Summary
Vi beskriver en mere konsekvent og hurtig metode til at kvantificere lungemetastase i 4T1 brystkræft model ved hjælp af Fiji-ImageJ.
Abstract
Brystkræft er en ødelæggende malignitet, der tegner sig for 40.000 kvindelige dødsfald og 30% af nye kvindelige kræftdiagnoser i USA i 2019 alene. Den hyppigste årsag til brystkræft relaterede dødsfald er den metastatiske byrde. Derfor, prækliniske modeller for brystkræft nødt til at analysere metastatisk byrde at være klinisk relevant. Den 4T1 brystkræft model giver en spontant metastaserende, kvantificerbare mus model for fase IV human brystkræft. Men de fleste 4T1 protokoller kvantificere metastatisk byrde ved manuelt at tælle farvede kolonier på væv kultur plader. Selv om dette er tilstrækkeligt til væv med lavere metastatisk byrde, menneskelige fejl i manuel optælling forårsager inkonsekvente og variable resultater, når pladerne er sammenløbet og vanskeligt at tælle. Denne metode tilbyder en computerbaseret løsning til menneskelig optællingsfejl. Her evaluerer vi protokollen ved hjælp af lungen, et meget metastatisk væv i 4T1-modellen. Billeder af methylenblåde plader erhverves og uploades til analyse i Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bestemmer derefter procentdelen af det valgte område af billedet, der er blåt, og repræsenterer pladeprocenten med metastatisk byrde. Denne computerbaserede tilgang giver mere ensartede og hurtige resultater end manuel optælling eller histopatologisk evaluering for meget metastatisk væv. Konsistensen af Fiji-ImageJ resultater afhænger af kvaliteten af billedet. Små variationer i resultaterne mellem billederne kan forekomme, og det anbefales derfor, at der tages flere billeder og resultaterne i gennemsnit. På trods af sine minimale begrænsninger, denne metode er en forbedring at kvantificere metastatisk byrde i lungerne ved at tilbyde konsekvente og hurtige resultater.
Introduction
En ud af otte kvinder vil blive diagnosticeret med brystkræft i hendes levetid, og alligevel på trods af flere behandlingsmuligheder brystkræft er den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald hos amerikanske kvinder1. Disse kvinder er ikke ved at dø af den primære tumor i deres bryst. I stedet, den metastatiske byrde er ansvarlig for dødeligheden af denne sygdom, da det almindeligvis breder sig til lungen, knogle, hjerne, lever, og lymfeknuder2. På grund af dette, brystkræft modeller nødt til at evaluere metastase til at bidrage til at bremse dødeligheden af denne sygdom. Den 4T1 murine brystkræft model er en fantastisk protokol til at opnå dette. Den metode, der er beskrevet her, giver en forbedring af 4T1-modellen ved at bruge Fiji-ImageJ til at kvantificere lungemetastase, hvilket giver konsekvente og hurtige resultater.
4T1-modellen er veletableret, og de fleste laboratorier bruger protokoller som dem, der er beskrevet af Pulaski og Ostrand-Rosenberg i 20013. Den 4T1 celle linje er 6-Thioguanin (6TG) resistente og repræsentative for fase IV, tredobbelt negativ brystkræft3,4,5. Det er klinisk relevant, da det er en ortopisk model og spontant metastaserer til de samme organer som i human brystkræft3,4. 4T1-cellerne metastaserer spontant med en forudsigelig hastighed baseret på mængden af indsprøjtedeceller 3,4. Det er vigtigt, at genetiske forskelle mellem mus, der anvendes her, forårsagede forventede interpersonelle variabiliteter i metastatisk byrde. For at evaluere metastase høstes væv for at indsamle og kvantificere kræftceller på fjerne steder ved hjælp af 6TG udvælgelse og methylenblå farvning. Resultatet er en samling af vævskulturplader med blå prikker, der repræsenterer metastatiske kolonier. Pulaski- og Ostrand-Rosenberg-protokollen kvantificerer imidlertid metastatiske kolonier ved manuelt at tælle dem, og derfor har dette været standardmetoden til vurdering af metastase i denne model. Mens dette er let for væv med lav metastatisk byrde, væv som lungerne er ofte lastet med metastaser. Da lungeplader kan være meget sammenflydende, præcist og præcist kvantificere metastatiske kolonier ved manuel optælling er vanskeligt og udsat for menneskelige fejl. For bedre at kvantificere metastatisk byrde, beskriver vi ved hjælp af Fiji-ImageJ for en computer-baseret løsning til menneskelig optælling fejl. Histopatologisk analyse med hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning er et andet middel til at kvantificere lungemetastaser, og interessant er også blevet forbedret med Fiji-ImageJ software6,7. Men fordi histopatologisk analyse observerer en enkelt skive af lungerne, kan det være unøjagtige og ikke repræsentative. Dette skyldes, at 4T1-modellen forårsager flere metastatiske læsioner i hele orglet, der ikke er jævnt fordelt. Mens de generelle tendenser mellem histopatologisk analyse og manuel optælling kan væreens 8, kan individuelle værdier variere, og derfor bør histopatologisk analyse ikke anvendes som det eneste middel til kvantificering. Vi demonstrerer fordelen i forhold til histopatologisk analyse og uoverensstemmelserne i manuel optælling mellem forskellige tællere, samtidig med at vi viser sammenhængen i brugen af Fiji-ImageJ. Derudover viser vi, at denne metode kan reducere inkubationstiden fra 10-14 dage til 5 dage, hvilket betyder, at forskere kan analysere data fra deres undersøgelse meget hurtigere, end når de er afhængige af manuel optælling.
