Summary
We beschrijven een meer consistente en snelle methode om longmetastase te kwantificeren in het 4T1 borstkankermodel met behulp van Fiji-ImageJ.
Abstract
Borstkanker is een verwoestende maligniteit, goed voor 40.000 vrouwelijke sterfgevallen en 30% van de nieuwe vrouwelijke kankerdiagnoses in de Verenigde Staten alleen al in 2019. De belangrijkste oorzaak van borstkanker gerelateerde sterfgevallen is de uitgezaaide last. Daarom moeten preklinische modellen voor borstkanker gemetastaseerde belasting analyseren om klinisch relevant te zijn. Het 4T1 borstkankermodel biedt een spontaan metastaserend, kwantificeerbaar muismodel voor stadium IV borstkanker bij de mens. Echter, de meeste 4T1 protocollen kwantificeren de uitgezaaide last door handmatig te tellen gekleurde kolonies op weefselkweek platen. Hoewel dit voldoende is voor weefsels met een lagere uitgezaaide belasting, veroorzaakt menselijke fout in handmatig tellen inconsistente en variabele resultaten wanneer platen samenvloeiend en moeilijk te tellen zijn. Deze methode biedt een computergebaseerde oplossing voor menselijke telfouten. Hier evalueren we het protocol met behulp van de long, een zeer uitgezaaid weefsel in het 4T1-model. Afbeeldingen van methyleen blauw bevlekte platen worden verworven en geüpload voor analyse in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bepaalt vervolgens het percentage van het geselecteerde gebied van de afbeelding dat blauw is, wat het percentage van de plaat met uitgezaaide last vertegenwoordigt. Deze computergebaseerde aanpak biedt consistentere en snellere resultaten dan handmatig tellen of histopathologische evaluatie voor zeer uitgezaaide weefsels. De consistentie van fiji-ImageJ resultaten hangt af van de kwaliteit van het beeld. Kleine variaties in de resultaten tussen beelden kunnen optreden, dus het wordt aanbevolen dat meerdere beelden worden genomen en resultaten gemiddeld. Ondanks de minimale beperkingen is deze methode een verbetering van het kwantificeren van uitgezaaide belasting in de longen door consistente en snelle resultaten te bieden.
Introduction
Een op de acht vrouwen zal worden gediagnosticeerd met borstkanker in haar leven, en toch ondanks meerdere behandeling opties borstkanker is de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen bij Amerikaanse vrouwen1. Deze vrouwen sterven niet aan de primaire tumor in hun borst. In plaats daarvan is de uitgezaaide last verantwoordelijk voor de mortaliteit van deze ziekte omdat deze zich vaak verspreidt naar de longen, het bot, de hersenen, de lever en de lymfeklieren2. Daarom moeten borstkankermodellen metastase evalueren om bij te dragen aan het terugdringen van de sterfte van deze ziekte. De 4T1 murine borstkanker model is een prachtig protocol om dit te bereiken. De hier beschreven methode biedt een verbetering van het 4T1-model door Fiji-ImageJ te gebruiken om longmetastase te kwantificeren, wat consistente en snelle resultaten oplevert.
De 4T1 model is goed ingeburgerd, met de meeste laboratoria met behulp van protocollen zoals die beschreven door Pulaski en Ostrand-Rosenberg in 20013. De 4T1-cellijn is 6-Thioguanine (6TG) resistent en representatief voor stadium IV, drievoudig negatief borstkanker3,4,5. Het is klinisch relevant omdat het een orthotopisch model is en spontaan uitzaait naar dezelfde organen als bij borstkanker bij de mens3,4. De 4T1-cellen metastaseren spontaan in een voorspelbaar tempo op basis van de hoeveelheid geïnjecteerde cellen3,4. Belangrijk is dat genetische verschillen tussen muizen die hier worden gebruikt, de verwachte inter-individuele variabiliteit in gemetastasaire lasten veroorzaakten. Om metastase te evalueren, worden weefsels geoogst om kankercellen in verre gebieden te verzamelen en te kwantificeren met behulp van 6TG-selectie en methyleenblauwe vlekken. Het resultaat is een verzameling weefselkweekplaten met blauwe stippen die uitgezaaide kolonies vertegenwoordigen. Het Pulaski- en Ostrand-Rosenberg-protocol kwantificeert echter gemetastaseerde kolonies door ze handmatig te tellen, en daarom is dit het standaardmiddel geweest om metastase in dit model te evalueren. Hoewel dit gemakkelijk is voor weefsels met een lage uitgezaaide belasting, weefsels zoals de longen zijn vaak beladen met uitzaaiingen. Aangezien longplaten zeer vloeiend kunnen zijn, is het nauwkeurig en nauwkeurig kwantificeren van uitgezaaide gemetastaseerde kolonies door handmatig tellen moeilijk en gevoelig voor menselijke fouten. Om gemetastaseerde lasten beter te kwantificeren, beschrijven we het gebruik van Fiji-ImageJ voor een computergebaseerde oplossing voor menselijke telfouten. Histopathologische analyse met hematoxylin en eosine (H&E) kleuring is een ander middel om longmetastasen te kwantificeren, en interessant is ook verbeterd met Fiji-ImageJ software6,7. Echter, omdat histopathologische analyse een enkel stukje van de long observeert, kan het onjuist en niet representatief zijn. Dit komt omdat het 4T1-model verschillende uitgezaaide laesies door het hele orgaan veroorzaakt die niet gelijkmatig verdeeld zijn. Hoewel de algemene trends tussen histopathologische analyse en handmatig tellen vergelijkbaar kunnen zijn8, kunnen de individuele waarden verschillen en mag histopathologische analyse daarom niet worden gebruikt als enig kwantificeringsmiddel. We tonen het voordeel ten opzichte van histopathologische analyse en de inconsistenties in handmatig tellen tussen verschillende tellers, terwijl ook de consistentie van het gebruik van Fiji-ImageJ aantoont. Bovendien tonen we aan dat deze methode de incubatietijd kan verminderen van 10-14 dagen tot 5 dagen, wat betekent dat onderzoekers gegevens uit hun studie veel eerder kunnen analyseren dan wanneer ze vertrouwen op handmatig tellen.
