Summary
우리는 피지-ImageJ를 사용하여 4T1 유방암 모델에서 폐 전이를 정량화하는 보다 일관되고 신속한 방법을 설명합니다.
Abstract
유방암은 2019년에만 미국에서 40,000명의 여성 사망과 30%의 새로운 여성 암 진단을 차지하는 파괴적인 악성 종양입니다. 유방암 관련 죽음의 주요 원인은 전이성 부담입니다. 따라서 유방암을 위한 전임상 모델은 전이성 부담을 임상적으로 관련시키기 위해 분석할 필요가 있다. 4T1 유방암 모델은 단계 IV 인간 유방암을 위한 자발적으로 전이되고 정량화 가능한 마우스 모델을 제공합니다. 그러나, 대부분의 4T1 프로토콜은 조직 배양 판에 스테인드 콜로니를 수동으로 계수함으로써 전이성 부담을 정량화한다. 이는 전이성 부담이 낮은 조직에 충분하지만 수동 계산의 인간의 오류는 플레이트가 혼잡하고 계산하기 어려운 경우 일관성이 없고 가변적인 결과를 초래합니다. 이 방법은 인간 계수 오류에 대한 컴퓨터 기반 솔루션을 제공합니다. 여기서, 우리는 4T1 모델에서 고전이성 조직인 폐를 이용한 프로토콜을 평가한다. 피지-ImageJ에서 분석을 위해 메틸렌 블루 스테인드 플레이트의 이미지를 획득하여 업로드합니다. 피지-ImageJ는 전이성 부담이 있는 플레이트의 백분율을 나타내는 파란색 이미지의 선택된 영역의 백분율을 결정합니다. 이 컴퓨터 기반 접근 방식은 고전이성 조직에 대한 수동 계수 또는 조직 병리학 평가보다 더 일관되고 신속한 결과를 제공합니다. 피지-ImageJ 결과의 일관성은 이미지의 품질에 따라 달라집니다. 이미지 간의 결과에 약간의 변화가 발생할 수 있으므로 여러 이미지를 촬영하고 결과를 평균화하는 것이 좋습니다. 최소한의 한계에도 불구하고,이 방법은 일관되고 신속한 결과를 제공함으로써 폐의 전이성 부담을 정량화하는 개선입니다.
Introduction
8명의 여자에 대하여 1개는 그녀의 일생에 있는 유방암으로 진단될 것입니다, 그러나 다중 처리 선택권에도 불구하고 유방암은 미국 여자에 있는 암 관련 죽음의 두 번째 주요한 원인입니다 1. 이 여자는 그들의 유방에 있는 1 차적인 종양에서 정지하지 않습니다. 대신, 전이성 부담은 일반적으로 폐, 뼈, 두뇌, 간 및 림프절2로퍼지기 때문에 이 질병의 사망에 책임 있습니다. 이 때문에 유방암 모델은 이 질병의 사망률을 억제하는 데 기여하기 위해 전이를 평가해야합니다. 4T1 뮤린 유방암 모델은 이를 달성하기 위한 훌륭한 프로토콜입니다. 여기에 설명된 방법은 피지-ImageJ를 사용하여 폐 전이를 정량화하여 일관되고 신속한 결과를 생성함으로써 4T1 모델에 대한 개선을 제공합니다.
4T1 모델은 잘 확립되어 있으며, 대부분의 실험실은 2001년 풀라스키와 오스트랜드-로젠버그가 설명한 프로토콜과 같은 프로토콜을 사용합니다. 4T1 세포주6-티오구아닌(6TG)은 내성 및 단계 IV, 삼중 음성 유방암3,4,5의대표이다. 그것은 정형 소 모델이며 인간 유방암3,4에서와같은 장기에 자발적으로 전이되기 때문에 임상적으로 관련이 있다. 4T1 세포는 주입된 세포의 양에 기초하여 예측 가능한 속도로 자발적으로 전이3,4. 중요한 것은, 여기에서 사용된 마우스 사이 유전다름은 전이성 부담에 있는 예상된 개별 간 가변성을 일으키는 원인이 되었습니다. 전이를 평가하기 위해, 조직은 6TG 선택 및 메틸렌 블루 스테인링을 사용하여 먼 부위의 암세포를 수집하고 정량화하기 위해 수확됩니다. 그 결과 전이성 식민지를 나타내는 파란색 점이 있는 조직 배양 판의 컬렉션이 생성됩니다. 그러나 풀라스키와 오스트랜드-로젠버그 프로토콜은 이를 수동으로 계산하여 전이성 식민지를 정량화하므로 이 모델에서 전이를 평가하는 표준 수단이 되었습니다. 이것은 낮은 전이성 부담을 가진 조직에 대 한 쉬운, 폐 같은 조직은 종종 전이와 함께 라덴. 폐 판은 매우 수렴 될 수 있기 때문에 수동 계수로 전이성 식민지를 정확하고 정확하게 정량화하기가 어렵고 인간의 실수가 발생하기 쉽습니다. 전이성 부담을 더 잘 정량화하기 위해 피지-ImageJ를 사용하여 인간 카운팅 오류에 대한 컴퓨터 기반 솔루션을 설명합니다. 혈종실린및 에오신(H&E) 염색을 통해 조직병리학적 분석은 폐 전이를 정량화하는 또 다른 수단이며, 흥미롭게도 피지-ImageJ 소프트웨어6,7로개선되었다. 그러나, 조직 병리학 적 분석은 폐의 단일 조각을 관찰하기 때문에, 그것은 부정확하고 대표적이지 않을 수 있습니다. 이는 4T1 모델이 고르게 분포되지 않는 장기 전체에 여러 전이성 병변을 일으키기 때문이다. 조직 병리학 적 분석과 수동 계수 사이의 전반적인 추세는 유사 할 수 있지만8,개별 값은 다를 수 있으므로 조직 병리학 분석은 정량화의 유일한 수단으로 사용되어서는 안됩니다. 우리는 조직 병리학 적 분석과 다른 카운터 사이의 수동 계산의 불일치에 비해 이점을 입증하면서 피지 -ImageJ를 사용하는 일관성을 보여줍니다. 또한, 우리는이 방법은 수동 계산에 의존 할 때보다 훨씬 빨리 자신의 연구에서 데이터를 분석 할 수 있다는 것을 의미 10-14 일에서 5 일로 잠복기 시간을 줄일 수 있음을 보여줍니다.
