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Developmental Biology

भेड़ में वयस्क और प्रीपुबर्टल अंडाशय से एकत्र इन विट्रो परिपक्व ओसाइट्स का विट्रीफिकेशन

Published: July 10, 2021 doi: 10.3791/62272
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary Medicine, University of Sassari

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य वयस्क और किशोर भेड़ ओसाइट्स के विट्रीफिकेशन के लिए एक मानक विधि प्रदान करना है । इसमें इन विट्रो परिपक्वता मीडिया की तैयारी से लेकर पोस्ट वार्मिंग कल्चर तक के सभी कदम शामिल हैं । न्यूनतम आवश्यक मात्रा सुनिश्चित करने के लिए क्रायोटॉप का उपयोग करके एमआईआई चरण में ओसाइट्स को विट्रीप किया जाता है।

Abstract

पशुधन में, इन विट्रो भ्रूण उत्पादन प्रणालियों को विकसित किया जा सकता है और बड़ी संख्या में अंडाशय और ओसाइट्स के लिए निरंतर धन्यवाद किया जा सकता है जिन्हें कसाईघर से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। वयस्क अंडाशय हमेशा कई अंत्येक्षक सहन करते हैं, जबकि पूर्व-प्यूबर्टल दानदाताओं में ओसाइट्स की अधिकतम संख्या 4 सप्ताह की उम्र में उपलब्ध होती है, जब अंडाशय एंट्राल रोम की पीक संख्या सहन करते हैं। इस प्रकार, 4 सप्ताह पुराने भेड़ के बच्चे को अच्छा दानदाता माना जाता है, भले ही प्रीपुबर्टल ओसाइट्स की विकासात्मक क्षमता उनके वयस्क समकक्ष की तुलना में कम हो।

बुनियादी अनुसंधान और वाणिज्यिक अनुप्रयोगों को वयस्क और प्रीपुबर्टल दोनों दानदाताओं से प्राप्त विट्रीफाइड ओसाइट्स को सफलतापूर्वक क्रायोप्रेरिजर्विंग की संभावना से बढ़ावा मिलेगा। प्रीपुबर्टल दानदाताओं से एकत्र ओसाइट के विट्रीफिकेशन से भी पीढ़ी के अंतराल को छोटा करने की अनुमति मिलेगी और इस प्रकार प्रजनन कार्यक्रमों में आनुवंशिक लाभ बढ़ जाएगा । हालांकि, क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद विकास की क्षमता का नुकसान स्तनधारी ओसाइट्स को शायद क्रायोप्रिजर्व के लिए सबसे कठिन सेल प्रकारों में से एक बनाता है। उपलब्ध क्रायोप्रिजर्वेशन तकनीकों में, विट्रीफिकेशन को पशु और मानव ओसाइट्स पर व्यापक रूप से लागू किया जाता है। तकनीक में हाल की प्रगति के बावजूद, क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंटों की उच्च सांद्रता के साथ-साथ हल्का चोट और ओस्मोटिक तनाव अभी भी कई संरचनात्मक और आणविक परिवर्तन को प्रेरित करता है और स्तनधारी ओसाइट्स की विकासात्मक क्षमता को कम करता है। यहां, हम किशोर और वयस्क दानदाताओं से एकत्र भेड़ oocytes के विट्रीफिकेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले विट्रो में परिपक्व हो जाते हैं। प्रोटोकॉल में ओसाइट इन विट्रो परिपक्वता से लेकर विट्रीफिकेशन, वार्मिंग और पोस्ट-वार्मिंग इनक्यूबेशन अवधि तक सभी प्रक्रियाएं शामिल हैं । Oocytes vitrified MII चरण में वास्तव में वार्मिंग के बाद निषेचित किया जा सकता है, लेकिन वे अतिरिक्त समय की जरूरत है निषेचन से पहले क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रियाओं के कारण नुकसान को बहाल करने और उनके विकास की क्षमता में वृद्धि करने के लिए । इस प्रकार, वार्मिंग के बाद संस्कृति की स्थिति और समय oocyte विकास क्षमता की बहाली के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं, खासकर जब oocyte किशोर दाताओं से एकत्र कर रहे हैं ।