Deze methode is een verzameling eenvoudige aanpassingen aan het Pulaski en Ostrand-Rosenberg protocol3. Omdat het 4T1-model veel wordt gebruikt en omdat longmetastase een kritieke parameter is om te meten in preklinische modellen, geloven we dat deze methode op grote schaal kan worden gebruikt en zeer waardevol is voor borstkankeronderzoekers. De enige extra benodigdheden die nodig zijn een camera en toegang tot een computer met Fiji-ImageJ, een gratis software die vaak wordt gebruikt in beeldanalyse9. Deze methode richt zich specifiek op longmetastase, maar het kan worden gebruikt voor andere weefsels met een aanzienlijke uitgezaaide last.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Virginia Tech en in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Het uitvoeren van dit protocol vereist toestemming van de juiste instellingen en naleving van alle juiste richtlijnen.
1. Celcultuur
- Maak complete kweekmedia (RPMI + 10% Foetale Runder Serum +1% Pen Strep). Herleef 4T1 cellen volgens ATCC Protocol10 en broed bij 37 °C en 5% CO2 in een T-25 kolf tot confluent. Verander media de dag na het herleven om dode cellen te verwijderen, en opnieuw als de media wordt besteed voordat cellen zijn confluent genoeg om passage.
- Zodra de T-25 kolf is confluent, passage cellen naar een T-75 kolf door het weggooien van media, waskolf met 5 mL van 1x Dulbecco's Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (DPBS), en het toevoegen van 500 μL van Trypsin-EDTA. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C tot de cellen loskomen.
- Eenmaal losgemaakt, voeg 5 mL van opgewarmde complete cultuur media aan cellen. Aspirate en breng de 5 mL over naar een T-75 kolf met 15 mL opgewarmde complete cultuurmedia.
- Passagecellen in T-75 kolven minstens vier keer. Doe dit zodra de kolf is confluent door het wassen met 8 mL van 1x DPBS, het toevoegen van 1 mL van Trypsin-EDTA voor het losmaken van cellen, het toevoegen van 10 mL van opgewarmde media aan cellen, en verdunnen 1:6-1:8 in een nieuwe T-75 kolf met 20 mL van opgewarmde volledige cultuur media.
- Passagecellen tot het juiste aantal T-150 kolven met 40 mL opgewarmde volledige kweekmedia voor het aantal te injecteren muizen. De meeste studies vereisen meerdere T-150 kolven om voldoende cellen te garanderen voor injectie.
- Wanneer muizen klaar zijn om te worden geïnjecteerd (8 weken oud of een gewicht van meer dan 20 g, afhankelijk van de IACUC of institutionele protocollen), oogst cellen door het weggooien van media, het wassen van elke kolf met 10 mL van 1x DPBS en het toevoegen van 2 mL trypsin-EDTA. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C tot de cellen loskomen.
- Was kolf met 10 mL volledige media en breng alle inhoud (10 mL media + 2 mL trypsin-EDTA celmengsel) over naar de volgende kolf. Blijf cellen uit elke kolf wassen en verzamelen met dezelfde 10 mL media om te voorkomen dat u een te grote hoeveelheid media gebruikt.
- Zodra alle kolven zijn verzameld, breng de inhoud in een 50 mL centrifuge buis. Verzamel een monster van 10 μL voor het tellen in een microcentrifugebuis en centrifugeer de 50 mL conische buis op 125 x g gedurende 5 minuten.
- Terwijl cellen worden gecentrifugeerd, voeg 10 μL Trypan blauw toe aan 10 μL celmonster. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Zodra het totale aantal cellen is bepaald, berekent u de concentratie cellen die nodig zijn om muizen te injecteren voor 1,2 x 106 cellen per muis (per 100 μL).
