Verwendung computerbasierter Bildanalyse zur Verbesserung der Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell

Summary

Wir beschreiben eine konsistentere und beschleunigte Methode zur Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell mit Fidschi-ImageJ.

Abstract

Brustkrebs ist eine verheerende Bösartigkeit, die allein im Jahr 2019 40.000 Todesfälle bei Frauen und 30 % der neuen Krebsdiagnosen bei Frauen in den Vereinigten Staaten ausmacht. Die Hauptursache für Todesfälle im Zusammenhang mit Brustkrebs ist die metastasierende Belastung. Daher müssen präklinische Modelle für Brustkrebs die metastasierende Belastung analysieren, um klinisch relevant zu sein. Das 4T1-Brustkrebsmodell bietet ein spontan metastasierendes, quantifizierbares Mausmodell für menschlichen Brustkrebs im Stadium IV. Die meisten 4T1-Protokolle quantifizieren jedoch die metastasierende Belastung, indem sie gefärbte Kolonien manuell auf Gewebekulturplatten zählen. Während dies für Gewebe mit geringerer metastasierender Belastung ausreicht, führt menschliches Versagen bei der manuellen Zählung zu inkonsistenten und variablen Ergebnissen, wenn Platten konfluent und schwer zu zählen sind. Diese Methode bietet eine computerbasierte Lösung für menschliche Zählfehler. Hier evaluieren wir das Protokoll mit der Lunge, einem hochmetastasierenden Gewebe im 4T1-Modell. Bilder von Methylenblau-gefärbten Platten werden in Fidschi-ImageJ zur Analyse aufgenommen und hochgeladen. Fiji-ImageJ bestimmt dann den Prozentsatz des ausgewählten Bildes, der blau ist, und stellt den Prozentsatz der Platte mit metastasierender Belastung dar. Dieser computergestützte Ansatz bietet konsistentere und schnellere Ergebnisse als manuelle Zählung oder histopathologische Auswertung für hochmetastasierte Gewebe. Die Konsistenz der Fidschi-ImageJ-Ergebnisse hängt von der Qualität des Bildes ab. Es können leichte Abweichungen in den Ergebnissen zwischen den Bildern auftreten, daher wird empfohlen, dass mehrere Bilder aufgenommen und die Ergebnisse gemittelt werden. Trotz ihrer minimalen Einschränkungen ist diese Methode eine Verbesserung der Quantifizierung der metastasierenden Belastung in der Lunge, indem sie konsistente und schnelle Ergebnisse bietet.

Introduction

Eine von acht Frauen wird in ihrem Leben an Brustkrebs diagnostiziert werden, und trotz mehrerer Behandlungsmöglichkeiten ist Brustkrebs die zweithäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle bei amerikanischen Frauen¹. Diese Frauen sterben nicht an dem primären Tumor in ihrer Brust. Stattdessen ist die metastasierende Last für die Sterblichkeit dieser Krankheit verantwortlich, da sie sich häufig auf die Lungen-, Knochen-, Gehirn-, Leber- und Lymphknoten ausbreitet². Aus diesem Grund müssen Brustkrebsmodelle Metastasen bewerten, um zur Eindämmung der Sterblichkeit dieser Krankheit beizutragen. Das 4T1 murinen Brustkrebsmodell ist ein hervorragendes Protokoll, um dies zu erreichen. Die hier beschriebene Methode bietet eine Verbesserung des 4T1-Modells, indem Fidschi-ImageJ verwendet wird, um Lungenmetastasen zu quantifizieren und konsistente und schnelle Ergebnisse zu erzielen.

Das 4T1-Modell ist etabliert, wobei die meisten Labore Protokolle wie die von Pulaski und Ostrand-Rosenberg im Jahr 2001 beschriebenen verwenden³. Die 4T1-Zelllinie ist 6-Thioguanin (6TG) resistent und repräsentativ für Stadium IV, dreifach negativer Brustkrebs^3,4,5. Es ist klinisch relevant, da es ein orthotopisches Modell ist und spontan zu den gleichen Organen metastasiert wie bei menschlichem Brustkrebs^3,4. Die 4T1-Zellen metastasieren spontan mit einer vorhersagbaren Rate basierend auf der Menge der injizierten Zellen^3,4. Wichtig ist, dass genetische Unterschiede zwischen Mäusen, die hier verwendet werden, die erwartete interindividuelle Variabilität der metastasierenden Belastung verursachten. Zur Bewertung der Metastasierung werden Gewebe geerntet, um Krebszellen an entfernten Standorten mit 6TG-Auswahl und Methylenblaufärbung zu sammeln und zu quantifizieren. Das Ergebnis ist eine Sammlung von Gewebekulturplatten mit blauen Punkten, die metastasierende Kolonien darstellen. Das Pulaski- und Ostrand-Rosenberg-Protokoll quantifiziert jedoch metastasierende Kolonien durch manuelles Zählen, und daher war dies das Standardmittel zur Bewertung von Metastasen in diesem Modell. Während dies für Gewebe mit geringer metastasierender Belastung einfach ist, sind Gewebe wie die Lunge oft mit Metastasen beladen. Da Lungenplatten sehr konfluent sein können, ist die genaue und präzise Quantifizierung metastasierender Kolonien durch manuelles Zählen schwierig und anfällig für menschliches Versagen. Um die metastasierende Belastung besser zu quantifizieren, beschreiben wir die Verwendung von Fiji-ImageJ für eine computerbasierte Lösung für menschliche Zählfehler. Histopathologische Analyse mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung ist ein weiteres Mittel zur Quantifizierung von Lungenmetastasen, und interessanterweise wurde auch mit Fiji-ImageJ Software^6,7verbessert. Da jedoch die histopathologische Analyse eine einzelne Scheibe der Lunge beobachtet, kann sie ungenau und unrepräsentativ sein. Dies liegt daran, dass das 4T1-Modell mehrere metastasierende Läsionen im gesamten Organ verursacht, die nicht gleichmäßig verteilt sind. Während die Gesamttrends zwischen histopathologischer Analyse und manueller Zählung ähnlich sein können^8,können einzelne Werte unterschiedlich sein und daher sollte die histopathologische Analyse nicht als einziges Mittel zur Quantifizierung verwendet werden. Wir zeigen den Nutzen im Vergleich zur histopathologischen Analyse und die Inkonsistenzen bei der manuellen Zählung zwischen verschiedenen Zählern, während wir gleichzeitig die Konsistenz der Verwendung von Fidschi-ImageJ demonstrieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Methode die Inkubationszeit von 10-14 Tagen auf 5 Tage reduzieren kann, was bedeutet, dass Forscher Daten aus ihrer Studie viel früher analysieren können, als wenn sie sich auf manuelles Zählen verlassen.