Introduction

मादा गेमेस का दीर्घकालिक भंडारण अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान कर सकता है, जैसे आनुवंशिक चयन कार्यक्रमों द्वारा घरेलू पशु प्रजनन में सुधार, पूर्व-सीटू वन्यजीव प्रजातियों के संरक्षण कार्यक्रम के माध्यम से जैव विविधता को संरक्षित करने में योगदान देना, और विट्रो जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान और अनुप्रयोगों में बढ़ाना विट्रो भ्रूण उत्पादन या परमाणु प्रत्यारोपण कार्यक्रमों में शामिल किए जाने के लिए धन्यवाद1,2,3। प्रजनन कार्यक्रमों में पीढ़ी के अंतराल को छोटा करके किशोर ओसाइट विट्रीफिकेशन से आनुवंशिक लाभ में भी वृद्धि होगी। अल्ट्रा-रैपिड कूलिंग और ओसाइट्स के वार्मिंग द्वारा विट्रीफिकेशन वर्तमान में पशुधन ओसाइट्स क्रायोप्रिजर्वेशन 5 के लिए एक मानक दृष्टिकोण मानाजाताहै। जुगाली करने वालों में, विट्रीफिकेशन से पहले, ऑसाइटो-व्युत्पन्न अंडाशय2से प्राप्त रोम से पुनः प्राप्ति के बाद, ओसाइट्स आमतौर पर विट्रो में परिपक्व होते हैं। वयस्क, और विशेष रूप से प्रीप्बर्टल अंडाशय4,6,वास्तव में क्रायोप्रीडेड होने के लिए लगभग असीमित संख्या में ओसाइट्स की आपूर्ति कर सकते हैं।

पशुओं में, ओसाइट विट्रीफिकेशन और वार्मिंग के बाद, पिछले दशक3के दौरान कई प्रयोगशालाओं द्वारा आमतौर पर >10% पर ब्लास्टोसिस्ट पैदावार की सूचना दी गई है। हालांकि, छोटे जुगाली में ओसाइट विट्रीफिकेशन अभी भी किशोर और वयस्क दोनों ऊसाइट्स के लिए अपेक्षाकृत नया माना जाता है, और भेड़ ओसाइट विट्रीफिकेशन के लिए एक मानक विधि2,5 स्थापितकी जानी बाकी है। हाल की प्रगति के बावजूद, विट्रीफाइड और गर्म ओसाइट वास्तव में कई कार्यात्मक और संरचनात्मक परिवर्तन प्रस्तुत करता है जो उनकी विकासात्मक क्षमता7,8,9को सीमित करता है। इस प्रकार, कुछ लेखों में विट्रिफाइड/गर्म भेड़ ओसाइट्स2में 10% या उससे अधिक पर ब्लास्टोसिस्ट विकास की सूचना दी गई है । उपर्युक्त परिवर्तनों को कम करने के लिए कई दृष्टिकोणों की जांच की गई है: विट्रीफिकेशन और विगलन समाधानों की संरचना का अनुकूलन10,11; विभिन्न क्रायो-उपकरणों के उपयोग के साथ प्रयोगकरना 8,12,13; और इन विट्रो परिपक्वता(आईवीएम)4, 14,15 और/

यहां हम किशोर और वयस्क दानदाताओं से एकत्र भेड़ oocytes के विट्रीफिकेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले विट्रो में परिपक्व हो जाते हैं। प्रोटोकॉल में ओसाइट इन विट्रो परिपक्वता से लेकर विट्रीफिकेशन, वार्मिंग और पोस्ट-वार्मिंग कल्चर पीरियड तक सभी प्रक्रियाएं शामिल हैं ।

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Protocol

पशु प्रोटोकॉल और नीचे वर्णित लागू प्रक्रियाओं Sassari विश्वविद्यालय में लागू नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार कर रहे हैं, यूरोपीय संघ के निर्देश 86/609/चुनाव आयोग और यूरोपीय समुदायों के आयोग की सिफारिश के अनुपालन में 2007/526/EC ।

1. oocyte हेरफेर के लिए मीडिया की तैयारी

  1. 0.1 ग्राम/एल पेनिसिलिन और 0.1 जी/एल स्ट्रेप्टोमाइसिन (पीबीएस) के साथ दुलबेक्को के फॉस्फेट बफर नमकीन को पूरक करके एकत्र अंडाशय के परिवहन के लिए माध्यम तैयार करें।
  2. 1 एल मिल्ली-क्यू पानी के साथ पाउडर में 9.5 ग्राम ऊतक संस्कृति माध्यम (टीसीएम) 199 को कमजोर करके ओसाइट संग्रह और परिपक्वता के लिए माध्यम तैयार करें, जो पेनिसिलिन (0.1%) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.1%)।
    1. कमजोर पड़ने के बाद, माध्यम के 100 एमएल को फ़िल्टर करें और इसे स्टॉक परिपक्वता माध्यम (एसएमएम) के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जो एक सप्ताह तक उपयोग किया जाएगा।
    2. शेष 900 एमएल को 25 एमएम एचईपीई, 0.36 ग्राम/एल बाइकार्बोनेट और 0.1% (डब्ल्यू/वी) पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) (पीएच 7.3, ओस्मोलिटी 290 एमओएम/केजी) के साथ सप्लीमेंट करके कलेक्शन मीडियम (सीएम) तैयार करें।
  3. 0.021 ग्राम/एल बाइकार्बोनेट, 10% गर्मी से इलाज करने वाले एस्टरस भेड़ सीरम, 1 आईयू/एमएल एफएसएच, 1 आईयू/एमएल एलएच, 100 माइक्रोल सिस्टेमाइन और 8 मिलीग्राम/एमएनएल के साथ पूरक के साथ परिपक्वता माध्यम तैयार करें ।
    नोट: 10 एमएल की मात्रा में परिपक्वता माध्यम को उपयोग से पहले कम से कम 4 घंटे के लिए मानक स्थितियों (हवा में 5% सीओ2 में 39 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम आर्द्रीकृत वातावरण में) पर इनक्यूबेटेड किया जाना चाहिए।
  4. इन विट्रो परिपक्वता के बाद ओसाइट के हेरफेर के लिए आधार माध्यम (बीएम) तैयार करें, जिसमें सीए++ और एमजी++के बिना पीबीएस शामिल है, जो 20% भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस) के साथ पूरक है।