- Na centrifugatie, decanteren media en resuspend cell pellet in de juiste hoeveelheid steriele 1x DPBS voor 1,2 x 106 cellen per 100 μL. Split cel / DPBS mengsel in microcentrifuge buizen voor gemakkelijke toegang met de spuit bij het aspirating cellen voor injectie. Houd cellen op ijs en injecteer kort daarna als cellen zullen beginnen te sterven na langere tijd op ijs te zijn.
2. Injecties
- Bereid cellen voor op injectie door de microcentrifugebuis te tikken of voorzichtig te mengen om de cellen opnieuw op te zetten en vervolgens 600 μL in een spuit van 1 mL aan te trekken. Draai de spuit naar boven en trek de zuiger naar beneden om cellen weg te brengen van de spuit opening. Tik op de spuit om het te ontdoen van luchtbellen.
- Bevestig de naaldschuin en geef cellen terug in de microcentrifugebuis tot er slechts 500 μL in de spuit blijft. Zet spuit plat op ijs.
LET OP: 4T1 cellen vallen snel uit de suspensie. Daarom is het belangrijk om cellen terug te mengen in suspensie door vaak te tikken. - Verdoes 8 weken oud/>20 g vrouwelijke BALB/c muis met isoflurane of ander goedgekeurd verdovingsmiddel. Controleer de ademhaling van de muis om de diepte van anesthesie te beoordelen.
- Zodra de muis goed is verdoofd, zoals aangegeven door gebrek aan hoornvliesreflex, plaats de muis op zijn rug. Houd met de duim, aanwijzer en middelvinger de muis voorzichtig ingedrukt. Gebruik de aanwijzer en middelvingers om het bovenlichaam en de duim van de muis in te houden voor het linkerachterbeen. Wees zachtaardig, maar stevig.
- Met de schuine kant van de naald omhoog, injecteer 100 μL van cellen onderhuids in de linker buikslachtige vetmat van de muis. Monitor voor een goede bleb en eventuele lekkage, en zorg ervoor dat de muis wakker wordt en beweegt gemakkelijk na de injectie.
- Wissel naalden tussen elke muis.
LET OP: Laat naald niet in de buikholte komen. Dit zou ertoe leiden dat de kanker zich snel verspreidt en niet representatief is voor het model. Om een onderhuidse injectie te garanderen, trek voorzichtig naar boven op de naald wanneer ingebracht in de linker buik borst vet pad. Als de naald gemakkelijk naar boven wordt getild, wordt deze correct onderhuids geplaatst.
- Wissel naalden tussen elke muis.
3.
- Monitor muizen ten minste 3 keer per week voor gewicht, lichaamsconditie score, tumor grootte, tumor conditie, ademhaling, activiteit niveau, uiterlijk, en beweging. Zodra de tumor bereikt 0,7-0,8 cm in diameter, beginnen dagelijks te controleren.
- Overweeg euthanasie wanneer de tumor grootte bereikt 1,5 cm, of gewichtsverlies bereikt 20%, of ernstige klinische daling van de lichaamsconditie score, tumor conditie, ademhaling, activiteit niveau, uiterlijk, of beweging worden waargenomen op basis van institutionele richtlijnen.
OPMERKING: Body condition score is cruciaal om te controleren als lichaamsgewicht kan toenemen als de tumor toeneemt in omvang, ontkennen lichaam conditie verlies als gevolg van ziekte last. Exacte monitoringprotocollen zijn afhankelijk van de goedgekeurde IACUC- of institutionele protocollen.
- Overweeg euthanasie wanneer de tumor grootte bereikt 1,5 cm, of gewichtsverlies bereikt 20%, of ernstige klinische daling van de lichaamsconditie score, tumor conditie, ademhaling, activiteit niveau, uiterlijk, of beweging worden waargenomen op basis van institutionele richtlijnen.
4. Obductie
- Euthanaseren muis met behulp van CO2 volgens institutionele richtlijnen.
- Spray muis met 70% ethanol te desinfecteren. Maak een incisie van de ventrale middellijn van de muis om de lichaamsholte bloot te stellen.
- Verwijder de nier. Blijf de middellijn snijden totdat het middenrif zichtbaar is. Gebruik een schaar om het middenrif te doorboren om de longen leeg te laten lopen. Knip het middenrif om een betere toegang tot de holte te krijgen.
- Gebruik een stompe schaar om het midden van de ribbenkast te snijden. Pin ribcage terug om de long en het hart bloot te leggen.
- Doorsloop het hart met 2 mL van niet-steriele 1x DPBS door het inbrengen van een naald in de top van het hart totdat het zwembaden in de buikholte waar de nier werd verwijderd.
- Om het hart en de longen te verwijderen, gebruik botte schaar om de slokdarm en luchtpijp direct boven het hart te snijden. Met behulp van tangen, beginnen om het hart weg te trekken van het lichaam en weggesneden op een bindweefsel houden het aan. De longen komen naar buiten met het hart.