이 방법은 풀라스키 및 오스트랜드-로젠버그 프로토콜3에대한 간단한 조정 모음입니다. 4T1 모델은 널리 사용되고 폐 전이가 전임상 모델에서 측정하는 중요한 매개 변수이기 때문에, 우리는 이 방법이 널리 사용될 수 있고 유방암 연구자에 매우 가치가 있다고 믿습니다. 필요한 유일한 추가 소모품은 카메라와 피지-ImageJ와 컴퓨터에 대 한 액세스, 이미지 분석에 자주 사용 하는 무료 소프트웨어9. 이 방법은 특히 폐 전이에 초점을 맞추고 있지만, 상당한 전이성 부담을 가진 다른 조직에 사용될 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 버지니아 공대의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 치료 및 사용을위한 국립 보건 가이드에 따라 승인되었습니다. 이 프로토콜을 수행하려면 적절한 기관의 허가와 모든 적절한 지침을 준수해야 합니다.
1. 세포 배양
- 완전한 문화 매체를 만듭니다 (RPMI + 10 % 태아 소 혈청 +1 % 펜 스트렙). ATCC프로토콜(10)에 따른 4T1 세포를 부활시키고 T-25 플라스크에서 37°C 및 5% CO2에서 컨서크까지 배양한다. 죽은 세포를 제거하기 위해 부활 한 다음 날 미디어를 변경하고, 세포가 통과 할 만큼 혼잡하기 전에 미디어가 소비되는 경우 다시.
- 일단 T-25 플라스크가 컨실트되면, 세포를 T-75 플라스크로 파기하여 미디어를 폐기하고, 1x 덜벡코의 인산염 버퍼살린 살린(DPBS)의 5mL로 플라스크를 세척하고 트립신-EDTA의 500 μL을 추가한다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
- 분리되면 셀에 온난한 완전한 배양 배지 5mL을 추가합니다. 5mL을 15mL의 온난한 완전한 문화 매체를 포함하는 T-75 플라스크로 흡인및 전송한다.
- T-75 플라스크의 통로 세포는 적어도 네 번 플라스크합니다. 플라스크가 1x DPBS 8mL로 세척하고, 세포를 분리하기 위한 트립신-EDTA 1mL을 추가하고, 10mL의 온온 된 미디어를 세포에 추가하고, 1:6-1:8을 20mL의 완전한 배양 배지를 포함하는 새로운 T-75 플라스크에 희석하여 이 작업을 수행하십시오.
- 40mL의 온난한 완전한 배양 배지를 함유한 T-150 플라스크의 적절한 수까지의 통로 세포는 주입될 마우스의 수를 위한 것이다. 대부분의 연구는 주사를 위한 충분한 세포를 지키기 위하여 다중 T-150 플라스크를 요구할 것입니다.
- 마우스를 주입할 준비가 되면(IACUC 또는 기관 프로토콜에 따라 8주 이상 또는 20g 이상 계량), 미디어를 폐기하여 세포를 수확하고, 각 플라스크를 1x DPBS10mL로 세척하고 트립신-EDTA 2mL를 첨가한다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
- 완전한 매체10mL로 플라스크를 세척하고 모든 내용물(10mL의 미디어 + 트립신-EDTA 세포 혼합물2mL)을 다음 플라스크로 옮겨보세요. 과도한 양의 매체를 사용하지 않도록 동일한 10mL의 미디어를 사용하여 각 플라스크에서 세포를 세척하고 수집합니다.
- 모든 플라스크가 수집되면 내용물들을 50mL 원심분리기 튜브로 옮기십시오. 마이크로센트심분리기 튜브에 계수하기 위한 10μL 샘플을 수집하고 50mL 원심형 튜브를 125 x g에서 5분간 원심분리합니다.
- 세포가 원심분리되는 동안, 세포 샘플의 10 μL에 Trypan 블루의 10 μL을 추가합니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다. 총 세포 수가 결정되면 마우스당 1.2 x 106 세포(100 μL당)에 마우스를 주입하는 데 필요한 세포의 농도를 계산합니다.
