Summary
Мы описываем более последовательный и оперативный метод количественной оценки метастазов легких в модели рака молочной железы 4T1 с помощью Фиджи-ImageJ.
Abstract
Рак молочной железы является разрушительным злокачественным новообразованием, на долю которого приходится 40 000 случаев смерти женщин и 30% новых диагнозов рака у женщин только в Соединенных Штатах в 2019 году. Основной причиной смерти от рака молочной железы является метастатическое бремя. Поэтому доклинические модели рака молочной железы должны анализировать метастатическое бремя, чтобы быть клинически актуальными. Модель рака молочной железы 4T1 обеспечивает спонтанно метастазирующую, поддающуюся количественной оценке модель мыши для iv стадии рака молочной железы человека. Тем не менее, большинство протоколов 4T1 количественно метастатического бремени, вручную подсчитывая окрашенных колоний на пластинах культуры тканей. Хотя этого достаточно для тканей с более низким метастатическим бременем, человеческая ошибка в ручном подсчете приводит к несовместимым и переменным результатам, когда пластины стечены и трудно подсчитать. Этот метод предлагает компьютерное решение ошибки подсчета людей. Здесь мы оцениваем протокол с использованием легких, высоко метастатической ткани в модели 4T1. Изображения метиленовых голубо-окрашенных пластин приобретаются и загружаются для анализа на Фиджи-ImageJ. Затем Fiji-ImageJ определяет процент выбранной области изображения синего цвета, что представляет собой процент пластины с метастатическим бременем. Этот компьютерный подход дает более последовательные и оперативные результаты, чем ручной подсчет или гистопатологическая оценка высокомастатической ткани. Последовательность результатов Fiji-ImageJ зависит от качества изображения. Небольшие различия в результатах между изображениями могут произойти, поэтому рекомендуется сделать несколько изображений и усредить результаты. Несмотря на свои минимальные ограничения, этот метод является улучшением количественной метастатической нагрузки в легких, предлагая последовательные и быстрые результаты.
Introduction
Одна из восьми женщин будет диагностирован рак молочной железы в ее жизни, и все же, несмотря на несколько вариантов лечения рака молочной железы является второй ведущей причиной рака, связанных смертей уамериканских женщин 1. Эти женщины не умирают от первичной опухоли в груди. Вместо этого, метастатическое бремя несет ответственность за смертность от этого заболевания, как это обычно распространяется на легкие, кости, мозг, печень и лимфатическиеузлы 2. Из-за этого, модели рака молочной железы должны оценить метастазы, чтобы способствовать сдерживанию смертности от этого заболевания. Модель рака молочной железы 4T1 murine является превосходным протоколом для достижения этой цели. Метод, описанный здесь предлагает улучшение модели 4T1 с помощью Фиджи-ImageJ для количественной оценки метастазов легких, производя последовательные и оперативные результаты.
Модель 4T1 хорошо зарекомендовала себя, большинство лабораторий используют протоколы, такие как описаны Пуласки и Остранд-Розенберг в 2001году 3. Линия клеток 4T1 6-Thioguanine (6TG) устойчива и представитель iv стадии, тройной отрицательныйрак молочной железы 3,4,5. Это клинически актуально, так как это ортопедическая модель и спонтанно метастазирует в те же органы, что и при раке молочнойжелезы человека 3,4. Клетки 4T1 спонтанно метастазируют с предсказуемой скоростью, основанной на количестве клеток, введенных3,4. Важно отметить, что генетические различия между мышами, используемыми здесь, вызвали ожидаемую меж индивидуальную изменчивость метастатического бремени. Для оценки метастазов, ткани собирают для сбора и количественной оценки раковых клеток в отдаленных местах с использованием 6TG отбора и метиленового синего окрашивания. Результатом является коллекция пластин культуры тканей с синими точками, представляющими метастатические колонии. Однако протокол Пуласки и Остранд-Розенберга количественно определяет метастатические колонии, вручную подсчитывая их, и поэтому это было стандартным средством оценки метастазов в этой модели. Хотя это легко для тканей с низким метастатическим бременем, ткани, как легкие часто нагруженные метастазами. Поскольку легочные пластины могут быть сильно стеченными, точно и точно количественными метастатическими колониями путем ручного подсчета трудно и склонны к человеческой ошибке. Чтобы лучше определить метастатическое бремя, мы описываем использование Fiji-ImageJ для компьютерного решения ошибки подсчета людей. Гистопатологический анализ с гематоксилином и эозином (H и E) окрашивание является еще одним средством количественной оценки метастазов легких, и интересно также была улучшена с Фиджи-ImageJ программноеобеспечение 6,7. Однако, поскольку гистопатологический анализ наблюдает один кусочек легких, он может быть неточным и непредставительным. Это потому, что модель 4T1 вызывает несколько метастатических поражений по всему органу, которые не равномерно распределены. В то время как общие тенденции между гистопатологическим анализом и ручнымподсчетом могут быть похожи на 8, индивидуальныезначения могут отличаться, и поэтому гистопатологический анализ не должен использоваться в качестве единственного средства количественной оценки. Мы демонстрируем преимущества по сравнению с гистопатологическим анализом и несоответствиями в ручном подсчете между различными счетчиками, а также демонстрируем последовательность использования Фиджи-ImageJ. Кроме того, мы показываем, что этот метод может сократить время инкубации с 10-14 дней до 5 дней, то есть исследователи могут анализировать данные из своего исследования гораздо раньше, чем при полагаться на ручной подсчет.