Denne metode er en samling af enkle justeringer af Pulaski- og Ostrand-Rosenberg-protokollen3. Fordi 4T1-modellen er meget udbredt, og fordi lungemetastastase er en kritisk parameter at måle i prækliniske modeller, mener vi, at denne metode kan anvendes i vid udstrækning og er meget værdifuld for brystkræftforskere. De eneste ekstra forsyninger behov er et kamera og adgang til en computer med Fiji-ImageJ, en gratis software, der ofte anvendes i billedanalyse9. Denne metode fokuserer specifikt på lungemetastase, men det kunne bruges til andre væv med betydelig metastatisk byrde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Den Institutionelle Animal Care and Use Committee (IACUC) i Virginia Tech og i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for pleje og brug af laboratoriedyr. Udførelse af denne protokol kræver tilladelse fra de relevante institutioner og overholdelse af alle relevante retningslinjer.
1. Cellekultur
- Lav komplette kulturmedier (RPMI + 10% Føtal Bovine Serum +1% Pen Strep). 4T1 celler genoplives i henhold til ATCC-protokol10 og inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i en T-25-kolbe indtil sammenløbet. Skift medier dagen efter genoplivning for at fjerne døde celler, og igen, hvis medierne er brugt, før cellerne er sammenløbet nok til passage.
- Når T-25-kolben er sammenløbet, skal der gås fra celler til en T-75-kolbe ved at kassere medier, vaske kolben med 5 ml 1x Dulbeccos fosfatbunede saltvand (DPBS) og tilsætte 500 μL Trypsin-EDTA. Inkuber i 5-10 minutter ved 37 °C, indtil cellerne løsner sig.
- Når du er afmonteret, tilsættes 5 ml opvarmet komplet kulturmedier til celler. Aspirere og overfør 5 ml til en T-75 kolbe indeholdende 15 ml opvarmet komplet kulturmedie.
- Passageceller i T-75 kolber mindst fire gange. Gør dette, når kolben er sammenløbet ved vask med 8 ml 1x DPBS, tilføjer 1 ml Trypsin-EDTA til afmontere celler, tilføje 10 ml opvarmet medie til celler, og fortynde 1:6-1:8 i en ny T-75 kolbe indeholder 20 ml opvarmet komplet kultur medier.
- Passageceller op til et passende antal T-150 kolber, der indeholder 40 ml opvarmet totalt kulturmedie, for at antallet af mus kan injiceres. De fleste undersøgelser vil kræve flere T-150 kolber for at sikre nok celler til injektion.
- Når mus er klar til at blive injiceret (8 uger gamle eller vejer over 20 g, afhængigt af IACUC eller institutionelle protokoller), høste celler ved at kassere medier, vask hver kolbe med 10 ml 1x DPBS og tilføje 2 ml trypsin-EDTA. Inkuber i 5-10 minutter ved 37 °C, indtil cellerne løsner sig.
- Kolbe vaskes med 10 ml komplet medie, og alt indhold (10 ml medie + 2 ml trypsin-EDTA-celleblanding) overføres til den næste kolbe. Fortsæt med at vaske og indsamle celler fra hver kolbe med de samme 10 ml medier for at undgå at bruge en for stor mængde medier.
- Når alle kolber er opsamlet, overføres indholdet til et 50 ml centrifugerør. Der udtages en 10 μL prøve til optælling i et mikrocentrifugerør, og det koniske 50 ml koniske rør centrifugeres ved 125 x g i 5 minutter.