Diese Methode ist eine Sammlung einfacher Anpassungen des Pulaski- und Ostrand-Rosenberg-Protokolls³. Da das 4T1-Modell weit verbreitet ist und die Lungenmetastasierung ein kritischer Parameter für präklinische Modelle ist, glauben wir, dass diese Methode weit verbreitet sein kann und für Brustkrebsforscher sehr wertvoll ist. Die einzigen zusätzlichen Vorräte sind eine Kamera und Der Zugriff auf einen Computer mit Fiji-ImageJ, einer kostenlosen Software, die häufig in der Bildanalyse verwendet wird⁹. Diese Methode konzentriert sich speziell auf Lungenmetastasen, aber es könnte für andere Gewebe mit signifikanter metastasierender Belastung verwendet werden.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Virginia Tech und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals genehmigt. Die Durchführung dieses Protokolls erfordert die Genehmigung der zuständigen Institutionen und die Einhaltung aller geeigneten Richtlinien.

1. Zellkultur

1. Machen Sie komplette Kulturmedien (RPMI + 10% Fetal Bovine Serum +1% Pen Strep). 4T1-Zellen gemäß ATCC-Protokoll¹⁰ beleben und bei 37 °C und 5%_CO2 in einem T-25-Kolben bis zum Einfluss inkubieren. Ändern Sie die Medien am Tag nach der Wiederbelebung, um abgestorbene Zellen zu entfernen, und wieder, wenn Medien verbraucht werden, bevor Zellen konfluent genug sind, um sie zu durchziehen.
2. Sobald der T-25-Kolben konfluent ist, durchführen Zellen zu einem T-75-Kolben durch Wegwerfen von Medien, Waschen Kolben mit 5 ml 1x Dulbecco Phosphat gepufferte Saline (DPBS), und Hinzufügen von 500 L Trypsin-EDTA. 5-10 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen lösen.
   1. Nach dem Lösen fügen Sie den Zellen 5 ml erwärmte komplette Kulturmedien hinzu. Aspirieren und übertragen Sie den 5 ml auf einen T-75-Kolben mit 15 ml erwärmten kompletten Kulturmedien.
3. Durchgangszellen in T-75-Flaschen mindestens viermal. Tun Sie dies, sobald der Kolben konfluent ist, indem Sie mit 8 ml 1x DPBS waschen, 1 ml Trypsin-EDTA zum Lösen von Zellen hinzufügen, 10 ml erwärmte Medien zu zellen hinzufügen und 1:6-1:8 in einen neuen T-75-Kolben verdünnen, der 20 ml erwärmte komplette Kulturmedien enthält.
4. Durchgangszellen bis zur entsprechenden Anzahl von T-150-Kolben, die 40 ml erwärmte komplette Kulturmedien enthalten, für die Anzahl der zu injizierenden Mäuse. Die meisten Studien erfordern mehrere T-150-Flaschen, um genügend Zellen für die Injektion zu gewährleisten.
5. Wenn Mäuse bereit sind, injiziert zu werden (8 Wochen alt oder mit einem Gewicht von mehr als 20 g, abhängig von den IACUC oder institutionellen Protokollen), Ernten Sie Zellen durch Dasverworfene Medien, waschen Sie jeden Kolben mit 10 ml 1x DPBS und fügen Sie 2 ml Trypsin-EDTA hinzu. 5-10 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen lösen.
6. Kolben mit 10 ml kompletter Medien waschen und alle Inhalte (10 ml Medien + 2 ml Trypsin-EDTA-Zellmischung) auf den nächsten Kolben übertragen. Fahren Sie fort, Zellen aus jedem Kolben mit den gleichen 10 ml Medien zu waschen und zu sammeln, um eine übermäßige Menge an Medien zu vermeiden.
   1. Sobald alle Kolben gesammelt sind, übertragen Sie den Inhalt in ein 50 ml Zentrifugenrohr. Sammeln Sie eine 10-L-Probe für die Zählung in einem Mikrozentrifugenrohr und zentrifugieren Sie das 50 ml konische Rohr bei 125 x g für 5 Minuten.
7. Während Zellen zentrifugiert werden, fügen Sie 10 L Trypan blau zu 10 l Zellprobe hinzu. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Sobald die Gesamtzahl der Zellen bestimmt ist, berechnen Sie die Konzentration der Zellen, die benötigt werden, um Mäuse für 1,2 x 10⁶ Zellen pro Maus (pro 100 L) zu injizieren.
8. Nach Zentrifugation, Dekantmedien und Resuspend zellpellet in der richtigen Menge an sterilen 1x DPBS für 1,2 x 10⁶ Zellen pro 100 l. Zelle/DPBS-Mischung in Mikrozentrifugenröhrchen teilen, um mit der Spritze bei der Injektion von Zellen leicht zugänglich zu sein. Halten Sie Zellen auf Eis und injizieren Sie bald danach, da die Zellen beginnen zu sterben, nachdem sie für längere Zeit auf Eis sind.

