sayma hatasına bilgisayar tabanlı bir çözüm sunar. Burada protokolü 4T1 modelinde yüksek metastatik bir doku olan akciğer kullanılarak değerlendiriyoruz. Metilen mavisi lekeli plakaların görüntüleri elde edilir ve Fiji-ImageJ analiz için yüklenir. Fiji-ImageJ daha sonra mavi olan görüntünün seçili alanının yüzdesini belirler ve plakanın metastatik yüke sahip yüzdesini temsil eder. Bu bilgisayar tabanlı yaklaşım, yüksek metastatik dokular için manuel sayma veya histopatolojik değerlendirmeden daha tutarlı ve hızlı sonuçlar sunar. Fiji-ImageJ sonuçlarının tutarlılığı görüntünün kalitesine bağlıdır. Görüntüler arasında sonuçlarda küçük farklılıklar oluşabilir, bu nedenle birden çok görüntü alınması ve sonuçların ortalaması önerilir. En az sınırlamalara rağmen, bu yöntem tutarlı ve hızlı sonuçlar sunarak akciğerdeki metastatik yükü ölçmek için bir gelişmedir.
Introduction
Sekiz kadından biri hayatı boyunca meme kanseri tanısı olacak, ve henüz birden fazla tedavi seçenekleri meme kanseri rağmen Amerikan kadınlarda kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedenidir1. Bu kadınlar memelerindeki primer tümörden ölmüyorlar. Bunun yerine, metastatik yük yaygın akciğer, kemik, beyin, karaciğer ve lenf düğümleri2yayılır gibi bu hastalığın mortalite sorumludur. Bu nedenle, meme kanseri modelleri bu hastalığın mortalitesini azaltmaya katkıda bulunmak için metastazı değerlendirmek gerekir. 4T1 murine meme kanseri modeli bunu başarmak için mükemmel bir protokoldür. Burada açıklanan yöntem, akciğer metastazı ölçmek için Fiji-ImageJ kullanarak 4T1 modeline bir iyileştirme sunarak, tutarlı ve hızlı sonuçlar üretir.
4T1 modeli iyi kurulmuş, bu pulaski ve Ostrand-Rosenberg tarafından açıklanan gibi protokolleri kullanarak en laboratuvarları ile 20013. 4T1 hücre hattı 6-Tiyoguanin (6TG) dirençli ve evre IV temsilcisi, üçlü negatif meme kanseri3,4,5. Bir ortotopik model olduğu gibi klinik olarak ilgilidir ve insan meme kanseri ile aynı organlara kendiliğinden metastaz3,4. 4T1 hücreleri kendiliğinden enjekte edilen hücrelerin miktarına göre öngörülebilir bir oranda metastaz3,4. Daha da önemlisi, burada kullanılan fareler arasındaki genetik farklılıklar metastatik yükte beklenen kişiler arası değişkenliğe neden oldu. Metastazı değerlendirmek için, dokular 6TG seçimi ve metilen mavisi boyama kullanarak uzak bölgelerdeki kanser hücrelerini toplamak ve ölçmek için hasat edilir. Sonuç metastatik kolonileri temsil eden mavi noktalı doku kültürü plakaları topluluğudur. Ancak Pulaski ve Ostrand-Rosenberg protokolü metastatik kolonileri elle sayarak ölçer ve bu nedenle bu modelde metastazı değerlendirmenin standart yolu olmuştur. Bu düşük metastatik yüke sahip dokular için kolay olsa da, akciğerler gibi dokular genellikle metastaz ile yüklü. Akciğer plakaları son derece etkili olabileceğiiçin, metastatik kolonileri manuel sayma ile doğru ve hassas bir şekilde ölçmek zordur ve insan hatasına yatkındır. Metastatik yükü daha iyi ölçmek için, insan sayma hatasına bilgisayar tabanlı bir çözüm için Fiji-ImageJ'i kullanmayı tanımlıyoruz. Hematoksilin ve eozin ile histopatolojik analiz (H & E) boyama akciğer metastazları ölçmek için başka bir araçtır, ve ilginç de Fiji-ImageJ yazılımı ile geliştirilmiştir6,7. Ancak histopatolojik analizler akciğerin tek bir dilimini gözlemlediği için yanlış ve temsiledilemez olabilir. Bunun nedeni, 4T1 modelinin organ boyunca eşit olarak dağıtılmamış çeşitli metastatik lezyonlara neden olmasıdır. Histopatolojik analiz ile manuel sayma arasındaki genel eğilimlerbenzer8 olmakla birlikte, bireysel değerler farklılık gösterir ve bu nedenle histopatolojik analiz tek nicelik aracı olarak kullanılmamalıdır. Fiji-ImageJ kullanmanın tutarlılığını gösterirken, histopatolojik analizve farklı sayaçlar arasındaki manuel sayma tutarsızlıklarına göre faydayı gösteriyoruz. Ayrıca, bu yöntemin kuluçka süresini 10-14 günden 5 güne düşürebileceğini gösteriyoruz, bu da araştırmacıların el ile sayıma güvendiğinizde çalışmalarında elde ettikleri verileri analiz edebildiği anlamına geliyor.