- 원심분리 후, 데산스 미디어 및 100 μL당 1.2 x 106 셀에 대한 멸균 1x DPBS의 정확한 양으로 세포 펠릿을 재중단한다. 세포/DPBS 혼합물을 마이크로원심분리기 튜브로 분할하여 주사를 위해 세포를 흡입할 때 주사기에 쉽게 접근할 수 있습니다. 얼음에 세포를 유지하고 세포가 오랜 시간 동안 얼음에있는 후 죽기 시작으로 곧 주입.
2. 주사
- 마이크로센트심분리기 튜브를 두드리거나 부드럽게 혼합하여 세포를 재일시 중단한 다음 600 μL을 1mL 주사기로 흡인하여 주입을 위한 세포를 준비합니다. 주사기를 위쪽으로 돌리고 플런저를 아래로 당겨 주사기 개구부에서 세포를 멀리 가져옵니다. 주사기를 눌러 기포를 제거합니다.
- 바늘 을 부착하고 500 μL만 주사기에 남아있을 때까지 마이크로 원심 분리기 튜브에 세포를 다시 분배합니다. 얼음에 주사기를 평평하게 놓습니다.
참고: 4T1 셀은 서스펜션에서 빠르게 떨어집니다. 따라서 세포를 자주 탭하여 세포를 현탁액으로 다시 혼합하는 것이 중요합니다. - 이소플루란 또는 기타 승인된 마취제를 사용하여 8주 된/>20g 암컷 BALB/c 마우스를 마취합니다. 마우스의 호흡을 모니터링하여 마취의 깊이를 평가합니다.
- 마우스가 각막 반사의 부족으로 표시된 대로 제대로 마취되면 마우스를 뒷면에 놓습니다. 엄지 손가락, 포인터 및 가운데 손가락을 사용하여 마우스를 부드럽게 누릅니다. 포인터와 가운데 손가락을 사용하여 마우스의 상반신과 왼쪽 다리의 엄지 손가락을 잡습니다. 부드럽지만 확고합니다.
- 바늘의 배꼽을 위로, 마우스의 왼쪽 복부 유방 지방 패드에 피하로 세포의 100 μL을 주입. 좋은 흠과 누출을 모니터링하고 마우스가 깨어나서 주입 후 쉽게 움직일 수 있도록 하십시오.
- 각 마우스 사이에 바늘을 변경합니다.
참고: 바늘이 복막 구멍에 들어가는 것을 허용하지 마십시오. 이것은 암이 빨리 퍼지고 모형의 대표적이지 않기 위하여 일으키는 원인이 될 것입니다. 피하 주사를 보장하기 위해 왼쪽 복부 유방 지방 패드에 삽입 할 때 바늘위로 부드럽게 당깁니다. 바늘이 쉽게 위쪽으로 들어 올리면 피하위치로 올바르게 배치됩니다.
- 각 마우스 사이에 바늘을 변경합니다.
3. 모니터링
- 체중, 신체 상태 점수, 종양 크기, 종양 상태, 호흡, 활동 수준, 외관 및 움직임을 위해 일주일에 3회 이상 마우스를 모니터링합니다. 종양이 직경 0.7-0.8cm에 도달하면 매일 모니터링하기 시작합니다.
- 종양 크기가 1.5cm에 도달하면 안락사를 고려하거나 체중 감소가 20%에 도달하거나 신체 상태 점수, 종양 상태, 호흡, 활동 수준, 외관 또는 움직임이 제도적 지침에 따라 관찰됩니다.
참고: 종양의 크기가 증가함에 따라 체중이 증가할 수 있기 때문에 신체 상태 점수가 모니터링하는 것이 중요합니다. 정확한 모니터링 프로토콜은 승인된 IACUC 또는 기관 프로토콜에 따라 달라집니다.
- 종양 크기가 1.5cm에 도달하면 안락사를 고려하거나 체중 감소가 20%에 도달하거나 신체 상태 점수, 종양 상태, 호흡, 활동 수준, 외관 또는 움직임이 제도적 지침에 따라 관찰됩니다.
4. 네크로키
- 기관 지침에 따라 CO2를 사용하여 마우스를 안락사시합니다.
- 소독하기 위해 70%의 에탄올로 마우스를 스프레이하세요. 신체 구멍을 노출 마우스의 복부 중간선을 절개합니다.
- 신장을 제거합니다. 다이어프램이 보일 때까지 중간선을 계속 절단합니다. 가위를 사용하여 다이어프램에 구멍을 뚫어 폐를 수축시하십시오. 다이어프램을 트리밍하여 캐비티에 더 잘 접근할 수 있습니다.
- 무딘 가위를 사용하여 흉곽의 중심을 잘라냅니다. 폐와 심장을 드러내기 위해 다시 고정 흉곽.
- 신장이 제거된 복강에서 풀링될 때까지 심장 정점에 바늘을 삽입하여 2mL의 비멸 균 1x DPBS로 심장을 퍼퓨즈합니다.