2. Injektionen

1. Bereiten Sie Zellen für die Injektion vor, indem Sie das Mikrozentrifugenrohr tippen oder sanft mischen, um die Zellen wieder aufzuhängen, und dann 600 l in eine 1 ml Spritze aspirieren. Drehen Sie die Spritze nach oben und ziehen Sie den Kolben nach unten, um zellenfern von der Spritzenöffnung zu bringen. Tippen Sie auf die Spritze, um sie von Luftblasen zu befreien.
2. Befestigen Sie die Nadel ab und geben Sie die Zellen wieder in das Mikrozentrifugenrohr, bis nur noch 500 l in der Spritze verbleiben. Spritze flach auf Eis legen.
   HINWEIS: 4T1-Zellen fallen schnell aus der Suspension. Daher ist es wichtig, Zellen durch häufiges Tippen wieder in die Suspension zu mischen.
3. Anästhetisieren Sie 8 Wochen alt/>20 g weibliche BALB/c Maus mit Isofluran oder einem anderen zugelassenen Anästhetikum. Überwachen Sie die Atmung der Maus, um die Tiefe der Anästhesie zu beurteilen.
4. Sobald die Maus richtig anästhetisiert ist, wie durch mangels Hornhautreflex angezeigt, legen Sie die Maus auf den Rücken. Halten Sie mit Daumen, Zeiger und Mittelfinger die Maus vorsichtig gedrückt. Verwenden Sie den Zeiger und den Mittelfinger, um den Oberkörper und Daumen der Maus für das hintere linke Bein zu halten. Seien Sie sanft, aber fest.
5. Mit der Abschrägung der Nadel nach oben, injizieren Sie 100 L Zellen subkutan in die linke Bauchbrust Fettpolster der Maus. Überwachen Sie eine gute Bleb und alle Leckagen, und stellen Sie sicher, dass die Maus aufwacht und bewegt sich leicht nach der Injektion.
   1. Ändern Sie die Nadeln zwischen jeder Maus.
      HINWEIS: Lassen Sie die Nadel nicht in die Peritonealhöhle gelangen. Dies würde dazu führen, dass sich der Krebs schnell ausbreitet und nicht repräsentativ für das Modell ist. Um eine subkutane Injektion zu gewährleisten, ziehen Sie vorsichtig nach oben auf der Nadel, wenn sie in das linke Bauchfettpolster eingesetzt wird. Wenn die Nadel leicht nach oben gehoben wird, wird sie subkutan positioniert.

3. Überwachung

1. Überwachen Sie Mäuse mindestens 3 mal pro Woche auf Gewicht, Körperzustandsbewertung, Tumorgröße, Tumorzustand, Atmung, Aktivitätsniveau, Aussehen und Bewegung. Sobald der Tumor einen Durchmesser von 0,7-0,8 cm erreicht hat, beginnen Sie täglich zu überwachen.
   1. Betrachten Sie Euthanasie, wenn die Tumorgröße 1,5 cm erreicht, oder Gewichtsverlust erreicht 20%, oder schwere klinische Abnahme des Körperzustands Score, Tumorzustand, Atmung, Aktivitätsniveau, Aussehen, oder Bewegung werden auf der Grundlage institutioneller Richtlinien beobachtet.
      HINWEIS: Körperzustand Score ist entscheidend zu überwachen, wie Körpergewicht kann zu erhöhen, wie der Tumor in der Größe zunimmt, Negieren Körperzustand Verlust aufgrund von Krankheitsbelastung. Genaue Überwachungsprotokolle hängen von den zugelassenen IACUC- oder institutionellen Protokollen ab.

4. Nekropsie

1. Euthanisieren Sie die Maus mit CO₂ nach den institutionellen Richtlinien.
2. Sprühmaus mit 70% Ethanol zum Desinfizieren. Machen Sie einen Schnitt bis zur ventralen Mittellinie der Maus, um die Körperhöhle freizulegen.
3. Entfernen Sie die Niere. Schneiden Sie die Mittellinie weiter, bis die Membran sichtbar ist. Verwenden Sie eine Schere, um das Zwerchfell zu punktieren, um die Lunge zu entschärfen. Trimmen Sie die Membran, um einen besseren Zugang zum Hohlraum zu erhalten.
4. Verwenden Sie eine stumpfe Schere, um die Mitte des Brustkorbs zu schneiden. Pin Brustkorb zurück, um die Lunge und das Herz zu belichten.
5. Durchdringen Sie das Herz mit 2 ml nicht-sterilen 1x DPBS, indem Sie eine Nadel in die Spitze des Herzens einsetzen, bis sie sich in der Bauchhöhle, in der die Niere entfernt wurde, einschwimmt.
6. Um das Herz und die Lunge zu entfernen, verwenden Sie eine stumpfe Schere, um die Speiseröhre und Luftröhre direkt über dem Herzen zu schneiden. Mit Zange, beginnen, das Herz weg aus dem Körper zu ziehen und schneiden Sie an jedem Bindegewebe halten es befestigt. Die Lunge wird mit dem Herzen herauskommen.
7. Identifizieren Sie die mehrlappige (rechte) und einlappige (linke) Lunge. Halten Sie das Herz zur Referenz befestigt, aber sobald die Lunge identifiziert ist, schneiden Sie das Herz weg.
8. Beschriften Sie eine 12 Wellplatte mit 1x Hank es Balanced Saline Solution (HBSS) in jedem Brunnen. Jede Maus benötigt 2 Brunnen. Legen Sie die mehrlappige (rechte) Lunge zur Metastasenauswertung in die 12-Well-Platte und halten Sie sie auf Eis. Halten Sie den benachbarten Brunnen vorerst leer.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dieselbe Lunge (mehrlappige) von jeder Maus zu verwenden, um sicherzustellen, dass jede Probe nahe ist. Die einlappende Lunge kann dann für andere Analysen wie Histopathologie verwendet werden.
   HINWEIS: Die Proben sind auf Eis oder bei 4 °C für einige Stunden stabil.