Bu yöntem Pulaski ve Ostrand-Rosenberg protokolü3basit ayarlamalar bir koleksiyondur. 4T1 modeli yaygın olarak kullanıldığından ve akciğer metastazı klinik öncesi modellerde ölçülecek kritik bir parametre olduğu için, bu yöntemin yaygın olarak kullanılabileceğine ve meme kanseri araştırmacıları için son derece değerli olduğuna inanıyoruz. Gerekli sadece ek malzemeleri bir kamera ve Fiji-ImageJ, ücretsiz bir yazılım görüntü analizi9sık kullanılan bir bilgisayara erişim vardır. Bu yöntem özellikle akciğer metastazı üzerinde duruluyor, ancak önemli metastatik yükü olan diğer dokular için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Virginia Tech Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Rehberi uyarınca. Bu protokolün gerçekleştirilmesi için ilgili kurumlardan izin ve tüm uygun kurallara uyulması gerekir.
1. Hücre Kültürü
- Tam kültür ortamı (RPMI + 10% Fetal Sığır Serumu +% 1 Pen Strep) olun. ATCC Protokol10'a göre 4T1 hücrelerini canlandırın vet-25 şişesinde 37 °C ve %5 CO 2'de konfluent olana kadar kuluçkaya yatırın. Ölü hücreleri kaldırmak için yeniden canlandıktan sonraki gün ortamı değiştirin ve hücreler geçebilecek kadar yoğun olmadan önce ortam harcanıyorsa tekrar.
- T-25 şişesi konfluent olduktan sonra, hücreleri t-75 şişesine aktarak, 5 mL 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) ile yıkayarak ve 500 μL Trypsin-EDTA ekleyerek bir T-75 şişesine geçiş. Hücreler ayrışana kadar 37 °C'de 5-10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Ayrıldıktan sonra hücrelere 5 mL ısıtılmış tam kültür ortamı ekleyin. 5 mL'yi 15 mL'lik ısıtmalı tam kültür ortamı içeren bir T-75 şişesine aspire edin ve aktarın.
- T-75 şişelerinde en az dört kez geçiş hücreleri. Şişe 8 mL 1x DPBS ile yıkandıktan sonra, hücreleri ayırmak için 1 mL Trypsin-EDTA ekleyerek, hücrelere 10 mL ısıtılmış ortam ekleyerek ve 1:6-1:8'i 20 mL ısıtılmış tam kültür ortamı içeren yeni bir T-75 şişesine seyrelterek yapın.
- Enjekte edilecek fare sayısı için 40 mL ısıtılmış tam kültür ortamı içeren uygun sayıda T-150 şişesine kadar geçiş hücreleri. Çoğu çalışma enjeksiyon için yeterli hücreleri sağlamak için birden fazla T-150 şişeleri gerektirir.
- Fareler enjekte edilmeye hazır olduğunda (IACUC veya kurumsal protokollere bağlı olarak 8 haftalık veya 20 g'ın üzerinde ağırlık), ortam atarak, her şişeyi 1x DPBS'nin 10 mL'si ile yıkayarak ve 2 mL tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri hasat edin. Hücreler ayrışana kadar 37 °C'de 5-10 dakika kuluçkaya yatırın.
- 10 mL tam ortam ile şişeyi yıkayın ve tüm içeriği (10 mL ortam + 2 mL tripsin-EDTA hücre karışımı) bir sonraki şişeye aktarın. Aşırı miktarda ortam kullanmaktan kaçınmak için aynı 10 mL'lik ortam kullanarak her şişeden hücreleri yıkamaya ve toplamaya devam edin.
- Tüm şişeler toplandıktan sonra, içindekileri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Mikrosantrifüj tüpünde saymak için 10 μL numune alın ve 50 mL konik tüpü 125 x g'de 5 dakika santrifüj edin.
- Hücreler santrifüj edilirken, 10 μL'lik hücre örneğine 10 μL Trypan mavisi ekleyin. Hemositometre kullanarak hücreleri say. Toplam hücre sayısı belirlendikten sonra fare başına 1,2 x 106 hücre (100°L başına) için fare enjekte etmek için gereken hücrelerin konsantrasyonu hesaplayın.
- Santrifüjden sonra, 100 μL'de 1,2 x 106 hücre için steril 1x DPBS'nin doğru miktarda decant media ve resuspend hücre peleti. Hücre/DPBS karışımını, enjeksiyon için hücreleri azarlarken şırınga ile kolay erişim için mikrosantrifüj tüplere bölün. Hücreleri buzüzerinde tutun ve kısa bir süre sonra enjekte gibi hücreler uzun süre buz üzerinde olduktan sonra ölmeye başlayacaktır.
2. Enjeksiyonlar
- Hücreleri tekrar askıya almak için mikrosantrifüj tüpüne dokunarak veya hafifçe karıştırarak hücreleri enjeksiyoniçin hazırlayın ve 600 μL'yi 1 mL şırıngaya aspire edin. Şırıngayı yukarı doğru çevirin ve hücreleri şırınga açılışından uzaklaştırmak için pistonu aşağı çekin. Hava kabarcıkları kurtulmak için şırınga dokunun.