- Identificeer de multi-lobed (rechts) en single-lobed (links) longen. Houd het hart bevestigd voor referentie, maar zodra de longen zijn geïdentificeerd, snijd het hart weg.
- Label een 12 put plaat met 1x Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) in elke put. Elke muis heeft 2 putten nodig. Plaats de multi-gelobde (rechter) long in de 12 put plaat voor metastase evaluatie en houd op ijs. Houd de naburige goed leeg voor nu.
OPMERKING: Het is belangrijk om dezelfde long (multi-lobed) van elke muis te gebruiken om ervoor te zorgen dat elk monster dicht in grootte is. De single-lobed long kan dan worden gebruikt voor andere analyse, zoals histopathologie.
LET OP: Monsters zijn stabiel op ijs of op 4 °C voor een paar uur.
5. Verwerkingsweefsels
LET OP: Alle stappen in deze sectie moeten worden gedaan met behulp van steriele techniek.
- Label 1 15 mL conische buis per muis en voeg 2,5 mL van type IV collagenase mengsel en 30 eenheden elastase aan elke buis. Om het collagenasemengsel van type IV te maken, los 2 mg collagenase van type IV per mL 1x HBSS en steriel filter op. Dit kan tot 12 maanden bij -20 °C worden opgeslagen en ontdooid wanneer dat nodig is.
- Breng de long naar de tweede, schoon 1x HBSS goed voor dat monster. Wervel met behulp van tangen om het resterende bloed te verwijderen. Breng schone long over naar lege 3,5 cm weefselkweekplaat. Gehaktlong met schaar. Spoel plaat met 2,5 mL van 1x HBSS, breng 1x HBSS en longstukken in een 15 mL conische buis die al collagenase/elastase cocktail bevat (5 mL totaal).
- Incubeer gedurende 75 minuten bij 4 °C. Blijf gedurende deze tijd monsters mengen, dus plaats buizen op een tuimelschakelaar of roterend wiel. Tijdens deze incubatiestap labelt u 50 mL centrifugebuizen en 10 cm weefselkweekplaten voor elke muis. Bij het doen van een verdunning, etiket genoeg 10 cm weefsel kweekplaten voor de verdunningen.
LET OP: Label het deksel van de weefselkweekplaten. Als het labelen van de plaat zelf, het schrijven zal interfereren met Fiji-ImageJ analyse. - Breng het volume van elke buis tot 10 mL in totaal met 1x HBSS. Giet de inhoud over een 70 μm celzeef in een conische buis van 50 mL voor elk monster. Gebruik de zuiger van een spuit van 1 mL om het monster voorzichtig door de zeef te malen om meer cellen door te laten filteren.
- Centrifuge gedurende 5 minuten bij 350 x g bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg en waspellet met 10 mL 1x HBSS. Herhaal deze stap twee keer.
- Resuspend pellet in 10 mL of 60 μM 6TG complete cultuurmedia, rpmi of IMDM. Plaatmonsters in 10 cm celkweekplaten, indien gewenst met behulp van een verdunningsschema. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 5 dagen.
OPMERKING: 1:2, 1:10 en 1:100 zijn veelvoorkomende verdunningen die empirisch moeten worden bepaald op basis van studieparameters.
LET OP: 6TG is giftig. Wees voorzichtig bij het hanteren en volg alle richtlijnen voor milieugezondheid en veiligheid voor verwijdering.
6. Kleurplaten
- Giet cultuurmedia van platen in geschikte afvalcontainer. Fix cellen door het toevoegen van 5 mL van onverdunde methanol per plaat en incubeer gedurende 5 minuten op RT, zorg ervoor dat methanol wervelen, zodat het de hele plaat bedekt.
LET OP: Methanol is gevaarlijk bij inname, ingeademd of op de huid. Gebruik een rookkap voor deze stap. - Giet methanol van platen in de juiste afvalcontainer. Spoel borden met 5 mL gedestilleerd water per plaat en giet water in de juiste afvalcontainer. Voeg 5 mL van 0,03% methyleenblauw per plaat toe en broed gedurende 5 minuten bij RT, zorg ervoor dat u de methyleenblauwe oplossing wervelt, zodat deze de hele plaat bedekt.
- Giet methyleenblauw in de juiste afvalcontainer. Spoel de platen opnieuw af met 5 mL gedestilleerd water per plaat. Draai platen ondersteboven en dep tegen een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Plaats de plaat op het deksel en laat de lucht 's nachts drogen bij RT.
LET OP: Uitgezaaide kolonies zullen blauw zijn. Zodra de platen zijn gedroogd, kunnen ze voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij RT.
7. Beeldanalyse
- Verwijder gelabelde deksels van platen, zorg ervoor dat de monsters duidelijk worden geïdentificeerd. Line-up alle gekleurde longplaten op een schone, lichte oppervlak om een foto van alle platen in een beeld te nemen.