5. Verarbeitung von Geweben

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt sollten mit steriler Technik durchgeführt werden.

1. Etikett ieren 1 15 ml konische Röhre pro Maus und fügen Sie 2,5 ml Typ IV Kollagennase-Mischung und 30 Einheiten Elastase zu jedem Rohr. Um Typ IV Kollagennase-Gemisch zu machen, lösen Sie 2 mg Typ IV Kollagennase pro ml 1x HBSS und sterilen Filter auf. Diese kann bis zu 12 Monate bei -20 °C gelagert und bei Bedarf aufgetaut werden.
2. Übertragen Sie die Lunge auf die zweite, saubere 1x HBSS gut für diese Probe. Wirbeln Sie mit Zangen, um restliches Blut zu entfernen. Saubere Lunge auf leere 3,5 cm Gewebekulturplatte übertragen. Hacken Lunge mit Schere. Spülplatte mit 2,5 ml 1x HBSS, 1x HBSS und Lungenstücke in ein 15 ml konisches Rohr übertragen, das bereits Kollagennase/Elastase-Cocktail enthält (5 ml insgesamt).
3. 75 Minuten bei 4 °C inkubieren. Mischen Sie während dieser Zeit die Proben weiter, platzieren Sie daher Rohre auf einer Wippe oder einem rotierenden Rad. Beschriften Sie während dieses Inkubationsschritts 50 ml Zentrifugenröhrchen und 10 cm Gewebekulturplatten für jede Maus. Wenn Sie eine Verdünnung machen, beschriften Sie genügend 10 cm Gewebekulturplatten für die Verdünnungen.
   HINWEIS: Beschriften Sie den Deckel der Gewebekulturplatten. Wenn die Platte selbst beschriftet wird, wird die Schrift die Fidschi-ImageJ-Analyse stören.
4. Bringen Sie volumenjedes Rohr bis zu 10 ml insgesamt mit 1x HBSS. Gießen Sie den Inhalt über ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr für jede Probe. Verwenden Sie den Kolben einer 1 ml Spritze, um die Probe vorsichtig durch das Sieb zu schleifen, damit mehr Zellen durchfiltern können.
5. Zentrifuge für 5 Minuten bei 350 x g bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand und waschen Pellet mit 10 ml 1x HBSS. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
6. Resuspend Pellet in 10 ml von 60 'M 6TG komplette Kulturmedien, entweder RPMI oder IMDM. Plattenproben in 10 cm Zellkulturplatten, falls gewünscht, mit einem Verdünnungsschema. Bei 37 °C inkubieren, 5% CO₂ für 5 Tage.
   ANMERKUNG: 1:2, 1:10 und 1:100 sind häufige Verdünnungen, die empirisch anhand von Studienparametern bestimmt werden müssen.
   VORSICHT: 6TG ist giftig. Seien Sie vorsichtig bei der Handhabung und befolgen Sie alle Richtlinien für die Umweltsicherheit und -sicherheit für die Entsorgung.

6. Färbplatten

1. Gießen Sie Kulturmedien von Platten in entsprechende Abfallbehälter. FixZellen durch Zugabe von 5 ml unverdünntem Methanol pro Platte und inkubieren für 5 Minuten bei RT, um sicherzustellen, dass Methanol zu wirbeln, so dass es die gesamte Platte bedeckt.
   VORSICHT: Methanol ist gefährlich, wenn es aufgenommen, eingeatmet oder auf der Haut ist. Verwenden Sie eine Dunstabzugshaube für diesen Schritt.
2. Methanol von Platten in entsprechende Abfallbehälter gießen. Spülen Sie Platten mit 5 ml destilliertem Wasser pro Platte und gießen Sie Wasser in entsprechende Abfallbehälter. Fügen Sie 5 ml 0,03% Methylenblau pro Platte hinzu und brüten 5 Minuten bei RT, um sicherzustellen, dass Methylenblaulösung so gewirbelt wird, dass sie die gesamte Platte bedeckt.
3. Methylenblau in entsprechenden Abfallbehälter gießen. Spülen Sie die Platten wieder mit 5 ml destilliertem Wasser pro Platte. Drehen Sie Platten auf den Kopf und bloten Sie gegen ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Platte auf den Deckel legen und die Luft über Nacht bei RT trocknen lassen.
   HINWEIS: Metastasierende Kolonien werden blau sein. Sobald die Platten getrocknet sind, können sie bei RT auf unbestimmte Zeit gelagert werden.

