Utilizzo dell'analisi delle immagini basata su computer per migliorare la quantificazione della metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1

Summary

Descriviamo un metodo più coerente e rapido per quantificare la metastasi polmonare nel modello di cancro al seno 4T1 utilizzando Fiji-ImageJ.

Abstract

Il cancro al seno è una malignità devastante, che rappresenta 40.000 decessi femminili e il 30% delle nuove diagnosi di cancro femminile solo negli Stati Uniti nel 2019. La causa principale dei decessi correlati al cancro al seno è il peso metastatico. Pertanto, i modelli preclinici per il cancro al seno devono analizzare il carico metastatico per essere clinicamente rilevanti. Il modello di cancro al seno 4T1 fornisce un modello di topo spontaneamente metastasibile e quantificabile per il cancro al seno umano allo stadio IV. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli 4T1 quantifica il carico metastatico contando manualmente le colonie macchiate sulle piastre di coltura tissutale. Mentre questo è sufficiente per i tessuti con un minore carico metastatico, l'errore umano nel conteggio manuale causa risultati incoerenti e variabili quando le piastre sono confluenti e difficili da contare. Questo metodo offre una soluzione basata su computer all'errore di conteggio umano. Qui, valutiamo il protocollo usando il polmone, un tessuto altamente metastatico nel modello 4T1. Le immagini di lastre macchiate di metilene blu vengono acquisite e caricate per l'analisi in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ determina quindi la percentuale dell'area selezionata dell'immagine che è blu, rappresentando la percentuale della piastra con carico metastatico. Questo approccio basato su computer offre risultati più coerenti e rapidi rispetto al conteggio manuale o alla valutazione istopatologica per tessuti altamente metastatici. La coerenza dei risultati di Fiji-ImageJ dipende dalla qualità dell'immagine. Possono verificarsi lievi variazioni nei risultati tra le immagini, quindi si consiglia di prendere più immagini e mediare i risultati. Nonostante i suoi limiti minimi, questo metodo è un miglioramento nella quantificazione del carico metastatico nel polmone offrendo risultati coerenti e rapidi.

Introduction

A una donna su otto verrà diagnosticato un cancro al seno nel corso della sua vita, eppure nonostante le molteplici opzioni di trattamento il cancro al seno è la seconda causa principale di decessi correlati al cancro nelle donne^{americane 1}. Queste donne non stanno morendo per il tumore primario nel seno. Invece, il carico metastatico è responsabile della mortalità di questa malattia in quanto comunemente si diffonde al polmone, all'osso, al cervello, al fegato e ai linfonodi². Per questo motivo, i modelli di cancro al seno devono valutare la metastasi per contribuire a frenare la mortalità di questa malattia. Il modello di cancro al seno murino 4T1 è un protocollo superbo per raggiungere questo obiettivo. Il metodo qui descritto offre un miglioramento al modello 4T1 utilizzando Fiji-ImageJ per quantificare la metastasi polmonare, producendo risultati coerenti e rapidi.

Il modello 4T1 è ben consolidato, con la maggior parte dei laboratori che utilizzano protocolli come quelli descritti da Pulaski e Ostrand-Rosenberg nel 2001³. La linea cellulare 4T1 è resistente alla 6-tioguanina (6TG) e rappresentativa dello stadio IV, tumore al seno triplo negativo^3,4,5. È clinicamente rilevante in quanto è un modello ortotopico e si metastasi spontaneamente agli stessi organi del cancro al seno^{umano 3,4}. Le cellule 4T1 si metastasi spontaneamente ad una velocità prevedibile in base alla quantità di cellule iniettate^3,4. È importante sottolineare che le differenze genetiche tra i topi qui utilizzati hanno causato una variabilità inter-individuale prevista nel carico metastatico. Per valutare la metastasi, i tessuti vengono raccolti per raccogliere e quantificare le cellule tumorali in siti distanti utilizzando la selezione 6TG e la colorazione blu di metilene. Il risultato è una raccolta di piastre di coltura tissutale con punti blu che rappresentano colonie metastatiche. Tuttavia, il protocollo di Pulaski e Ostrand-Rosenberg quantifica le colonie metastatiche contandole manualmente, e quindi questo è stato il mezzo standard per valutare la metastasi in questo modello. Mentre questo è facile per i tessuti con basso carico metastatico, tessuti come i polmoni sono spesso carichi di metastasi. Poiché le placche polmonari possono essere altamente confluenti, quantificare con precisione e precisione le colonie metastatiche attraverso il conteggio manuale è difficile e incline all'errore umano. Per quantificare meglio il carico metastatico, descriviamo l'utilizzo di Fiji-ImageJ per una soluzione basata su computer all'errore di conteggio umano. L'analisi istopatologica con colorazione ematossilina ed eosina (H&E) è un altro mezzo per quantificare le metastasi polmonari, ed è interessante notare che è stato anche migliorato con il software Fiji-ImageJ^6,7. Tuttavia, poiché l'analisi istopatologica osserva una singola fetta del polmone, può essere imprecisa e non rappresentativa. Questo perché il modello 4T1 causa diverse lesioni metastatiche in tutto l'organo che non sono distribuite uniformemente. Mentre le tendenze generali tra l'analisi istopatologica e il conteggio manuale^{possono essere simili 8}, i singoli valori possono differire e quindi l'analisi istopatologica non dovrebbe essere utilizzata come unico mezzo di quantificazione. Dimostriamo il beneficio rispetto all'analisi istopatologica e le incongruenze nel conteggio manuale tra i diversi contatori, dimostrando allo stesso tempo la coerenza dell'utilizzo di Fiji-ImageJ. Inoltre, mostriamo che questo metodo può ridurre il tempo di incubazione da 10-14 giorni a 5 giorni, il che significa che i ricercatori possono analizzare i dati del loro studio molto prima rispetto a quando si affidano al conteggio manuale.