- Maak een foto van de collectie platen in een goed verlichte ruimte, om reflecties te minimaliseren als de platen zijn zeer reflecterend. Reflecties in de platen zullen de beeldanalyse beïnvloeden en moeten daarom worden vermeden.
LET OP: Fiji-ImageJ heeft een bovengrens van 2 gigapixels. De meeste moderne smartphones zullen voldoende camera's hebben. Gebruik geen camera van minder dan 8 megapixels. De camera die in dit experiment werd gebruikt was een 12,2 megapixel op een Google Pixel 2. - Snijd de afbeelding bij om de platen op te nemen, maar sluit de deksels of iets anders op de achtergrond van de afbeelding uit. Upload de bijgesneden afbeelding naar Fiji-ImageJ.
- Wijzig de afbeelding in zwart-wit met behulp van de volgende opdrachten: Afbeelding, Aanpassen, Kleurdrempel, Drempelmethode: Standaard, Drempelkleur: B&W, Drempelruimte: Lab. Schakel het achtergrondvak Donker uit. Het beeld moet nu zwart-wit zijn. Zwart vertegenwoordigt de lichte achtergrond, en wit vertegenwoordigt de blauwe uitgezaaide kolonies.
- Selecteer met het gereedschap Cirkel op de werkbalk Fiji-ImageJ het te analyseren gebied. Teken een cirkel te gebruiken voor alle platen om ervoor te zorgen elke plaat wordt geanalyseerd voor hetzelfde formaat gebied. Kies een grootte die het geanalyseerde gebied op de platen maximaliseert terwijl het minimaliseren van het achtergrondgeluid dat op de rand van de platen verschijnt. De grootte verschijnt in de werkbalk als deze wordt getekend, dus het is mogelijk om een perfecte cirkel te maken door de hoogte en de breedte te bewaken terwijl de cirkel wordt getekend.
- Analyseer de geselecteerde cirkel om te bepalen welk percentage van het gebied wit is, wat het gebied van de plaat vertegenwoordigt dat blauwe uitgezaaide kolonies heeft. Gebruik de volgende opdrachten:
Deeltjes analyseren, verkleinen (pixel2):0-Oneindigheid, Circulariteit: 0,00-1,00, Weergeven: Niets en schakel het selectievakje Samenvatten in. Raak OK. - Nota van het % gebiedsresultaat. Dit is het percentage van het geselecteerde gebied dat wit is en dus de uitgezaaide last vertegenwoordigt.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de resultaten op te slaan in Fiji-ImageJ of de volledige resultatenpagina te kopiëren/plakken in een apart document. Als de resultaten van het gebied van % onverwacht of verdacht zijn, is het mogelijk om te zien of een van de andere metingen ook verdacht waren of dat % gebied onjuist is geregistreerd. - Verplaats de cirkel, zonder de grootte te veranderen door het in het midden te grijpen, naar de volgende plaat op de foto. Herhaal stap 7.6 en 7.7 voor alle platen op de foto.
- Herhaal stap 7.1 – 7.8 op ten minste twee beelden. Zodra alle platen en afbeeldingen zijn geanalyseerd, gemiddeld het % gebied resultaten tussen de verschillende beelden voor elke plaat om eventuele inconsistenties tussen foto's te verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode bevat eenvoudige aanpassingen van het Pulaski- en Ostrand-Rosenberg 4T1-protocol3 en kan worden gevisualiseerd in figuur 1. Wanneer 3 afzonderlijke onderzoekers handmatig gemetastaseerde gemetastaseerde kolonies voor 12 longplaten (1:10 verdunning), de resultaten waren zeer inconsistent tussen de verschillende tellers (Figuur 2A). Alle onderzoekers werden gericht om "tellen de gemetastaseerde kolonies die verschijnen als blauwe stippen", maar de inconsistenties tonen het probleem met het handmatig tellen van zeer gemetastaseerde platen. De onderzoekers hadden verschillende niveaus van ervaring met de 4T1 model. Een door de raad gecertificeerde veterinaire patholoog analyseerde H&E gekleurde longdia's voor metastase als een andere methode om te vergelijken met Fiji-ImageJ longplaat analyse(figuur 2B).
Met behulp van de Fiji-ImageJ analyse, 3 afzonderlijke onderzoekers geanalyseerd 3 afzonderlijke beelden van de verzameling van 12 platen (1:2 verdunning). Beelden werden genomen in twee afzonderlijke lab ruimtes met iets andere verlichting. De opstelling van de platen of de hoek van waaruit de foto werd genomen waren verschillend tussen elk beeld. In tegenstelling tot de handmatige telresultaten, de Fiji-ImageJ resultaten waren consistent tussen tellers voor elk van de 3 beelden (Figuur 3A). Om te bepalen of er inconsistenties waren tussen de 3 beelden, werden de resultaten van de 3 afbeeldingen en de 3 tellers per longplaat gecombineerd (figuur 3B). Er zijn verschillen tussen afbeeldingen voor sommige platen, maar de algemene trends zijn vergelijkbaar en het biedt meer consistentie dan handmatig tellen. Om rekening te houden met de variaties tussen de 3 verschillende afbeeldingen, werden de resultaten van elke afbeelding gemiddeld voor elke plaat(figuur 3C). Deze gemiddelden leverden consistente resultaten op tussen tellers die uitgezaaide en nauwkeurig uitgezaaide lasten nauwkeurig en nauwkeurig analyseren. Daarom stelt dit protocol voor om ten minste 3 afbeeldingen van de plaatverzameling in verschillende opstellingen, vanuit verschillende hoeken of in iets andere lichtinstellingen, te nemen en vervolgens de resultaten te analyseren en te gemiddelderen. Het contrast tussen handmatig tellen en Fiji-ImageJ-analyse wordt gevisualiseerd bij het vergelijken van figuur 2A met figuur 3C.