- Mens celler centrifugeres, tilsættes 10 μL Trypan blå til 10 μL celleprøve. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer. Når det samlede antal celler er bestemt, beregnes den koncentration af celler, der er nødvendige for at injicere mus, i 1,2 x 106 celler pr. mus (pr. 100 μL).
- Efter centrifugering, dekantering af medier og resuspenderet cellepellet i korrekt mængde steril 1x DPBS til 1,2 x 106 celler pr. 100 μL. Split celle/ DPBS blanding i mikrocentrifuge rør for nem adgang med sprøjten, når indsugning celler til injektion. Hold celler på is og injicere snart derefter som celler vil begynde at dø efter at være på is i længere tid.
2. Injektioner
- Tilbered cellerne til injektion ved at trykke på eller forsigtigt blande mikrocentrifugerøret for at opslænke cellerne igen, og indsugning derefter 600 μL i en 1 ml sprøjte. Drej sprøjten opad, og træk stemplet ned for at få cellerne væk fra sprøjteåbningen. Bank på sprøjten for at befri den for luftbobler.
- Fastgør kanylen op og dispenser cellerne tilbage i mikrocentrifugerøret, indtil der kun er 500 μL tilbage i sprøjten. Sæt sprøjten fladt på is.
BEMÆRK: 4T1 celler falder hurtigt ud af suspensionen. Derfor er det vigtigt at blande cellerne tilbage i suspensionen ved at trykke ofte. - Bedøve 8 uger gammel/>20 g kvindelig BALB/c mus ved hjælp af isofluran eller andet godkendt bedøvelsesmiddel. Overvåg musens vejrtrækning for at vurdere dybden af anæstesi.
- Når musen er korrekt bedøvet som angivet ved mangel på hornhinde refleks, placere musen på ryggen. Hold forsigtigt musen nede ved hjælp af tommelfingeren, markøren og langfingeren. Brug markøren og midterste fingre til at holde musens overkrop og tommelfinger for sin bageste venstre ben. Vær blid, men fast.
- Når kanylen er op, indsprøjtes 100 μL celler subkutende ind i musens venstre abdominale mælkefedtpude. Overvåg for en god bleb og enhver lækage, og sørg for musen vågner op og bevæger sig let efter injektion.
- Skift nåle mellem hver mus.
BEMÆRK: Lad ikke nålen komme ind i bughulen. Dette ville medføre, at kræften spredes hurtigt og ikke være repræsentativ for modellen. For at sikre en subkutan injektion skal du forsigtigt trække opad på nålen, når den indsættes i den venstre abdominale brystfedtpude. Hvis nålen let løftes opad, er den korrekt placeret subkutende.
- Skift nåle mellem hver mus.
3. Overvågning
- Monitor mus mindst 3 gange om ugen for vægt, kropstilstand score, tumor størrelse, tumor tilstand, respiration, aktivitetsniveau, udseende, og bevægelse. Når tumoren når 0,7-0,8 cm i diameter, begynder at overvåge dagligt.
- Overvej dødshjælp, når tumor størrelse når 1.5 cm, eller vægttab når 20%, eller alvorlige kliniske fald i kroppens tilstand score, tumor tilstand, respiration, aktivitetsniveau, udseende, eller bevægelse er observeret baseret på institutionelle retningslinjer.
BEMÆRK: Body condition score er afgørende for at overvåge som kropsvægt kan stige som tumoren stiger i størrelse, negating kropstilstand tab på grund af sygdomsbyrde. De nøjagtige overvågningsprotokoller vil afhænge af de godkendte IACUC- eller institutionelle protokoller.
- Overvej dødshjælp, når tumor størrelse når 1.5 cm, eller vægttab når 20%, eller alvorlige kliniske fald i kroppens tilstand score, tumor tilstand, respiration, aktivitetsniveau, udseende, eller bevægelse er observeret baseret på institutionelle retningslinjer.
4. Obduktion
- Aflivning af mus ved hjælp af CO2 efter institutionelle retningslinjer.
- Spray mus med 70% ethanol til at desinficere. Lav et snit op ventrale midterlinjen af musen til at udsætte kroppen hulrum.
- Fjern nyrerne. Fortsæt med at skære midterlinjen, indtil mellemgulvet er synligt. Brug en saks til at punktere mellemgulvet for at tømme lungerne. Trim mellemgulvet for at få bedre adgang til hulrummet.
- Brug stump saks til at skære midten af brystkassen. Pin brystkasse tilbage for at eksponere lunge og hjerte.
- Se hjertet med 2 ml ikke-steril 1x DPBS ved at indsætte en nål i spidsen af hjertet, indtil det puljer i bughulen, hvor nyrerne blev fjernet.