Questo metodo è un insieme di semplici regolazioni del protocollo³di Pulaski e Ostrand-Rosenberg . Poiché il modello 4T1 è ampiamente utilizzato e poiché la metastasi polmonare è un parametro critico da misurare nei modelli preclinici, crediamo che questo metodo possa essere ampiamente utilizzato ed è altamente prezioso per i ricercatori sul cancro al seno. Le uniche forniture aggiuntive necessarie sono una fotocamera e l'accesso a un computer con Fiji-ImageJ, un software libero utilizzato frequentemente nell'analisi delle immagini⁹. Questo metodo si concentra specificamente sulla metastasi polmonare, ma potrebbe essere utilizzato per altri tessuti con un significativo carico metastatico.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Virginia Tech e in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. L'esecuzione di questo protocollo richiede l'autorizzazione delle istituzioni appropriate e il rispetto di tutte le linee guida appropriate.

1. Coltura cellulare

1. Crea supporti di coltura completi (RPMI + 10% siero bovino fetale +1% Pen Strep). Ravvivare le cellule 4T1 secondo il protocollo ATCC¹⁰ e incubare a 37 °C e al 5% di CO₂ in un pallone T-25 fino a confluenza. Cambiare il supporto il giorno dopo la riavivizione per rimuovere le celle morte e di nuovo se il supporto viene speso prima che le celle siano abbastanza confluenti da passare.
2. Una volta che il pallone T-25 è confluente, passare le cellule in un pallone T-75 scartando il supporto, lavare il pallone con 5 ml di 1x dulbecco di dulbecco tamponato salino tamponato (DPBS), e aggiungendo 500 μL di Tripsina-EDTA. Incubare per 5-10 minuti a 37 °C fino a quando le cellule non si staccano.
   1. Una volta staccato, aggiungere 5 mL di mezzi di coltura completi riscaldati alle cellule. Aspirare e trasferire i 5 mL in un pallone T-75 contenente 15 ml di mezzi di coltura completi riscaldati.
3. Cellule di passaggio in flaconi T-75 almeno quattro volte. Eseguire questa operazioni una volta che il pallone è confluente lavando con 8 ml di 1x DPBS, aggiungendo 1 ml di Tripside-EDTA per staccare le cellule, aggiungendo 10 ml di mezzi riscaldati alle cellule e diluendo 1:6-1:8 in un nuovo pallone T-75 contenente 20 ml di mezzi di coltura completi riscaldati.
4. Cellule di passaggio fino al numero appropriato di mastri T-150 contenenti 40 mL di mezzi di coltura completi riscaldati per il numero di topi da iniettare. La maggior parte degli studi richiederà più flaconi T-150 per garantire abbastanza cellule per l'iniezione.
5. Quando i topi sono pronti per essere iniettati (8 settimane o di peso superiore a 20 g, a seconda della IACUC o dei protocolli istituzionali), raccogliere le cellule scartando i mezzi, lavando ogni pallone con 10 ml di 1x DPBS e aggiungendo 2 ml di tripside-EDTA. Incubare per 5-10 minuti a 37 °C fino a quando le cellule non si staccano.
6. Lavare il pallone con 10 ml di supporto completo e trasferire tutto il contenuto (10 ml di supporti + 2 ml di miscela di cellule tripside-EDTA) nel pallone successivo. Continuare a lavare e raccogliere le cellule da ogni pallone utilizzando gli stessi 10 ml di supporti per evitare l'uso di una quantità eccessiva di supporti.
   1. Una volta raccolti tutti i contenitori, trasferire il contenuto in un tubo di centrifuga da 50 ml. Raccogliere un campione da 10 μL per il conteggio in un tubo di microcentrifugo e centrifugare il tubo conico da 50 ml a 125 x g per 5 minuti.
7. Mentre le cellule vengono centrifugate, aggiungere 10 μL di tripano blu a 10 μL di campione cellulare. Contare le cellule usando un emocitometro. Una volta determinato il numero totale di cellule, calcolare la concentrazione di cellule necessarie per iniettare topi per 1,2 x 10^{6 cellule} per topo (per 100 μL).
8. Dopo la centrifugazione, i mezzi decantati e il pellet di cellule resuspend nella corretta quantità di DPBS sterile 1x per 1,2 x 10⁶ cellule per 100 μL. Miscela split cell/DPBS in tubi a microcentrifugo per un facile accesso con la siringa durante l'aspirazione di cellule per iniezione. Tenere le cellule sul ghiaccio e iniettare poco dopo quando le cellule inizieranno a morire dopo essere state sul ghiaccio per lunghi periodi di tempo.