Een andere manier om de verbeteringen van dit protocol aan te tonen is het vergelijken van de rangschikking van de platen van de meeste tot minst gemetastaseerde last tussen tellers, op basis van de tellingen van figuur 2 en figuur 3. Handmatig tellen overeengekomen op de meest confluent plaat, maar alle volgende rangen waren inconsistent tussen tellers (Figuur 4A). Contrasterend, de gelederen van Fiji-ImageJ analyse voor elk beeld waren veel consistenter tussen tellers (Figuur 4B). De consistentie wordt ook gezien wanneer de resultaten van elke afbeelding voor elke plaat gemiddeld werden gemaakt(figuur 4C). We erkennen dat dit protocol geen volledige consistentie biedt tussen tellers, maar het is een verbetering ten opzichte van handmatig tellen bij het vergelijken van figuur 4A met figuur 4C. Histopathologische analyse verschilde van zowel handmatige als Fiji-ImageJ tellen (Figuur 4D).
Om het belang aan te tonen van het vermijden van reflecties in de beelden, wordt een afbeelding met een reflectie van een hand en de daaropvolgende Fiji-ImageJ-analyse getoond (links) tegen dezelfde plaat zonder reflectie (rechts)(figuur 5A). Andere donkere vlekken van een vuile achtergrondoppervlak of bloedmonster residu op de platen kan een negatieve invloed Fiji-ImageJ analyse ook. De bloedplaat in figuur 5B heeft slechts 2 uitgezaaide kolonies (opgemerkt door witte pijlen), maar het donkere residu (opgemerkt door zwarte pijlen) zorgde ervoor dat Fiji-ImageJ het als 31,6% gemetastaseert beschouwde. Daarom is het belangrijk om een schoon, licht oppervlak te hebben en deze methode niet te gebruiken voor bloedmonsters, omdat bloedmonsters meestal resterende donkere vlekken op de plaat achterlaten die geen uitgezaaide kolonies zijn.
Figuur 1: Protocol Schematisch. Dit protocol richt zich uitsluitend op het analyseren van longmetastase in het 4T1-model. De algemene stroom van dit protocol omvat het kweken van 4T1 cellen in de cultuur, het injecteren van BALB / c vrouwelijke muizen met 4T1 cellen in de linker buik borst vet pad, monitoring muizen volgens IACUC en institutionele protocollen, het opofferen van muizen en het verzamelen van de longen, het verzamelen van cellen uit de longmonsters, plating en incubateren cellen in 6TG selectie media, vaststelling en kleuring cellen na 5 dagen, het nemen van foto's van de platen, en het analyseren van het gebruik van Fiji-ImageJ. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Handmatig tellen van uitgezaaide cellen en histopathologische analyse hebben inconsistente resultaten. A. 12 longplaten met een verdunning van 1:10 werden handmatig geteld door 3 afzonderlijke onderzoekers die geïnstrueerd werden om uitgezaaide kolonies op dezelfde manier te tellen, hoewel de ervaring met het model varieerde tussen onderzoekers. Het aantal gemedastaatkolonies dat werd geteld varieerde sterk tussen onderzoekers. B. Histopathologische analyse identificeerde en kwantificeerde individuele tumorcelaggregaten, geclassificeerd als metastasen, aanwezig in H&E gekleurde longdia's. Er worden hoge, gemiddelde en lage vergrotingsafbeeldingen van één representatieve dia weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Fiji-ImageJ-analyse is nauwkeurig en nauwkeurig bij het bepalen van uitgezaaide lasten. A. 12 longplaten met een 1:2 verdunning werden geanalyseerd door 3 afzonderlijke onderzoekers in 3 afzonderlijke beelden van de 12 longplaten. B. De resultaten van elk van de 3 beelden door elk van de 3 onderzoekers werden gecombineerd. C. Resultaten van elke longplaat van de 3 beelden werden gemiddeld. One-way ANOVA met tukey's meervoudige vergelijkingstest bepaalde geen significante verschillen tussen tellers voor elke longplaat. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde + SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Fiji-ImageJ analyse biedt een meer consistente rangschikking van gemetastaseerte in vergelijking met handmatig tellen en histopathologische analyse. A. Dezelfde longplaten uit figuur 2 werden gerangschikt van de meeste tot minst gemetastaseerde op basis van de handmatige tellingen van figuur 2. B. Dezelfde 12 longplaten uit figuur 3 werden gerangschikt van de meeste tot minst gemetastaseerd op basis van de Fiji-ImageJ analyse van figuur 3A. C. De gemiddelden van figuur 3C werden gerangschikt van de meeste tot minst gemetastaseerd. D. Longdia's werden gerangschikt van de meeste tot minst gemetastaseerd op basis van histopathologische evaluatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Reflecties en niet-gemetastaseerde donkere vlekken zullen de resultaten negatief beïnvloeden. A. Een beeld met een weerspiegeling van een hand die de foto neemt verstoort de Fiji-Beeld J analyse, zoals getoond in het vergelijken van de reflectie Fiji-ImageJ analyse (links) aan de juiste Fiji-ImageJ analyse (rechts) B. Bloedplaten laten vaak restjes vlekken (zwarte pijlen) op de platen die niet uitgezaaide kolonies (witte pijlen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals aangetoond, kan het handmatig tellen van de gemetastaseerde kolonies op elke longplaat een onnauwkeurige en onnauwkeurige methode zijn om longmetastase te kwantificeren, wat de noodzaak van een beter kwantificeringsmiddel aantoont (figuur 2). Histopathologische analyse verschilde enigszins van zowel handmatig tellen als Fiji-ImageJ-analyse(figuur 2B en 4D),waarschijnlijk omdat de H&E-dia's geen representatief monster van het hele orgaan zijn. Het protocol oogst een hele long, en is daarom meer representatief voor de totale longmetastase, en is consistenter dan handmatig tellen. Verschillende benaderingen van Fiji-ImageJ analyse werden geprobeerd en worden hieronder besproken, maar het hierboven beschreven protocol lijkt de superieure methode.
Long-, bloed- en hersenmonsters werden verzameld voor deze studie. Echter, het bloed en de hersenen monsters had zeer weinig uitgezaaide kolonies, indien van toepassing op alle. We hebben vastgesteld dat het handmatig tellen van de uitgezaaide kolonies optimaal is voor deze minder uitgezaaide weefsels, en daarom werden bloed- en hersengegevens niet opgenomen. Wanneer de uitgezaaide last gemakkelijk handmatig kan worden meegeteld (bijvoorbeeld tien of twintig gemetastasaire kolonies in tegenstelling tot duizenden), is de oorspronkelijke kwestie van menselijke fouten niet relevant, en daarom is dit protocol niet nodig. Ook bloedmonsters kunnen donkere vlekken achterlaten op de platen na fixatie, die interfereert met de Fiji-ImageJ analyse(figuur 5). Belangrijk is dat de hoeveelheid geïnjecteerde cellen de gemetastaseerde last kan beïnvloeden. Bijvoorbeeld, als minder cellen worden geïnjecteerd en de muizen langer kunnen overleven, heeft de kanker meer tijd om zich te verspreiden naar de traditioneel minder uitgezaaide sites zoals de hersenen3,4. Daarom kan dit protocol worden gewijzigd om de uitgezaaide last van andere weefsels op te nemen als ze de tijd krijgen om zeer uitgezaaid te worden. Als u het 4T1-model voor de eerste keer probeert of de hoeveelheid geïnjecteerde cellen wijzigt, raden we u aan om ten minste twee verdunningen te proberen bij het plating van cellen. Voor deze studie gebruikten we een verdunning van 1:2 en 1:10. De 1:2 verdunning zou moeilijk zijn geweest om handmatig te tellen, maar werd gemakkelijk geteld in Fiji-ImageJ. De 1:10 verdunning was nog steeds moeilijk handmatig te tellen en leidde daarom tot inconsistente resultaten. Verdunningen kunnen worden gewijzigd op basis van de specifieke studieparameters.