- For at fjerne hjerte og lunger, bruge stump saks til at skære spiserøret og luftrøret direkte over hjertet. Ved hjælp af scesk, begynder at trække hjertet væk fra kroppen og skæres væk på enhver bindevæv holde det fastgjort. Lungerne vil komme ud med hjertet.
- Identificer de multi-fligede (højre) og enkelt-fligede (venstre) lunger. Hold hjertet knyttet til reference, men når lungerne er identificeret, skære hjertet væk.
- Mærk en 12 brøndplade med 1x Hanks Balanced Saline Solution (HBSS) i hver brønd. Hver mus har brug for 2 brønde. Placer multi-fligede (højre) lunge i 12 godt plade til metastase evaluering og holde på is. Hold naboen godt tom for nu.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge den samme lunge (multi-fligede) fra hver mus for at sikre, at hver prøve er tæt på. Den enkelt-fligede lunge kan derefter bruges til anden analyse, ligesom histopatologi.
BEMÆRK: Prøverne er stabile på is eller ved 4 °C i nogle få timer.
5. Behandling af væv
BEMÆRK: Alle trin i dette afsnit skal udføres ved hjælp af steril teknik.
- Etiket 1 15 ml konisk rør pr mus og tilsæt 2,5 ml type IV collagenase blanding og 30 enheder af elastase til hvert rør. For at gøre type IV collagenase blanding, opløses 2 mg type IV collagenase per ml 1x HBSS og sterilt filter. Dette kan opbevares i op til 12 måneder ved -20 °C og optøet, når det er nødvendigt.
- Overfør lungen til den anden, rengør 1x HBSS godt for den pågældende prøve. Swirl ved hjælp af sniver til at fjerne eventuelle resterende blod. Overfør ren lunge til tomme 3,5 cm væv kultur plade. Hakkende lunge med en saks. Skyl pladen med 2,5 ml 1x HBSS, overføres 1x HBSS og lungestykker til et 15 ml konisk rør, der allerede indeholder kollagenase/elastasecocktail (5 ml total).
- Inkuberes i 75 minutter ved 4 °C. Fortsæt med at blande prøver i denne periode, så placer rør på en rocker eller roterende hjul. Under dette inkubationstrin skal der mærkes 50 ml centrifugerør og 10 cm vævskulturplader til hver mus. Hvis du laver en fortynding, mærke nok 10 cm væv kultur plader til fortyndinger.
BEMÆRK: Mærl låget på vævskulturpladerne. Hvis mærkning pladen selv, vil skriften forstyrre Fiji-ImageJ analyse. - Bring volumen af hvert rør op til 10 ml i alt med 1x HBSS. Indholdet hældes over en cellestien på 70 μm i et konisk rør på 50 ml for hver prøve. Brug stemplet på en 1 ml sprøjte til forsigtigt at slibe prøven gennem sien, så flere celler kan filtreres igennem.
- Centrifuge i 5 minutter ved 350 x g ved stuetemperatur (RT). Kassér supernatanten og vask pellet med 10 ml 1x HBSS. Gentag dette trin to gange.
- Opslæmmet pellet i 10 ml 60 μM 6TG komplette kulturmedier, enten RPMI eller IMDM. Pladeprøver i 10 cm cellekulturplader ved hjælp af en fortyndingsordning, hvis det ønskes. Inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 5 dage.
BEMÆRK: 1:2, 1:10 og 1:100 er almindelige fortyndinger, der skal bestemmes empirisk baseret på undersøgelsesparametre.
FORSIGTIG: 6TG er giftigt. Vær forsigtig, når du håndterer og følger alle retningslinjer for miljøsundhed og sikkerhed for bortskaffelse.
6. Farvning plader
- Hæld kulturmedier fra pladerne i en passende affaldsbeholder. Fix celler ved at tilføje 5 ml ufortyndet methanol pr plade og inkubere i 5 minutter på RT, og sørg for at hvirvle methanol, så det dækker hele pladen.
FORSIGTIG: Methanol er farligt, hvis det indtages, inhaleres eller er på huden. Brug en røghætte til dette trin. - Hæld methanol af pladerne i en passende affaldsbeholder. Skyl pladerne med 5 ml destilleret vand pr. plade, og hæld vand i en passende affaldsbeholder. Tilsæt 5 ml 0,03% methylenblåt pr. plade og inkuberes i 5 minutter ved RT, og sørg for at hvirvle methylenblå opløsning, så den dækker hele pladen.