- İğneyi yukarı takın ve hücreleri şırıngada sadece 500°L kalana kadar mikrosantrifüj tüpüne geri dağıtın. Şırıngayı buza düz koy.
NOT: 4T1 hücreleri süspansiyondan hızla düşer. Bu nedenle, sık sık dokunarak hücreleri süspansiyon geri karıştırmak önemlidir. - Anestezi 8 haftalık/>20 g dişi BALB/c fare isofluran veya diğer onaylı anestezik ajan kullanarak. Anestezinin derinliğini değerlendirmek için farenin nefesini izleyin.
- Fare kornea reflekseksikliği ile belirtildiği gibi düzgün anestezi sonra, sırtına fare yerleştirin. Başparmağı, işaretçiyi ve orta parmağı nızı kullanarak fareyi hafifçe basılı tutun. Farenin üst gövdesini ve başparmağını arka sol bacağı için tutmak için işaretçiyi ve orta parmakları kullanın. Nazik ama sert ol.
- İğnenin dik meçlesiyle, farenin sol karın meme yağ yastığına deri altı olarak 100°L hücre enjekte edin. İyi bir kanama ve herhangi bir sızıntı için monitör ve fare uyanır ve enjeksiyondan sonra kolayca hareket emin olun.
- İğneleri her fare arasında değiştirin.
NOT: İğnenin periton boşluğuna girmesine izin vermeyin. Bu kanser hızlı bir şekilde yayılmasına neden olur ve modeli temsil değil. Deri altı enjeksiyonu sağlamak için, sol karın meme yağ yastığına yerleştirildiğinde iğneyi hafifçe yukarı doğru çekin. İğne kolayca yukarı kaldırılırsa, deri altına doğru şekilde konumlandırılır.
- İğneleri her fare arasında değiştirin.
3. İzleme
- Monitör fareler en az 3 kez haftada kilo, vücut durum skoru, tümör boyutu, tümör durumu, solunum, aktivite düzeyi, görünüm ve hareket için. Tümör çapı 0.7-0.8 cm ulaştığında, günlük izlemeye başlar.
- Tümör boyutu 1.5 cm'ye ulaştığında veya kilo kaybı %20'ye ulaştığında veya vücut durumu skorunda, tümör durumunda, solunumda, aktivite düzeyine, görünüme veya harekette ciddi klinik düşüşler kurumsal kılavuza göre gözlendiğinde ötanaziyi göz önünde bulundurun.
NOT: Tümör boyut arttıkça vücut ağırlığı arttıkça vücut durumu skorunun izlenmesi için çok önemlidir, hastalık yüküne bağlı vücut durumu kaybı olumsuzdur. Tam izleme protokolleri onaylanmış IACUC veya kurumsal protokollere bağlıdır.
- Tümör boyutu 1.5 cm'ye ulaştığında veya kilo kaybı %20'ye ulaştığında veya vücut durumu skorunda, tümör durumunda, solunumda, aktivite düzeyine, görünüme veya harekette ciddi klinik düşüşler kurumsal kılavuza göre gözlendiğinde ötanaziyi göz önünde bulundurun.
4. Nekropsi
- Kurumsal yönergeleri izleyerek CO2 kullanarak fare ötenazi.
- Dezenfekte etmek için% 70 etanol ile sprey fare. Vücut boşluğu ortaya çıkarmak için farenin ventral orta hattı kadar bir kesi yapın.
- Böbreği çıkar. Diyafram görünür olana kadar orta hattı kesmeye devam edin. Akciğerleri söndürmek için diyafram ı delmek için makas kullanın. Kaviteye daha iyi erişim sağlamak için diyaframı kırpın.
- Göğüs kafesinin merkezini kesmek için künt makas kullanın. Akciğerve kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini geri sıkıştır.
- Brördün alındığı karın boşluğunda biraraya gelene kadar kalbin apex içine bir iğne takarak steril olmayan 1x DPBS 2 mL ile kalp perfuse.
- Kalp ve akciğerleri çıkarmak için, yemek borusu ve doğrudan kalp üzerinde trakea kesmek için künt makas kullanın. Forceps kullanarak, vücuttan uzak kalp çekmeye başlar ve bağlı tutmak herhangi bir bağ dokusu kesip. Akciğerler kalple birlikte çıkacak.
- Çok loblu (sağ) ve tek lokul (sol) akciğerleri tanımlayın. Referans için kalbi bağlı tutun, ama akciğerler tespit edildikten sonra, kalbi kes.
- Her kuyuda 1x Hank'in Dengeli Tuzlu Solüsyonu (HBSS) içeren 12 kuyuluk plakayı etiketlayın. Her farenin 2 kuyuya ihtiyacı vardır. Metastaz değerlendirmesi için çok loblu (sağ) akciğeri 12 kuyu plakası içinde yerleştirin ve buzüzerinde tutun. Şimdilik komşuyu boş tut.
