Summary
Nous décrivons une méthode plus cohérente et expéditieuse pour quantifier la métastase pulmonaire dans le modèle de cancer du sein 4T1 en utilisant Fiji-ImageJ.
Abstract
Le cancer du sein est une malignité dévastatrice, représentant 40 000 décès de femmes et 30 % des nouveaux diagnostics de cancer féminin aux États-Unis pour la seule année 2019. La principale cause de décès liés au cancer du sein est la charge métastatique. Par conséquent, les modèles précliniques pour le cancer du sein doivent analyser le fardeau métastatique pour être médicalement pertinents. Le modèle de cancer du sein 4T1 fournit un modèle de souris spontanément métastasante et quantifiable pour le cancer du sein humain de stade IV. Cependant, la plupart des protocoles 4T1 quantifient la charge métastatique en comptant manuellement les colonies tachées sur les plaques de culture tissulaire. Bien que cela soit suffisant pour les tissus ayant une charge métastatique inférieure, l’erreur humaine dans le comptage manuel provoque des résultats incohérents et variables lorsque les plaques sont confluentes et difficiles à compter. Cette méthode offre une solution informatique à l’erreur de comptage humain. Ici, nous évaluons le protocole à l’aide du poumon, un tissu hautement métastatique dans le modèle 4T1. Des images de plaques tachées de méthylène sont acquises et téléchargées pour analyse dans Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ détermine ensuite le pourcentage de la zone sélectionnée de l’image bleue, représentant le pourcentage de la plaque avec charge métastatique. Cette approche informatisée offre des résultats plus cohérents et rapides que le comptage manuel ou l’évaluation histopathologique pour les tissus hautement métastatiques. La cohérence des résultats fiji-imagej dépend de la qualité de l’image. De légères variations de résultats entre les images peuvent se produire, il est donc recommandé que plusieurs images soient prises et que les résultats soient en moyenne. Malgré ses limites minimales, cette méthode est une amélioration de la quantification du fardeau métastatique dans le poumon en offrant des résultats cohérents et rapides.
Introduction
Une femme sur huit recevra un diagnostic de cancer du sein au cours de sa vie, et pourtant, malgré de multiples options de traitement, le cancer du sein est la deuxième cause de décès liés au cancer chez les femmesaméricaines 1. Ces femmes ne meurent pas de la tumeur primaire dans leur sein. Au lieu de cela, la charge métastatique est responsable de la mortalité de cette maladie car elle se propage généralement au poumon, à l’os, au cerveau, au foie, et aux ganglions lymphatiques2. Pour cette raison, les modèles de cancer du sein doivent évaluer les métastases pour contribuer à réduire la mortalité de cette maladie. Le modèle 4T1 murine cancer du sein est un protocole superbe pour y parvenir. La méthode décrite ici offre une amélioration du modèle 4T1 en utilisant Fiji-ImageJ pour quantifier la métastase pulmonaire, produisant des résultats cohérents et rapides.
Le modèle 4T1 est bien établi, la plupart des laboratoires utilisant des protocoles tels que ceux décrits par Pulaski et Ostrand-Rosenberg en 20013. La lignée cellulaire 4T1 est résistante à la 6-Thioguanine (6TG) et représentative du stade IV, triple cancer du seinnégatif 3,4,5. Il est cliniquement pertinent car il est un modèle orthotopique et métastase spontanément aux mêmes organes que dans le cancer du seinhumain 3,4. Les cellules 4T1 métastasent spontanément à un rythme prévisible basé sur la quantité de cellules injectées3,4. Fait important, les différences génétiques entre les souris utilisées ici ont causé la variabilité inter-individuelle prévue dans la charge métastatique. Pour évaluer la métastase, les tissus sont récoltés pour recueillir et quantifier les cellules cancéreuses dans des sites éloignés à l’aide de la sélection 6TG et de la coloration bleue du méthylène. Le résultat est une collection de plaques de culture tissulaire avec des points bleus représentant des colonies métastatiques. Cependant, le protocole Pulaski et Ostrand-Rosenberg quantifie les colonies métastatiques en les comptant manuellement, et c’est donc le moyen standard d’évaluer les métastases dans ce modèle. Bien que cela soit facile pour les tissus à faible charge métastatique, les tissus comme les poumons sont souvent chargés de métastases. Comme les plaques pulmonaires peuvent être très confluentes, la quantification précise et précise des colonies métastatiques par comptage manuel est difficile et sujette à l’erreur humaine. Pour mieux quantifier le fardeau métastatique, nous décrivons l’utilisation de Fiji-ImageJ pour une solution informatique à l’erreur de comptage humain. L’analyse histopathologique avec la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) est un autre moyen de quantifier les métastases pulmonaires, et il est intéressant de l’améliorer avec le logiciel Fiji-ImageJ6,7. Cependant, parce que l’analyse histopathologique observe une seule tranche du poumon, elle peut être inexacte et non représentative. C’est parce que le modèle 4T1 provoque plusieurs lésions métastatiques dans tout l’organe qui ne sont pas réparties uniformément. Alors que les tendances globales entre l’analyse histopathologique et le comptage manuelpeuvent être similaires 8, les valeurs individuelles peuvent différer et donc l’analyse histopathologique ne doit pas être utilisée comme seul moyen de quantification. Nous démontrons l’avantage par rapport à l’analyse histopathologique et aux incohérences dans le comptage manuel entre les différents compteurs, tout en démontrant la cohérence de l’utilisation de Fiji-ImageJ. En outre, nous montrons que cette méthode peut réduire le temps d’incubation de 10-14 jours à 5 jours, ce qui signifie que les chercheurs peuvent analyser les données de leur étude beaucoup plus tôt que lorsqu’ils s’appuient sur le comptage manuel.
