Utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1
Summary
Descriviamo un metodo più coerente e rapido per quantificare la metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1 utilizzando Fiji-ImageJ.
Abstract
Il cancro al seno è una malignità devastante, che rappresenta 40.000 decessi femminili e il 30% delle nuove diagnosi di cancro femminile solo negli Stati Uniti nel 2019. La causa principale dei decessi correlati al cancro al seno è il peso metastatico. Pertanto, i modelli preclinici per il cancro al seno devono analizzare il carico metastatico per essere clinicamente rilevanti. Il modello di cancro al seno 4T1 fornisce un modello di topo spontaneamente metastasibile e quantificabile per il cancro al seno umano allo stadio IV. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli 4T1 quantifica il carico metastatico contando manualmente le colonie macchiate sulle piastre di coltura tissutale. Mentre questo è sufficiente per i tessuti con un minore carico metastatico, l’errore umano nel conteggio manuale causa risultati incoerenti e variabili quando le piastre sono confluenti e difficili da contare. Questo metodo offre una soluzione basata su computer all’errore di conteggio umano. Qui, valutiamo il protocollo usando il polmone, un tessuto altamente metastatico nel modello 4T1. Le immagini di lastre macchiate di metilene blu vengono acquisite e caricate per l’analisi in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ determina quindi la percentuale dell’area selezionata dell’immagine che è blu, rappresentando la percentuale della piastra con carico metastatico. Questo approccio basato su computer offre risultati più coerenti e rapidi rispetto al conteggio manuale o alla valutazione istopatologica per tessuti altamente metastatici. La coerenza dei risultati di Fiji-ImageJ dipende dalla qualità dell’immagine. Possono verificarsi lievi variazioni nei risultati tra le immagini, quindi si consiglia di prendere più immagini e mediare i risultati. Nonostante i suoi limiti minimi, questo metodo è un miglioramento nella quantificazione del carico metastatico nel polmone offrendo risultati coerenti e rapidi.
Introduction
A una donna su otto verrà diagnosticato un cancro al seno nel corso della sua vita, eppure nonostante le molteplici opzioni di trattamento il cancro al seno è la seconda causa principale di decessi correlati al cancro nelle donneamericane 1. Queste donne non stanno morendo per il tumore primario nel seno. Invece, il carico metastatico è responsabile della mortalità di questa malattia in quanto comunemente si diffonde al polmone, all’osso, al cervello, al fegato e ai linfonodi2. Per questo motivo, i modelli di cancro al seno devono valutare la metastasi per contribuire a frenare la mortalità di questa malattia. Il modello di cancro al seno murino 4T1 è un protocollo superbo per raggiungere questo obiettivo. Il metodo qui descritto offre un miglioramento al modello 4T1 utilizzando Fiji-ImageJ per quantificare la metastasi polmonare, producendo risultati coerenti e rapidi.
Il modello 4T1 è ben consolidato, con la maggior parte dei laboratori che utilizzano protocolli come quelli descritti da Pulaski e Ostrand-Rosenberg nel 20013. La linea cellulare 4T1 è resistente alla 6-tioguanina (6TG) e rappresentativa dello stadio IV, tumore al seno triplo negativo3,4,5. È clinicamente rilevante in quanto è un modello ortotopico e si metastasi spontaneamente agli stessi organi del cancro al senoumano 3,4. Le cellule 4T1 si metastasi spontaneamente ad una velocità prevedibile in base alla quantità di cellule iniettate3,4. È importante sottolineare che le differenze genetiche tra i topi qui utilizzati hanno causato una variabilità inter-individuale prevista nel carico metastatico. Per valutare la metastasi, i tessuti vengono raccolti per raccogliere e quantificare le cellule tumorali in siti distanti utilizzando la selezione 6TG e la colorazione blu di metilene. Il risultato è una raccolta di piastre di coltura tissutale con punti blu che rappresentano colonie metastatiche. Tuttavia, il protocollo di Pulaski e Ostrand-Rosenberg quantifica le colonie metastatiche contandole manualmente, e quindi questo è stato il mezzo standard per valutare la metastasi in questo modello. Mentre questo è facile per i tessuti con basso carico metastatico, tessuti come i polmoni sono spesso carichi di metastasi. Poiché le placche polmonari possono essere altamente confluenti, quantificare con precisione e precisione le colonie metastatiche attraverso il conteggio manuale è difficile e incline all’errore umano. Per quantificare meglio il carico metastatico, descriviamo l’utilizzo di Fiji-ImageJ per una soluzione basata su computer all’errore di conteggio umano. L’analisi istopatologica con colorazione ematossilina ed eosina (H&E) è un altro mezzo per quantificare le metastasi polmonari, ed è interessante notare che è stato anche migliorato con il software Fiji-ImageJ6,7. Tuttavia, poiché l’analisi istopatologica osserva una singola fetta del polmone, può essere imprecisa e non rappresentativa. Questo perché il modello 4T1 causa diverse lesioni metastatiche in tutto l’organo che non sono distribuite uniformemente. Mentre le tendenze generali tra l’analisi istopatologica e il conteggio manualepossono essere simili 8, i singoli valori possono differire e quindi l’analisi istopatologica non dovrebbe essere utilizzata come unico mezzo di quantificazione. Dimostriamo il beneficio rispetto all’analisi istopatologica e le incongruenze nel conteggio manuale tra i diversi contatori, dimostrando allo stesso tempo la coerenza dell’utilizzo di Fiji-ImageJ. Inoltre, mostriamo che questo metodo può ridurre il tempo di incubazione da 10-14 giorni a 5 giorni, il che significa che i ricercatori possono analizzare i dati del loro studio molto prima rispetto a quando si affidano al conteggio manuale.
Questo metodo è un insieme di semplici regolazioni del protocollo3di Pulaski e Ostrand-Rosenberg . Poiché il modello 4T1 è ampiamente utilizzato e poiché la metastasi polmonare è un parametro critico da misurare nei modelli preclinici, crediamo che questo metodo possa essere ampiamente utilizzato ed è altamente prezioso per i ricercatori sul cancro al seno. Le uniche forniture aggiuntive necessarie sono una fotocamera e l’accesso a un computer con Fiji-ImageJ, un software libero utilizzato frequentemente nell’analisi delle immagini9. Questo metodo si concentra specificamente sulla metastasi polmonare, ma potrebbe essere utilizzato per altri tessuti con un significativo carico metastatico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come dimostrato, il conteggio manuale delle colonie metastatiche su ogni piastra polmonare può essere un metodo impreciso e impreciso per quantificare la metastasi polmonare, dimostrando la necessità di un migliore mezzo di quantificazione (Figura 2). L’analisi istopatologica differiva leggermente sia dal conteggio manuale che dall’analisi Fiji-ImageJ (Figura 2B e 4D), probabilmente perché le diapositive H&E non sono un campione rappresentati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), dal Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) e dai National Institutes of Health R21EB028429 (IA).
Materials
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 1 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
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- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
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- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
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- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