- 심장과 폐를 제거하려면 무딘 가위를 사용하여 식도와 기관지를 심장 바로 위에 자른다. 집게를 사용하여, 몸에서 멀리 심장을 당기고 부착 유지 어떤 결합 조직에서 잘라 시작합니다. 폐는 심장과 함께 나올 것입니다.
- 멀티 로브(오른쪽)와 단일 로브(왼쪽) 폐를 식별합니다. 참조를 위해 부착 된 심장을 유지하지만 폐가 확인되면 심장을 잘라냅니다.
- 각 우물에 행크의 균형 잡힌 식염수 솔루션(HBSS)이 포함된 12개의 웰 플레이트에 라벨을 부착합니다. 각 마우스는 2 개의 우물이 필요합니다. 전이 평가를 위해 12 개의 우물 판에 멀티 로브 (오른쪽) 폐를 놓고 얼음을 유지하십시오. 지금은 이웃을 잘 비워 두십시오.
참고: 각 샘플의 크기가 가깝도록 모든 마우스에서 동일한 폐(멀티 로브)를 사용하는 것이 중요합니다. 단 하나 로브 폐는 그 때 조직 병리학 같이 그밖 분석을 위해 이용될 수 있습니다.
참고: 샘플은 몇 시간 동안 얼음이나 4°C에서 안정적입니다.
5. 조직 처리
참고: 이 섹션의 모든 단계는 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.
- 마우스 당 1 15mL 원전 튜브를 라벨과 각 튜브에 2.5mL 타입 IV 콜라게나아제 혼합물과 30 단위의 엘라스타아제를 추가합니다. 타입 IV 콜라게나아제 혼합물을 만들기 위하여는, mL 1x HBSS 및 멸균 필터 당 타입 IV 콜라게나아제의 2 mg을 녹입니다. 이는 -20°C에서 최대 12개월까지 보관하고 필요할 때 해동할 수 있다.
- 폐를 두 번째로 옮기고, 그 견본을 위해 잘 1x HBSS를 청소합니다. 남은 혈액을 제거하기 위해 집게를 사용하여 소용돌이. 깨끗한 폐를 빈 3.5 cm 조직 배양 판으로 옮기습니다. 가위로 폐를 다진다. 1x HBSS2.5mL의 린스 플레이트는 1x HBSS와 폐 조각을 이미 콜라게나아제/엘라스타제 칵테일(총 5mL)을 함유하고 있는 15mL 원전 튜브로 옮킨다.
- 4 °C에서 75 분 동안 배양하십시오. 이 시간 동안 샘플을 계속 혼합하므로 튜브를 로커 또는 회전 휠에 배치하십시오. 이 인큐베이션 단계 동안 각 마우스에 대해 50mL 원심분리기 튜브와 10cm 조직 배양 판을 라벨로 지정합니다. 희석을 하는 경우 희석을 위해 충분한 10cm 조직 배양 판을 라벨로 지정하십시오.
참고: 조직 배양 판의 뚜껑에 라벨을 붙입니다. 접시 자체에 레이블을 지정하는 경우, 쓰기피지-ImageJ 분석을 방해할 것입니다. - 1배 HBSS로 각 튜브의 최대 10mL 를 가져옵니다. 각 샘플에 대해 70 μm 셀 스트레이너위에 내용물을 50mL 원문 튜브에 붓습니다. 1 mL 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 샘플을 부드럽게 갈아서 더 많은 세포가 걸러낼 수 있도록 합니다.
- 원심 분리기는 실온 (RT)에서 350 x g에서 5 분 동안. 1x HBSS10mL로 상체를 버리고 펠릿을 씻으십시오. 이 단계를 두 번 반복합니다.
- RPMI 또는 IMDM 중 60 μM 6TG 완전 문화 매체의 10mL에서 펠릿을 재중단합니다. 10cm 세포 배양 판에서 플레이트 샘플을, 원하는 경우 희석 방식을 사용하여. 37°C에서 배양하고 5일 동안 5%CO2를 배양합니다.
참고: 1:2, 1:10 및 1:100은 연구 매개 변수에 따라 경험적으로 결정되어야 하는 일반적인 희석제입니다.
주의: 6TG는 독성이 있습니다. 취급 시 주의하고 폐기를 위한 모든 환경 보건 및 안전 지침을 따르십시오.
6. 스테인딩 플레이트
- 적절한 폐기물 용기에 접시를 배양 미디어를 부어. 플레이트당 5mL의 희석되지 않은 메탄올을 추가하고 RT에서 5분 동안 배양하여 전체 플레이트를 덮도록 메탄올을 소용돌이치게 합니다.
주의: 메탄올은 섭취, 흡입 또는 피부에 있는 경우 위험합니다. 이 단계에 는 연기 후드를 사용합니다. - 메탄올을 접시에 붓고 적절한 폐기물 용기에 넣습니다. 접시당 증류수 5mL로 접시를 헹구고 적절한 폐기물 용기에 물을 붓습니다. 플레이트당 0.03% 메틸렌 블루 5mL를 추가하고 RT에서 5분 동안 배양하여 메틸렌 블루 용액을 소용돌이시켜 전체 플레이트를 덮습니다.