2. Oocyte संग्रह और परिपक्वता

  1. किशोर (उम्र के 30-40 दिन, शरीर के वजन 6-10 किलो) और वयस्क अंडाशय से oocytes ठीक करें।
  2. 27 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 1-2 घंटे के भीतर वाणिज्यिक कसाईघर से प्रयोगशाला के लिए एकत्र अंडाशय परिवहन।
  3. पीबीएस ताजा माध्यम में धोने के बाद, कूप सामग्री को छोड़ने के लिए माइक्रो-ब्लेड का उपयोग करके सीएम में अंडाशय को काट लें।
  4. 60x आवर्धन के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप परीक्षा के तहत, ग्रेनुलोसा कोशिकाओं की 4-10 परतों के साथ उन लोगों को चुनकर इन विट्रो परिपक्वता के लिए क्यूमुलस-ओसाइट परिसरों (COCs) का चयन करें, एक समान साइटोप्लाज्म के साथ ओसाइट, साइटोप्लाज्म में लिपिड बूंदों का सजातीय वितरण और लगभग 90 m μ (मतलब) के बाहरी व्यास के साथ।
  5. चयनित सीओसी को सीएम में तीन बार धोएं और अंत में उन्हें परिपक्वता माध्यम में स्थानांतरित करें।
    नोट: किशोर oocytes के लिए, vitrification के बाद अस्तित्व में सुधार करने के लिए, १०० μM trehalose के साथ परिपक्वता माध्यम पूरक ।
  6. इन विट्रो परिपक्वता के लिए, चार-अच्छी पेट्री व्यंजनों में परिपक्वता माध्यम के 600 माइक्रोन में 30-35 सीओसी स्थानांतरित करें, जिसमें 300 माइक्रोन खनिज तेल शामिल हैं और उन्हें 22 (वयस्क ओसाइट्स) /24 (किशोर ओसाइट्स) एच के लिए हवा में 5% सीओ2 में 39 डिग्री सेल्सियस पर शामिल किया गया है।
  7. इन विट्रो परिपक्वता के बाद, धीरे-धीरे पिपटिंग करके क्यूमुलस कोशिकाओं के कोक्स को डेनड करें। 60x आवर्धन के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत परीक्षा के बाद, केवल पहले ध्रुवीय शरीर पर निष्कासन दिखाने वालों का चयन करें, और इस प्रकार मेटाफेज II (एमआईआई) चरण में, विट्रीफिकेशन के लिए।