Этот метод представляет собой набор простых корректировок к протоколу Пуласки и Остранд-Розенберга3. Поскольку модель 4T1 широко используется, и потому, что метастазы легких является критическим параметром для измерения в доклинических моделях, мы считаем, что этот метод может быть широко использован и очень ценен для исследователей рака молочной железы. Единственными дополнительными принадлежностями, необходимыми являются камера и доступ к компьютеру с Фиджи-ImageJ, свободное программное обеспечение, часто используемое в анализеизображений 9. Этот метод специально фокусируется на метастазах легких, но он может быть использован для других тканей со значительным метастатическим бременем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Технологического института Вирджинии и в соответствии с Национальным руководством по охране здоровья и использованию лабораторных животных. Выполнение этого протокола требует разрешения соответствующих учреждений и соблюдения всех соответствующих руководящих принципов.
1. Культура клеток
- Сделать полную культуру средств массовой информации (RPMI и 10% плода крупного рогатого скота сыворотки 1% Пен Strep). Оживите клетки 4T1 в соответствиис протоколом 10 ATCC и инкубировать при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в колбе Т-25 до слияния. Изменение средств массовой информации на следующий день после возрождения, чтобы удалить мертвые клетки, и снова, если средства массовой информации тратится до клетки достаточно стечены, чтобы пройти.
- После того, как Т-25 колба стечена, проход клеток в колбу Т-75, отбрасывая средства массовой информации, стиральная колба с 5 мл 1x Dulbecco фосфат буферного солевого раствора (DPBS), и добавить 500 йл трипсина-ЭДТА. Инкубировать в течение 5-10 минут при 37 градусов по Цельсию, пока клетки не отсоединятся.
- После отсоединея, добавить 5 мл разогретой полной культуры средств массовой информации для клеток. Аспирировать и перенести 5 мл на колбу Т-75, содержащую 15 мл разогретых полных культурных средств массовой информации.
- Проходные камеры в колбы Т-75 не менее четырех раз. Сделайте это после того, как колба стечена путем мытья с 8 мл 1x DPBS, добавив 1 мл трипсина-EDTA для отсоединения клеток, добавив 10 мл разогретых средств массовой информации в ячейки, и разбавления 1:6-1:8 в новую колбу Т-75, содержащую 20 мл прогретых полных средств массовой информации культуры.
- Проходные клетки до соответствующего количества колб Т-150, содержащих 40 мл разогретых полных культурных средств массовой информации для количества мышей, которые будут введены. Большинство исследований потребует нескольких колб Т-150, чтобы обеспечить достаточное количество клеток для инъекций.
- Когда мыши готовы к инъекциям (8 недель или весом более 20 г, в зависимости от МАКУК или институциональных протоколов), собирают клетки, отбрасывая средства массовой информации, мыть каждую колбу 10 мл 1x DPBS и добавляя 2 мл трипсина-ЭДТА. Инкубировать в течение 5-10 минут при 37 градусов по Цельсию, пока клетки не отсоединятся.
- Вымойте колбу с 10 мл полного мультимедиа и перенесите все содержимое (10 мл мультимедиа и 2 мл смеси трипсина-ЭДТА) в следующую колбу. Продолжайте мыть и собирать клетки из каждой колбы, используя те же 10 мл средств массовой информации, чтобы избежать использования чрезмерного количества средств массовой информации.