2. Iniezioni

1. Preparare le cellule per l'iniezione toccando o mescolando delicatamente il tubo di microcentrifugo per rimescolare le cellule, quindi aspirare 600 μL in una siringa da 1 ml. Ruotare la siringa verso l'alto e tirare lo stantuffo verso il basso per allontanare le cellule dall'apertura della siringa. Toccare la siringa per liberarla dalle bolle d'aria.
2. Attaccare l'ago smussare e erogare le cellule nel tubo di microcentrifugo fino a quando nella siringa rimangono solo 500 μL. Metti la siringa piatta sul ghiaccio.
   NOTA: le cellule 4T1 cadono rapidamente dalla sospensione. Pertanto, è importante mescolare le cellule in sospensione toccando frequentemente.
3. Anestetizzare il topo BALB/c femmina di 8 settimane/>20 g utilizzando isoflurane o altro agente anestetico approvato. Monitorare la respirazione del topo per valutare la profondità dell'anestesia.
4. Una volta che il mouse è correttamente anestetizzato come indicato dalla mancanza di riflesso corneale, posizionare il mouse sulla schiena. Usando il pollice, il puntatore e il dito medio, tenere premuto delicatamente il mouse. Usa il puntatore e le dita centrali per tenere premuto la parte superiore del corpo e il pollice del mouse per la gamba sinistra posteriore. Sii gentile ma fermo.
5. Con la smussatura dell'ago in su, iniettare 100 μL di cellule per via sottocutanea nel cuscinetto grasso mammario addominale sinistro del topo. Monitorare per una buona benda e qualsiasi perdita, e assicurarsi che il mouse si svegli e si muova facilmente dopo l'iniezione.
   1. Cambiare gli aghi tra ogni mouse.
      NOTA: Non lasciare che l'ago entri nella cavità peritoneale. Ciò causerebbe una rapida diffusione del cancro e non rappresentativo del modello. Per garantire un'iniezione sottocutanea, tirare delicatamente verso l'alto sull'ago quando inserito nel cuscinetto grasso mammario addominale sinistro. Se l'ago viene facilmente sollevato verso l'alto, è posizionato correttamente per via sottocutanea.

3. Monitoraggio

1. Monitora i topi almeno 3 volte a settimana per peso, punteggio delle condizioni corporee, dimensione del tumore, condizione tumorale, respirazione, livello di attività, aspetto e movimento. Una volta che il tumore raggiunge 0,7-0,8 cm di diametro, inizia a monitorare ogni giorno.
   1. Considera l'eutanasia quando la dimensione del tumore raggiunge 1,5 cm, o la perdita di peso raggiunge il 20%, o il grave declino clinico del punteggio delle condizioni del corpo, le condizioni tumorali, la respirazione, il livello di attività, l'aspetto o il movimento sono osservati sulla base delle linee guida istituzionali.
      NOTA: Il punteggio delle condizioni del corpo è fondamentale da monitorare poiché il peso corporeo può aumentare con l'aumentare delle dimensioni del tumore, negando la perdita delle condizioni del corpo a causa del peso della malattia. I protocolli di monitoraggio esatti dipenderanno dall'IACUC approvato o dai protocolli istituzionali.

4. Necropsia

1. Eutanasia del mouse utilizzando co_{2 seguendo} le linee guida istituzionali.
2. Spruzzare il topo con il 70% di etanolo per disinfettare. Fai un'incisione sulla linea mediana ventrale del mouse per esporre la cavità corporea.
3. Rimuovere il rene. Continuare a tagliare la linea mediana fino a quando il diaframma non è visibile. Usa le forbici per forare il diaframma per sgonfiare i polmoni. Tagliare il diaframma per ottenere un migliore accesso alla cavità.
4. Usa forbici smussate per tagliare il centro della gabbia toracica. Pin ribcage indietro per esporre il polmone e il cuore.
5. Perfondere il cuore con 2 mL di 1x DPBS non sterile inserendo un ago nell'apice del cuore fino a quando non si incunea nella cavità addominale in cui il rene è stato rimosso.
6. Per rimuovere il cuore e i polmoni, utilizzare forbici smussate per tagliare l'esofago e la trachea direttamente sopra il cuore. Usando le forcelle, inizia a allontanare il cuore dal corpo e taglialo via a qualsiasi tessuto connettivo tenendolo attaccato. I polmoni escono con il cuore.
7. Identificare i polmoni multi-lobato (destra) e monolobato (sinistra). Tenere il cuore attaccato per riferimento, ma una volta identificati i polmoni, tagliare il cuore.
8. Etichettare una piastra di 12 polacche contenente 1x Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) in ogni pozzo. Ogni topo ha bisogno di 2 pozzi. Posizionare il polmone multi-lobato (a destra) nella piastra del pozzo 12 per la valutazione della metastasi e tenere sul ghiaccio. Tieni il vicino ben vuoto per ora.
   NOTA: È importante utilizzare lo stesso polmone (multi-lobato) da ogni mouse per assicurarsi che ogni campione sia di dimensioni vicine. Il polmone a lobato singolo può quindi essere usato per altre analisi, come l'istopatologia.
   NOTA: I campioni sono stabili sul ghiaccio o a 4 °C per alcune ore.