Cette méthode est une collection d’ajustements simples au protocole Pulaski et Ostrand-Rosenberg3. Parce que le modèle 4T1 est largement utilisé, et parce que la métastase pulmonaire est un paramètre critique à mesurer dans les modèles précliniques, nous croyons que cette méthode peut être largement utilisée et est très précieuse pour les chercheurs sur le cancer du sein. Les seules fournitures supplémentaires nécessaires sont une caméra et l’accès à un ordinateur avec Fiji-ImageJ, un logiciel libre fréquemment utilisé dans l’analyse d’images9. Cette méthode se concentre spécifiquement sur la métastase pulmonaire, mais elle pourrait être utilisée pour d’autres tissus avec une charge métastatique significative.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de Virginia Tech et conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. L’exécution de ce protocole exige la permission des institutions appropriées et le respect de toutes les lignes directrices appropriées.
1. Culture cellulaire
- Faire des médias culturels complets (RPMI + 10% Sérum bovin fœtal +1% Pen Strep). Raviver les cellules 4T1 selon le protocole ATCC10 et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 dans un flacon T-25 jusqu’au confluent. Changez de média le lendemain de la relance pour éliminer les cellules mortes, et encore une fois si les médias sont dépensés avant que les cellules ne soient suffisamment confluentes pour passer.
- Une fois que le flacon T-25 est confluent, les cellules de passage à un flacon T-75 en jetant les médias, laver la fiole avec 5 mL de 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS), et l’ajout de 500 μL de Trypsin-EDTA. Incuber de 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent.
- Une fois détaché, ajouter 5 mL de culture complète réchauffée aux cellules. Aspirer et transférer les 5 mL dans un flacon T-75 contenant 15 mL de culture complète réchauffée.
- Cellules de passage dans les flacons T-75 au moins quatre fois. Faites ceci une fois que le flacon est confluent en lavant avec 8 mL de 1x DPBS, en ajoutant 1 mL de Trypsin-EDTA pour détacher les cellules, en ajoutant 10 mL de médias réchauffés aux cellules, et en diluant 1:6-1:8 dans un nouveau flacon T-75 contenant 20 mL de médias culturels complets réchauffés.
- Cellules de passage jusqu’au nombre approprié de flacons T-150 contenant 40 mL de médias de culture complète réchauffés pour le nombre de souris à injecter. La plupart des études nécessiteront plusieurs flacons T-150 pour assurer suffisamment de cellules pour l’injection.
- Lorsque les souris sont prêtes à être injectées (8 semaines ou pesant plus de 20 g, selon l’IACUC ou les protocoles institutionnels), récoltez les cellules en jetant les supports, en lavant chaque flacon avec 10 mL de DPBS 1x et en ajoutant 2 mL de trypsine-EDTA. Incuber de 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent.
- Laver le flacon avec 10 mL de supports complets et transférer tout le contenu (10 mL de médias + 2 mL de mélange de cellules trypsine-EDTA) au flacon suivant. Continuez à laver et à recueillir les cellules de chaque flacon à l’aide des mêmes 10 mL de médias pour éviter d’utiliser une quantité excessive de médias.
- Une fois que tous les flacons ont été collectés, transférer le contenu dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Prélouillez un échantillon de 10 μL pour compter dans un tube de microcentrifugeuse et centrifugez le tube conique de 50 mL à 125 x g pendant 5 minutes.
- Pendant que les cellules sont centrifugées, ajouter 10 μL de bleu Trypan à 10 μL d’échantillon cellulaire. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Une fois que le nombre total de cellules est déterminé, calculer la concentration de cellules nécessaires pour injecter des souris pour 1,2 x 106 cellules par souris (par 100 μL).
- Après centrifugation, décanter les médias et resuspendre les granulés cellulaires en quantité correcte de 1x DPBS stérile pour 1,2 x 106 cellules par 100 μL. Diviser le mélange cellule/DPBS en tubes de microcentrifugeuse pour faciliter l’accès avec la seringue lors de l’aspiration des cellules pour injection. Gardez les cellules sur la glace et injectez peu de temps après car les cellules commenceront à mourir après avoir été sur la glace pendant de longues périodes de temps.