- После того, как все колбы были собраны, передать содержимое в 50 мл центрифуги трубки. Соберите образец 10 МКЛ для подсчета в микроцентрифуге трубки и центрифуги 50 мл конической трубки на 125 х г в течение 5 минут.
- В то время как клетки центрифугированы, добавьте 10 МКЛ трипан-голубого до 10 МКЛ образца клеток. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Как только общее количество клеток будет определено, вычислите концентрацию клеток, необходимых для инъекций мышей для 1,2х 10 6 клеток на мышь (на 100 МКЛ).
- После центрифугации, декантированных средств массовой информации и повторного перерасхода клеточных гранул в правильном количестве стерильных 1x DPBS для 1,2х 10 6 клеток на 100 МЛ. Сплит ячейки / DPBS смесь в микроцентрифуг трубки для легкого доступа со шприцем при аспирации клеток для инъекций. Держите клетки на льду и вводить вскоре после этого, как клетки начнут умирать после того, как на льду в течение длительных периодов времени.
2. Инъекции
- Подготовка клеток для инъекций, нажав или осторожно смешивания микроцентрифуг трубки для повторного перерасхода клеток, а затем аспирировать 600 йл в 1 мл шприца. Поверните шприц вверх и потяните поршень вниз, чтобы привести клетки от открытия шприца. Нажмите на шприц, чтобы избавить его от пузырьков воздуха.
- Прикрепите иглу скошенной и обойтись клетки обратно в трубку микроцентрифуг, пока только 500 йл остаются в шприце. Положите шприц плашмя на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: 4T1 клетки выпадают из подвески быстро. Поэтому важно смешивать клетки обратно в подвеску, часто нажав. - Анестезировать 8 недель / 20 г женщин BALB / c мыши с помощью изофлюрана или другого утвержденного обезболивающего агента. Мониторинг дыхания мыши, чтобы оценить глубину анестезии.
- После того, как мышь правильно анестезируется, как указано на отсутствие роговицы рефлекс, поместите мышь на спину. Используя большой, указательный и средний палец, аккуратно удерживайте мышь. Используйте указательный и средний пальцы, чтобы удержать верхнюю часть тела мыши и большой палец для задней левой ноги. Будьте нежны, но тверды.
- С скошенной иглы вверх, ввиснуть 100 йл клеток подкожно в левой брюшной молочной молочной молочной площадке мыши. Монитор для хорошего bleb и любой утечки, и обеспечить мышь просыпается и движется легко после инъекции.
- Изменение иглы между каждой мышью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте игле войти в брюшную полость. Это приведет к быстрой распространению рака и не будет репрезентативным для модели. Для обеспечения подкожной инъекции, осторожно потяните вверх на иглу при вставке в левой брюшной молочной молочной жир площадку. Если иглу легко поднять вверх, она правильно расположена подкожно.
- Изменение иглы между каждой мышью.
3. Мониторинг
- Мониторинг мышей по крайней мере 3 раза в неделю для веса, состояние тела оценка, размер опухоли, состояние опухоли, дыхание, уровень активности, внешний вид, и движение. Как только опухоль достигнет 0,7-0,8 см в диаметре, начать контролировать ежедневно.
- Рассмотрим эвтаназии, когда размер опухоли достигает 1,5 см, или потеря веса достигает 20%, или тяжелое клиническое снижение состояния тела оценка, состояние опухоли, дыхание, уровень активности, внешний вид, или движение наблюдаются на основе институциональных руководящих принципов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка состояния тела имеет решающее значение для мониторинга, как вес тела может увеличиться, как опухоль увеличивается в размерах, отрицая потерю состояния тела из-за бремени болезни. Точные протоколы мониторинга будут зависеть от утвержденных МАКУК или институциональных протоколов.
- Рассмотрим эвтаназии, когда размер опухоли достигает 1,5 см, или потеря веса достигает 20%, или тяжелое клиническое снижение состояния тела оценка, состояние опухоли, дыхание, уровень активности, внешний вид, или движение наблюдаются на основе институциональных руководящих принципов.
4. Некропсия
- Euthanize мыши с использованием CO2 следующие институциональные руководящие принципы.
- Спрей мыши с 70% этанола для дезинфекции. Сделайте разрез до брюшной средней линии мыши, чтобы разоблачить полость тела.
- Удалите почку. Продолжайте разрезать средней линии до тех пор, пока диафрагма не будет видна. Используйте ножницы, чтобы проколоть диафрагму, чтобы сдуть легкие. Обрезать диафрагму, чтобы получить лучший доступ к полости.