- Hæld methylenblåt i passende affaldsbeholder. Skyl igen pladerne med 5 ml destilleret vand pr. plade. Vend pladerne på hovedet og skamplet mod en køkkenrulle for at fjerne overskydende væske. Placer pladen på låget og lad luften tørre natten over på RT.
BEMÆRK: Metastatiske kolonier vil være blå. Når pladerne er tørret, kan de opbevares på RT på ubestemt tid.
7. Billedanalyse
- Fjern mærkede låg fra pladerne, idet der sørges for, at prøverne er klar. Line up alle farvede lungeplader på en ren, lys overflade til at tage et billede af alle pladerne i ét billede.
- Tag et billede af samlingen af plader i et godt oplyst område, og sørg for at minimere refleksioner, da pladerne er meget reflekterende. Refleksioner i pladerne vil påvirke billedanalysen og skal derfor undgås.
BEMÆRK: Fiji-ImageJ har en øvre grænse på 2 gigapixels. De fleste moderne smartphones vil have tilstrækkelige kameraer. Brug ikke et kamera mindre end 8 megapixel. Kameraet, der anvendes i dette eksperiment var en 12,2 megapixel på en Google Pixel 2. - Beskær billedet for at medtage pladerne, men ekskluder låg eller andet i baggrunden af billedet. Overfør det beskårne billede til Fiji-ImageJ.
- Skift billedet til sort-hvid ved hjælp af følgende kommandoer: Billede, Juster, Farvegrænse, Tærskelmetode: Standard, Tærskelfarve: B&W, Tærskelplads: Lab. Vælg feltet Mørk baggrund. Billedet skulle nu være sort og hvidt. Sort repræsenterer den lyse baggrund, og hvid repræsenterer de blå metastatiske kolonier.
- Vælg det område, der skal analyseres, ved hjælp af cirkelværktøjet på værktøjslinjen Fiji-ImageJ. Tegn en cirkel, der skal bruges til alle pladerne for at sikre, at hver plade analyseres for området af samme størrelse. Vælg en størrelse, der maksimerer det analyserede område på pladerne, samtidig med at baggrundsstøjen, der vises på kanten af pladerne, minimeres. Størrelsen vises på værktøjslinjen, som den tegnes, så det er muligt at lave en perfekt cirkel ved at overvåge højden og bredden, efterhånden som cirklen tegnes.
- Analysér den valgte cirkel for at bestemme, hvor stor en procentdel af området der er hvidt, hvilket repræsenterer det område af pladen, der har blå metastatiske kolonier. Brug følgende kommandoer:
Analysér, Analysér partikler, Størrelse (pixel2):0-Uendelighed, Cirkularitet: 0,00-1,00, Vis: Intet, og markér afkrydsningsfeltet Opsummer. Ram OK. - Post resultatet % af området. Dette er procentdelen af det valgte område, der er hvidt, og repræsenterer derfor den metastatiske byrde.
BEMÆRK: Det anbefales enten at gemme resultaterne i Fiji-ImageJ eller kopiere/indsætte hele resultatsiden i et separat dokument. Hvis resultaterne af % af området er uventede eller mistænkelige, er det muligt at se, om nogen af de andre målinger også var mistænkelige, eller om % område blev registreret forkert. - Flyt cirklen, uden at ændre dens størrelse ved at snuppe den i midten, til den næste plade på billedet. Gentag trin 7.6 og 7.7 for alle plader på billedet.
- Gentag trin 7.1 – 7.8 på mindst to billeder mere. Når alle plader og billeder er blevet analyseret, gennemsnit % Område resultater mellem forskellige billeder for hver plade for at afbøde eventuelle uoverensstemmelser mellem billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode indeholder enkle justeringer fra Pulaski og Ostrand-Rosenberg 4T1 protokol3 og kan visualiseres i figur 1. Når 3 separate forskere manuelt tælles metastatiske kolonier for 12 lungeplader (1:10 fortynding), resultaterne var meget inkonsekvent mellem forskellige tællere (Figur 2A). Alle forskere blev instrueret til at "tælle metastatiske kolonier, der vises som blå prikker", men uoverensstemmelser viser problemet med manuelt at tælle meget metastatiske plader. Forskerne havde forskellige niveauer af erfaring med 4T1 model. En bord-certificeret veterinær patolog analyseret H & E farvede lunge dias for metastase som en anden metode til at sammenligne med Fiji-ImageJ lunge plade analyse (Figur 2B).