2. Injections
- Préparer les cellules à l’injection en tapant ou en mélangeant doucement le tube de microcentrifugeuse pour résusquer les cellules, puis aspirer 600 μL dans une seringue de 1 mL. Tournez la seringue vers le haut et tirez le piston vers le bas pour éloigner les cellules de l’ouverture de la seringue. Appuyez sur la seringue pour la débarrasser des bulles d’air.
- Attachez l’aiguille et distribuez les cellules dans le tube de microcentrifugeuse jusqu’à ce qu’il ne reste que 500 μL dans la seringue. Mettre la seringue à plat sur la glace.
REMARQUE : Les cellules 4T1 tombent rapidement de suspension. Par conséquent, il est important de mélanger les cellules de nouveau en suspension en tapant fréquemment. - Anesthésier la souris BALB/c femelle de 8 semaines/>20 g à l’aide d’isoflurane ou d’un autre agent anesthésique approuvé. Surveillez la respiration de la souris pour évaluer la profondeur de l’anesthésie.
- Une fois que la souris est correctement anesthésiée comme indiqué par manque de réflexe cornéen, placez la souris sur son dos. À l’aide du pouce, du pointeur et du majeur, maintenez doucement la souris. Utilisez le pointeur et les doigts du milieu pour maintenir le haut du corps et le pouce de la souris pour sa jambe gauche arrière. Soyez doux mais ferme.
- Avec le biseau de l’aiguille vers le haut, injectez 100 μL des cellules sous-cutanéement dans la garniture mammaire abdominale gauche de graisse de la souris. Surveillez un bon saignement et toute fuite, et assurez-vous que la souris se réveille et se déplace facilement après l’injection.
- Changer les aiguilles entre chaque souris.
REMARQUE : Ne laissez pas l’aiguille pénétrer dans la cavité péritonéale. Cela entraînerait une propagation rapide du cancer et ne serait pas représentatif du modèle. Pour assurer une injection sous-cutanée, tirez doucement vers le haut sur l’aiguille lorsqu’elle est insérée dans la graisse mammaire abdominale gauche. Si l’aiguille est facilement soulevée vers le haut, elle est correctement positionnée sous-cutanée.
- Changer les aiguilles entre chaque souris.
3. Surveillance
- Surveillez les souris au moins 3 fois par semaine pour le poids, le score de l’état corporel, la taille de la tumeur, l’état tumoral, la respiration, le niveau d’activité, l’apparence et le mouvement. Une fois que la tumeur atteint 0.7-0.8 cm de diamètre, commencez à surveiller quotidiennement.
- Considérez l’euthanasie quand la taille de tumeur atteint 1.5 cm, ou la perte de poids atteint 20%, ou le déclin clinique grave du score de condition corporelle, de l’état de tumeur, de la respiration, du niveau d’activité, de l’aspect, ou du mouvement sont observés basés sur des directives institutionnelles.
NOTE : Le score de condition corporelle est crucial pour surveiller car le poids corporel peut augmenter pendant que la tumeur augmente dans la taille, négationnant la perte de condition corporelle due à la charge de maladie. Les protocoles de surveillance exacts dépendront des protocoles IACUC ou institutionnels approuvés.
- Considérez l’euthanasie quand la taille de tumeur atteint 1.5 cm, ou la perte de poids atteint 20%, ou le déclin clinique grave du score de condition corporelle, de l’état de tumeur, de la respiration, du niveau d’activité, de l’aspect, ou du mouvement sont observés basés sur des directives institutionnelles.
4. Nécropsie
- Euthanasier la souris à l’aide de CO2 selon les directives institutionnelles.
- Vaporiser la souris de 70 % d’éthanol pour la désinfecter. Faire une incision jusqu’à la ligne médiane ventrale de la souris pour exposer la cavité du corps.
- Enlevez le rein. Continuez à couper la ligne médiane jusqu’à ce que le diaphragme soit visible. Utilisez des ciseaux pour percer le diaphragme pour dégonfler les poumons. Coupez le diaphragme pour obtenir un meilleur accès à la cavité.
- Utilisez des ciseaux contondants pour couper le centre de la cage thoracique. Pin cage thoracique en arrière pour exposer le poumon et le cœur.
- Perfuser le cœur avec 2 mL de 1x DPBS 1x stérile en insérant une aiguille dans l’apex du cœur jusqu’à ce qu’il se fonde dans la cavité abdominale où le rein a été enlevé.
- Pour enlever le cœur et les poumons, utilisez des ciseaux contondants pour couper l’œsophage et la trachée directement au-dessus du cœur. À l’aide de forceps, commencer à tirer le cœur loin du corps et couper à n’importe quel tissu conjonctif le garder attaché. Les poumons sortiront avec le coeur.