- Используйте тупые ножницы, чтобы разрезать центр грудной клетки. Прикрепите грудную клетку назад, чтобы разоблачить легкие и сердце.
- Perfuse сердце с 2 мл нестериленых 1x DPBS путем вставки иглы в вершину сердца, пока он бассейны в брюшной полости, где почка была удалена.
- Чтобы удалить сердце и легкие, используйте тупые ножницы, чтобы сократить пищевода и трахеи непосредственно над сердцем. Используя типсы, начните тянуть сердце от тела и отрезать на любой соединительной ткани держать его прилагается. Легкие выходят с сердцем.
- Определите многолопастные (справа) и однолопастные (левые) легкие. Держите сердце прилагается для справки, но как только легкие определены, отрезать сердце прочь.
- Этикетка 12 хорошо пластины, содержащие 1x Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS) в каждой хорошо. Каждой мыши нужно 2 колодца. Поместите многолопастное (правое) легкое в 12 хорошо пластины для оценки метастазов и держать на льду. Держите соседний колодец пустым на данный момент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать одно и то же легкое (многолопастное) от каждой мыши, чтобы гарантировать, что каждый образец близок по размеру. Однолопастное легкое может быть использовано для другого анализа, например, гистопатологии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы стабильны на льду или при 4 градусах Цельсия в течение нескольких часов.
5. Обработка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе должны быть сделаны с использованием стерильной техники.
- Этикетка 1 15 мл конической трубки на мышь и добавить 2,5 мл типа IV коллагеназы смеси и 30 единиц эластазы для каждой трубки. Чтобы сделать тип IV коллагеназы смеси, растворить 2 мг типа IV коллагеназы на мл 1x HBSS и стерильный фильтр. Это может храниться до 12 месяцев при -20 градусов по Цельсию и оттаивать, когда это необходимо.
- Передача легких на второй, чистый 1x HBSS хорошо для этого образца. Вихрь с помощью типсов, чтобы удалить оставшиеся крови. Передача чистого легкого в пустую пластину культуры ткани 3,5 см. Фарш легких с ножницами. Промыть пластину с 2,5 мл 1x HBSS, передачи 1x HBSS и легких частей в 15 мл конической трубки уже содержащие коллагеназы / эластасы коктейль (5 мл в общей сложности).
- Инкубировать в течение 75 минут при 4 градусов по Цельсию. Продолжить смешивание образцов в течение этого времени, так что поместите трубки на рокер или вращающееся колесо. Во время этого шага инкубации, этикетка 50 мл центрифуг трубки и 10 см ткани культуры пластин для каждой мыши. При этом разбавления, этикетка достаточно 10 см ткани культуры пластин для разбавления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этикетка крышку пластин культуры тканей. Если маркировка самой пластины, письменной форме будет мешать Фиджи-ImageJ анализа. - Довнесите объем каждой трубки до 10 мл в общей сложности с 1x HBSS. Налейте содержимое более 70 мкм ситечко клеток в 50 мл конической трубки для каждого образца. Используйте поршень шприца 1 мл, чтобы аккуратно измельчить образец через ситечко, чтобы позволить больше клеток, чтобы фильтровать до конца.
- Центрифуга в течение 5 минут при температуре 350 x г при комнатной температуре (RT). Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы с 10 мл 1x HBSS. Повторите этот шаг дважды.
- Resuspend гранулы в 10 мл 60 МКМ 6TG полной культуры средств массовой информации, либо RPMI или IMDM. Образцы плит в пластинах культуры клеток 10 см, используя схему разбавления при желании. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в течение 5 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1:2, 1:10 и 1:100 являются общими разбавления, которые должны быть эмпирически определены на основе параметров исследования.
ВНИМАНИЕ: 6TG является токсичным. Используйте осторожность при обработке и следовать всем экологическим здоровья и безопасности руководящих принципов для удаления.
6. Окрашивание пластин
- Налейте культурные средства массовой информации с тарелок в соответствующий контейнер для отходов. Исправить клетки, добавив 5 мл неразбавленного метанола на тарелку и инкубировать в течение 5 минут на RT, убедившись, что вихрь метанола так, что она охватывает всю пластину.
ВНИМАНИЕ: Метанол опасен при приеме внутрь, вдыхании или на коже. Используйте дым капот для этого шага. - Налейте метанол с тарелок в соответствующий контейнер для отходов. Промыть пластины с 5 мл дистиллированной воды на тарелку и залить водой в соответствующий контейнер для отходов. Добавьте 5 мл 0,03% метиленового синего на тарелку и инкубировать в течение 5 минут в RT, убедившись, что закружить метиленовый синий раствор так, чтобы он покрывал всю пластину.