NOT: Her numunenin boyutuna yakın olduğundan emin olmak için her fareden aynı akciğeri (çok loblu) kullanmak önemlidir. Tek loblu akciğer daha sonra histopatoloji gibi diğer analizler için kullanılabilir.
NOT: Numuneler buzda veya 4 °C'de birkaç saat stabildir.
5. İşleme Dokuları
NOT: Bu bölümdeki tüm adımlar steril teknik kullanılarak yapılmalıdır.
- Fare başına etiket 1 15 mL konik tüp ve her tüpe tip IV kollajenaz karışımıve 30 birim elastaz ekleyin. Tip IV kollajenaz karışımı yapmak için, mL 1x HBSS ve steril filtre başına tip IV kollajenaz 2 mg çözünür. Bu da -20 °C'de 12 aya kadar saklanabilir ve gerektiğinde çözülebilir.
- Akciğeri ikinciye aktarın, bu örnek için 1x HBSS'yi temizleyin. Kalan kanı çıkarmak için forceps kullanarak girdap. Temiz akciğeri boş 3,5 cm doku kültür plakasına aktarın. Makasla kıyma ciğeri. 2,5 mL 1x HBSS ile durulayın, 1x HBSS ve akciğer parçalarını kollajenaz/elastaz kokteyli (toplam 5 mL) içeren 15 mL konik tüpe aktarın.
- 4 °C'de 75 dakika kuluçkaya yatırın. Bu süre içinde örnekleri karıştırmaya devam edin, bu nedenle tüpleri bir rocker veya dönen tekerüzerine yerleştirin. Bu kuluçka adımı nda, her fare için 50 mL santrifüj tüpü ve 10 cm doku kültür plakası etiketlendi. Bir seyreltme yapıyorsanız, seyreltmeler için yeterli 10 cm doku kültür plakaları etiket.
NOT: Doku kültür plakalarının kapağını etiketlayın. Plakanın kendisini etiketlemevarsa, yazı Fiji-ImageJ analizini bozar. - 1x HBSS ile her tüpün hacmini toplam 10 mL'ye kadar getirin. Her numune için 50 mL konik tüpiçine 70 m hücreli süzgeç üzerine içindekileri dökün. Daha fazla hücrenin filtrelemesine izin vermek için numuneyi süzgeçten hafifçe öğütmek için 1 mL'lik şırınganın pistonu kullanın.
- Oda sıcaklığında 350 x g'de (RT) 5 dakika santrifüj. 1x HBSS 10 mL ile supernatant atın ve yıkama pelet. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
- RPMI veya IMDM olmak üzere 60 μM 6TG tam kültür medyasının 10 mL'lik kısmını yeniden askıya alın. Plaka örnekleri istenirse seyreltme şeması kullanılarak 10 cm hücre kültür plakaları. 37 °C'de, %5 CO2'de 5 gün kuluçkaya yatırın.
NOT: 1:2, 1:10 ve 1:100, çalışma parametrelerine göre ampirik olarak belirlenmesi gereken yaygın seyreltmelerdir.
DİkKAT: 6TG zehirlidir. Kullanım yaparken dikkatli olun ve bertaraf için tüm Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine uyun.
6. Boyama plakaları
- Uygun atık konteyner içine plakalar kapalı kültür medya dökün. Plaka başına 5 mL seyreltilmemiş metanol ekleyerek hücreleri düzeltin ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın, metanolün tamamını kapsaymasını sağlayacak şekilde döndürün.
DİkKAT: Metanol yutulduğunda, solunduğunda veya ciltüzerindeyse tehlikelidir. Bu adım için bir duman başlık kullanın. - Uygun atık konteyner içine plakalar kapalı metanol dökün. Plaka başına 5 mL distile su ile durulayın ve uygun atık kabına su dökün. Plaka başına %0,03 metilen mavisi 5 mL ekleyin ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın, metilen mavisi çözeltisini tüm plakayı kapsamasını sağlayacak şekilde döndürün.
- Uygun atık kabına metilen mavisi dökün. Plaka başına 5 mL distile su ile tekrar durulayın. Plakaları ters çevirin ve fazla sıvıyı çıkarmak için kağıt havluya karşı lekeleyin. Plakayı kapağına yerleştirin ve havanın bir gecede RT'de kurumasına izin verin.
NOT: Metastatik koloniler mavi olacaktır. Tabaklar kurutulduktan sonra RT'de süresiz olarak saklanabilir.
7. Görüntü analizi
- Plakalardan etiketlenmiş kapakları çıkarın ve numunelerin net bir şekilde tanımlanmasını sağlamaya özen inin. Tüm lekeli akciğer plakalarını temiz ve açık bir yüzeye dizin ve tüm plakaların fotoğrafını tek bir görüntüde alın.
- Plakalar çok yansıtıcı olduğu için yansımaları en aza indirmek için emin olun, iyi aydınlatılmış bir alanda plakakoleksiyonu bir resim çekmek. Plakalardaki yansımalar görüntü analizini etkileyecektir ve bu nedenle kaçınılması gerekir.