7. Bildanalyse

1. Entfernen Sie beschriftete Deckel von den Platten, wobei Sie auf eine eindeutige Identifizierung der Proben achten. Richten Sie alle gefärbten Lungenplatten auf einer sauberen, hellen Oberfläche aus, um ein Bild aller Platten in einem Bild zu machen.
2. Machen Sie ein Bild von der Sammlung von Platten in einem gut beleuchteten Bereich, um reflexionen zu minimieren, da die Platten sehr reflektierend sind. Reflexionen in den Platten beeinflussen die Bildanalyse und müssen daher vermieden werden.
   HINWEIS: Fidschi-ImageJ hat eine Obergrenze von 2 Gigapixeln. Die meisten modernen Smartphones werden über genügend Kameras verfügen. Verwenden Sie keine Kamera mit weniger als 8 Megapixeln. Die Kamera, die in diesem Experiment verwendet wurde, war ein 12,2 Megapixel auf einem Google Pixel 2.
3. Schneiden Sie das Bild zu, um die Platten einzuschließen, schließen Sie jedoch die Deckel oder irgendetwas anderes im Hintergrund des Bildes aus. Laden Sie das zugeschnittene Bild in Fiji-ImageJ hoch.
4. Ändern Sie das Bild mit den folgenden Befehlen in Schwarzweiß: Bild, Anpassen, Farbschwellenwert, Schwellenwertmethode: Standard, Schwellenwertfarbe: B&W, Schwellenwertbereich: Lab. Deaktivieren Sie das Feld Dunkles Hintergrund. Das Bild sollte nun schwarz und weiß sein. Schwarz stellt den hellen Hintergrund dar, und Weiß stellt die blauen metastasierenden Kolonien dar.
5. Wählen Sie mit dem Werkzeug Kreis auf der Symbolleiste Fidschi-ImageJ den zu analysierenden Bereich aus. Zeichnen Sie einen Kreis, der für alle Platten verwendet werden soll, um sicherzustellen, dass jede Platte für die gleiche Größe analysiert wird. Wählen Sie eine Größe aus, die den analysierten Bereich auf den Platten maximiert und gleichzeitig das Hintergrundrauschen minimiert, das am Rand der Platten angezeigt wird. Die Größe wird in der Symbolleiste angezeigt, während sie gezeichnet wird, so dass es möglich ist, einen perfekten Kreis zu bilden, indem Sie die Höhe und die Breite überwachen, während der Kreis gezeichnet wird.
6. Analysieren Sie den ausgewählten Kreis, um zu bestimmen, welcher Prozentsatz der Fläche weiß ist, der die Fläche der Platte darstellt, die blaue metastasierende Kolonien hat. Verwenden Sie die folgenden Befehle:
   Analysieren, Analysieren von Partikeln, Größe (Pixel^2):0-Infinity, Zirkularität: 0.00-1.00, Anzeigen: Nichts, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zusammenfassen. Klicken Sie auf OK.
7. Zeichnen Sie das Ergebnis %Fläche auf. Dies ist der Prozentsatz des ausgewählten Bereichs, der weiß ist, und stellt daher die metastasierende Belastung dar.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, entweder die Ergebnisse in Fiji-ImageJ zu speichern oder die gesamte Ergebnisseite in ein separates Dokument zu kopieren/einzufügen. Wenn % Flächenergebnisse unerwartet oder verdächtig sind, kann man sehen, ob eine der anderen Messungen ebenfalls verdächtig war oder ob % Fläche falsch aufgezeichnet wurde.
8. Verschieben Sie den Kreis, ohne seine Größe zu ändern, indem Sie ihn in seiner Mitte greifen, zur nächsten Platte im Bild. Wiederholen Sie die Schritte 7.6 und 7.7 für alle Platten im Bild.
9. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 – 7.8 auf mindestens zwei weiteren Bildern. Nachdem alle Platten und Bilder analysiert wurden, durchschnittlich die % Fläche Ergebnisse zwischen verschiedenen Bildern für jede Platte, um alle Inkonsistenzen zwischen den Bildern zu mildern.

Representative Results

Diese Methode enthält einfache Anpassungen aus dem Pulaski und Ostrand-Rosenberg 4T1 Protokoll³ und kann in Abbildung 1visualisiert werden. Wenn 3 separate Forscher metastasierende Kolonien manuell für 12 Lungenplatten zählten (1:10 Verdünnung), waren die Ergebnisse zwischen verschiedenen Zählern sehr inkonsistent (Abbildung 2A). Alle Forscher wurden angewiesen, "die metastasierenden Kolonien zu zählen, die als blaue Punkte erscheinen", aber die Inkonsistenzen zeigen das Problem mit der manuellen Zählung hochmetastasierender Platten. Die Forscher hatten unterschiedliche Erfahrungen mit dem 4T1-Modell. Ein boardzertifizierter Veterinärpathologe analysierte H&E-gefärbte Lungendias auf Metastasen als eine weitere Methode zum Vergleich mit der Fidschi-ImageJ Lungenplattenanalyse (Abbildung 2B).

Mit Hilfe der Fidschi-ImageJ-Analyse analysierten 3 separate Forscher 3 separate Bilder der Sammlung von 12 Platten (1:2 Verdünnung). Die Bilder wurden in zwei separaten Laborräumen mit leicht unterschiedlicher Beleuchtung aufgenommen. Die Anordnung der Platten oder der Winkel, aus dem das Bild aufgenommen wurde, waren zwischen den einzelnen Bildern unterschiedlich. Im Gegensatz zu den manuellen Zählergebnissen waren die Ergebnisse von Fiji-ImageJ konsistent zwischen den Zählern für jedes der 3 Bilder (Abbildung 3A). Um festzustellen, ob es Inkonsistenzen zwischen den 3 Bildern gab, wurden die Ergebnisse der 3 Bilder und der 3 Zähler pro Lungenplatte kombiniert (Abbildung 3B). Es gibt Unterschiede zwischen den Bildern für einige Platten, aber die allgemeinen Trends sind ähnlich und es bietet mehr Konsistenz als manuelles Zählen. Um die Variationen zwischen den 3 verschiedenen Bildern zu berücksichtigen, wurden die Ergebnisse jedes Bildes für jede Platte gemittelt (Abbildung 3C). Diese Durchschnittswerte lieferten konsistente Ergebnisse zwischen Zählern, die die metastasierende Belastung genau und präzise analysieren. Daher schlägt dieses Protokoll vor, mindestens 3 Bilder der Plattensammlung in verschiedenen Anordnungen, aus verschiedenen Winkeln oder in leicht unterschiedlichen Lichteinstellungen zu nehmen und dann die Ergebnisse zu analysieren und zu mittelisieren. Der Kontrast zwischen manueller Zählung und Fidschi-ImageJ-Analyse wird beim Vergleich von Abbildung 2A mit Abbildung 3Cvisualisiert.