3. वीर्य संग्रह, ठंड और विगलन प्रक्रियाएं

  1. वीर्य क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए आधार माध्यम तैयार करें जिसमें राम एक्सटेंडर (200 एमएम ट्रिस; 70 एमएम साइट्रिक एसिड; 55 एमएम फ्रक्टोज; पीएच 7.2, ओस्मोलिटी 300 मॉम/किलो) अंडे की जर्दी 20% (v/v) के साथ सप्लीमेंट किया गया।
  2. केवल भेड़ प्रजनन के मौसम (अक्टूबर-नवंबर) के दौरान वीर्य लीजिए।
  3. वयस्क मेढ़े (आयु वर्ग 2-5 वर्ष) से कृत्रिम योनि द्वारा स्खलन प्राप्त करें, बाहरी वातावरण में बनाए रखा और एक जीवित वजन रखरखाव राशन खिलाया। मेढ़े को अलग-अलग पेन में अलग रखें, लेकिन एक दूसरे के बीच दृश्य संपर्क के साथ।
  4. प्रत्येक पुरुष से कम से कम 8 स्खलन प्राप्त करने के लिए पूरे प्रजनन के मौसम के दौरान एक सप्ताह में वीर्य संग्रह दोहराएं।
  5. संग्रह के बाद 5 मिनट के भीतर पर्यावरण के तापमान पर प्रयोगशाला के लिए वीर्य के नमूनों परिवहन और तुरंत प्रक्रिया। दो-तीन मेढ़े के स्खलन को पूल करें और शुक्राणु एकाग्रता स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का मूल्यांकन करें।
  6. पूलिंग के बाद, 4% ग्लाइस्रोल के साथ पूरक वीर्य क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए आधार माध्यम के साथ 400 x 106 शुक्राणुओं/एमएल तक स्खलन को पतला करें। फिर पतला वीर्य को 2 घंटे की अवधि में 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और ठंड से पहले इसे 20 मिनट तक समतुलित करें।
  7. वीर्य के नमूनों को सूखी बर्फ पर पैलेट फॉर्म (0.25 एमएल) में फ्रीज करें और फिर उन्हें तरल नाइट्रोजन में डुबकी लगाएं।
  8. विगलन के लिए, एक निष्फल ग्लास फाल्कन में गोली डाल दिया और 39 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस के लिए पानी के स्नान में डुबकी।

4. इन विट्रो निषेचन और भ्रूण संस्कृति

  1. सिंथेटिक ऑविड्यूक्टल फ्लूइड (SOF) के गठन के लिए स्टॉक तैयार करें।
    1. स्टॉक ए तैयार करें: मिलिक-पानी का 99.4 एमएल; 6.29 ग्राम नैक; 0.534 ग्राम केसीएल; 0.161 ग्राम केएच2पीओ4; 0.182 ग्राम एमजीएसओ4 ·7एच2ओ; और सोडियम लैक्टेट का 0.6 एमएल। 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. स्टॉक बी तैयार करें: मिलिक-पानी का 10 एमएल; 0.210 ग्राम नाएचसीओ3; और फिनॉल रेड के 2-3 ग्राम। 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. स्टॉक सी तैयार करें: मिलिक-पानी का 10 एमएल; और 0.051 ग्राम सोडियम पायरुवेट। 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. स्टॉक डी तैयार करें: मिलिक-पानी का 10 एमएल; और 0.262 ग्राम सीएसीएल2 2H 2O. 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    5. सोफ की 10 एमएल तैयार करें जिसमें मिल्लीक्यू वाटर की 7.630 एमएल, स्टॉक ए की 1 एमएल, स्टॉक बी की 1 एमएल, स्टॉक सी की 0.07 एमएल और स्टॉक डी की 0.7 एमएल शामिल है।
    6. इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) माध्यम तैयार करें: SOF 2% गर्मी से इलाज करने वाले एस्ट्रोस भेड़ सीरम, 10 μg/mL हेपरिन और 1 μg/mL hypoutarine (ओस्मोलिटी 280-290 mOsm/kg) के साथ पूरक ।
      नोट: 10 मिलीएल की मात्रा में आईवीएफ माध्यम को मानक स्थितियों में (अधिकतम आर्द्रीकृत वातावरण में 5% सीओ2,5% O 2 और 90% एन2) में 39 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग से पहले कम से कम 4 घंटे किया जाना चाहिए।
  2. गर्म आईवीएफ माध्यम के १.५ मिलील नीचे एक निष्फल ग्लास शंकु नली में जमे हुए/गल वीर्य aliquots हस्तांतरण और हवा में 5% सीओ2 पर एक आर्द्र वातावरण में ३९ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए उन्हें इनक्यूबेट ।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, मोटिवल शुक्राणु तरल स्तंभ के एपिकल हिस्से की ओर तैरते हैं। शीर्ष परत लीजिए और शुक्राणु गतिशीलता मूल्यांकन के लिए निरीक्षण करें।
    नोट: शुक्राणु गतिशीलता मापदंडों का आकलन निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ कंप्यूटर-असिस्टेड स्पर्म एनालिसिस (CASA) सिस्टम का उपयोग करके किया जाना चाहिए: शुक्राणु ट्रैक ओवरलैपिंग से बचने के लिए अधिग्रहीत 25 फ्रेम, न्यूनतम विपरीत 10, औसत पथ का न्यूनतम वेग 30 माइक्रोन/एस, और प्रगतिशील गतिशीलता > ८०% सीधे । इस प्रणाली में राम शुक्राणु मूल्यांकन के लिए एक विशिष्ट सेटअप है। प्रत्येक नमूने के लिए, शुक्राणु निलंबन के 5 μL उपसंख्य 10 माइक्रोन की गहराई के साथ एक पूर्व गर्म विश्लेषण कक्ष में लोड कर रहे हैं । शुक्राणु गतिशीलता का मूल्यांकन 40x पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जाता है और कम से कम चार अलग-अलग सूक्ष्म क्षेत्रों में न्यूनतम 500 शुक्राणु प्रति सबसैंपल का विश्लेषण किया जाना चाहिए। कुल मोटिवल और प्रोग्रेसिव मोटिवल स्पर्म के प्रतिशत का मूल्यांकन किया गया। आईवीएफ के लिए, प्रगतिशील मोटिवल शुक्राणुओं का प्रतिशत 30% ≥ होना चाहिए।
  4. तनु तैरना-अप 1 x 106 शुक्राणुओं पर मोटिवेट शुक्राणुओं/एमएल अंतिम एकाग्रता और चार-अच्छी पेट्री व्यंजनों में खनिज तेल के साथ कवर आईवीएफ माध्यम के ३०० माइक्रोन में एमआईआई ओसाइट्स के साथ सह-इनक्यूबेट ।
  5. 22 घंटे के बाद चार-अच्छी तरह से पेट्री व्यंजनों में प्रकल्पित जाइगोट्स को स्थानांतरित किया जाता है जिसमें SOF होता है जिसमें 0.4% गोजातीय सीरम एल्बुमिन और ओविक्टल एकाग्रता पर आवश्यक और गैर-आवश्यक अमीनो एसिड होते हैं, जैसा कि खनिज तेल और संस्कृति के तहत16 द्वारा रिपोर्ट किया गया है।
  6. 22-, 26 और ३२-एच के बाद गर्भाधान, 60x आवर्धन के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत परीक्षा द्वारा, दो अलग-अलग ब्लास्टोर्मेस दिखाते हुए, क्लीव्ड ओसाइट्स की संख्या रिकॉर्ड करें।
  7. संस्कृति के पांचवें से नौवें दिन तक दैनिक भ्रूण का निरीक्षण करें और नवगठित ब्लास्टोसिस्ट को 60x आवर्धन के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत परीक्षा द्वारा दर्ज किया जाना चाहिए।