5. Lavorazione dei tessuti

NOTA: Tutti i passaggi di questa sezione devono essere eseguiti con tecnica sterile.

1. Etichettare 1 tubo conico da 15 ml per topo e aggiungere 2,5 ml di miscela di collagenasi di tipo IV e 30 unità di elastasi a ciascun tubo. Per fare la miscela di collagenasi di tipo IV, sciogliere 2 mg di collagenasi di tipo IV per mL 1x HBSS e filtro sterile. Questo può essere conservato fino a 12 mesi a -20 °C e scongelato quando necessario.
2. Trasferire il polmone al secondo, pulire bene 1x HBSS per quel campione. Ruotare usando le forcep per rimuovere il sangue rimanente. Trasferire il polmone pulito nella piastra di coltura tissutale vuota da 3,5 cm. Polmone tritare con forbici. Risciacquare la piastra con 2,5 ml di 1 HBSS, trasferire 1x HBSS e pezzi polmonari in un tubo conico da 15 ml già contenente collagenasi/elastasi cocktail (5 mL totali).
3. Incubare per 75 minuti a 4 °C. Continuare a mescolare i campioni durante questo periodo, quindi posizionare i tubi su un rocker o una ruota rotante. Durante questa fase di incubazione, etichettare i tubi di centrifuga da 50 ml e le piastre di coltura tissutale da 10 cm per ogni topo. Se si fa una diluizione, etichettare abbastanza piastre di coltura tissutale da 10 cm per le diluizioni.
   NOTA: Etichettare il coperchio delle piastre di coltura tissutale. Se si etichetta la piastra stessa, la scrittura interferirà con l'analisi Fiji-ImageJ.
4. Portare il volume di ogni tubo fino a 10 mL totali con 1 HBSS. Versare il contenuto su un colino cellulare di 70 μm in un tubo conico da 50 ml per ciascun campione. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da 1 ml per macinare delicatamente il campione attraverso il filtro per consentire a più cellule di filtrare.
5. Centrifuga per 5 minuti a 350 x g a temperatura ambiente (RT). Scartare il supernatante e lavare il pellet con 10 mL di 1x HBSS. Ripetere questo passaggio due volte.
6. Resuspend pellet in 10 mL di 60 μM 6TG supporti di coltura completi, RPMI o IMDM. Campioni di piastre in piastre di coltura cellulare di 10 cm, utilizzando uno schema di diluizione, se lo si desidera. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 5 giorni.
   NOTA: 1:2, 1:10 e 1:100 sono diluizioni comuni che dovranno essere determinate empiricamente in base ai parametri di studio.
   ATTENZIONE: 6TG è tossico. Prestare attenzione durante la manipolazione e seguire tutte le linee guida per la salute e la sicurezza ambientale per lo smaltimento.

6. Piastre di colorazione

1. Versare i supporti di coltura dalle piastre in un contenitore di rifiuti appropriato. Fissare le cellule aggiungendo 5 mL di metanolo non diluito per piastra e incubare per 5 minuti a RT, assicurandosi di ruotare il metanolo in modo che copra l'intera piastra.
   ATTENZIONE: Il metanolo è pericoloso se ingerito, inalato o sulla pelle. Utilizzare una cappa aspirante per questo passaggio.
2. Versare il metanolo dalle piastre in un contenitore di rifiuti appropriato. Risciacquare le piastre con 5 mL di acqua distillata per piastra e versare acqua in un contenitore di rifiuti appropriato. Aggiungere 5 mL di blu di metilene allo 0,03% per piastra e incubare per 5 minuti a RT, assicurandosi di ruotare la soluzione blu di metilene in modo che copra l'intera piastra.
3. Versare il blu di metilene in un contenitore di rifiuti appropriato. Risciacquare nuovamente le piastre con 5 mL di acqua distillata per piastra. Capovolgere le piastre e tamponare contro un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare la piastra sul coperchio e lasciare asciugare l'aria durante la notte a RT.
   NOTA: Le colonie metastatiche saranno blu. Una volta asciugati, i piatti possono essere conservati a RT a tempo indeterminato.