NOT: Fiji-ImageJ 2 gigapixels bir üst sınırı vardır. En modern akıllı telefonlar yeterli kameralar olacak. 8 megapikselden daha az bir kamera kullanmayın. Bu deneyde kullanılan kamera, Google Pixel 2'de 12.2 megapiksel olarak kullanıldı. - Görüntüyü plakaları içerecek şekilde kırpın, ancak kapakları veya görüntünün arka planındaki herhangi bir şeyi hariç tonuyla kapatın. Kırpılan görüntüyü Fiji-ImageJ'e yükleyin.
- Aşağıdaki komutları kullanarak görüntüyü siyah beyazolarak değiştirin: Resim, Ayarla, Renk Eşiği, Eşik yöntemi: Varsayılan, Eşik rengi: B&W, Eşik alanı: Lab. Koyu arka plan kutusunu seçil. Görüntü şimdi siyah ve beyaz olmalıdır. Siyah ışık arka planı temsil eder ve beyaz mavi metastatik kolonileri temsil eder.
- Fiji-ImageJ araç çubuğundaki Circle aracını kullanarak çözümlenecek alanı seçin. Her plakanın aynı büyüklükteki alan için analiz edildiğinden emin olmak için tüm plakalar için kullanılacak bir daire çizin. Plakaların kenarında görünen arka plan gürültüsünü en aza indirirken plakalar üzerinde analiz edilen alanı en üst düzeye çıkaran bir boyut seçin. Çizildikçe boyut araç çubuğunda görünür, bu nedenle daire çizilirken yüksekliği ve genişliği izleyerek mükemmel bir daire yapmak mümkündür.
- Mavi metastatik kolonilere sahip plakanın alanını temsil eden alanın yüzde kaçının beyaz olduğunu belirlemek için seçili daireyi analiz edin. Aşağıdaki komutları kullanın:
Analiz Et, Parçacıkları Analiz Et, Boyut (piksel2):0-Sonsuzluk, Dairesellik: 0.00-1.00, Göster: Hiçbir şey ve Özetle kutusunu işaretleyin. Tamam vur. - % Alan sonucunu kaydedin. Bu, beyaz olan seçili alanın yüzdesidir ve bu nedenle metastatik yükü temsil eder.
NOT: Sonuçları Fiji-ImageJ'de kaydetmeli veya tüm sonuçlar sayfasını ayrı bir belgeye kopyalamak/yapıştırmak önerilir. % Alan sonuçları beklenmeyen veya şüpheliyse, diğer ölçümlerden herhangi birinin de şüpheli olup olmadığını veya % Alanının yanlış kaydedilip kaydedildiğini görmek mümkündür. - Daireyi, ortasında yakalayarak boyutunu değiştirmeden resimdeki bir sonraki plakaya taşıyın. Resimdeki tüm plakalar için 7.6 ve 7 adımlarını tekrarlayın.
- En az iki görüntü de 7.1 – 7.8 adımlarını tekrarlayın. Tüm plakalar ve görüntüler analiz edildikten sonra, resimler arasındaki tutarsızlıkları azaltmak için her plaka için farklı görüntüler arasındaki % Alan sonuçlarının ortalaması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem Pulaski ve Ostrand-Rosenberg 4T1 protokol3'ten basit ayarlamalar içerir ve Şekil 1'degörselleştirilebilir. 3 ayrı araştırmacı 12 akciğer plakası (1:10 seyreltme) için metastatik kolonileri elle saydıklarında, sonuçlar farklı sayaçlar arasında çok tutarsızdı(Şekil 2A). Tüm araştırmacılar "mavi nokta olarak görünen metastatik kolonileri saymak" için yönlendirildi, ancak tutarsızlıklar el ile yüksek metastatik plakalar sayma ile sorunu göstermektedir. Araştırmacılar 4T1 modeli ile deneyim değişen düzeylerde vardı. Kurul sertifikalı veteriner patolog, Fiji-ImageJ akciğer plaka analizi(Şekil 2B)ile karşılaştırmak için başka bir yöntem olarak metastaz için H&E lekeli akciğer slaytlarını analiz etti.
Fiji-ImageJ analizini kullanarak, 3 ayrı araştırmacı 12 plaka (1:2 seyreltme) koleksiyonunun 3 ayrı görüntüsünü analiz etti. Görüntüler biraz farklı aydınlatma ile iki ayrı laboratuvar alanlarda alınmıştır. Plakaların düzenlenmesi veya resmin çekildiği açı her görüntü arasında farklıydı. Manuel sayma sonuçlarının aksine, Fiji-ImageJ sonuçları 3 görüntünün her biri için sayaçlar arasında tutarlıydı(Şekil 3A). 3 görüntü arasında tutarsızlık olup olmadığını belirlemek için, 3 görüntü ve 3 sayaçtan elde edilen sonuçlar akciğer plakası başına birleştirilmiştir(Şekil 3B). Bazı plakalar için görüntüler arasında farklılıklar vardır, ancak genel eğilimler benzer dir ve manuel saymaktan daha fazla tutarlılık sunar. 3 farklı görüntü arasındaki değişimleri hesaba katmak için, her görüntüden elde edilen sonuçlar her bir plaka için ortalama olarak hesaplandı(Şekil 3C). Bu ortalamalar, metastatik yükü doğru ve tam olarak analiz eden sayaçlar arasında tutarlı sonuçlar sağlamıştır. Bu nedenle, bu protokol, farklı açılardan veya biraz farklı ışık ayarlarında, farklı düzenlemelerde plaka koleksiyonunun en az 3 görüntüsünü niçin aldığını ve ardından sonuçları analiz edip ortalamasını almayı önerir. Şekil 2A ile Şekil 3Ckarşılaştırıldığında manuel sayma ve Fiji-ImageJ analizi arasındaki kontrast görselleştirilir.