5. Oocyte विट्रीफिकेशन और वार्मिंग

नोट: डिवाइस क्रायोटॉप्स17का उपयोग करके न्यूनतम आवश्यक मात्रा (एमईवी) की विधि के बाद विट्रीफिकेशन करें।

  1. बीएम में 2 मिनट के लिए 38.5 डिग्री सेल्सियस पर पांच oocytes के एक समूह समतुलिण। बीएम का उपयोग कम कैल्शियम एकाग्रता ([Ca2++] 2.2मिलीग्राम/डीएल)10की गारंटी देता है।
  2. बीएम में 7.5% (v/v) डिमेथिल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) और 7.5% (v/v) एथिलीन ग्लाइकोल (ईजी) वाले समतुल्य समाधान के लिए 3 मिनट के जोखिम के साथ ओसाइट्स को निर्जलित करें।
  3. ओसाइट्स को 16.5% (v/v) DMSO, 16.5% (v/v) ईजी और 0.5 एम ट्रेहलोस वाले विट्रीफिकेशन समाधान में स्थानांतरित करें, उन्हें क्रायोटॉप डिवाइस में लोड करने से पहले और सीधे उन्हें 30 एस के भीतर तरल नाइट्रोजन में जल्दी से आगे बढ़नेवाला।
  4. जैविक तापमान को गर्म करने के लिए, तरल नाइट्रोजन से प्रत्येक विट्रीफिकेशन डिवाइस की सामग्री को 38.5 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए बीएम में 1.25 मीटर ट्रेहलोस की 200 माइक्रोन बूंदें में स्थानांतरित करें, और मिश्रण को सुविधाजनक बनाने के लिए धीरे-धीरे हलचल करें।
  5. इंट्रासेलुलर क्रायोप्रोटेक्टेंट को हटाने को बढ़ावा देने के लिए, 38.5 सी पर 38.5 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए कम ट्रेहैल समाधान (0.5 मीटर, 0.25 मीटर, 0.125 एम ट्रेहलोस) की 200 माइक्रोल बूंदों में oocytes स्टेपवाइज स्थानांतरित करें।