- Identifier les poumons multi lobés (droite) et mono lobés (gauche). Gardez le cœur attaché pour la référence, mais une fois que les poumons sont identifiés, couper le cœur loin.
- Étiquetez une plaque de 12 puits contenant 1x Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) dans chaque puits. Chaque souris a besoin de 2 puits. Placez le poumon multi lobé (droit) dans la plaque de 12 puits pour l’évaluation des métastases et continuez sur la glace. Gardez le puits voisin vide pour l’instant.
REMARQUE : Il est important d’utiliser le même poumon (multi lobé) de chaque souris pour s’assurer que chaque échantillon est de taille proche. Le poumon mono lobé peut alors être utilisé pour d’autres analyses, comme l’histopathologie.
REMARQUE : Les échantillons sont stables sur la glace ou à 4 °C pendant quelques heures.
5. Traitement des tissus
REMARQUE : Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile.
- Étiquetez 1 tube conique de 15 mL par souris et ajoutez 2,5 mL de mélange de collagène de type IV et 30 unités d’élaslasase à chaque tube. Pour faire le mélange de collagène de type IV, dissoudre 2 mg de collagène de type IV par mL 1x HBSS et filtre stérile. Celui-ci peut être stocké jusqu’à 12 mois à -20 °C et décongelé en cas de besoin.
- Transférez le poumon au deuxième, nettoyez bien 1x HBSS pour cet échantillon. Tourbillonnez à l’aide de forceps pour enlever le reste du sang. Transférer le poumon propre dans une plaque de culture tissulaire vide de 3,5 cm. Hacher le poumon avec des ciseaux. Rincer la plaque avec 2,5 mL de 1x HBSS, transférer 1x HBSS et morceaux de poumon dans un tube conique de 15 mL contenant déjà du cocktail collagène/élasstase (5 mL au total).
- Incuber pendant 75 minutes à 4 °C. Continuez à mélanger les échantillons pendant ce temps, alors placez les tubes sur un rocker ou une roue rotative. Au cours de cette étape d’incubation, étiquetez les tubes de centrifugeuse de 50 mL et les plaques de culture tissulaire de 10 cm pour chaque souris. Si vous faites une dilution, étiquetez suffisamment de plaques de culture tissulaire de 10 cm pour les dilutions.
REMARQUE : Étiquetez le couvercle des plaques de culture tissulaire. Si l’étiquetage de la plaque elle-même, l’écriture interférera avec l’analyse Fiji-ImageJ. - Porter le volume de chaque tube jusqu’à 10 mL au total avec 1x HBSS. Verser le contenu sur une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube conique de 50 mL pour chaque échantillon. Utilisez le piston d’une seringue de 1 mL pour moudre doucement l’échantillon à travers la passoire pour permettre à plus de cellules de filtrer à travers.
- Centrifugeuse pendant 5 minutes à 350 x g à température ambiante (RT). Jetez le supernatant et lavez la pastille avec 10 mL de 1x HBSS. Répétez cette étape deux fois.
- Resuspendez les granulés dans 10 mL de 60 μM 6TG multimédia de culture complet, soit RPMI ou IMDM. Échantillons de plaques dans des plaques de culture cellulaire de 10 cm, à l’aide d’un système de dilution si désiré. Incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 5 jours.
REMARQUE : 1:2, 1:10 et 1:100 sont des dilutions courantes qui devront être déterminées empiriquement en fonction des paramètres de l’étude.
ATTENTION: 6TG est toxique. Faire preuve de prudence lors de la manipulation et suivre toutes les directives en matière de santé et de sécurité environnementales pour l’élimination.
6. Plaques de coloration
- Verser les supports de culture des plaques dans un conteneur à déchets approprié. Fixer les cellules en ajoutant 5 mL de méthanol non dilué par plaque et incuber pendant 5 minutes à RT, en s’assurant de tourbillonner le méthanol afin qu’il couvre toute la plaque.
ATTENTION : Le méthanol est dangereux s’il est ingéré, inhalé ou sur la peau. Utilisez une hotte de fumée pour cette étape. - Verser le méthanol des plaques dans un contenant de déchets approprié. Rincer les assiettes avec 5 mL d’eau distillée par assiette et verser l’eau dans un récipient à déchets approprié. Ajouter 5 mL de 0,03% de bleu méthylène par plaque et incuber pendant 5 minutes à RT, en s’assurant de tourbillonner la solution bleu méthylène afin qu’il couvre toute la plaque.
- Verser le bleu méthylène dans un contenant de déchets approprié. Rincer à nouveau les assiettes avec 5 mL d’eau distillée par assiette. Retourner les assiettes à l’envers et éponger contre une serviette en papier pour enlever l’excès de liquide. Déposer la plaque sur son couvercle et laisser sécher l’air toute la nuit à RT.