Eine weitere Möglichkeit, die Verbesserungen dieses Protokolls zu demonstrieren, ist der Vergleich der Rangfolge der Platten von den meisten bis zur geringsten metastasierenden Belastung zwischen Zählern, basierend auf den Zählungen aus Abbildung 2 und Abbildung 3. Die manuelle Zählung wurde auf der konfluentsten Platte vereinbart, aber alle folgenden Ränge waren zwischen den Zählern inkonsistent (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu waren die Ränge aus der Fidschi-ImageJ-Analyse für jedes Bild zwischen den Zählern viel konsistenter (Abbildung 4B). Die Konsistenz wird auch angezeigt, wenn die Ergebnisse jedes Bildes für jede Platte gemittelt wurden (Abbildung 4C). Wir erkennen an, dass dieses Protokoll keine vollständige Konsistenz zwischen leistungsindikatoren bietet, aber es stellt eine Verbesserung gegenüber der manuellen Zählung dar, wenn man Abbildung 4A mit Abbildung 4Cvergleicht. Die histopathologische Analyse unterschied sich sowohl von der manuellen als auch von der Fidschi-BildJ-Zählung (Abbildung 4D).

Um zu demonstrieren, wie wichtig es ist, Reflexionen in den Bildern zu vermeiden, wird ein Bild mit einer Handreflexion und der anschließenden Fidschi-ImageJ-Analyse (links) gegen dieselbe Platte ohne Reflexion (rechts) gezeigt (Abbildung 5A). Andere dunkle Flecken von einer schmutzigen Hintergrundoberfläche oder Blutprobenrückstände auf den Platten können sich auch negativ auf die Fidschi-ImageJ-Analyse auswirken. Die Blutplatte in Abbildung 5B hat nur 2 metastasierende Kolonien (bemerkt durch weiße Pfeile), aber die dunklen Rückstände (bemerkt durch schwarze Pfeile) veranlassten Fiji-ImageJ, es als 31,6% metastasiert zu betrachten. Daher ist es wichtig, eine saubere, helle Oberfläche zu haben und diese Methode nicht für Blutproben zu verwenden, da Blutproben in der Regel restliche dunkle Flecken auf der Platte hinterlassen, die keine metastasierenden Kolonien sind.

Abbildung 1: Protokollschema. Dieses Protokoll konzentriert sich ausschließlich auf die Analyse der Lungenmetastasierung im 4T1-Modell. Der allgemeine Fluss dieses Protokolls umfasst das Wachstum von 4T1-Zellen in der Kultur, die Injektion von BALB/c weiblichen Mäusen mit 4T1-Zellen im linken Brustfettpad, die Überwachung von Mäusen nach IACUC und institutionellen Protokollen, das Opfern von Mäusen und das Sammeln der Lunge, das Sammeln von Zellen aus den Lungenproben, die Beschichtung und Inkubation von Zellen in 6TG-Auswahlmedien, die Fixierung und Färbung von Zellen nach 5 Tagen, das Fotografieren der Platten und die Analyse mit Fidschi-Bild. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Das manuelle Zählen von metastasierenden Zellen und die histopathologische Analyse haben inkonsistente Ergebnisse. A. 12 Lungenplatten mit einer Verdünnung von 1:10 wurden manuell von 3 separaten Forschern gezählt, die angewiesen wurden, metastasierende Kolonien auf die gleiche Weise zu zählen, obwohl die Erfahrungen mit dem Modell zwischen den Forschern variierten. Die Zahl der gezählten metastasierenden Kolonien schwankte zwischen den Forschern stark. B. Die histopathologische Analyse identifizierte und quantifizierte einzelne Tumorzellaggregate, die als Metastasen klassifiziert sind und in H&E-gefärbten Lungendias vorhanden sind. Es werden Bilder mit hoher, mittlerer und niedriger Vergrößerung einer repräsentativen Folie angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Die Fidschi-ImageJ-Analyse ist genau und präzise bei der Bestimmung der metastasierenden Belastung. A. 12 Lungenplatten mit einer Verdünnung von 1:2 wurden von 3 separaten Forschern in 3 separaten Bildern der 12 Lungenplatten analysiert. B. Die Ergebnisse aus jedem der 3 Bilder von jedem der 3 Forscher wurden kombiniert. C. Die Ergebnisse jeder Lungenplatte aus den 3 Bildern wurden gemittelt. Einweg-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest stellte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zählern für jede Lungenplatte fest. Die Daten werden als Mittelwert + SD angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Die Fidschi-ImageJ-Analyse bietet eine konsistentere Rangfolge der metastasierenden Belastung im Vergleich zur manuellen Zählung und histopathologischen Analyse. A. Die gleichen Lungenplatten aus Abbildung 2 wurden anhand der manuellen Zählungen aus Abbildung 2 von den meisten bis zu den wenigsten metastasierenden Typen gewertet. B. Die gleichen 12 Lungenplatten aus Abbildung 3 wurden von den meisten bis zu den wenigsten metastasierenden basierend auf der Fidschi-ImageJ-Analyse aus Abbildung 3A. C. Die Durchschnittswerte aus Abbildung 3C wurden von den meisten bis zu den wenigsten metastasierenden bewertet. D. Lungenrutschen wurden auf der Grundlage histopathologischer Auswertungen von den meisten bis zu den wenigsten metastasierend eingestuft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Reflexionen und nicht-metastasierende dunkle Flecken wirken sich negativ auf die Ergebnisse aus. A. Ein Bild mit einer Darstellung einer Hand, die das Bild macht, stört die Fidschi-Bild J-Analyse, wie beim Vergleich der Reflexion Fidschi-ImageJ-Analyse (links) mit der richtigen Fidschi-ImageJ-Analyse (rechts) B gezeigt wird. Blutplatten hinterlassen oft übrig gebliebene Flecken (schwarze Pfeile) auf den Platten, die keine metastasierenden Kolonien sind (weiße Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Wie gezeigt, kann das manuelle Zählen der metastasierenden Kolonien auf jeder Lungenplatte eine ungenaue und ungenaue Methode zur Quantifizierung von Lungenmetastasen sein, was die Notwendigkeit einer besseren Quantifizierung simoniert (Abbildung 2). Die histopathologische Analyse unterschied sich sowohl von der manuellen Zählung als auch von der Fidschi-ImageJ-Analyse(Abbildung 2B und 4D), wahrscheinlich, weil die H&E-Folien keine repräsentative Probe des gesamten Organs sind. Das Protokoll erntet eine ganze Lunge und ist daher repräsentativer für die gesamte Lungenmetastasierung und ist konsistenter als manuelles Zählen. Mehrere verschiedene Ansätze für Die Fidschi-ImageJ-Analyse wurden versucht und werden unten diskutiert, aber das oben beschriebene Protokoll scheint die überlegene Methode zu sein.