Bu protokol tarafından sunulan iyileştirmeleri göstermenin bir diğer yolu da, şekil 2 ve Şekil 3'tekisayımlara göre plakaların sayaçlar arasındaki en düşük metastatik yükten en az metastatik yüke doğru sıralamasını karşılaştırmaktır. Manuel sayma en uyumlu plaka üzerinde anlaştılar, ancak aşağıdaki tüm rütbeler sayaçlar arasında tutarsızdı (Şekil 4A). Buna karşılık, her görüntü için Fiji-ImageJ analizinden safları sayaçları arasında çok daha tutarlı idi (Şekil 4B). Tutarlılık, her bir plaka için her görüntüden elde edilen sonuçların ortalaması olduğunda da görülür(Şekil 4C). Bu protokolün sayaçlar arasında tam bir tutarlılık sunmadığını kabul ediyoruz, ancak Şekil 4A ile Şekil 4C'yikarşılaştırırken manuel sayma da bir gelişmedir. Histopatolojik analiz, hem manuel hem de Fiji-ImageJ sayımından farklıydı (Şekil 4D).
Görüntülerde yansımaları kaçınarak önemini göstermek için, bir el yansıması ve sonraki Fiji-ImageJ analizi ile bir görüntü gösterilir (solda) bir yansıma olmadan aynı plaka karşı (sağ)(Şekil 5A). Kirli bir arka plan yüzeyinden gelen diğer koyu lekeler veya plakalar üzerindeki kan örneği kalıntısı Fiji-ImageJ analizini de olumsuz etkileyebilir. Şekil 5B'deki kan plakasında sadece 2 metastatik koloni (beyaz oklarla belirtilmiştir) vardır, ancak koyu kalıntı (siyah oklarla belirtilmiştir) Fiji-ImageJ'in bunu %31.6 metastatik olarak kabul etmesini neden etmiştir. Bu nedenle, temiz, açık bir yüzeye sahip olmak ve kan örnekleri genellikle metastatik koloniler olmayan plaka üzerinde artık koyu lekeler bırakacaktır gibi kan örnekleri için bu yöntemi kullanmamak önemlidir.
Şekil 1: Protokol Şeması. Bu protokol sadece 4T1 modelinde akciğer metastazıanaliz odaklanır. Bu protokolün genel akışı kültürde 4T1 hücrelerinin büyümesini, BALB/c dişi farelere sol karın meme yağ yastığında 4T1 hücreleri enjekte etmeyi, Fareleri IACUC ve kurumsal protokollere göre izlemeyi, fareleri kurban etmeyi ve akciğeri toplamayı, akciğer örneklerinden hücreleri toplamayı, 6TG seçim medyasında hücreleri kaplamayı ve kuluçkaya yatırmayı, 5 gün sonra hücreleri sabitlemeyi ve boyamayı, plakaların fotoğraflarını çekmeyi ve Fiji'yi kullanarak Görüntü'ü analiz etmeyi içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Metastatik hücrelerin elle sayma ve histopatolojik analizlerinin tutarsız sonuçları vardır. A. 1:10 seyreltme ile 12 akciğer plakaları elle 3 ayrı araştırmacılar tarafından aynı şekilde metastatik koloniler saymak için talimat olarak sayılır, model ile deneyim araştırmacılar arasında farklılık olsa da. Sayılan metastatik kolonilerin sayısı araştırmacılar arasında büyük ölçüde farklılık gösterir. B. Histopatolojik analiz, H&E lekeli akciğer slaytlarında bulunan metastaz olarak sınıflandırılan bireysel tümör hücre agregalarını saptandırıp ölçüldü. Bir temsilci slaydının yüksek, orta ve düşük büyütme görüntüleri gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fiji-ImageJ analizi metastatik yükün belirlenmesinde doğru ve kesindir. A. 1:2 seyreltme ile 12 akciğer plakası 12 akciğer plakası 3 ayrı görüntüleri 3 ayrı araştırmacılar tarafından analiz edildi. B. 3 araştırmacının her biri tarafından 3 görüntünün her birinin sonuçları birleştirildi. C. 3 görüntüden her akciğer plakasının sonuçları ortalama olarak açıklandı. Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA, her akciğer plakası için sayaçlar arasında anlamlı bir fark saptamaz. Veriler ortalama + SD olarak gösterilir.