- Налейте метиленовый синий в соответствующий контейнер отходов. Промыть тарелки снова с 5 мл дистиллированной воды на тарелку. Переверни тарелки вверх дном и помарки против бумажного полотенца, чтобы удалить избыток жидкости. Поместите пластину на крышку и дайте воздуху высохнуть на ночь в RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метастатические колонии будут синими. После того, как пластины высушиваются, они могут храниться в RT на неопределенный срок.
7. Анализ изображений
- Снимите маркированную крышку с пластин, заботясь о четкой идентификации образцов. Выстроить все окрашенные пластины легких на чистой, светлой поверхности, чтобы сфотографировать все пластины в одном изображении.
- Смойте коллекцию пластин в хорошо освещенной области, убедившись, чтобы свести к минимуму отражения, как пластины очень отражающей. Отражения в пластинах будут влиять на анализ изображения и, следовательно, следует избегать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиджи-ImageJ имеет верхний предел 2 гигапикселей. Большинство современных смартфонов будет иметь достаточно камер. Не используйте камеру менее 8 мегапикселей. Камера, используемая в этом эксперименте, была 12,2 мегапикселя на Google Pixel 2. - Обрезать изображение, чтобы включить пластины, но исключить крышки или что-нибудь еще в фоновом режиме изображения. Загрузите обрезанное изображение в Фиджи-ImageJ.
- Измените изображение на черно-белое, используя следующие команды: Изображение, Отрегулируйте, Пороговый цвет, Пороговый метод: По умолчанию, Пороговый цвет: B и W, Пороговое пространство: Lab. Unselect The Dark background box. Изображение теперь должно быть черно-белым. Черный цвет представляет световой фон, а белый представляет синие метастатические колонии.
- Используя инструмент Circle на панели инструментов Fiji-ImageJ, выберите область, которая будет проанализирована. Нарисуйте один круг для использования для всех пластин, чтобы убедиться, что каждая пластина анализируется для той же площади. Выберите размер, который максимизирует проанализированную область на пластинах, минимизируя фоновый шум, который появляется на краю пластин. Размер отображается в панели инструментов по мере ее нарисования, поэтому можно сделать идеальный круг, отслеживая высоту и ширину по мере нарисования круга.
- Проанализируйте выбранный круг, чтобы определить, какой процент области белый, который представляет область пластины, которая имеет синие метастатические колонии. Используйте следующие команды:
Анализ, Анализ частиц, Размер(пиксель 2): 0-Бесконечность, Циркулярность: 0.00-1.00, Показать: Ничего, и проверить резюме поле. Хит ОК. - Запись % Площадь результат. Это процент выбранной области, которая является белой, и, следовательно, представляет метастатическое бремя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется либо сохранить результаты в Fiji-ImageJ, либо скопировать/вставить всю страницу результатов в отдельный документ. Если результаты % area являются неожиданными или подозрительными, то можно увидеть, если любой из других измерений были также подозрительными или если % Площадь была записана неправильно. - Перемести круг, не изменяя его размер, схватив его в центре, к следующей пластине на картинке. Повторите шаги 7.6 и 7.7 для всех пластин на картинке.
- Повторите шаги 7.1 - 7.8 по крайней мере еще на двух изображениях. После того, как все пластины и изображения были проанализированы, средний % Площадь результаты между различными изображениями для каждой пластины, чтобы смягчить любые несоответствия между картинками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод содержит простые корректировки протокола3 Pulaski и Ostrand-Rosenberg 4T1 и может быть визуализирован на рисунке 1. Когда 3 отдельных исследователя вручную подсчитали метастатические колонии для 12 легочных пластин (1:10 разбавления), результаты были очень несовместимы между различными счетчиками(рисунок 2A). Все исследователи были направлены на "подсчитать метастатические колонии, которые появляются как синие точки", но несоответствия демонстрируют проблему с ручным подсчетом высоко-метастатические пластины. Исследователи имели различный опыт работы с моделью 4T1. Сертифицированный ветеринарный патологоанатом проанализировал H и E окрашенных легких слайды для метастазов в качестве еще одного метода для сравнения с Фиджи-ImageJ анализа легких пластины (Рисунок 2B).