Ved hjælp af Fiji-ImageJ analyse, 3 separate forskere analyseret 3 separate billeder af samlingen af 12 plader (1:2 fortynding). Billeder blev taget i to separate lab rum med lidt anderledes belysning. Placeringen af pladerne eller den vinkel, hvorfra billedet blev taget var forskellige mellem hvert billede. I modsætning til de manuelle optællingsresultater var Fiji-ImageJ-resultaterne konsistente mellem tællerne for hvert af de 3 billeder (Figur 3A). For at afgøre, om der var uoverensstemmelser mellem de 3 billeder, blev resultaterne fra de 3 billeder og de 3 tællere kombineret pr. lungeplade (Figur 3B). Der er forskelle mellem billeder for nogle plader, men de overordnede tendenser er ens, og det giver mere konsistens end manuel optælling. For at tage højde for variationerne mellem de 3 forskellige billeder blev resultaterne fra hvert billede i gennemsnit for hver plade (Figur 3C). Disse gennemsnit gav ensartede resultater mellem tællere, der præcist og præcist analysere metastatisk byrde. Derfor foreslår denne protokol at tage mindst 3 billeder af pladesamlingen i forskellige arrangementer, fra forskellige vinkler eller i lidt forskellige lysindstillinger og derefter analysere og beregne gennemsnittet af resultaterne. Kontrasten mellem manuel optælling og Fiji-ImageJ-analyse visualiseres , når figur 2A sammenlignes med figur 3C.
En anden måde at påvise de forbedringer, der tilbydes af denne protokol er at sammenligne placeringen af pladerne fra de fleste til mindst metastatisk byrde mellem tællere, baseret på optællingerne fra figur 2 og figur 3. Manuel optælling aftalt på den mest sammenløb plade, men alle følgende rækker var inkonsekvent mellem tællere (Figur 4A). Kontrasterende, rækken fra Fiji-ImageJ analyse for hvert billede var langt mere konsekvent mellem tællere (Figur 4B). Konsistensen ses også, når resultaterne fra hvert billede for hver plade blev gennemsnit (Figur 4C). Vi anerkender, at denne protokol ikke giver fuldstændig overensstemmelse mellem tællere, men det er en forbedring fra manuel optælling ved sammenligning af figur 4A til figur 4C. Histopatologisk analyse afveg fra både manuel og Fiji-ImageJ optælling (Figur 4D).
For at vise vigtigheden af at undgå refleksioner i billederne, et billede med en afspejling af en hånd og dens efterfølgende Fiji-ImageJ analyse er vist (venstre) i modsætning til den samme plade uden en refleksion (højre) (Figur 5A). Andre mørke pletter fra en beskidt baggrundsoverflade eller blodprøve rester på pladerne kan have en negativ indvirkning Fiji-ImageJ analyse også. Blodpladen i figur 5B har kun 2 metastatiske kolonier (bemærket af hvide pile), men de mørke rester (bemærket af sorte pile) fik Fiji-ImageJ til at betragte det som 31,6% metastatisk. Derfor er det vigtigt at have en ren, lys overflade og ikke bruge denne metode til blodprøver, da blodprøver typisk vil efterlade resterende mørke pletter på pladen, der ikke er metastatiske kolonier.
Figur 1: Protokolskematisk. Denne protokol fokuserer udelukkende på at analysere lungemetastase i 4T1-modellen. Den generelle strøm af denne protokol omfatter voksende 4T1 celler i kultur, indsprøjtning BALB / c kvindelige mus med 4T1 celler i venstre abdominale mammary fedt pad, overvågning mus i henhold til IACUC og institutionelle protokoller, ofre mus og indsamle lungerne, indsamle celler fra lungeprøver, plating og inkubering celler i 6TG udvælgelse medier, fastsættelse og farvning celler efter 5 dage, tage billeder af pladerne, og analysere ved hjælp af Fiji ImageJ. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Manuel optælling af metastatiske celler og histopatologisk analyse har inkonsistente resultater. A. 12 lungeplader med en 1:10 fortynding blev manuelt talt af 3 separate forskere instrueret om at tælle metastatiske kolonier på samme måde, selv om erfaring med modellen varierede mellem forskere. Antallet af metastatiske kolonier tælles varierede meget mellem forskere. B. Histopatologisk analyse identificeret og kvantificeret individuelle tumor celle aggregater, klassificeret som metastaser, til stede i H & E farvede lungedias. Der vises billeder af høj, mellem og lav forstørrelse af et repræsentativt dias. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fiji-ImageJ-analysen er nøjagtig og præcis ved bestemmelsen af metastatisk byrde. A. 12 lungeplader med en 1:2 fortynding blev analyseret af 3 separate forskere i 3 separate billeder af de 12 lungeplader. B. Resultater fra hver af de 3 billeder af hver af de 3 forskere blev kombineret. C. Resultaterne fra hver lungeplade fra de 3 billeder blev i gennemsnit. Envejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligningstest bestemte ingen signifikante forskelle mellem tællere for hver lungeplade. Data vises som middel + SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fiji-ImageJ-analyse giver en mere ensartet rangordning af metastatisk byrde sammenlignet med manuel optælling og histopatologisk analyse. A. De samme lungeplader fra figur 2 blev rangeret fra de fleste til mindst metastatiske baseret på de manuelle tal fra figur 2. B. De samme 12 lungeplader fra figur 3 blev rangeret fra de fleste til mindst metastatiske baseret på Fiji-ImageJ-analysen fra figur 3A. C. Gennemsnittene fra figur 3C blev rangeret fra de fleste til mindst metastatiske. D. Lungedias blev rangeret fra de fleste til mindst metastatiske baseret på histopatologisk evaluering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Refleksioner og ikke-metastatiske mørke pletter vil have en negativ indvirkning på resultaterne. A. Et billede med en afspejling af en hånd at tage billedet forstyrrer Fiji-Image J analyse, som vist i at sammenligne refleksion Fiji-ImageJ analyse (venstre) til den korrekte Fiji-ImageJ analyse (højre) B. Blodplader ofte efterlader sidesten pletter (sorte pile) på pladerne, der ikke er metastatiske kolonier (hvide pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som påvist kan manuel optælling af metastatiske kolonier på hver lungeplade være en unøjagtig og upræcist metode til kvantificering af lungemetastase, hvilket viser behovet for et bedre middel til kvantificering (figur 2). Histopatologisk analyse afveg en smule fra både manuel optælling og Fiji-ImageJ analyse (Figur 2B og 4D), sandsynligvis fordi H & E dias ikke er et repræsentativt udsnit af hele organet. Protokollen høster en hel lunge, og er derfor mere repræsentativ for total lungemetastase, og er mere konsekvent end manuel optælling. Flere forskellige tilgange til Fiji-ImageJ analyse blev forsøgt og diskuteres nedenfor, men protokollen skitseret ovenfor synes at være den overlegne metode.
Lunge-, blod- og hjerneprøver blev indsamlet til denne undersøgelse. Men, blod-og hjerneprøver havde meget få metastatiske kolonier, hvis nogen overhovedet. Vi fandt ud af, at manuel optælling af metastatiske kolonier er optimal for disse mindre metastatiske væv, og derfor blev blod- og hjernedata ikke inkluderet. Når den metastatiske byrde er let at tælle manuelt (f.eks. 10 eller 20 metastatiske kolonier i modsætning til tusinder), er det oprindelige spørgsmål om menneskelige fejl ikke relevant, og derfor er denne protokol ikke nødvendig. Desuden kan blodprøver efterlade mørke pletter på pladerne efter fiksering, hvilket forstyrrer Fiji-ImageJ-analysen (Figur 5). Det er vigtigt, at mængden af indsprøjtede celler kan påvirke den metastatiske byrde. For eksempel, hvis færre celler injiceres, og musene kan overleve længere, kræften har mere tid til at sprede sig til de traditionelt mindre metastatiske steder som hjernen3,4. Derfor kan denne protokol ændres til at omfatte den metastatiske byrde af andre væv, hvis de får tid til at blive meget metastatisk. Hvis du prøver 4T1-modellen første gang eller ændrer mængden af indsprøjtede celler, anbefaler vi, at du prøver mindst to fortyndinger, når du pletter celler. Til denne undersøgelse brugte vi en 1:2 og 1:10 fortynding. 1:2 fortynding ville have været svært at tælle manuelt, men blev talt let i Fiji-ImageJ. 1:10 fortynding var stadig vanskeligt at tælle manuelt og førte derfor til inkonsekvente resultater. Fortyndinger kan ændres på grundlag af de specifikke undersøgelsesparametre.