Şekil 4: Fiji-ImageJ analizi, manuel sayma ve histopatolojik analize göre metastatik yükün daha tutarlı bir sıralamasını sağlar. Bir. Şekil 2'deki aynı akciğer plakaları Şekil 2'deki manuel sayımlara göre en çok metastatikten en az metastatik olarak sıralanmıştır. B. Şekil 3'teki aynı 12 akciğer plakası, Şekil 3A'daki Fiji-ImageJ analizine göre en fazla metastatikten en az metastatik olarak sıralanmıştır. D. Akciğer kaymaları histopatolojik değerlendirmeye göre en az metastatik ten en az metastatik olarak sıralandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yansımalar ve metastatik olmayan koyu lekeler sonuçları olumsuz yönde etkileyecektir. Bir. Resmi çeken bir elin yansıması olan bir görüntü, fiji-ImageJ analizini (solda) doğru Fiji-ImageJ analiziyle (sağda) karşılaştırırken gösterildiği gibi, metastatik koloniler (beyaz oklar) olmayan plakalarda genellikle artık lekeler (siyah oklar) bırakır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gösterildiği gibi, her akciğer plakasındaki metastatik kolonilerin elle sayılması, akciğer metastazının ölçülmesi için yanlış ve kesin olmayan bir yöntem olabilir ve daha iyi bir nicelleştirme aracına ihtiyaç duyulduğunu gösterir(Şekil 2). Histopatolojik analiz, h&e slaytları tüm organın temsili bir örneği olmadığı için hem manuel sayma hem de Fiji-ImageJ analizinden(Şekil 2B ve 4D)biraz farklıydı. Protokol tüm bir akciğer hasat, ve bu nedenle toplam akciğer metastazı daha temsilcisi, ve manuel sayma daha tutarlıdır. Fiji-ImageJ analizine çeşitli farklı yaklaşımlar denenmiş ve aşağıda tartışılmıştır, ancak yukarıda özetlenen protokol üstün bir yöntem gibi görünmaktadır.
Bu çalışma için akciğer, kan ve beyin örnekleri alındı. Ancak, kan ve beyin örnekleri çok az metastatik koloniler vardı, eğer varsa. Metastatik kolonilerin elle saymanın bu daha az metastatik dokular için en uygun olduğunu belirledik ve bu nedenle kan ve beyin verileri dahil edilmedi. Metastatik yükün elle sayması kolay olduğunda (örneğin, binlercesinin aksine on veya yirmi metastatik koloni), insan hatası nın asıl konusu önemli değildir ve bu nedenle bu protokole gerek yoktur. Ayrıca, kan örnekleri fiksasyon sonrası plakalar üzerinde koyu lekeler bırakabilir, hangi Fiji-ImageJ analizi ile müdahale(Şekil 5). Daha da önemlisi, enjekte edilen hücrelerin miktarı metastatik yükü etkileyebilir. Örneğin, daha az hücre enjekte edilir ve fareler daha uzun süre hayatta kalabilir, kanser beyin gibi geleneksel olarak daha az metastatik sitelere yaymak için daha fazla zamana sahiptir3,4. Bu nedenle, bu protokol, yüksek-metastatik olmak için zaman verilirse diğer dokuların metastatik yükünü içerecek şekilde değiştirilebilir. 4T1 modelini ilk kez deniyorsanız veya enjekte edilen hücrelerin miktarını değiştiriyorsanız, hücreleri kaplamayaparken en az iki seyreltme denemenizi öneririz. Bu çalışma için, bir 1:2 ve 1:10 seyreltme kullanılır. 1:2 seyreltme elle saymak zor olurdu, ama Fiji-ImageJ kolayca sayılır. 1:10 seyreltme hala elle saymak zordu ve bu nedenle tutarsız sonuçlara yol açtı. Seyreltmeler özel çalışma parametrelerine göre değiştirilebilir.