Используя анализ Fiji-ImageJ, 3 отдельных исследователя проанализировали 3 отдельных изображения коллекции из 12 пластин (1:2 разбавления). Изображения были сделаны в двух отдельных лабораторных помещениях с несколько иным освещением. Расположение пластин или угол, с которого была сделана фотография, отличались между каждым изображением. В отличие от результатов ручного подсчета, результаты Fiji-ImageJ были последовательными между счетчиками для каждого из 3 изображений(рисунок 3A). Чтобы определить, были ли несоответствия между 3 изображениями, результаты 3 изображений и 3 счетчиков были объединены на легочную пластину(рисунок 3B). Есть различия между изображениями для некоторых пластин, но общие тенденции похожи, и он предлагает больше согласованности, чем ручной подсчет. Для учета вариаций между 3 различными изображениями, результаты от каждого изображения были усредняться для каждой пластины(рисунок 3C). Эти средние показатели обеспечили последовательные результаты между счетчиками, которые точно и точно анализируют метастатическое бремя. Таким образом, этот протокол предлагает принимать по крайней мере 3 изображения коллекции пластин в различных аранжировках, под разными углами, или в несколько разных настройках света, а затем анализировать и усреднеть результаты. Контраст между ручным подсчетом и анализом Фиджи-ImageJ визуализируется при сравнении рисунка 2A с рисунком 3C.
Еще один способ продемонстрировать улучшения, предлагаемые этим протоколом, - сравнение ранжирования пластин от большинства до наименее метастатического бремени между счетчиками, основанное на подсчете с рисунка 2 и рисунка 3. Ручной подсчет согласовывается на наиболее слияние пластины, но все следующие ряды были несовместимы между счетчиками (Рисунок 4A). Контрастно, ряды от Фиджи-ImageJ анализа для каждого изображения были гораздо более последовательными между счетчиками (Рисунок 4B). Последовательность также видно, когда результаты от каждого изображения для каждой пластины были усредняться (Рисунок 4C). Мы признаем, что этот протокол не предлагает полной согласованности между счетчиками, но это улучшение от ручного подсчета при сравнении рисунок 4A на рисунке 4C. Гистопатологический анализ отличался как от ручного, так и от фиджийского подсчета изображений(рисунок 4D).
Чтобы продемонстрировать важность избежания отражений на изображениях, показано изображение с отражением руки и последующим анализом Фиджи-ImageJ (слева) против той же пластины без отражения(справа) (рисунок 5A). Другие темные пятна от грязной фоновой поверхности или остатков образца крови на пластинах могут негативно повлиять на анализ Фиджи-ImageJ тоже. Пластина крови на рисунке 5B имеет только 2 метастатические колонии (отмеченные белыми стрелками), но темные остатки (отмеченные черными стрелками) заставили Fiji-ImageJ считать его 31,6% метастатическим. Поэтому важно иметь чистую, светлую поверхность и не использовать этот метод для образцов крови, так как образцы крови, как правило, оставляют остаточные темные пятна на пластине, которые не являются метастатическими колониями.
Рисунок 1: Схема протокола. Этот протокол фокусируется исключительно на анализе метастазов легких в модели 4T1. Общий поток этого протокола включает в себя выращивание 4T1 клеток в культуре, инъекционные BALB / C женских мышей с 4T1 клеток в левой брюшной молочной жировой площадке, мониторинг мышей в соответствии с IACUC и институциональных протоколов, жертвуя мышей и сбора легких, сбор клеток из образцов легких, покрытие и инкубации клеток в 6TG отбора средств массовой информации, фиксации и окрашивания клеток после 5 дней, принимая фотографии пластин, и анализ с помощью Фиджи-Образ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Ручной подсчет метастатических клеток и гистопатологический анализ имеют противоречивые результаты. A. 12 легочных пластин с разбавлением 1:10 были вручную подсчитаны 3 отдельными исследователями, проинструктировавами считать метастатические колонии таким же образом, хотя опыт работы с моделью варьировался между исследователями. Количество подсчитанных метастатических колоний сильно различалось между исследователями. Б. Гистопатологический анализ выявил и количественно определил отдельные агрегаты опухолевых клеток, классифицируемые как метастазы, присутствующие в окрашенных слайдах легких. Отображаются