- 메틸렌 블루를 적절한 폐기물 용기에 붓습니다. 접시 당 증류수 5mL로 다시 접시를 헹구십시오. 접시를 거꾸로 뒤집어 종이 타월에 얼룩을 두어 여분의 액체를 제거합니다. 뚜껑에 접시를 놓고 RT에서 밤새 공기를 건조시키십시오.
참고: 전이성 식민지는 파란색이 될 것입니다. 플레이트가 건조되면 RT에 무기한 보관할 수 있습니다.
7. 이미지 분석
- 샘플의 명확한 식별을 보장하기 위해 주의, 접시에서 라벨 뚜껑을 제거합니다. 모든 스테인드 폐 판을 깨끗하고 밝은 표면에 정렬하여 모든 플레이트를 하나의 이미지로 촬영합니다.
- 조명이 잘 되는 공간에서 플레이트 컬렉션을 촬영하여 플레이트가 매우 반사되어 반사를 최소화합니다. 플레이트의 반사는 이미지 분석에 영향을 미치므로 피해야 합니다.
참고 : 피지 - 이미지J의 상한이 2 기가 픽셀. 대부분의 현대 스마트 폰은 충분한 카메라를 해야합니다. 8메가픽셀 미만의 카메라를 사용하지 마십시오. 이 실험에 사용된 카메라는 Google 픽셀 2에서 12.2 메가 픽셀이었습니다. - 플레이트를 포함하도록 이미지를 자르지만 이미지 배경에 있는 뚜껑이나 다른 것은 제외합니다. 피지 이미지J에 잘려진 이미지를 업로드합니다.
- 이미지, 조정, 색상 임계값, 임계값 임계값, 임계값 설정 방법: 기본값, 임계값 색상: B&W, 임계값 공간: Lab. 어두운 배경 상자 선택 취소: 다음 명령을 사용하여 이미지를 흑백으로 변경합니다. 이제 이미지가 흑백이어야 합니다. 검은색은 밝은 배경을 나타내고 흰색은 파란색 전이성 콜로니를 나타냅니다.
- 피지-ImageJ 도구 모음의 원 도구를 사용하여 분석할 영역을 선택합니다. 각 플레이트가 동일한 크기의 영역에 대해 분석되도록 모든 플레이트에 사용할 원 1개를 그립니다. 플레이트 가장자리에 나타나는 배경 잡음을 최소화하면서 플레이트의 분석 영역을 최대화하는 크기를 선택합니다. 크기는 그릴 때 도구 모음에 나타나므로 원이 그려질 때 높이와 너비를 모니터링하여 완벽한 원을 만들 수 있습니다.
- 선택한 원을 분석하여 파란색 전이성 콜로니가 있는 플레이트 영역을 나타내는 영역의 백분율이 흰색인지 확인합니다. 다음 명령을 사용합니다.
분석, 분석 입자, 크기 (픽셀2):0-무한대, 원형: 0.00-1.00, 표시: 없음, 및 요약 상자를 확인 합니다. 확인을 명중. - % 영역 결과를 기록합니다. 이는 선택한 영역의 백분율이며 따라서 전이성 부담을 나타냅니다.
참고: 결과를 피지-ImageJ에 저장하거나 전체 결과 페이지를 별도의 문서에 복사/붙여넣는 것이 좋습니다. % 영역 결과가 예기치 않거나 의심스러운 경우 다른 측정값도 의심스러운지 또는 % 영역이 잘못 기록되었는지 확인할 수 있습니다. - 그 크기를 중앙에 잡아서 크기를 변경하지 않고 원을 그림의 다음 접시로 이동합니다. 그림의 모든 플레이트에 대해 7.6 및 7.7 단계를 반복합니다.
- 7.1 - 7.8 단계를 두 개 이상의 이미지에서 반복합니다. 모든 플레이트와 이미지를 분석한 결과 각 플레이트의 서로 다른 이미지 간에 평균 %면적 결과가 생성되어 그림 간의 불일치를 완화합니다.
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Representative Results
이 방법은 풀라스키 및 오스트랜드-로젠버그 4T1 프로토콜3에서 간단한 조정을 포함하고 그림 1에서시각화할 수 있다. 3명의 별도 연구원이 12개의 폐판(1:10 희석)에 대해 수동으로 전이성 콜로니를 계산했을 때, 결과는 다른카운터(그림 2A)간에매우 일치하지 않았다. 모든 연구자들은 "푸른 점으로 나타나는 전이성 식민지를 계산"하도록 지시받았지만, 불일치는 고전이성 플레이트를 수동으로 계산하는 문제를 보여줍니다. 연구원은 4T1 모형을 가진 경험의 다양한 수준을 가졌습니다. 보드 인증 수의병리학자는 피지-ImageJ 폐판분석(도 2B)과비교하기 위한 또 다른 방법으로 전이를 위한 H&E 염색폐 슬라이드를 분석하였다.