7. Analisi delle immagini

1. Rimuovere i coperchi etichettati dalle piastre, facendo attenzione a garantire una chiara identificazione dei campioni. Allinea tutte le piastre polmonari macchiate su una superficie pulita e leggera per scattare una foto di tutte le piastre in un'unica immagine.
2. Scatta una foto della collezione di piatti in un'area ben illuminata, assicurandoti di ridurre al minimo i riflessi poiché le piastre sono molto riflettenti. I riflessi nelle lastre influenzeranno l'analisi delle immagini e quindi dovranno essere evitati.
   NOTA: Fiji-ImageJ ha un limite superiore di 2 gigapixel. La maggior parte degli smartphone moderni avrà fotocamere sufficienti. Non utilizzare una fotocamera inferiore a 8 megapixel. La fotocamera utilizzata in questo esperimento era un megapixel da 12,2 megapixel su un Google Pixel 2.
3. Ritaglia l'immagine per includere le lastre, ma escludi i coperchi o qualsiasi altra cosa sullo sfondo dell'immagine. Carica l'immagine ritagliata in Fiji-ImageJ.
4. Modificare l'immagine in bianco e nero utilizzando i comandi seguenti: Immagine, Regola, Soglia colore, Metodo soglia: Predefinito, Colore soglia: B&W, Spazio soglia: Lab. Deselezionare la casella Sfondo scuro. L'immagine dovrebbe ora essere in bianco e nero. Il nero rappresenta lo sfondo chiaro e il bianco rappresenta le colonie metastatiche blu.
5. Utilizzando lo strumento Cerchio sulla barra degli strumenti Fiji-ImageJ, selezionate l'area da analizzare. Disegnare un cerchio da utilizzare per tutte le piastre per assicurarsi che ogni piastra sia analizzata per l'area delle stesse dimensioni. Scegliete una dimensione che massimizzi l'area analizzata sulle piastre riducendo al minimo il rumore di fondo che appare sul bordo delle piastre. La dimensione viene visualizzata nella barra degli strumenti man mano che viene disegnata, quindi è possibile creare un cerchio perfetto monitorando l'altezza e la larghezza man mano che il cerchio viene disegnato.
6. Analizzare il cerchio selezionato per determinare quale percentuale dell'area è bianca, che rappresenta l'area della piastra con colonie metastatiche blu. Utilizzare i comandi seguenti:
   Analizzare, analizzare particelle, dimensioni (pixel^2):0-Infinito, Circolarità: 0,00-1,00, Mostra: nulla e selezionare la casella Riepiloga. Colpisci OK.
7. Registrare il risultato % area. Questa è la percentuale dell'area selezionata che è bianca e rappresenta quindi il carico metastatico.
   NOTA: si consiglia di salvare i risultati in Fiji-ImageJ o copiare/incollare l'intera pagina dei risultati in un documento separato. Se i risultati di % Area sono imprevisti o sospetti, è quindi possibile vedere se anche una qualsiasi delle altre misurazioni era sospetta o se % Area è stata registrata in modo errato.
8. Spostare il cerchio, senza alterarne le dimensioni afferrandolo al centro, nella piastra successiva dell'immagine. Ripetere i passaggi 7.6 e 7.7 per tutte le lastre dell'immagine.
9. Ripetere i passaggi da 7.1 a 7.8 su almeno altre due immagini. Una volta analizzate tutte le lastre e le immagini, media i risultati dell'area % tra immagini diverse per ogni piastra per mitigare eventuali incongruenze tra le immagini.

Representative Results

Questo metodo contiene semplici regolazioni dal protocollo³ Pulaski e Ostrand-Rosenberg 4T1 e può essere visualizzato nella figura 1. Quando 3 ricercatori separati hanno contato manualmente colonie metastatiche per 12 piastre polmonari (diluizione 1:10), i risultati sono stati molto incoerenti tra diversi contatori(Figura 2A). Tutti i ricercatori sono stati indirizzati a "contare le colonie metastatiche che appaiono come punti blu", ma le incongruenze dimostrano il problema con il conteggio manuale delle placche altamente metastatiche. I ricercatori avevano diversi livelli di esperienza con il modello 4T1. Un patologo veterinario certificato dalla scheda ha analizzato le diapositive polmonari macchiate di H&E per la metastasi come un altro metodo da confrontare con l'analisi delle piastre polmonari Fiji-ImageJ (Figura 2B).

Utilizzando l'analisi Fiji-ImageJ, 3 ricercatori separati hanno analizzato 3 immagini separate della raccolta di 12 piastre (diluizione 1:2). Le immagini sono state scattate in due spazi di laboratorio separati con un'illuminazione leggermente diversa. La disposizione delle lastre o l'angolo da cui è stata scattata l'immagine erano diverse tra ogni immagine. A differenza dei risultati del conteggio manuale, i risultati di Fiji-ImageJ erano coerenti tra i contatori per ciascuna delle 3 immagini (Figura 3A). Per determinare se ci sono state incongruenze tra le 3 immagini, i risultati delle 3 immagini e dei 3 contatori sono stati combinati per piastra polmonare (Figura 3B). Ci sono differenze tra le immagini per alcune lastre, ma le tendenze generali sono simili e offrono più coerenza rispetto al conteggio manuale. Per tenere conto delle variazioni tra le 3 diverse immagini, i risultati di ogni immagine sono stati mediati per ogni lastra (Figura 3C). Queste medie hanno fornito risultati coerenti tra contatori che analizzano con precisione e precisione il carico metastatico. Pertanto, questo protocollo suggerisce di prendere almeno 3 immagini della raccolta delle lastre in diverse disposizioni, da diverse angolazioni o in impostazioni di luce leggermente diverse, e quindi analizzare e mediare i risultati. Il contrasto tra il conteggio manuale e l'analisi Fiji-ImageJ viene visualizzato quando si confronta la figura 2A con la figura 3C.