6. ओसाइट गुणवत्ता के बाद वार्मिंग का आकलन

  1. वार्मिंग के बाद, सीए ++ औरएमजी ++ प्लस 20% एफसीएस (बीएम) के बिना पीबीएस में 6 घंटे के लिए ऊसाइट्स को हवा में 5% सीओ2 में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: vitrification के बाद जैविक और संरचनात्मक सुविधाओं को बहाल करने की ओसाइट क्षमता प्रजातियों और उपयोग किए गए ओसाइट्स की कक्षाओं के संबंध में है।
  2. चूंकि क्रायोप्रिजर्वेशन नुकसान को ठीक करने की ओसाइट क्षमता समय-निर्भर है, इसलिए वार्मिंग के बाद इन विट्रो संस्कृति (0 एच, 2 एच, 4 एच, 6 एच) के विभिन्न समय बिंदुओं पर ओसाइट गुणवत्ता का आकलन करें, ताकि ओसाइट निषेचन के लिए इष्टतम समय खिड़की को परिभाषित किया जा सके।
    नोट: वयस्क भेड़ ओसाइट में, इष्टतम समय 4 घंटे के बाद वार्मिंग है; प्रीपुबर्टल ओसाइट के लिए, इष्टतम समय 2 एच पोस्ट-वार्मिंग है।

7. Oocyte अस्तित्व का आकलन

  1. वार्मिंग के तुरंत बाद और वार्मिंग के बाद की संस्कृति के प्रत्येक समय बिंदु के लिए, रूपात्मक रूप से 100x आवर्धन के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ओसाइट्स का मूल्यांकन करते हैं।
    नोट: संरचनात्मक परिवर्तन के साथ Oocytes, जैसे बेहोश साइटोप्लाज्म, नुकसान जोना pellucida और/या झिल्ली को विकृत के रूप में वर्गीकृत किया जाना चाहिए ।
  2. डबल डिफरेंशियल फ्लोरोसेंट धुंधला का उपयोग करके झिल्ली अखंडता मूल्यांकन को मान्य करें।
  3. बीएम के 2 एमसीएल में ऊसाइट्स को इनक्यूबेट किया गया जिसमें प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई; 10 माइक्रोग्राम/एमएल) और होचस्ट 33342 (10 माइक्रोग्राम/एमएल) 5 मिनट के लिए हवा में 5% सीओ2 में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर ।
  4. ताजा बीएम में तीन बार धोने के बाद, 350 एनएम के उत्तेजन फिल्टर और होचस्ट 33342 के लिए 460 एनएम के उत्सर्जन और 535 एनएम का एक्सट्रेशन फिल्टर और पीआई के लिए 617 एनएम के उत्सर्जन का उपयोग करके फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत ओसाइट्स का निरीक्षण करें।
    नोट: एक बरकरार झिल्ली के साथ Oocytes Hoechst 33342 के साथ रंगीन डीएनए के नीले फ्लोरेसेंस द्वारा मान्यता प्राप्त की जा सकती है। क्षतिग्रस्त झिल्ली के साथ Oocyte पीआई के साथ डीएनए धुंधला होने के कारण लाल फ्लोरेसेंस दिखाता है।

8. कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि और आरओएस इंट्रासेलुलर स्तर का मूल्यांकन

