コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善
Summary
我々は、フィジー-ImageJを用いて4T1乳癌モデルにおける肺転移を定量化するためのより一貫した迅速な方法を記述する。
Abstract
乳癌は壊滅的な悪性腫瘍であり、2019年だけで米国で40,000人の女性死亡と新しい女性癌診断の30%を占めています。乳癌関連死の主な原因は転移性負担である。したがって、乳癌の前臨床モデルは、臨床的に関連する転移性負担を分析する必要があります。4T1乳癌モデルはステージIVのヒト乳癌のための自然転移、定量化可能なマウスモデルを提供する。しかし、ほとんどの4T1プロトコルは、組織培養プレート上の染色されたコロニーを手動でカウントすることによって、転移性負担を定量化する。これは転移負担の少ない組織では十分ですが、手動カウントの人為的ミスは、プレートがコンフルでカウントが困難な場合に矛盾した可変結果を引き起こします。この方法は、人間のカウントエラーに対するコンピュータベースのソリューションを提供します。ここでは、4T1モデルにおける転移性の高い組織である肺を用いてプロトコルを評価する。フィジー-ImageJで分析のためにメチレンブルー染色プレートの画像を取得し、アップロードします。フィジー-ImageJは、画像の選択された領域の青の割合を、転移性負担を持つプレートの割合を表す割合を決定します。このコンピュータベースのアプローチは、転移性の高い組織に対する手動カウントや組織病理学的評価よりも、より一貫した迅速な結果を提供します。フィジー-ImageJの結果の一貫性は、画像の品質に依存します。画像間の結果のわずかな変化が発生する可能性があるため、複数の画像を撮影し、結果を平均化することをお勧めします。その制限は最小限に抑え、この方法は、一貫した迅速な結果を提供することにより、肺の転移性負担を定量化するための改善である。
Introduction
女性の8人に1人は生涯に乳がんと診断されますが、複数の治療オプションにもかかわらず、乳癌はアメリカの女性における癌関連死の第2位の原因です。これらの女性は、彼らの胸の原発性腫瘍で死んでいない。その代わりに、転移性負担は、一般的に肺、骨、脳、肝臓、およびリンパ節2に広がるにつれて、この疾患の死亡率を担う。このため、乳がんモデルは転移を評価してこの疾患の死亡率を抑制する必要があります。4T1マウス乳癌モデルはこれを達成するためのすばらしいプロトコルである。ここで説明する方法は、フィジー-ImageJを使用して肺転移を定量化し、一貫した迅速な結果を生み出すことで、4T1モデルの改善を提供します。
4T1モデルは確立されており、ほとんどのラボでは、2001年にプラスキとオストランド・ローゼンバーグが記述したプロトコルを使用しています。4T1細胞株は、6-チオグアニン(6TG)耐性であり、ステージIV、トリプルネガティブ乳癌3、4、5の代表である。それは、直交性モデルであり、ヒト乳癌3,4と同じ器官に自発的に転移するので、臨床的に関連している。4T1細胞は、3,4を注入した細胞の量に基づいて予測可能な速度で自発的に転移する。重要なことに、ここで使用されるマウス間の遺伝的な違いは、転移性負担における予想される個人間変動を引き起こした。転移を評価するために、組織を採取して、6TG選択とメチレンブルー染色を用いて遠方の部位で癌細胞を採取し定量します。結果は、転移性コロニーを表す青い点を有する組織培養プレートの集合である。しかし、プラスキとオストランド・ローゼンバーグのプロトコルは、転移性コロニーを手動で数えることによって定量化するため、このモデルの転移を評価する標準的な手段となっています。これは転移性負担の少ない組織では容易であるが、肺のような組織はしばしば転移を伴う。肺プレートは非常にコンフルエントであり得るため、手動カウントによって転移性コロニーを正確かつ正確に定量化することは困難であり、人為的ミスを起こしやすい。転移性の負担をより良く定量化するために、人数カウントエラーに対するコンピュータベースのソリューションに Fiji-ImageJ を使用する方法について説明します。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色を用いた病理組織学的解析は、肺転移を定量するもう一つの手段であり、興味深いことにフィジー-ImageJソフトウェア6,7で改善された。しかし、組織病理学的分析は肺の単一のスライスを観察するので、不正確で非代表的である可能性があります。これは、4T1モデルが均一に分布していない器官全体でいくつかの転移性病変を引き起こすからです。組織病理学的解析と手動カウントの全体的な傾向は8と似ていますが、個々の値は異なるため、組織病理学的分析は定量の唯一の手段として使用しないでください。我々は、異なるカウンタ間の手動カウントにおける組織病理学的分析との比較に比べて利点を示し、同時にFiji-ImageJを使用する一貫性を実証する。さらに、この方法は、インキュベーション時間を10〜14日から5日に短縮できることを示し、研究者は手動カウントに頼るときよりもはるかに早く研究のデータを分析できることを示しています。
この方法は、プラスキとオストランド・ローゼンバーグプロトコル3に対する簡単な調整のコレクションです。4T1モデルは広く使用されており、肺転移は前臨床モデルで測定する重要なパラメータであるため、この方法は広く使用でき、乳がん研究者にとって非常に価値があると考えています。必要な追加の供給は、カメラとフィジー-ImageJ、画像解析9で頻繁に使用されるフリーソフトウェアを搭載したコンピュータへのアクセスです。この方法は特に肺転移に焦点を当てていますが、転移性の大きな負担を伴う他の組織に使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
示されているように、各肺板上の転移コロニーを手動で数えることは、肺転移を定量する不正確で不正確な方法であり、より良い定量手段の必要性を示す(図2)。H&Eスライドは臓器全体の代表的なサンプルではないため、組織病理学的分析は手動計数とフィジー-ImageJ分析(図2Bおよび4D)の両方とは若干異なった。プロトコルは肺全体を収?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、バージニア・メリーランド州獣医学部(IA)、バージニア工科大学臨界技術・応用医療センター(IA)、国立衛生研究所R21EB028429(IA)によって支援されました。
Materials
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 1 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