Un altro modo per dimostrare i miglioramenti offerti da questo protocollo è confrontare la classificazione delle piastre dalla maggior parte al carico metastatico minimo tra i contatori, in base ai conteggi della figura 2 e della figura 3. Il conteggio manuale è stato concordato sulla piastra più confluente, ma tutti i seguenti ranghi erano incoerenti tra i contatori(figura 4A). Al contrario, i ranghi dell'analisi Fiji-ImageJ per ogni immagine erano molto più coerenti tra i contatori (Figura 4B). La coerenza si verifica anche quando sono stati mediti i risultati di ciascuna immagine per ogni lastra (Figura 4C). Riconosciamo che questo protocollo non offre una coerenza completa tra i contatori, ma è un miglioramento rispetto al conteggio manuale quando si confronta la figura 4A con la figura 4C. L'analisi istopatologica differiva sia dal conteggio manuale che da quello delle Fiji-ImageJ (Figura 4D).

Per dimostrare l'importanza di evitare riflessi nelle immagini, viene mostrata un'immagine con un riflesso di una mano e la sua successiva analisi Fiji-ImageJ (a sinistra) opposta alla stessa lastra senza riflessione (a destra) (Figura 5A). Anche altre imperfezioni scure provenienti da una superficie di fondo sporca o da un residuo di campione di sangue sulle piastre possono influire negativamente sull'analisi Fiji-ImageJ. La lastra di sangue nella figura 5B ha solo 2 colonie metastatiche (notata da frecce bianche), ma il residuo scuro (notato dalle frecce nere) ha fatto sì che Fiji-ImageJ lo considera 31,6% metastatico. Pertanto, è importante avere una superficie pulita e leggera e non utilizzare questo metodo per campioni di sangue poiché i campioni di sangue in genere lasceranno macchie scure residue sulla piastra che non sono colonie metastatiche.

Figura 1: Schema del protocollo. Questo protocollo si concentra esclusivamente sull'analisi della metastasi polmonare nel modello 4T1. Il flusso generale di questo protocollo include la crescita di cellule 4T1 in coltura, l'iniezione di topi femmine BALB / c con cellule 4T1 nel cuscinetto di grasso mammario addominale sinistro, il monitoraggio dei topi secondo la IACUC e protocolli istituzionali, il sacrificio dei topi e la raccolta del polmone, la raccolta di cellule dai campioni polmonari, la placcatura e l'incubazione delle cellule nei supporti di selezione 6TG, il fissaggio e la colorazione delle cellule dopo 5 giorni, la raccolta delle foto delle piastre e l'analisi utilizzando Fiji-ImageJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il conteggio manuale delle cellule metastatiche e l'analisi istopatologica hanno risultati incoerenti. A. 12 piastre polmonari con una diluizione 1:10 sono state contate manualmente da 3 ricercatori separati istruiti a contare le colonie metastatiche allo stesso modo, anche se l'esperienza con il modello variava tra i ricercatori. Il numero di colonie metastatiche contate variava notevolmente tra i ricercatori. B. La commissione per i trasporti e L'analisi istopatologica ha identificato e quantificato singoli aggregati cellulari tumorali, classificati come metastasi, presenti negli scivoli polmonari macchiati di H&E. Vengono visualizzate immagini di ingrandimento alte, medie e basse di una diapositiva rappresentativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: L'analisi Fiji-ImageJ è accurata e precisa nel determinare il carico metastatico. A. 12 piastre polmonari con una diluizione 1:2 sono state analizzate da 3 ricercatori separati in 3 immagini separate delle 12 placche polmonari. B. La commissione per i trasporti e I risultati di ciascuna delle 3 immagini di ciascuno dei 3 ricercatori sono stati combinati. C. La commissione per l' I risultati di ogni piastra polmonare delle 3 immagini sono stati mediati. ANOVA uni-way con il test di confronto multiplo di Tukey non ha determinato differenze significative tra i contatori per ogni piastra polmonare. I dati sono mostrati come meschino + SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: L'analisi Fiji-ImageJ fornisce una classificazione più coerente del carico metastatico rispetto al conteggio manuale e all'analisi istopatologica. A. La commissione per l'a Le stesse placche polmonari della figura 2 sono state classificate dalla maggior parte alla meno metastatica in base ai conteggi manuali della figura 2. B. La commissione per i trasporti e Le stesse 12 placche polmonari della figura 3 sono state classificate dalla maggior parte alla meno metastatica sulla base dell'analisi Fiji-ImageJ della figura 3A. D. La commissione per l' Gli scivoli polmonari sono stati classificati dalla maggior parte ai meno metastatici in base alla valutazione istopologica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Riflessi e macchie scure non metastatiche avranno un impatto negativo sui risultati. A. La commissione per l'a Un'immagine con il riflesso di una mano che scatta la foto interrompe l'analisi Fiji-Image J, come mostrato nel confrontare l'analisi Figi-ImageJ di riflessione (a sinistra) con la corretta analisi Fiji-ImageJ (a destra) B. Le placche di sangue spesso lasciano macchie rimanenti (frecce nere) sulle placche che non sono colonie metastatiche (frecce bianche). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Come dimostrato, il conteggio manuale delle colonie metastatiche su ogni piastra polmonare può essere un metodo impreciso e impreciso per quantificare la metastasi polmonare, dimostrando la necessità di un migliore mezzo di quantificazione (Figura 2). L'analisi istopatologica differiva leggermente sia dal conteggio manuale che dall'analisi Fiji-ImageJ (Figura 2B e 4D), probabilmente perché le diapositive H&E non sono un campione rappresentativo dell'intero organo. Il protocollo raccoglie un intero polmone, ed è quindi più rappresentativo della metastasi polmonare totale, ed è più coerente del conteggio manuale. Diversi approcci all'analisi Fiji-ImageJ sono stati tentati e sono discussi di seguito, ma il protocollo sopra descritto sembra essere il metodo superiore.