  1. माइटोट्रैकर रेड सीएम-एच2एक्सआरोस (एमटी-रेड) जांच तैयार करें।
    1. 1 एमएमएम समाधान प्राप्त करने के लिए डीएमएसओ के 1 मिलीएल के साथ 1 शीशी (50 माइक्रोग्राम) की सामग्री को पतला करें। तरल नाइट्रोजन में पतला शीशी रखें।
    2. 100 माइक्रोन स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए डीएमओ के साथ समाधान 1 mM को पतला करें और इसे अंधेरे में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 2′, 7'-dichlorodihydrofluorescein डायसेटेट (एच2डीसीएफ-डीए) जांच तैयार करें।
    1. पहले 100 एमएमएम समाधान प्राप्त करने के लिए एच2डीसीएफ-डीए को 0.1% पॉलीविनाइल पाइरोलिडोन (पीवीए) /पीबीएस में पतला करें। अंधेरे में -80 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें।
    2. 100 माइक्रोन स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए 0.1% PVA/PBS में पहला समाधान पतला करें। इसे अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. बढ़ते माध्यम (एमएम) तैयार करें: एमएम के 10 एमएल के लिए, ग्लाइसरोल के 5 एमएल, पीबीएस के 5 एमएल और 250 मिलीग्राम सोडियम एजाइड जोड़ें। उपयोग होने तक इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 500 एनएम एमटी-रेड (स्टॉक समाधान: डीएमएसओ में 100 माइक्रोन) के साथ बीएम में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ओसाइट्स को इनक्यूबेट करें।
  5. एमटी-रेड प्रोब के साथ इनक्यूबेशन के बाद, बीएम में तीन बार ओसाइट्स को धोएं और 5 माइक्रोनएम एच 2 डीसीएफ-डीए (स्टॉक समाधान: बीएम में 100 माइक्रोन) वाले एक ही मीडिया में20मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. जांच के संपर्क में आने के बाद, बीएम में ओसाइट्स को धोएं और कम से कम 15 मिनट के लिए 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड/पीबीएस में ठीक करें।
  7. फिक्सेशन के बाद, नमूनों के संपीड़न से बचने के लिए मोम कुशन का उपयोग करके एमएम के 4 माइक्रोन ड्रॉप में बीएम में तीन बार ओसाइट्स धोएं और ग्लास स्लाइड पर माउंट करें।
  8. मूल्यांकन तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर करें।
  9. एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ इम्यूनोलेबेल्ड वर्गों का विश्लेषण करें। माइक्रोस्कोप Ar/He/Ne लेजर से सुसज्जित है, एक 40/60x तेल उद्देश्य का उपयोग कर । अनुक्रमिक उत्तेजन द्वारा वर्गों का विश्लेषण करें।
  10. माइटोकॉन्ड्रियल मूल्यांकन के लिए, एमटी-रेड (एक्सपोजर: 579 एनएम; उत्सर्जन: 599 एनएम) का पता लगाने के लिए मल्टीफोटोन लेजर के साथ नमूनों का निरीक्षण करें।
  11. 488 एनएम और बी-2 ए फ़िल्टर (495 एनएम एक्सपोजर और 519 एनएम उत्सर्जन) पर एक आर्गन आयन लेजर रे का उपयोग करें ताकि डाइक्लोरोफ्लोफोरेसिन (डीसीएफ)18को इंगित किया जा सके।
  12. प्रत्येक व्यक्ति में ऊसाइट, भूमध्य रेखीय विमान19पर एमटी-रेड और डीसीएफ फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें।
  13. सभी छवि अधिग्रहण के दौरान निरंतर मूल्यों पर फ्लोरेसेंस तीव्रता से संबंधित मापदंडों को बनाए रखें (लेजर ऊर्जा 26%, अनुक्रमिक सेटिंग्स 1: पीएमटी1 लाभ 649-पीएमटी2 लाभ 482; अनुक्रमिक सेटिंग 2: पीएमटी1 लाभ 625-पीएमटी 2 लाभ 589; ऑफसेट 0; पिनहोल आकार: 68)।
  14. 20द्वारा मानकीकृत प्रक्रियाओं का पालन करते हुए, लीका लास एएफ लाइट इमेज विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके फ्लोरेसेंस तीव्रता का मात्रात्मक विश्लेषण करें।
  15. भूमध्य रेखीय विमान तक पहुंचने तक, जेड धुरी पर चलते हुए, एक बार चित्रों को कैप्चर करें।
  16. प्रत्येक तस्वीर के लिए, ग्रे स्केल में बदलें और चैनल 1 (Hoechst ब्लू से संबंधित) को बंद कर दिया गया था। फिर मैन्युअल रूप से एक घिरा हुआ क्षेत्र पर ब्याज (आरओआई) का एक क्षेत्र आकर्षित करता है, जो मेइयोटिक धुरी के आसपास है।
    नोट: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से चैनल 2 (FITC) पर पिक्सेल औसत मूल्य पढ़ सकते हैं, यह से पृष्ठभूमि के मूल्य घटाना ।
  17. पिक्सेल के मतलब मूल्यों को रिकॉर्ड करें और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सबमिट करें।

9. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. निम्नलिखित मतभेदों का विश्लेषण करें: किशोर बनाम वयस्क ओसाइट्स में जीवित रहने की दर, जीवित रहने की दर और नियंत्रण में विकासात्मक क्षमता और ट्रेहलोस-उपचारित किशोर ओसाइट्स, जीवितवेशन और पार्थेनोजेनेटिक सक्रियण दर और वयस्क ओसाइट्स की विकासात्मक क्षमता विभिन्न कैल्शियम एकाग्रता मीडिया के साथ विवर्तित, निषेचन दर और किशोर ओसाइट्स में भ्रूण उत्पादन कम या उच्च कैल्शियम एकाग्रता के साथ विप्रीकृत, किशोर विप्रितिक्षित oocytes में सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया फेनोटाइप ची स्क्वायर टेस्ट का उपयोग करके वयस्क और किशोर विट्रीफाइड ओसाइट्स के बीच पोस्ट-वार्मिंग संस्कृति और पार्थेनोजेनेटिक एक्टिवेशन दरों के विभिन्न समय बिंदु।
  2. पोस्ट-वार्मिंग संस्कृति के विभिन्न समय बिंदुओं के दौरान विट्रीफाइड वयस्क ओसाइट्स में दरार दर और भ्रूण उत्पादन का विश्लेषण करें, माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि की फ्लोरेसेंस तीव्रता और किशोर विट्रीफाइड ओसाइट्स में आरओएस इंट्रासेल्युलर स्तर के विभिन्न समय बिंदुओं के दौरान एवोवा द्वारा लेवेन के परीक्षण द्वारा विचरण की एकरूपता के विश्लेषण के बाद विश्लेषण के बाद। समूहों के बीच और बीच मतभेदों को उजागर करने के लिए एक के बाद तदर्थ परीक्षण Tukey परीक्षण का उपयोग करें ।
  3. सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें और पी < 0.05 की संभावना को महत्व का न्यूनतम स्तर माना जाए। सभी परिणाम ईई.M ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं ।