изображения высокого, среднего и низкого увеличения одного репрезентативного слайда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Фиджи-ImageJ анализ является точным и точным в определении метастатического бремени. A. 12 легочных пластин с разбавлением 1:2 были проанализированы 3 отдельными исследователями в 3 отдельных изображениях 12 легочных пластин. Б. Результаты каждого из 3 изображений каждого из 3 исследователей были объединены. К. Результаты от каждой пластины легких из 3 изображений были усредчены. Одной из сторон ANOVA с многократным тестом сравнения Tukey не определил никаких существенных различий между счетчиками для каждой пластины легких. Данные отображаются как среднее - SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 4: Анализ Фиджи-ImageJ обеспечивает более последовательное ранжирование метастатического бремени по сравнению с ручным подсчетом и гистопатологическим анализом. А. Те же легочные пластины с рисунка 2 ранжироваться от большинства до наименее метастатических на основе ручных подсчетов с рисунка 2. Б. Те же 12 легочных пластин с рисунка 3 были ранжированы от большинства до наименее метастатических на основе анализа Фиджи-ImageJ с рисунка 3A. C. Средние показатели с рисунка 3C были ранжированы от большинства до наименее метастатических. Д. Слайды легких ранжироваться от большинства до наименее метастатических на основе гистопатологической оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Размышления и не метастатические темные пятна негативно повлияют на результаты. А. Изображение с отражением руки принимая изображение нарушает анализ Фиджи-Изображение J, как показано в сравнении отражения Фиджи-ImageJ анализа (слева) для правильного анализа Фиджи-ImageJ (справа) B. Кровь пластины часто оставляют остатки пятен (черные стрелки) на пластинах, которые не метастатические колонии (белые стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как попродемонстрировано, ручной подсчет метастатических колоний на каждой пластине легких может быть неточным и неточным методом количественной оценки метастазов легких, демонстрируя необходимость лучшего средства количественной оценки(рисунок 2). Гистопатологический анализ несколько отличался как от ручного подсчета, так и от анализа Fiji-ImageJ(рисунок 2B и 4D),вероятно, потому, что слайды H и E не являются репрезентативной выборкой всего органа. Протокол собирает все легкое, и, следовательно, является более репрезентативным общего метастазирования легких, и является более последовательным, чем ручной подсчет. Было предпринято несколько различных подходов к анализу Фиджи-Образдж, которые обсуждаются ниже, однако изложенный выше протокол, как представляется, является превосходным методом.
Для этого исследования были собраны образцы легких, крови и мозга. Тем не менее, образцы крови и мозга было очень мало метастатических колоний, если таковые имеются на всех. Мы определили, что ручной подсчет метастатических колоний является оптимальным для этих менее метастатических тканей, и поэтому данные крови и мозга не были включены. Когда метастатическое бремя легко подсчитать вручную (например, десять или двадцать метастатических колоний в отличие от тысяч), исходная проблема человеческой ошибки не актуальна, и поэтому этот протокол не нужен. Кроме того, образцы крови могут оставить темные пятна на пластинах после фиксации, что мешает анализу Фиджи-ImageJ(рисунок 5). Важно отметить, что количество вводимых клеток может влиять на метастатическое бремя. Например, если меньше клеток вводят и мыши могут выжить дольше, рак имеет больше времени, чтобы распространиться на традиционно менее метастатических сайтов,как мозг 3,4. Таким образом, этот протокол может быть изменен, чтобы включить метастатическое бремя других тканей, если им дано время, чтобы стать высоко-метастатическим. При попытке модели 4T1 в первый раз или изменение количества вводимых клеток, мы рекомендуем попробовать по крайней мере два разбавления при обливки клеток. Для этого исследования мы использовали разбавление 1:2 и 1:10. Разбавление 1:2 было бы трудно сосчитать вручную, но было легко засчитано на Фиджи-ImageJ. Разбавление 1:10 по-прежнему трудно подсчитать вручную и, следовательно, привело к непоследовательным результатам. Разбавления могут быть изменены на основе конкретных параметров исследования.