Der blev taget billeder af individuelle lungeplader og de 12 lungeplader sammen. Individuelle plader blev analyseret på to måder: enten beskæring billedet til et centralt kvadrat af pladen før upload til Fiji-ImageJ, eller ved hjælp af cirkel valg værktøj i Fiji-ImageJ at vælge den centrale cirkel af pladen i uncropped billede. Vi fandt, at ved hjælp af cirkel valg værktøj i Fiji-ImageJ tilbudt den nemmeste, mest konsekvente måde at skabe en samme størrelse område for analyse for alle plader. Desuden var det bedre at analysere hele samlingen af lungeplader i samme billede end at analysere individuelle billeder af enkelte lungeplader. At have alle lungepladerne i samme billede gør det muligt at bruge den samme størrelse cirkel let mellem lungepladerne. Det sikrer, at alle lungeplader har samme afstand fra kameraet, og derfor bør den samme størrelse cirkel til analyse være den korrekte størrelse for alle lungeplader i billedet. Det gør også analysen hurtigere, da det ikke er nødvendigt at trække cirklen tilbage mellem pladerne. Det er simpelthen trukket til den næste plade i billedet uden at ændre sin størrelse, hvilket garanterer den samme størrelse bruges til alle plader i billedet. Når du vælger størrelsen af cirklen, er det vigtigt at gøre den stor nok til at analysere størstedelen af pladen, mens lille nok til at undgå baggrundsstøj fra kanterne af pladen. Desuden blev cellerne i et forsøg på at redde reagenser også belagt med 6 brøndplader og sammenlignet med de 10 cm vævskulturplader. Fiji-ImageJ resultaterne fra de 6 brøndplader var mindre konsekvente og korrelerer ikke med de 10 cm retter (data ikke vist). En forklaring er den mindre overflade areal giver et mindre område at analysere, hvilket fører til mindre repræsentative data. En anden er, at reducere overfladearealet gør det muligt for cellerne at vokse hurtigere, da de er tættere på andre overlevende celler. Derfor anbefaler vi ikke at bruge andre vævskulturreagenser end det, vi har beskrevet i protokollen.
Som nævnt før, undgå refleksioner og have en ren, lys baggrund er helt afgørende for denne metode. Figur 5A viser, hvordan en refleksion analyseres i Fiji-ImageJ, og viser derfor den afgørende betydning af at undgå refleksioner. Da vævskulturplader er meget reflekterende, er det gavnligt at tage billedet i en lille vinkel for at undgå refleksioner fra enten dig selv at tage billedet eller fra lyskilderne ovenfor. Der skal tages højde for lysforholdene i det specifikke arbejdsområde. Vi foreslår at tage flere billeder af de plader, der skal analyseres, forsøger lidt forskellige arrangementer og / eller vinkler, i et godt oplyst område. Studer billederne intenst for eventuelle refleksioner. Hvis der er uoverensstemmelser i analysen, skyldes det sandsynligvis et billedkvalitetsproblem. Hvis du vil foretage fejlfinding, skal du sammenligne det normale billede med det sort-hvide billede. Hvis områder, der ikke er blå i det normale billede, vises som hvide i det sorte og hvide billede, er der sandsynligvis en refleksion eller skamplet, der ændrer resultaterne.
Ud over konsistens, en anden bemærkelsesværdig fordel ved denne metode er, at det producerer data meget hurtigere end manuel optælling. Manuel optælling af flere plader er meget tidskrævende, mens Fiji-ImageJ analyse kan gøres hurtigt. Det giver også mulighed for en kortere inkubationstid. Pulaski og Ostrand-Rosenberg anbefaler en 10-14 dages inkubationstid for de belagte celler, hvilket tilføjer en betydelig mængde tid til undersøgelsen3. Den 10-14 dages inkubationstid giver mulighed for større, lettere at tælle kolonier til at danne. Men mange lungeplader kan blive sammenløbet inden da. I stedet giver 5 dages inkubation tid til, at 6TG-udvælgelsen kan dræbe ikke-kræftceller (dokumenteret af raske kontrolmus, der ikke har nogen kolonier på deres lungeplader, data, der ikke er vist), og til, at cellerne kan vokse nok til at blive kvantificeret med Fiji-ImageJ. Dette reducerer tiden betydeligt mellem de mus, der ofres, og analyserer vigtige metastatiske data.
Afslutningsvis vil jeg sige, at fordelene ved denne metode langt opvejer begrænsningerne. Vi anerkender, at denne metode ikke giver perfekt konsistens. Selv om dette ikke er den ideelle metode til mindre metastatisk væv, kan disse væv nemt tælles manuelt. Mens få et billede uden refleksioner kan kræve nogle omhyggelig fotografering, konsistensen opnået med denne metode er betydelig. Det er muligt, at denne metode kan anvendes til andre væv, der er meget metastatisk og andre protokoller, der kræver optælling af farvede objekter. Undersøgelsen design kunne også give mulighed for at analysere hastigheden af metastase eller effekten af anti-cancer behandlinger på metastase. Denne metode vil give meget ensartede, pålidelige metastasedata og repræsenterer en betydelig forfinelse af 4T1-modellen. Anvendelsen af denne model til kommende brystkræft metastase forskning er af allerstørste betydning i bevæbne forskere med værktøjer til at bekæmpe brystkræft dødelighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) og National Institutes of Health R21EB028429 (IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