Für diese Studie wurden Lungen-, Blut- und Hirnproben entnommen. Allerdings hatten die Blut- und Hirnproben nur sehr wenige metastasierende Kolonien, wenn überhaupt. Wir stellten fest, dass das manuelle Zählen der metastasierenden Kolonien für diese weniger metastasierenden Gewebe optimal ist, weshalb Blut- und Hirndaten nicht berücksichtigt wurden. Wenn die metastasierende Last leicht manuell zu zählen ist (z. B. zehn oder zwanzig metastasierende Kolonien im Gegensatz zu Tausenden), ist das ursprüngliche Problem des menschlichen Versagens nicht relevant, und daher wird dieses Protokoll nicht benötigt. Auch Blutproben können dunkle Flecken auf den Platten nach der Fixierung hinterlassen, was die Fidschi-ImageJ-Analyse stört (Abbildung 5). Wichtig ist, dass die Menge der injizierten Zellen die metastasierende Belastung beeinflussen kann. Zum Beispiel, wenn weniger Zellen injiziert werden und die Mäuse länger überleben können, hat der Krebs mehr Zeit, sich auf die traditionell weniger metastasierenden Stellen wie das Gehirn^3,4zu verbreiten. Daher könnte dieses Protokoll so geändert werden, dass es die metastasierende Belastung anderer Gewebe einschließt, wenn ihnen Zeit gegeben wird, hochmetastasiert zu werden. Wenn Sie das 4T1-Modell zum ersten Mal ausprobieren oder die Anzahl der injizierten Zellen ändern, empfehlen wir, beim Beschichten von Zellen mindestens zwei Verdünnungen zu versuchen. Für diese Studie haben wir eine Verdünnung von 1:2 und 1:10 verwendet. Die 1:2-Verdünnung wäre schwer manuell zu zählen gewesen, wurde aber in Fidschi-ImageJ leicht gezählt. Die 1:10-Verdünnung war noch schwer manuell zu zählen und führte somit zu inkonsistenten Ergebnissen. Verdünnungen können basierend auf den spezifischen Studienparametern modifiziert werden.

Es wurden Bilder von einzelnen Lungenplatten und den 12 Lungenplatten zusammen gemacht. Einzelne Platten wurden auf zwei Arten analysiert: entweder das Bild vor dem Hochladen auf Fidschi-ImageJ auf ein zentrales Quadrat der Platte zuschneiden oder das Kreisauswahlwerkzeug in Fidschi-ImageJ zu verwenden, um den zentralen Kreis der Platte im ungeschnittenen Bild auszuwählen. Wir fanden heraus, dass die Verwendung des Kreisauswahlwerkzeugs in Fidschi-ImageJ die einfachste und konsistenteste Möglichkeit bot, einen gleichgroßen Bereich für die Analyse für alle Platten zu erstellen. Darüber hinaus war die Analyse der gesamten Sammlung von Lungenplatten im selben Bild der Analyse einzelner Bilder einzelner Lungenplatten überlegen. Mit allen Lungenplatten im gleichen Bild ermöglicht es, dass der gleich große Kreis leicht zwischen den Lungenplatten verwendet werden kann. Es stellt sicher, dass alle Lungenplatten den gleichen Abstand zur Kamera haben und daher sollte der gleiche Kreis für die Analyse die richtige Größe für alle Lungenplatten im Bild sein. Es macht auch die Analyse schneller, da eine Neuzeichnung des Kreises zwischen den Platten nicht notwendig ist. Es wird einfach auf die nächste Platte im Bild gezogen, ohne seine Größe zu ändern, was garantiert, dass die gleiche Größe für alle Platten im Bild verwendet wird. Bei der Auswahl der Kreisgröße ist es wichtig, ihn groß genug zu machen, um den Großteil der Platte zu analysieren, während er klein genug ist, um das Hintergrundrauschen von den Rändern der Platte zu vermeiden. Darüber hinaus wurden zellenweise in 6 Brunnenplatten eingezäunt und mit den 10 cm Gewebekulturplatten verglichen. Die Fidschi-ImageJ-Ergebnisse aus den 6 Brunnenplatten waren weniger konsistent und korrelierten nicht mit den 10 cm-Gerichten (Daten nicht dargestellt). Eine Erklärung ist, dass die kleinere Fläche eine kleinere Zuanalysefläche bietet, was zu weniger repräsentativen Daten führt. Eine andere ist, dass die Verringerung der Oberfläche ermöglicht es den Zellen, schneller zu wachsen, da sie näher an anderen überlebenden Zellen sind. Daher empfehlen wir nicht, andere Gewebekulturreagenzien als das, was wir im Protokoll beschrieben haben, zu verwenden.