Er zijn foto's gemaakt van individuele longplaten en de 12 longplaten samen. Individuele platen werden op twee manieren geanalyseerd: ofwel bijsnijden van de afbeelding naar een centraal vierkant van de plaat voorafgaand aan het uploaden naar Fiji-ImageJ, of met behulp van de cirkel selectie tool in Fiji-ImageJ om de centrale cirkel van de plaat in de niet-bijgecropte afbeelding te selecteren. We vonden dat het gebruik van de cirkel selectie tool in Fiji-ImageJ bood de makkelijkste, meest consistente manier om een gebied van dezelfde grootte voor analyse voor alle platen te creëren. Bovendien was het analyseren van de hele collectie longplaten in hetzelfde beeld superieur aan het analyseren van individuele beelden van enkele longplaten. Het hebben van alle longplaten in hetzelfde beeld zorgt ervoor dat de cirkel van dezelfde grootte gemakkelijk tussen de longplaten kan worden gebruikt. Het zorgt ervoor dat alle longplaten dezelfde afstand tot de camera hebben en daarom moet de cirkel van dezelfde grootte voor analyse de juiste grootte zijn voor alle longplaten in het beeld. Het maakt ook de analyse sneller als het opnieuw trekken van de cirkel is niet nodig tussen de platen. Het wordt eenvoudig gesleept aan de volgende plaat in het beeld zonder zijn grootte te veranderen, die de zelfde grootte garandeert voor alle platen in het beeld wordt gebruikt. Bij het selecteren van de grootte van de cirkel, is het belangrijk om het groot genoeg om de meerderheid van de plaat te analyseren, terwijl klein genoeg om het achtergrondgeluid van de randen van de plaat te voorkomen. Bovendien, in een poging om reagentia te redden, cellen werden ook verguld in 6 goed platen en in vergelijking met de 10 cm weefselkweek platen. De Fiji-ImageJ resultaten van de 6 goed borden waren minder consistent en niet correleren met de 10 cm gerechten (gegevens niet getoond). Een verklaring is dat het kleinere oppervlak een kleiner gebied biedt om te analyseren, wat leidt tot minder representatieve gegevens. Een andere is dat het verminderen van het oppervlak kan de cellen om sneller te groeien als ze dichter bij andere overlevende cellen. Daarom raden we het gebruik van andere reagentia van weefselkweek dan wat we in het protocol hebben beschreven niet aan.
Zoals eerder vermeld, het vermijden van reflecties en het hebben van een schone, lichte achtergrond zijn absoluut cruciaal voor deze methode. Figuur 5A laat zien hoe een reflectie wordt geanalyseerd in Fiji-ImageJ en toont daarom het cruciale belang van het vermijden van reflecties. Als weefsel cultuur platen zijn zeer reflecterende, is het gunstig om de foto te nemen in een lichte hoek om reflecties te voorkomen van ofwel jezelf het nemen van de foto of van de lichtbronnen hierboven. Er moet rekening worden gehouden met de lichtomstandigheden van het specifieke werkgebied. We raden u aan meerdere foto's te maken van de te analyseren platen, waarbij we iets andere arrangementen en/of hoeken proberen in een goed verlichte ruimte. Bestudeer de foto's intens voor eventuele reflecties. Als er inconsistenties in de analyse, is het waarschijnlijk te wijten aan een beeldkwaliteit probleem. Als u problemen wilt oplossen, vergelijkt u de normale afbeelding met de zwart-witafbeelding. Als gebieden die niet blauw zijn in het normale beeld als wit worden weergegeven in de zwart-witafbeelding, is er waarschijnlijk een reflectie of smet die de resultaten verandert.
Naast consistentie, een ander opmerkelijk voordeel van deze methode is dat het produceert gegevens veel sneller dan handmatig tellen. Handmatig tellen van meerdere platen is zeer tijdrovend, terwijl Fiji-ImageJ analyse kan snel worden gedaan. Het zorgt ook voor een kortere incubatietijd. Pulaski en Ostrand-Rosenberg raden een incubatietijd van 10-14 dagen aan voor de vergulde cellen, waardoor de studie een aanzienlijke hoeveelheid tijd toevoegde3. De incubatietijd van 10-14 dagen zorgt voor grotere, gemakkelijker te tellen kolonies. Echter, veel longplaten kunnen worden confluent vóór die tijd. In plaats daarvan geeft 5 dagen incubatie genoeg tijd voor de 6TG-selectie om niet-kankercellen te doden (bewezen door gezonde controlemuizen die geen kolonies op hun longplaten hebben, gegevens die niet zijn weergegeven), en voor de cellen om genoeg te groeien om gemakkelijk te worden gekwantificeerd met Fiji-ImageJ. Dit vermindert aanzienlijk de tijd tussen de muizen worden opgeofferd en het analyseren van essentiële uitgezaaide gegevens.
Tot slot wegen de voordelen van deze methode ruimschoots op tegen de beperkingen. We erkennen dat deze methode geen perfecte consistentie biedt. Hoewel dit niet de ideale methode is voor minder uitgezaaide weefsels, kunnen deze weefsels gemakkelijk handmatig worden geteld. Terwijl het krijgen van een beeld zonder reflecties kan vereisen wat zorgvuldige fotografie, de consistentie opgedaan met deze methode is aanzienlijk. Het is mogelijk dat deze methode kan worden gebruikt voor andere weefsels die zeer uitgezaaid en andere protocollen die het tellen van gekleurde objecten vereisen. Het ontwerp van de studie kan ook het analyseren van de snelheid van metastase of het effect van anti-kankerbehandelingen op metastase mogelijk maken. Deze methode zal zeer consistente, betrouwbare metastasegegevens opleveren en vormt een aanzienlijke verfijning van het 4T1-model. De toepassing van dit model op aanstaande borstkanker metastase onderzoek is van het grootste belang bij het bewapenen van onderzoekers met instrumenten om te vechten tegen borstkanker sterfte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), het Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) en National Institutes of Health R21EB028429 (IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