Campioni polmonari, sanguigni e cerebrali sono stati raccolti per questo studio. Tuttavia, i campioni di sangue e cervello avevano pochissime colonie metastatiche, se non nessuna. Abbiamo determinato che il conteggio manuale delle colonie metastatiche è ottimale per questi tessuti meno metastatici, e quindi i dati del sangue e del cervello non sono stati inclusi. Quando il carico metastatico è facile da contare manualmente (ad esempio, dieci o venti colonie metastatiche rispetto a migliaia), la questione originale dell'errore umano non è rilevante, e quindi questo protocollo non è necessario. Inoltre, i campioni di sangue possono lasciare macchie scure sulle piastre dopo la fissazione, il che interferisce con l'analisi Fiji-ImageJ (Figura 5). È importante sottolineare che la quantità di cellule iniettate può influenzare il carico metastatico. Ad esempio, se vengono iniettate meno cellule e i topi possono sopravvivere più a lungo, il cancro ha più tempo per diffondersi nei siti tradizionalmente meno metastatici^{come il cervello 3,4}. Pertanto, questo protocollo potrebbe essere modificato per includere il carico metastatico di altri tessuti se viene dato loro il tempo di diventare altamente metastatici. Se si tenta il modello 4T1 per la prima volta o si modifica la quantità di celle iniettate, si consiglia di provare almeno due diluizioni durante la placcatura delle celle. Per questo studio, abbiamo usato una diluizione 1:2 e 1:10. La diluizione 1:2 sarebbe stata difficile da contare manualmente, ma è stata conteggiata facilmente in Fiji-ImageJ. La diluizione 1:10 era ancora difficile da contare manualmente e quindi ha portato a risultati incoerenti. Le diluizioni possono essere modificate in base ai parametri di studio specifici.

Sono state scattate foto di singole placche polmonari e delle 12 placche polmonari insieme. Le singole lastre sono state analizzate in due modi: ritagliando l'immagine in un quadrato centrale della piastra prima del caricamento su Fiji-ImageJ, o utilizzando lo strumento di selezione del cerchio in Fiji-ImageJ per selezionare il cerchio centrale della piastra nell'immagine non ritagliata. Abbiamo scoperto che l'utilizzo dello strumento di selezione del cerchio in Fiji-ImageJ offriva il modo più semplice e coerente per creare un'area delle stesse dimensioni per l'analisi per tutte le lastre. Inoltre, analizzare l'intera collezione di placche polmonari nella stessa immagine era superiore all'analisi delle singole immagini di singole placche polmonari. Avere tutte le placche polmonari nella stessa immagine consente di utilizzare facilmente il cerchio delle stesse dimensioni tra le placche polmonari. Assicura che tutte le piastre polmonari siano della stessa distanza dalla fotocamera e quindi il cerchio delle stesse dimensioni per l'analisi dovrebbe essere la dimensione corretta per tutte le piastre polmonari nell'immagine. Rende inoltre l'analisi più rapida in quanto non è necessario ridisegnare il cerchio tra le piastre. Viene semplicemente trascinato nella piastra successiva dell'immagine senza modificarne le dimensioni, il che garantisce che le stesse dimensioni vengono utilizzate per tutte le lastre dell'immagine. Quando si seleziona la dimensione del cerchio, è importante renderlo abbastanza grande da analizzare la maggior parte della piastra mentre è abbastanza piccolo da evitare il rumore di fondo dai bordi della piastra. Inoltre, nel tentativo di salvare i reagenti, le cellule sono state placcate anche in 6 piastre di pozzo e rispetto alle piastre di coltura tissutale di 10 cm. I risultati Fiji-ImageJ dei 6 piatti del pozzo erano meno coerenti e non erano correlati ai piatti da 10 cm (dati non mostrati). Una spiegazione è che l'area di superficie più piccola fornisce un'area più piccola da analizzare, portando a dati meno rappresentativi. Un altro è che la riduzione della superficie consente alle cellule di crescere più rapidamente man mano che sono più vicine ad altre cellule sopravvissute. Pertanto, non è consigliabile utilizzare reagenti per la coltura tissutale diversi da quelli che abbiamo descritto nel protocollo.