Были сделаны снимки отдельных пластин легких и 12 легочных пластин вместе. Отдельные пластины были проанализированы двумя способами: либо обрезка изображения на центральном квадрате пластины до загрузки на Фиджи-ImageJ, или с помощью инструмента выбора круга на Фиджи-ImageJ, чтобы выбрать центральный круг пластины в необрезаном изображении. Мы обнаружили, что использование инструмента выбора круга на Фиджи-ImageJ предлагает самый простой и последовательный способ создания одноразмерной области для анализа всех пластин. Кроме того, анализ всей коллекции легочных пластин на одном изображении был выше анализа отдельных изображений одиночных пластин легких. Наличие всех легочных пластин на одном изображении позволяет легко использовать круг одного размера между пластинами легких. Это гарантирует, что все пластины легких находятся на одинаковом расстоянии от камеры и, следовательно, одного размера круг для анализа должен быть правильный размер для всех пластин легких на изображении. Это также делает анализ быстрее, как перерисовка круга не является необходимым между пластинами. Его просто перетаскивают к следующей пластине на изображении без изменения его размера, что гарантирует тот же размер используется для всех пластин на картинке. При выборе размера круга, важно, чтобы сделать его достаточно большим, чтобы проанализировать большинство пластины в то время как достаточно мал, чтобы избежать фонового шума от краев пластины. Кроме того, в попытке сохранить реагенты, клетки были также потрохались в 6 пластин хорошо и по сравнению с 10 см ткани культуры пластин. Результаты Fiji-ImageJ из 6 пластин были менее последовательными и не соотносились с 10-сантиметровыми блюдами (данные не показаны). Одно из объяснений заключается в том, что меньшая площадь поверхности обеспечивает меньшую площадь для анализа, что приводит к менее репрезентативным данным. Другой заключается в том, что уменьшение площади поверхности позволяет клеткам расти быстрее, поскольку они находятся ближе к другим выжившим клеткам. Поэтому мы не рекомендуем использовать какие-либо реагенты культуры тканей, кроме того, что мы описали в протоколе.
Как упоминалось ранее, избегая отражений и имея чистый, световой фон являются абсолютно важными для этого метода. Рисунок 5A демонстрирует, как анализируется отражение на Фиджи-ImageJ и, следовательно, показывает критическое значение избежания отражений. Поскольку пластины культуры тканей являются весьма отражающими, полезно сделать снимок под небольшим углом, чтобы избежать отражений от себя, принимая картину или из источников света выше. Необходимо будет учитывать условия освещения конкретной рабочей зоны. Мы предлагаем сделать несколько фотографий пластин, которые будут проанализированы, пробуя несколько иные механизмы и/ или углы, в хорошо освещенной области. Изучите фотографии интенсивно для любых размышлений. Если в анализе есть несоответствия, то, скорее всего, это связано с проблемой качества изображения. Чтобы устранения неполадок, сравните нормальную картинку с черно-белой картинкой. Если области, которые не синие в нормальной картине появляются как белые в черно-белом рисунке, есть вероятность отражения или порока, который изменяет результаты.
Помимо согласованности, еще одним заметным преимуществом этого метода является то, что он производит данные гораздо быстрее, чем ручной подсчет. Ручной подсчет нескольких пластин очень трудоемкий, в то время как анализ Fiji-ImageJ может быть сделан быстро. Это также позволяет сократить инкубацио время. Пуласки и Остранд-Розенберг рекомендуют 10-14-дневный инкубационный период для поцарапленных клеток, добавляя значительное количество времени кисследованию 3. Инкубационный период 10-14 дней позволяет формировать большие, более простые в подсчете колонии. Однако, много плит легкя могут стать confluent перед после этого. Вместо этого, 5 дней инкубации дает достаточно времени для выбора 6TG, чтобы убить нераковой клетки (доказано здоровыми мышами контроля, не имеющих каких-либо колоний на легких пластин, данные не показаны), и для клеток расти достаточно, чтобы быть легко количественно с Фиджи-ImageJ. Это значительно сокращает время между жертвоприношениями мышей и анализом основных метастатических данных.
В заключение я хотел бы сказать, что преимущества этого метода намного перевешивают ограничения. Мы признаем, что этот метод не предлагает идеальной согласованности. Хотя это не идеальный метод для менее метастатических тканей, эти ткани можно легко пересчитать вручную. Хотя получение изображения без отражений может потребовать тщательной фотографии, последовательность, полученная с помощью этого метода имеет важное значение. Вполне возможно, что этот метод может быть использован для других тканей, которые являются высоко-метастатическими и другими протоколами, которые требуют подсчета окрашенных объектов. Конструкция изучения смогла также позволить для анализировать тариф metastasis или влияния anti-cancer обработать на метастазах. Этот метод обеспечит высокопоследовательную и надежную метастазирующую информацию и представляет собой значительное уточнение модели 4T1. Применение этой модели для предстоящих исследований метастазирования рака молочной железы имеет первостепенное значение в вооружении исследователей с инструментами для борьбы со смертностью от рака молочной железы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Вирджиния-Мэриленд колледж ветеринарной медицины (IA), Вирджиния Технологический институт критических технологий и прикладных научных центров инженерного здоровья (IA), и Национальные институты здравоохранения R21EB028429 (IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