REMARQUE : Les colonies métastatiques seront bleues. Une fois les assiettes séchées, elles peuvent être conservées à RT indéfiniment.
7. Analyse d’image
- Retirer les couvercles étiquetés des assiettes, en prenant soin d’assurer une identification claire des échantillons. Alignez toutes les plaques pulmonaires tachées sur une surface claire et propre pour prendre une photo de toutes les plaques en une seule image.
- Prenez une photo de la collection de plaques dans une zone bien éclairée, en vous assurant de minimiser les réflexions car les plaques sont très réfléchissantes. Les réflexions dans les plaques influenceront l’analyse d’image et doivent donc être évitées.
REMARQUE: Fiji-ImageJ a une limite supérieure de 2 gigapixels. La plupart des téléphones intelligents modernes auront suffisamment de caméras. N’utilisez pas un appareil photo de moins de 8 mégapixels. L’appareil photo utilisé dans cette expérience était un 12,2 mégapixels sur un Pixel 2 de Google. - Recadrer l’image pour inclure les plaques, mais exclure les couvercles ou toute autre chose à l’arrière-plan de l’image. Téléchargez l’image recadrée dans Fiji-ImageJ.
- Modifiez l’image en noir et blanc à l’aide des commandes suivantes : Image, Ajustement, Seuil de couleur, Méthode de seuil : Par défaut, Couleur seuil : B&W, Espace seuil : Laboratoire. Désélectionner la boîte de fond sombre. L’image doit maintenant être en noir et blanc. Le noir représente le fond clair, et le blanc représente les colonies métastatiques bleues.
- À l’aide de l’outil Cercle sur la barre d’outils Fidji-ImageJ, sélectionnez la zone à analyser. Dessinez un cercle à utiliser pour toutes les plaques pour vous assurer que chaque plaque est analysée pour la même taille. Choisissez une taille qui maximise la surface analysée sur les plaques tout en minimisant le bruit de fond qui apparaît sur le bord des plaques. La taille apparaît dans la barre d’outils au fur et à mesure qu’elle est dessinée, il est donc possible de faire un cercle parfait en surveillant la hauteur et la largeur au fur et à mesure que le cercle est dessiné.
- Analyser le cercle sélectionné pour déterminer quel pourcentage de la zone est blanc, ce qui représente la zone de la plaque qui a des colonies métastatiques bleues. Utilisez les commandes suivantes :
Analyser, analyser les particules, taille (pixel2):0-Infinity, Circularité: 0.00-1.00, Afficher: Rien, et coché la case Résumé. Frappe bien. - Enregistrez le résultat de la zone en %. C’est le pourcentage de la zone sélectionnée qui est blanc, et représente donc le fardeau métastatique.
REMARQUE : Il est recommandé d’enregistrer les résultats dans Fiji-ImageJ ou de copier/coller l’intégralité de la page de résultats dans un document distinct. Si les résultats de la zone % sont inattendus ou suspects, il est alors possible de voir si l’une des autres mesures était également suspecte ou si % Area a été enregistré de manière incorrecte. - Déplacez le cercle, sans altérer sa taille en le saisissant en son centre, vers la plaque suivante de l’image. Répétez les étapes 7.6 et 7.7 pour toutes les plaques de l’image.
- Répétez les étapes 7.1 – 7.8 sur au moins deux images supplémentaires. Une fois que toutes les plaques et images ont été analysées, la moyenne des résultats de zone en % entre les différentes images pour chaque plaque afin d’atténuer les incohérences entre les images.
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Representative Results
Cette méthode contient des ajustements simples du protocole4T1 3 de Pulaski et Ostrand-Rosenberg et peut être visualisée dans la figure 1. Lorsque 3 chercheurs distincts ont compté manuellement les colonies métastatiques pour 12 plaques pulmonaires (dilution de 1:10), les résultats étaient très incohérents entre les différents compteurs (figure 2A). Tous les chercheurs ont été dirigés pour « compter les colonies métastatiques qui apparaissent comme des points bleus », mais les incohérences démontrent le problème avec le comptage manuel des plaques hautement métastatiques. Les chercheurs avaient différents niveaux d’expérience avec le modèle 4T1. Un pathologiste vétérinaire certifié par le conseil a analysé les toboggans pulmonaires tachés de H&E pour la métastase comme une autre méthode à comparer à l’analyse des plaques pulmonaires Fiji-ImageJ (Figure 2B).