피지-ImageJ 분석을 사용하여 3명의 별도 연구원은 12개의 플레이트(1:2 희석)의 수집에 대한 3개의 개별 이미지를 분석했습니다. 이미지는 약간 다른 조명두 개의 별도 실험실 공간에서 촬영되었습니다. 플레이트의 배열 또는 사진을 찍은 각도는 각 이미지마다 달랐습니다. 수동 계산 결과와는 달리, 피지-ImageJ 결과는 각각 3개의이미지(그림 3A)에대한 카운터 간에 일관되게 일치하였다. 3개의 이미지 사이에 불일치가 있었는지 확인하기 위해, 3개의 이미지와 3개의 카운터로부터의 결과는 폐판당 결합되었다(도3B). 일부 플레이트의 이미지에는 차이가 있지만 전반적인 추세는 유사하며 수동 계산보다 일관성이 높습니다. 3개의 상이한 이미지 사이의 변형을 고려하기 위해 각 이미지의 결과는 각플레이트(그림 3C)에대해 평균화되었습니다. 이러한 평균은 전이성 부담을 정확하고 정확하게 분석하는 카운터 간에 일관된 결과를 제공했습니다. 따라서 이 프로토콜은 플레이트 컬렉션의 적어도 3개의 이미지를 다른 배열, 다른 각도 또는 약간 다른 조명 설정에서 촬영한 다음 결과를 분석하고 평균화하는 것을 제안합니다. 그림 2A와 그림 3C를비교할 때 수동 계수와 피지-ImageJ 분석 간의 대비가 시각화됩니다.
이 프로토콜에서 제공하는 개선을 입증하는 또 다른 방법은 그림 2와 그림 3의수를 기반으로 카운터 사이의 가장 이상전성 부담에서 가장 적은 전이성 부담으로 플레이트의 순위를 비교하는 것입니다. 수동 계산은 가장 컨할 수 있는 플레이트에 동의했지만, 다음 순위는카운터(그림 4A)와일치하지 않았다. 대조적으로, 각 이미지에 대한 피지 이미지J 분석의 순위는 카운터(그림 4B)사이에훨씬 더 일치했다. 일관성은 각 플레이트에 대한 각 이미지의 결과가 평균되었을 때도 볼 수있습니다(그림 4C). 이 프로토콜은 카운터 간에 완전한 일관성을 제공하지는 않지만 그림 4A와 그림 4C를비교할 때 수동 계산에서 개선된 것입니다. 조직 병리학 적 분석은 수동 및 피지 이미지J 계산(그림 4D)과모두 달랐다.
이미지의 반사를 피하는 것의 중요성을 입증하기 위해, 손의 반사와 후속 피지-ImageJ 분석이 있는 이미지가 반사없이 동일한 플레이트에 반대하는(왼쪽)(그림5A)를나타내고 있다. 더러운 배경 표면이나 플레이트의 혈액 샘플 잔류물에서 다른 어두운 결점도 피지-ImageJ 분석에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 그림 5B의 혈전은 2전전이성 식민지 (흰색 화살표로 지적됨)만 가지고 있지만 어두운 잔류물 (검은 화살로 지적됨)은 피지 -ImageJ가 31.6 %의 전이성으로 간주했습니다. 따라서, 혈액 샘플이 전이성 식민지가 아닌 플레이트에 잔류 다크 스팟을 남길 것이기 때문에 깨끗하고 가벼운 표면을 가지고 혈액 샘플에 이 방법을 사용하지 않는 것이 중요합니다.
그림 1: 프로토콜 회로도. 이 프로토콜은 4T1 모델에서 폐 전이를 분석하는 데만 중점을 둡니다. 이 프로토콜의 일반적인 흐름은 배양에서 4T1 세포를 성장시키고, 왼쪽 복부 유방 지방 패드에 4T1 세포를 주입하고, IACUC 및 기관 프로토콜에 따라 마우스를 모니터링하고, 마우스를 희생하고 폐를 수집, 폐 샘플에서 세포를 수집하고, 6TG 선택 배지에서 세포를 수집하고, 6TG 선택 배지에서 세포를 수집하고, 피지 를 사용하여 세포를 고정및 염색하는 것을 포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수동으로 전이성 세포를 계산하고 조직 병리학 적 분석은 일치하지 않는 결과를 가지고 있습니다. A. 1:10 희석을 가진 12개의 폐 판은 연구원 사이에서 다양하더라도 전이성 식민지를 같은 방식으로 계산하도록 지시된 3명의 개별 연구원에 의해 수동으로 계산되었습니다. 계산된 전이성 식민지의 수는 연구원 사이에서 크게 변화했습니다. B. H&E 염색 폐 슬라이드에 존재하는 전이체로 분류된 개별 종양 세포 응고를 확인하고 정량화한 조직 병리학 분석. 하나의 대표적인 슬라이드의 높은, 중간 및 낮은 배율 이미지가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 피지-ImageJ 분석은 전이성 부담을 결정하는 데 정확하고 정확합니다. A. 12 개의 폐 판은 1:2 희석을 가진 12 개의 폐 플레이트가 12 개의 폐 판의 3 개의 별도 이미지에서 3 명의 분리 된 연구원에 의해 분석되었습니다. B. 3명의 연구원각각에 의하여 3개의 심상 각각에서 결과가 결합되었습니다. C. 3개의 심상에서 각 폐 판에서 결과는 평균했다. Tukey의 다중 비교 시험을 가진 단방향 ANOVA는 각 폐 판에 대한 카운터 사이 중요한 다름을 결정하지 않았습니다. 데이터는 평균 + SD로 표시됩니다.