Tek tek akciğer plakaları ve 12 akciğer plakasının birlikte çekilmiş fotoğrafları. Tek tek plakalar iki şekilde analiz edildi: Fiji-ImageJ'e yüklemeden önce görüntüyü plakanın merkezi bir karesine kırpmak veya plakanın kırpılmamış görüntüsündeki merkezi daireyi seçmek için Fiji-ImageJ'deki daire seçim aracını kullanmak. Fiji-ImageJ'deki daire seçim aracını kullanarak tüm plakalar için analiz için aynı boyutta bir alan oluşturmanın en kolay ve tutarlı yolunu sunduğunu bulduk. Ayrıca, aynı görüntüde akciğer plakaları tüm toplama analiz tek akciğer plakaları bireysel görüntüleri analiz üstündü. Tüm akciğer plakalarının aynı görüntüde olması, aynı boyuttaki dairenin akciğer plakaları arasında kolayca kullanılmasını sağlar. Tüm akciğer plakalarının kameradan aynı mesafede olmasını sağlar ve bu nedenle analiz için aynı büyüklükteki daire görüntüdeki tüm akciğer plakaları için doğru boyutta olmalıdır. Ayrıca daire plakalar arasında gerekli değildir yeniden çizim olarak analiz daha hızlı hale getirir. Sadece resimdeki tüm plakalar için aynı boyutu garanti boyutunu değiştirmeden görüntüde bir sonraki plakaya sürüklenir. Dairenin boyutunu seçerken, plakanın kenarlarından arka plan gürültüsünü önlemek için yeterince küçükken plakanın çoğunluğunu analiz edecek kadar büyük olması önemlidir. Ayrıca, reaktifleri kurtarmak amacıyla hücreler de 6 kuyu plakası içine kaplandı ve 10 cm doku kültür plakaları ile karşılaştırıldı. 6 kuyu plakaları Fiji-ImageJ sonuçları daha az tutarlı ve 10 cm yemekleri (veri gösterilmez) ile ilişkili değildi. Bir açıklama küçük yüzey alanı daha az temsili veri yol, analiz etmek için daha küçük bir alan sağlar. Başka bir yüzey alanı azaltarak hücrelerin diğer hayatta kalan hücrelere daha yakın olarak daha hızlı büyümesini sağlar. Bu nedenle, protokolde açıklananlar dışında herhangi bir doku kültürü reaktifi kullanılmasını önermiyoruz.
Daha önce de belirtildiği gibi, yansımaları kaçınarak ve temiz, hafif arka plan olması kesinlikle bu yöntem için önemlidir. Şekil 5A, Fiji-ImageJ'de bir yansımanın nasıl analiz edildiğini gösterir ve bu nedenle yansımalardan kaçınmanın kritik önemini gösterir. Doku kültürü plakaları son derece yansıtıcı olduğundan, ya kendiniz in resim çekerken ya da yukarıdaki ışık kaynaklarından yansımaları önlemek için hafif bir açıyla resim çekmek için yararlıdır. Belirli çalışma alanının aydınlatma koşullarının hesaba katılması gerekir. İncelenecek plakaların birden fazla fotoğrafını çekmenizi, iyi aydınlatılmış bir alanda biraz farklı düzenlemeler ve/veya açıları denemenizi öneririz. Herhangi bir yansımaları için yoğun resimleri incenin. Çözümlemede tutarsızlıklar varsa, büyük olasılıkla bir resim kalitesi sorunu nedeniyle. Sorun gidermek için normal resmi siyah beyaz resimle karşılaştırın. Normal resimde mavi olmayan alanlar siyah beyaz resimde beyaz olarak görünüyorsa, sonuçları değiştiren bir yansıma veya leke olabilir.
Tutarlılığa ek olarak, bu yöntemin bir diğer önemli yararı da manuel sayımdan çok daha hızlı veri üretmesidir. Fiji-ImageJ analizi hızlı bir şekilde yapılabilirken, birden fazla plakayı elle saymak çok zaman alır. Ayrıca daha kısa kuluçka süresi sağlar. Pulaski ve Ostrand-Rosenberg kaplama lı hücreler için 10-14 günlük kuluçka dönemi önererek çalışmaya önemli miktarda zaman katıyor3. 10-14 günlük kuluçka dönemi daha büyük, daha kolay ilçe kolonileri oluşmasını sağlar. Ancak, birçok akciğer plakaları daha önce confluent olabilir. Bunun yerine, kuluçka 5 gün kanser olmayan hücreleri öldürmek için 6TG seçimi için yeterli zaman verir (sağlıklı kontrol fareler akciğer plakaları üzerinde herhangi bir koloni leri olmayan kanıtlanmış, veri gösterilmez), ve hücrelerin yeterince kolayca Fiji-ImageJ ile ölçülecek büyümek için. Bu, farelerin kurban edilmesi ve temel metastatik verilerin analiz edilmesi arasındaki süreyi önemli ölçüde azaltır.
Sonuç olarak, bu yöntemin yararları çok sınırlamalar ağır basar. Bu yöntemin mükemmel tutarlılık sunmadığını kabul ediyoruz. Bu daha az metastatik dokular için ideal bir yöntem olmasa da, bu dokular kolayca elle sayılabilir. Yansımaları olmadan bir resim almak bazı dikkatli fotoğrafçılık gerektirebilir iken, bu yöntem ile kazanılan tutarlılık önemlidir. Bu yöntem, yüksek metastatik diğer dokular ve lekeli nesneleri sayma gerektiren diğer protokoller için kullanılabilir mümkündür. Çalışma tasarımı da metastaz oranı veya metastaz üzerinde anti-kanser tedavilerin etkisi analiz etmek için izin verebilir. Bu yöntem, son derece tutarlı, güvenilir metastaz verileri sağlayacak ve 4T1 modeli için önemli bir iyileştirme temsil eder. Yaklaşan meme kanseri metastaz araştırma için bu modelin uygulanması meme kanseri mortalite karşı mücadele araçları ile araştırmacılar silahlandırma son derece önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Virginia-Maryland Veterinerlik Koleji (IA), Virginia Tech Institute for Critical Technology ve Uygulamalı Bilim Mühendislik Sağlık Merkezi (IA) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R21EB028429 (IA) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