À l’aide de l’analyse Fidji-ImageJ, 3 chercheurs distincts ont analysé 3 images distinctes de la collection de 12 plaques (1:2 dilution). Les images ont été prises dans deux espaces de laboratoire distincts avec un éclairage légèrement différent. L’agencement des plaques ou l’angle d’où la photo a été prise étaient différents entre chaque image. Contrairement aux résultats du comptage manuel, les résultats fiji-imagej étaient cohérents entre les compteurs pour chacune des 3 images (Figure 3A). Pour déterminer s’il y avait des incohérences entre les 3 images, les résultats des 3 images et des 3 compteurs ont été combinés par plaque pulmonaire (figure 3B). Il existe des différences entre les images pour certaines plaques, mais les tendances globales sont similaires et il offre plus de cohérence que le comptage manuel. Pour tenir compte des variations entre les 3 images différentes, les résultats de chaque image ont été en moyenne pour chaque plaque (figure 3C). Ces moyennes ont fourni des résultats cohérents entre les compteurs qui analysent avec précision et précision le fardeau métastatique. Par conséquent, ce protocole suggère de prendre au moins 3 images de la collection de plaques dans différents arrangements, sous différents angles, ou dans des paramètres de lumière légèrement différents, puis d’analyser et de faire la moyenne des résultats. Le contraste entre le comptage manuel et l’analyse Fiji-ImageJ est visualisé lorsque l’on compare la figure 2A à la figure 3C.
Une autre façon de démontrer les améliorations offertes par ce protocole est de comparer le classement des plaques de la charge la plus ou la moins métastatique entre les compteurs, en fonction des dénombrements de la figure 2 et de la figure 3. Le comptage manuel s’est mis d’accord sur la plaque la plus confluente, mais tous les rangs suivants étaient incohérents entre les compteurs (figure 4A). En revanche, les rangs de l’analyse Fiji-ImageJ pour chaque image étaient beaucoup plus cohérents entre les compteurs (Figure 4B). La cohérence est également observée lorsque les résultats de chaque image pour chaque plaque ont été en moyenne (Figure 4C). Nous reconnaissons que ce protocole n’offre pas une cohérence complète entre les compteurs, mais il s’agit d’une amélioration par rapport au comptage manuel lorsqu’on compare la figure 4A à la figure 4C. L’analyse histopathologique diffère du comptage manuel et fidjien-ImageJ (Figure 4D).
Pour démontrer l’importance d’éviter les reflets dans les images, une image avec un reflet d’une main et son analyse fidjienne-imageJ ultérieure est montrée (à gauche) opposée à la même plaque sans réflexion (droite) (Figure 5A). D’autres imperfections foncées provenant d’une surface de fond sale ou de résidus d’échantillons de sang sur les plaques peuvent également avoir un impact négatif sur l’analyse Fiji-ImageJ. La plaque sanguine de la figure 5B ne compte que 2 colonies métastatiques (notées par des flèches blanches), mais les résidus sombres (notés par les flèches noires) ont amené Fiji-ImageJ à la considérer comme métastatique à 31,6 %. Par conséquent, il est important d’avoir une surface propre et légère et de ne pas utiliser cette méthode pour les échantillons de sang, car les échantillons de sang laissent généralement des taches sombres résiduelles sur la plaque qui ne sont pas des colonies métastatiques.
Figure 1 : Schéma de protocole. Ce protocole se concentre uniquement sur l’analyse des métastases pulmonaires dans le modèle 4T1. Le flux général de ce protocole comprend la croissance des cellules 4T1 en culture, l’injection de souris femelles BALB/c avec des cellules 4T1 dans la graisse mammaire abdominale gauche, la surveillance des souris selon l’IACUC et les protocoles institutionnels, le sacrifice des souris et la collecte du poumon, la collecte des cellules à partir des échantillons pulmonaires, le placage et l’incubation des cellules dans les médias de sélection 6TG, la fixation et la coloration des cellules après 5 jours, la prise de photos des plaques, et l’analyse à l’aide de Fidji-ImageJ. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Le comptage manuel des cellules métastatiques et l’analyse histopathologique ont des résultats incohérents. R. 12 plaques pulmonaires avec une dilution de 1:10 ont été comptées manuellement par 3 chercheurs distincts chargés de compter les colonies métastatiques de la même façon, bien que l’expérience avec le modèle variait d’un chercheur à l’autre. Le nombre de colonies métastatiques comptées variait considérablement d’un chercheur à l’autre. B. L’analyse histopathologique a identifié et quantifié les agrégats individuels de cellules tumorales, classés comme métastases, présents dans les toboggans pulmonaires tachés de H&E. Des images de grossissement élevé, moyen et faible d’une diapositive représentative sont affichées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : L’analyse Fidji-ImageJ est exacte et précise pour déterminer la charge métastatique. A. 12 plaques pulmonaires avec une dilution de 1:2 ont été analysées par 3 chercheurs distincts dans 3 images distinctes des 12 plaques pulmonaires. B. Les résultats de chacune des 3 images de chacun des 3 chercheurs ont été combinés. C. C. Les résultats de chaque plaque pulmonaire des 3 images ont été en moyenne. ANOVA uni sensée avec le test de comparaison multiple de Tukey n’a déterminé aucune différence significative entre les compteurs pour chaque plaque pulmonaire. Les données sont affichées comme moyenne + SD. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : L’analyse Fidji-ImageJ fournit un classement plus cohérent de la charge métastatique par rapport au comptage manuel et à l’analyse histopathologique. R. Les mêmes plaques pulmonaires de la figure 2 ont été classées de la plupart aux moins métastatiques en fonction des dénombrements manuels de la figure 2. B. Les mêmes 12 plaques pulmonaires de la figure 3 ont été classées de la plus à la moins métastatique d’après l’analyse Fidji-ImageJ de la figure 3A. C. Les moyennes de la figure 3C ont été classées de la plus à la moins métastatique. D. D. Les diapositives pulmonaires ont été classées de la plupart aux moins métastatiques basées sur l’évaluation histopathologique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Les réflexions et les taches sombres non métastatiques auront un impact négatif sur les résultats. R. Une image avec le reflet d’une main prenant la photo perturbe l’analyse Fiji-Image J, comme le montre la comparaison de la réflexion Fidji-ImageJ analyse (à gauche) à l’analyse correcte Fiji-ImageJ (droite) B. Les plaques de sang laissent souvent des taches restes (flèches noires) sur les plaques qui ne sont pas des colonies métastatiques (flèches blanches). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Comme démontré, compter manuellement les colonies métastatiques sur chaque plaque pulmonaire peut être une méthode inexacte et imprécise pour quantifier les métastases pulmonaires, démontrant la nécessité d’un meilleur moyen de quantification (figure 2). L’analyse histopathologique différait légèrement du comptage manuel et de l’analyse Fiji-ImageJ(figure 2B et 4D),probablement parce que les diapositives H&E ne sont pas un échantillon représentatif de l’ensemble de l’organe. Le protocole récolte un poumon entier, et est donc plus représentatif de la métastase pulmonaire totale, et est plus cohérent que le comptage manuel. Plusieurs approches différentes de l’analyse Fidji-ImageJ ont été tentées et sont discutées ci-dessous, mais le protocole décrit ci-dessus semble être la méthode supérieure.
Des échantillons de poumon, de sang, et de cerveau ont été rassemblés pour cette étude. Cependant, les échantillons de sang et de cerveau ont eu très peu de colonies métastatiques, le cas échéant du tout. Nous avons déterminé que le comptage manuel des colonies métastatiques est optimal pour ces tissus moins métastatiques, et donc les données sanguines et cérébrales n’ont pas été incluses. Lorsque le fardeau métastatique est facile à compter manuellement (p. ex., dix ou vingt colonies métastatiques au lieu de milliers), la question originale de l’erreur humaine n’est pas pertinente et, par conséquent, ce protocole n’est pas nécessaire. En outre, les échantillons de sang peuvent laisser des taches sombres sur les plaques après la fixation, ce qui interfère avec l’analyse Fiji-ImageJ (Figure 5). Fait important, la quantité de cellules injectées peut influencer la charge métastatique. Par exemple, si moins de cellules sont injectées et que les souris peuvent survivre plus longtemps, le cancer a plus de temps pour se propager aux sites traditionnellement moins métastatiques comme lecerveau 3,4. Par conséquent, ce protocole pourrait être modifié pour inclure la charge métastatique d’autres tissus s’ils ont le temps de devenir hautement métastatiques. Si vous essayez le modèle 4T1 pour la première fois ou modifiez la quantité de cellules injectées, nous vous recommandons d’essayer au moins deux dilutions lors du placage des cellules. Pour cette étude, nous avons utilisé une dilution de 1:2 et 1:10. La dilution 1:2 aurait été difficile à compter manuellement, mais a été comptée facilement dans Fiji-ImageJ. La dilution de 1:10 était encore difficile à compter manuellement et a donc conduit à des résultats incohérents. Les dilutions peuvent être modifiées en fonction des paramètres spécifiques de l’étude.