그림 4: 피지-ImageJ 분석은 수동 계수 및 조직 병리학 분석에 비해 전이성 부담의 보다 일관된 순위를 제공합니다. A. 그림 2에서 동일한 폐 플레이트는 그림 2의 수동 수에 따라 대부분의 전이성에서 가장 적은 전이성으로 순위가 매겨졌습니다. B. 그림 3에서 동일한 12 개의 폐 플레이트는 그림 3AC의 피지 -ImageJ 분석을 기반으로 가장 이상 전이성에서 가장 적은 전이성으로 순위가 매겨졌습니다. D. 폐 슬라이드는 조직 병리학 적 평가에 따라 대부분의 전이성에서 가장 적은 전이성으로 선정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 반사 및 비전성 다크 스팟은 결과에 부정적인 영향을 미칩니다. A. 사진을 찍는 손을 반사하는 이미지는 피지 이미지 J 분석 (왼쪽)을 올바른 피지 -ImageJ 분석 (오른쪽)에 비교하는 것과 같이 피지 이미지 J 분석을 방해합니다 (오른쪽) B. 혈액 판은 종종 전이성 식민지 (흰색 화살표)가 아닌 접시에 남은 얼룩 (검은 화살표)을 남깁니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
입증된 바와 같이, 각 폐 판상에 전이성 콜로니를 수동으로 세는 것은 폐 전이를 정량화하는 부정확하고 부정확한 방법이 될 수 있으며, 더 나은 정량화 수단에 대한 필요성을 입증할 수있다(도 2). 히스토병학적 분석은 H&E 슬라이드가 전체 장기의 대표적인 샘플이 아니기 때문에 수동 계수와 피지-ImageJ분석(그림 2B 및 4D)과약간 차이가 있었습니다. 프로토콜은 전체 폐를 수확하고, 그러므로 총 폐 전이를 더 대표하고, 수동 계산 보다는 더 일관적입니다. 피지-ImageJ 분석에 대 한 몇 가지 다른 접근 시도 하 고 아래 설명, 하지만 위에서 설명 하는 프로토콜 우수한 방법으로 나타납니다.
폐, 혈액 및 뇌 샘플이 연구를 위해 수집되었습니다. 그러나, 혈액과 두뇌 견본은 아주 몇몇 전이성 식민지가 있었습니다, 전혀 있는 경우에. 우리는 수동으로 전이성 식민지를 세는 것이 이 덜 전이성 조직에 최적이라고 결정했습니다, 그러므로 혈액과 두뇌 데이터는 포함되지 않았습니다. 전이성 부담이 수동으로 계산하기 쉬운 경우(예: 수천 개가 아닌 10개 또는 20개의 전이성 식민지) 인간의 실수의 원래 문제는 관련이 없으므로 이 프로토콜이 필요하지 않습니다. 또한, 혈액 샘플은 고정 후 플레이트에 어두운 반점을 남길 수 있으며, 이는 피지-ImageJ분석(그림 5)을방해한다. 중요한 것은, 주입된 세포의 양은 전이성 부담에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 더 적은 세포가 주입되고 마우스가 더 오래 살아남을 수 있는 경우에, 암은 두뇌3,4같이 전통적으로 더 적은 전이성 사이트에 퍼지는 더 많은 시간이 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 고전성이 될 시간이 주어지면 다른 조직의 전이성 부담을 포함하도록 수정될 수 있다. 4T1 모델을 처음으로 시도하거나 주입된 세포의 양을 변경하는 경우, 세포를 도금할 때 적어도 두 개의 희석을 시도하는 것이 좋습니다. 이 연구를 위해, 우리는 1:2와 1:10 희석을 사용했습니다. 1:2 희석은 수동으로 계산하기 어려웠을 것이지만 피지-ImageJ에서 쉽게 계산되었습니다. 1:10 희석은 여전히 수동으로 계산하기가 어려웠기 때문에 일치하지 않는 결과를 초래했습니다. 희석은 특정 스터디 매개 변수에 따라 수정될 수 있습니다.