Come accennato in precedenza, evitare riflessioni e avere uno sfondo pulito e leggero sono assolutamente fondamentali per questo metodo. La figura 5A dimostra come una riflessione viene analizzata in Fiji-ImageJ e quindi mostra l'importanza critica di evitare riflessioni. Poiché le piastre di coltura tissutale sono altamente riflettenti, è utile scattare la foto con una leggera angolazione per evitare riflessi da soli che scattano la foto o dalle fonti di luce sopra. Le condizioni di illuminazione dell'area di lavoro specifica dovranno essere contabili. Si consiglia di scattare più foto delle lastre da analizzare, provando arrangiamenti e/o angoli leggermente diversi, in un'area ben illuminata. Studia intensamente le immagini per qualsiasi riflessione. Se ci sono incongruenze nell'analisi, è probabile che sia dovuto a un problema di qualità dell'immagine. Per risolvere i problemi, confrontare l'immagine normale con l'immagine in bianco e nero. Se le aree che non sono blu nell'immagine normale appaiono come bianche nell'immagine in bianco e nero, è probabile che vi sia un riflesso o un'imperfezione che altera i risultati.

Oltre alla coerenza, un altro notevole vantaggio di questo metodo è che produce dati molto più rapidamente del conteggio manuale. Il conteggio manuale di più lastre richiede molto tempo, mentre l'analisi Fiji-ImageJ può essere eseguita rapidamente. Consente anche un tempo di incubazione più breve. Pulaski e Ostrand-Rosenberg raccomandano un periodo di incubazione di 10-14 giorni per le cellule placcate, aggiungendo una notevole quantità di tempo allo studio³. Il periodo di incubazione di 10-14 giorni consente la creazione di colonie più grandi e più facili da contare. Tuttavia, molte placche polmonari possono diventare confluenti prima di allora. Invece, 5 giorni di incubazione danno abbastanza tempo per la selezione 6TG per uccidere le cellule non cancerose (comprovate da topi di controllo sani che non hanno colonie sulle loro placche polmonari, dati non mostrati) e per far crescere abbastanza da essere facilmente quantificate con Fiji-ImageJ. Ciò riduce significativamente il tempo tra i topi sacrificati e l'analisi dei dati metastatici essenziali.

Per concludere, i vantaggi di questo metodo superano di gran lunga i limiti. Riconosciamo che questo metodo non offre una coerenza perfetta. Sebbene questo non sia il metodo ideale per i tessuti meno metastatici, questi tessuti possono essere facilmente conteggiati manualmente. Mentre ottenere un'immagine senza riflessi può richiedere una fotografia attenta, la coerenza acquisita con questo metodo è significativa. È possibile che questo metodo possa essere utilizzato per altri tessuti altamente metastatici e altri protocolli che richiedono il conteggio di oggetti macchiati. La progettazione dello studio potrebbe anche consentire di analizzare il tasso di metastasi o l'effetto dei trattamenti anti-cancro sulla metastasi. Questo metodo fornirà dati di metastasi altamente coerenti e affidabili e rappresenta un significativo perfezionamento del modello 4T1. L'applicazione di questo modello alla prossima ricerca sulla metastasi del cancro al seno è della massima importanza per armare i ricercatori di strumenti per combattere la mortalità per cancro al seno.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia chamber	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice	The Jackson Laboratory	000651
Blunt scissors	Roboz	RS-6700
Calculator	Any	Any
Camera	Any	Any	Minimum of 8 megapixels
Centrifuge	Any	Any	Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage	Any	Any
Computer with Fiji-ImageJ	Any	Any	Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-10
Curved scissors	Roboz	RS-5859
Distilled water	Any	Any
Elastase	MP Biomedicals	100617
Electronic scale	Any	Any
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Forceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubator	See comments	See comments	Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylene blue	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Pins or needles	Any	Any	For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rocker or rotating wheel	Any	Any
Sharp scissors	Roboz	RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flasks	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flasks	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flasks	Fisher Scientific	13-680-65
Tri-cornered plastic beaker	Fisher Scientific	14-955-111F	Used to weigh mice
Trypan blue	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collagenase	Sigma-Aldrich	C5138
3.5 cm tissue culture plates	Nunclon	153066
1 mL syringe	BD	309659
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
10 cm tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-22
12 well plate	Corning	3512
15 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in needles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM cell strainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Dilute to 70% with DI water