Des photos ont été prises des plaques pulmonaires individuelles et des 12 plaques pulmonaires ensemble. Les plaques individuelles ont été analysées de deux façons : soit recadrage de l’image sur un carré central de la plaque avant le téléchargement sur Fiji-ImageJ, soit utilisation de l’outil de sélection du cercle dans Fiji-ImageJ pour sélectionner le cercle central de la plaque dans l’image non croppée. Nous avons constaté que l’utilisation de l’outil de sélection de cercle dans Fiji-ImageJ offrait le moyen le plus facile et le plus cohérent de créer une zone de même taille pour l’analyse de toutes les plaques. En outre, l’analyse de toute la collection de plaques pulmonaires dans la même image était supérieure à l’analyse d’images individuelles de plaques pulmonaires simples. Avoir toutes les plaques pulmonaires dans la même image permet d’utiliser facilement le cercle de même taille entre les plaques pulmonaires. Il s’assure que toutes les plaques pulmonaires sont à la même distance de la caméra et donc le cercle de même taille pour l’analyse devrait être la bonne taille pour toutes les plaques pulmonaires dans l’image. Il rend également l’analyse plus rapide car redessiner le cercle n’est pas nécessaire entre les plaques. Il est simplement traîné à la plaque suivante dans l’image sans changer sa taille, ce qui garantit la même taille est utilisée pour toutes les plaques de l’image. Lors de la sélection de la taille du cercle, il est important de le rendre assez grand pour analyser la majorité de la plaque tout en étant assez petit pour éviter le bruit de fond des bords de la plaque. En outre, dans une tentative de sauver les réhésifs, les cellules ont également été plaquées dans 6 plaques de puits et comparées aux plaques de culture tissulaire de 10 cm. Les résultats fidjiens-imageJ des 6 plaques de puits étaient moins cohérents et n’étaient pas corrélés aux plats de 10 cm (données non montrées). Une explication est la plus petite surface fournit une plus petite zone à analyser, conduisant à des données moins représentatives. Une autre est que la réduction de la surface permet aux cellules de croître plus rapidement car elles sont plus proches des autres cellules survivantes. Par conséquent, nous ne recommandons pas d’utiliser d’éragents de culture tissulaire autres que ce que nous avons décrit dans le protocole.
Comme mentionné précédemment, éviter les réflexions et avoir un fond propre et léger sont absolument essentiels à cette méthode. La figure 5A montre comment une réflexion est analysée dans Fiji-ImageJ et montre donc l’importance cruciale d’éviter les réflexions. Comme les plaques de culture tissulaire sont très réfléchissantes, il est avantageux de prendre la photo à un léger angle pour éviter les réflexions de vous-même prenant la photo ou des sources de lumière ci-dessus. Les conditions d’éclairage de l’aire de travail spécifique devront être prises en compte. Nous vous suggérons de prendre plusieurs photos des plaques à analyser, en essayant des arrangements et/ou des angles légèrement différents, dans une zone bien éclairée. Étudiez intensément les images pour toute réflexion. S’il y a des incohérences dans l’analyse, c’est probablement en raison d’un problème de qualité d’image. Pour dépanner, comparez l’image normale à l’image en noir et blanc. Si les zones qui ne sont pas bleues dans l’image normale apparaissent comme blanches dans l’image en noir et blanc, il y a probablement une réflexion ou un défaut qui modifie les résultats.
En plus de la cohérence, un autre avantage notable de cette méthode est qu’elle produit des données beaucoup plus rapidement que le comptage manuel. Le comptage manuel de plusieurs plaques prend beaucoup de temps, tandis que l’analyse Fiji-ImageJ peut être effectuée rapidement. Il permet également un temps d’incubation plus court. Pulaski et Ostrand-Rosenberg recommandent une période d’incubation de 10 à 14 jours pour les cellules plaquées, ce qui ajoute beaucoup de temps àl’étude 3. La période d’incubation de 10 à 14 jours permet la forme de colonies plus grandes et plus faciles à compter. Cependant, de nombreuses plaques pulmonaires peuvent devenir confluentes avant cette époque. Au lieu de cela, 5 jours d’incubation donne suffisamment de temps pour la sélection 6TG pour tuer les cellules non cancéreuses (prouvé par des souris témoins saines n’ayant pas de colonies sur leurs plaques pulmonaires, données non montrées), et pour les cellules de croître suffisamment pour être facilement quantifié avec Fiji-ImageJ. Cela diminue considérablement le temps entre les souris sacrifiées et l’analyse des données métastatiques essentielles.
En conclusion, les avantages de cette méthode l’emportent de loin sur les limites. Nous reconnaissons que cette méthode n’offre pas une parfaite cohérence. Bien que ce ne soit pas la méthode idéale pour les tissus moins métastatiques, ces tissus peuvent facilement être comptés manuellement. Tout en obtenant une image sans réflexions peut exiger une certaine photographie soigneuse, la cohérence acquise avec cette méthode est significative. Il est possible que cette méthode pourrait être utilisée pour d’autres tissus qui sont hautement métastatiques et d’autres protocoles qui nécessitent le comptage des objets tachés. La conception de l’étude pourrait également permettre d’analyser le taux de métastase ou d’effet des traitements anticancéraux sur la métastase. Cette méthode fournira des données de métastase hautement cohérentes et fiables et représente un raffinement significatif du modèle 4T1. L’application de ce modèle à la recherche à venir sur la métastase du cancer du sein est de la plus haute importance pour armer les chercheurs d’outils pour lutter contre la mortalité par cancer du sein.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), le Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) et les National Institutes of Health R21EB028429 (IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
| Calculator | Any | Any | |
| Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
| Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
| CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
| Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
| Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
| Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
| Distilled water | Any | Any | |
| Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
| Electronic scale | Any | Any | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
| Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
| Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
| Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
| RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
| Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
| Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
| T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
| T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
| Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
| Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
| Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 3.5 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 12 well plate | Corning | 3512 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
| 1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
| 27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
| 70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |
References
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- Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
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- Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
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