Wie bereits erwähnt, sind die Vermeidung von Reflexionen und einen sauberen, leichten Hintergrund für diese Methode absolut entscheidend. Abbildung 5A zeigt, wie eine Reflexion in Fidschi-ImageJ analysiert wird und zeigt daher die entscheidende Bedeutung der Vermeidung von Reflexionen. Da Gewebekulturplatten stark reflektierend sind, ist es vorteilhaft, das Bild in einem leichten Winkel zu nehmen, um Reflexionen von entweder sich selbst oder von den Lichtquellen oben zu vermeiden. Die Lichtverhältnisse des jeweiligen Arbeitsbereichs müssen berücksichtigt werden. Wir empfehlen, mehrere Bilder der zu analysierenden Platten zu machen, indem wir leicht unterschiedliche Anordnungen und/oder Winkel in einem gut beleuchteten Bereich ausprobieren. Studieren Sie die Bilder intensiv für alle Reflexionen. Wenn es Inkonsistenzen in der Analyse gibt, ist dies wahrscheinlich auf ein Bildqualitätsproblem zurückzuführen. Vergleichen Sie zur Fehlerbehebung das normale Bild mit dem Schwarzweißbild. Wenn Bereiche, die im normalen Bild nicht blau sind, im Schwarz-Weiß-Bild als weiß erscheinen, gibt es wahrscheinlich eine Reflexion oder einen Makel, der die Ergebnisse verändert.

Neben der Konsistenz ist ein weiterer bemerkenswerter Vorteil dieser Methode, dass sie Daten viel schneller erzeugt als manuelles Zählen. Das manuelle Zählen mehrerer Platten ist sehr zeitaufwändig, während die Fidschi-ImageJ-Analyse schnell durchgeführt werden kann. Es ermöglicht auch eine kürzere Inkubationszeit. Pulaski und Ostrand-Rosenberg empfehlen eine 10-14-tägige Inkubationszeit für die plattierten Zellen, wodurch der Studie eine beträchtliche Zeit spanne Zeit hinzugefügt wird³. Die 10-14-tägige Inkubationszeit ermöglicht die Bildung größerer, leichter zu zählender Kolonien. Allerdings können viele Lungenplatten bis dahin konfluent werden. Stattdessen gibt 5 Tage Inkubation genug Zeit für die 6TG-Auswahl, um nicht-kanzeröse Zellen abzutöten (bewiesen durch gesunde Kontrollmäuse, die keine Kolonien auf ihren Lungenplatten haben, Daten nicht gezeigt), und damit die Zellen so wachsen, dass sie leicht mit Fidschi-ImageJ quantifiziert werden können. Dies verringert die Zeit zwischen den geopferten Mäusen und der Analyse wesentlicher metastasierender Daten erheblich.

Abschließend möchte ich sagen, dass die Vorteile dieser Methode die Grenzen bei weitem überwiegen. Wir erkennen an, dass diese Methode keine perfekte Konsistenz bietet. Obwohl dies nicht die ideale Methode für weniger metastasierende Gewebe ist, können diese Gewebe leicht manuell gezählt werden. Während ein Bild ohne Reflexionen zu erhalten, kann einige sorgfältige Fotografie erfordern, die Konsistenz mit dieser Methode gewonnen ist signifikant. Es ist möglich, dass diese Methode für andere Gewebe verwendet werden könnte, die hochmetastasisch sind, und andere Protokolle, die das Zählen von gebeizten Objekten erfordern. Das Studiendesign könnte auch die Analyse der Rate der Metastasierung oder der Wirkung von Anti-Krebs-Behandlungen auf Metastasen ermöglichen. Diese Methode liefert hochkonsistente, zuverlässige Metastasendaten und stellt eine signifikante Verfeinerung des 4T1-Modells dar. Die Anwendung dieses Modells auf die kommende Brustkrebsmetastasenforschung ist von größter Bedeutung, wenn es darum geht, Forscher mit Werkzeugen zur Bekämpfung der Brustkrebssterblichkeit zu bewaffnen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia chamber	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice	The Jackson Laboratory	000651
Blunt scissors	Roboz	RS-6700
Calculator	Any	Any
Camera	Any	Any	Minimum of 8 megapixels
Centrifuge	Any	Any	Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage	Any	Any
Computer with Fiji-ImageJ	Any	Any	Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-10
Curved scissors	Roboz	RS-5859
Distilled water	Any	Any
Elastase	MP Biomedicals	100617
Electronic scale	Any	Any
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Forceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubator	See comments	See comments	Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylene blue	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Pins or needles	Any	Any	For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rocker or rotating wheel	Any	Any
Sharp scissors	Roboz	RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flasks	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flasks	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flasks	Fisher Scientific	13-680-65
Tri-cornered plastic beaker	Fisher Scientific	14-955-111F	Used to weigh mice
Trypan blue	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collagenase	Sigma-Aldrich	C5138
3.5 cm tissue culture plates	Nunclon	153066
1 mL syringe	BD	309659
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
10 cm tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-22
12 well plate	Corning	3512
15 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in needles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM cell strainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Dilute to 70% with DI water