Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren
Summary
We beschrijven een meer consistente en snelle methode om longmetastase te kwantificeren in het 4T1 borstkankermodel met behulp van Fiji-ImageJ.
Abstract
Borstkanker is een verwoestende maligniteit, goed voor 40.000 vrouwelijke sterfgevallen en 30% van de nieuwe vrouwelijke kankerdiagnoses in de Verenigde Staten alleen al in 2019. De belangrijkste oorzaak van borstkanker gerelateerde sterfgevallen is de uitgezaaide last. Daarom moeten preklinische modellen voor borstkanker gemetastaseerde belasting analyseren om klinisch relevant te zijn. Het 4T1 borstkankermodel biedt een spontaan metastaserend, kwantificeerbaar muismodel voor stadium IV borstkanker bij de mens. Echter, de meeste 4T1 protocollen kwantificeren de uitgezaaide last door handmatig te tellen gekleurde kolonies op weefselkweek platen. Hoewel dit voldoende is voor weefsels met een lagere uitgezaaide belasting, veroorzaakt menselijke fout in handmatig tellen inconsistente en variabele resultaten wanneer platen samenvloeiend en moeilijk te tellen zijn. Deze methode biedt een computergebaseerde oplossing voor menselijke telfouten. Hier evalueren we het protocol met behulp van de long, een zeer uitgezaaid weefsel in het 4T1-model. Afbeeldingen van methyleen blauw bevlekte platen worden verworven en geüpload voor analyse in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bepaalt vervolgens het percentage van het geselecteerde gebied van de afbeelding dat blauw is, wat het percentage van de plaat met uitgezaaide last vertegenwoordigt. Deze computergebaseerde aanpak biedt consistentere en snellere resultaten dan handmatig tellen of histopathologische evaluatie voor zeer uitgezaaide weefsels. De consistentie van fiji-ImageJ resultaten hangt af van de kwaliteit van het beeld. Kleine variaties in de resultaten tussen beelden kunnen optreden, dus het wordt aanbevolen dat meerdere beelden worden genomen en resultaten gemiddeld. Ondanks de minimale beperkingen is deze methode een verbetering van het kwantificeren van uitgezaaide belasting in de longen door consistente en snelle resultaten te bieden.
Introduction
Een op de acht vrouwen zal worden gediagnosticeerd met borstkanker in haar leven, en toch ondanks meerdere behandeling opties borstkanker is de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen bij Amerikaanse vrouwen1. Deze vrouwen sterven niet aan de primaire tumor in hun borst. In plaats daarvan is de uitgezaaide last verantwoordelijk voor de mortaliteit van deze ziekte omdat deze zich vaak verspreidt naar de longen, het bot, de hersenen, de lever en de lymfeklieren2. Daarom moeten borstkankermodellen metastase evalueren om bij te dragen aan het terugdringen van de sterfte van deze ziekte. De 4T1 murine borstkanker model is een prachtig protocol om dit te bereiken. De hier beschreven methode biedt een verbetering van het 4T1-model door Fiji-ImageJ te gebruiken om longmetastase te kwantificeren, wat consistente en snelle resultaten oplevert.
De 4T1 model is goed ingeburgerd, met de meeste laboratoria met behulp van protocollen zoals die beschreven door Pulaski en Ostrand-Rosenberg in 20013. De 4T1-cellijn is 6-Thioguanine (6TG) resistent en representatief voor stadium IV, drievoudig negatief borstkanker3,4,5. Het is klinisch relevant omdat het een orthotopisch model is en spontaan uitzaait naar dezelfde organen als bij borstkanker bij de mens3,4. De 4T1-cellen metastaseren spontaan in een voorspelbaar tempo op basis van de hoeveelheid geïnjecteerde cellen3,4. Belangrijk is dat genetische verschillen tussen muizen die hier worden gebruikt, de verwachte inter-individuele variabiliteit in gemetastasaire lasten veroorzaakten. Om metastase te evalueren, worden weefsels geoogst om kankercellen in verre gebieden te verzamelen en te kwantificeren met behulp van 6TG-selectie en methyleenblauwe vlekken. Het resultaat is een verzameling weefselkweekplaten met blauwe stippen die uitgezaaide kolonies vertegenwoordigen. Het Pulaski- en Ostrand-Rosenberg-protocol kwantificeert echter gemetastaseerde kolonies door ze handmatig te tellen, en daarom is dit het standaardmiddel geweest om metastase in dit model te evalueren. Hoewel dit gemakkelijk is voor weefsels met een lage uitgezaaide belasting, weefsels zoals de longen zijn vaak beladen met uitzaaiingen. Aangezien longplaten zeer vloeiend kunnen zijn, is het nauwkeurig en nauwkeurig kwantificeren van uitgezaaide gemetastaseerde kolonies door handmatig tellen moeilijk en gevoelig voor menselijke fouten. Om gemetastaseerde lasten beter te kwantificeren, beschrijven we het gebruik van Fiji-ImageJ voor een computergebaseerde oplossing voor menselijke telfouten. Histopathologische analyse met hematoxylin en eosine (H&E) kleuring is een ander middel om longmetastasen te kwantificeren, en interessant is ook verbeterd met Fiji-ImageJ software6,7. Echter, omdat histopathologische analyse een enkel stukje van de long observeert, kan het onjuist en niet representatief zijn. Dit komt omdat het 4T1-model verschillende uitgezaaide laesies door het hele orgaan veroorzaakt die niet gelijkmatig verdeeld zijn. Hoewel de algemene trends tussen histopathologische analyse en handmatig tellen vergelijkbaar kunnen zijn8, kunnen de individuele waarden verschillen en mag histopathologische analyse daarom niet worden gebruikt als enig kwantificeringsmiddel. We tonen het voordeel ten opzichte van histopathologische analyse en de inconsistenties in handmatig tellen tussen verschillende tellers, terwijl ook de consistentie van het gebruik van Fiji-ImageJ aantoont. Bovendien tonen we aan dat deze methode de incubatietijd kan verminderen van 10-14 dagen tot 5 dagen, wat betekent dat onderzoekers gegevens uit hun studie veel eerder kunnen analyseren dan wanneer ze vertrouwen op handmatig tellen.
Deze methode is een verzameling eenvoudige aanpassingen aan het Pulaski en Ostrand-Rosenberg protocol3. Omdat het 4T1-model veel wordt gebruikt en omdat longmetastase een kritieke parameter is om te meten in preklinische modellen, geloven we dat deze methode op grote schaal kan worden gebruikt en zeer waardevol is voor borstkankeronderzoekers. De enige extra benodigdheden die nodig zijn een camera en toegang tot een computer met Fiji-ImageJ, een gratis software die vaak wordt gebruikt in beeldanalyse9. Deze methode richt zich specifiek op longmetastase, maar het kan worden gebruikt voor andere weefsels met een aanzienlijke uitgezaaide last.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals aangetoond, kan het handmatig tellen van de gemetastaseerde kolonies op elke longplaat een onnauwkeurige en onnauwkeurige methode zijn om longmetastase te kwantificeren, wat de noodzaak van een beter kwantificeringsmiddel aantoont (figuur 2). Histopathologische analyse verschilde enigszins van zowel handmatig tellen als Fiji-ImageJ-analyse(figuur 2B en 4D),waarschijnlijk omdat de H&E-dia’s geen representatief monster van het hele orgaan zi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), het Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) en National Institutes of Health R21EB028429 (IA).
Materials
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 1 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
- Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333 (2019).
- Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).