사진은 개별 폐 판과 12 개의 폐 판이 함께 찍은 것입니다. 개별 플레이트는 피지-ImageJ에 업로드하기 전에 플레이트의 중앙 사각형으로 이미지를 자르거나 피지-ImageJ의 원 선택 도구를 사용하여 잘라진 이미지에서 플레이트의 중앙 원을 선택하는 두 가지 방법으로 분석되었습니다. 우리는 피지 -ImageJ에서 원 선택 도구를 사용하여 모든 플레이트에 대한 분석을위한 동일한 크기의 영역을 만드는 가장 쉽고 일관된 방법을 제공했다는 것을 발견했다. 더욱이, 동일한 이미지로 폐판의 전체 수집을 분석하는 것은 단일 폐 판의 개별 심상을 분석하는 것이 우수했다. 동일한 이미지에 모든 폐 플레이트를 사용하면 동일한 크기의 원이 폐 플레이트 사이에 쉽게 사용할 수 있습니다. 모든 폐 플레이트가 카메라와 동일한 거리이므로 분석을 위한 동일한 크기의 원은 이미지의 모든 폐 플레이트에 적합한 크기여야 합니다. 또한 플레이트 사이에 원을 다시 그리는 것이 필요하지 않기 때문에 분석이 더 빨라집니다. 크기를 변경하지 않고 이미지의 다음 플레이트로 드래그하기만 하면 그림의 모든 플레이트에 동일한 크기가 사용됩니다. 원의 크기를 선택할 때, 플레이트의 가장자리에서 배경 잡음을 피하기에 충분히 작으면서 도면의 대부분을 분석할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 더욱이, 시약을 저장하기 위해, 세포는 또한 6 웰 플레이트에서 도금하고 10cm 조직 배양 판에 비해. 6 웰 플레이트의 피지-ImageJ 결과는 덜 일관적이었고 10cm 요리 (표시된 데이터)와 상관 관계가 없습니다. 한 가지 설명은 더 작은 표면적으로 분석할 영역이 작아대표적인 데이터가 줄어듭니다. 또 다른 하나는 표면적을 줄이면 다른 생존 세포에 더 가까워지면 세포가 더 빨리 성장할 수 있다는 것입니다. 따라서, 우리는 우리가 프로토콜에 설명 한 것 이외의 조직 배양 시약을 사용하지 않는 것이 좋습니다.
앞에서 언급했듯이 반사를 피하고 깨끗하고 가벼운 배경을 갖는 것은이 방법에 절대적으로 중요합니다. 그림 5A는 피지-ImageJ에서 반사를 분석하는 방법을 보여 주므로 반사를 피하는 것이 중요합니다. 조직 배양 판은 매우 반사, 그것은 자신이 또는 위의 광원에서 반사를 피하기 위해 약간의 각도에서 사진을 찍는 것이 좋습니다. 특정 작업 영역의 조명 조건을 고려해야 합니다. 우리는 분석 할 플레이트의 여러 사진을 복용하는 것이 좋습니다, 약간 다른 배열 및 / 또는 각도를 시도, 잘 조명 영역에서. 어떤 반사에 대한 강렬하게 사진을 공부. 분석에 불일치가 있는 경우 화질 문제로 인해 발생할 수 있습니다. 문제를 해결하려면 일반 그림을 흑백 그림과 비교합니다. 일반 그림에서 파란색이 아닌 영역이 흑백 그림에서 흰색으로 나타나면 결과를 변경하는 반사 또는 흠이 있을 수 있습니다.
일관성 외에도 이 방법의 또 다른 주목할 만한 이점은 수동 계산보다 훨씬 빠르게 데이터를 생성한다는 것입니다. 피지-ImageJ 분석은 빠르게 수행 할 수있는 동안 수동으로 여러 플레이트를 계산하는 것은 매우 시간이 많이 걸립니다. 또한 잠복기 시간을 단축할 수 있습니다. 풀라스키와 오스트랜드-로젠버그는 도금 된 세포에 대한 10-14 일 잠복기를 권장하여 연구3에상당한 시간을 추가합니다. 10-14일 잠복기는 더 크고 수에 쉽게 식민지가 형성될 수 있게 합니다. 그러나, 많은 폐 판은 그 전에 confluent 될 수 있습니다. 대신, 5일 간의 인큐베이션은 6TG 선택으로 비암성 세포를 죽일 수 있는 충분한 시간을 제공합니다(건강한 대조군 마우스가 폐 판에 식민지가 없는 것으로 입증되고, 데이터는 표시되지 않음), 그리고 피지-ImageJ로 쉽게 정량화될 수 있을 만큼 세포가 충분히 성장할 수 있도록 합니다. 이것은 현저하게 희생되는 마우스 사이 시간을 감소시키고 필수적인 전이성 데이터를 분석합니다.
결론을 위해 이 방법의 이점은 한계보다 훨씬 큽니다. 우리는이 방법이 완벽한 일관성을 제공하지 않는다는 것을 인정합니다. 이것은 덜 전이성 조직에 대한 이상적인 방법은 아니지만, 그 조직은 쉽게 수동으로 계산 할 수 있습니다. 반사없이 그림을 얻는 것은 몇 가지 신중한 사진을 필요로 할 수 있지만,이 방법으로 얻은 일관성은 중요하다. 이 방법은 전이성이 높은 다른 조직및 스테인드 객체를 계산해야 하는 기타 프로토콜에 사용될 수 있습니다. 연구 디자인은 또한 전이의 비율 또는 전이에 항암 처리의 효력을 분석하는 것을 허용할 수 있었습니다. 이 방법은 매우 일관되고 신뢰할 수 있는 전이 데이터를 제공하며 4T1 모델에 대한 상당한 개선을 나타냅니다. 곧 유방암 전이 연구에이 모델의 응용 프로그램은 유방암 사망에 맞서 싸울 수있는 도구를 가진 연구원을 무장에 가장 중요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 버지니아 -메릴랜드 수의과 대학 (IA), 엔지니어링 건강을위한 중요한 기술 및 응용 과학 센터 (IA), 및 건강 R21EB028429 (IA)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
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- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
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- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
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