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Representative Results

किशोर दाताओं से oocyte के क्रायोटोलेंस वयस्क लोगों की तुलना में कम है । पहला प्रभाव वयस्क ओसाइट्स(चित्रा 1 ए;χ2 परीक्षण पी<0.001) की तुलना में कम वार्मिंग के बाद जीवित रहने की दर है। किशोर oocytes वार्मिंग(चित्रा 1B)के बाद एक कम झिल्ली अखंडता दिखाया । परिपक्वता माध्यम में ट्रेहलोज के उपयोग का उद्देश्य यह सत्यापित करना था कि क्या यह चीनी किशोर ओसाइट्स में क्रायोइंज की चोटों को कम कर सकती है। आंकड़ों का प्रदर्शन किया है23 कि oocytes ट्रेहालोस अनुपूरण के साथ 24 घंटे के लिए परिपक्व vitrification के बाद उच्च जीवित रहने की दर दिखाया/गैर इलाज समूह की तुलना में वार्मिंग(तालिका 1:८५.७% बनाम ७५.३% क्रमशः; χ2 परीक्षण पी<०.०५) । ट्रेहालोस अनुपूरण वास्तव में वार्मिंग(चित्रा 2 ए)के बाद उच्च झिल्ली अखंडता से जुड़ा हुआ था। इस प्रकार, किशोर ओसाइट्स की इन विट्रो परिपक्वता के दौरान ट्रेहलोस के उपयोग ने विट्रीफिकेशन (85.7%) के बाद जीवित रहने की दरों में वृद्धि की वयस्क लोगों (90.3%) के बराबर मूल्यों के लिए। हालांकि, ट्रेहलोस सप्लीमेंट(टेबल 1)द्वारा किशोर ओसाइट्स की दरार, निषेचन और विकासात्मक दरों में वृद्धि नहीं की गई थी।

विट्रीफिकेशन के बाद ओसाइट क्षमता में सुधार करने के लिए हमने वयस्क ओवाइन ओसाइट्स में कैल्शियम सांद्रता के साथ विभिन्न विट्रीफिकेशन मीडिया में 9.9 से 0.4 मिलीग्राम/डीएल10तक परीक्षण किया। प्राप्त परिणामों से पता चला है कि २.२ मिलीग्राम/डीएल के बराबर कैल्शियम एकाग्रता के साथ मीडिया के उपयोग के बाद वार्मिंग जीवित रहने की दर में वृद्धि हुई, विकास की क्षमता में सुधार और वयस्क oocyte10 (तालिका 2)के पार्थेनोजेनेटिक सक्रियण कम । इस प्रकार हमने किशोर ओसाइट्स के विट्रीफिकेशन के लिए कम कैल्शियम विट्रीफिकेशन मीडिया का परीक्षण किया। जैसा कि तालिका 3में दिखाया गया है, कम कैल्शियम एकाग्रता के साथ किशोर ओसाइट्स विट्रीफाइड उच्च कैल्शियम एकाग्रता (क्रमशः 44.35% बनाम 32.29%) के साथ oocytes विट्रीड की तुलना में उच्च निषेचन दरों का सबूत है; पी<0.05), लेकिन भ्रूण उत्पादन में कोई अंतर नहीं पाया गया ।

विट्रिफाइड/गरम ओसाइट्स को क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रियाओं के कारण नुकसान को बहाल करने और उनकी विकास क्षमता बढ़ाने के लिए निषेचन से पहले अतिरिक्त समय की आवश्यकता होती है । पिछले एक अध्ययन ने वास्तव में यह दर्शाया है कि एटीपी इंट्रासेलुलर एकाग्रता, माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि और इन विट्रो विकासात्मक क्षमता को विट्रीफाइड/गल ओसाइट्स में कम कर दिया जाता है, जो उच्च इंट्रासेलर आरओएस सांद्रता6भी दिखाते हैं। ये परिवर्तन विशेष रूप से वार्मिंग के तुरंत बाद चिह्नित किए जाते हैं। वार्मिंग के बाद की संस्कृति के दौरान, वयस्क और किशोर दोनों ऊसाइट्स विट्रीफिकेशन प्रक्रियाओं6,24के दौरान हुए नुकसान से आंशिक रूप से उबरने में सक्षम होते हैं। विभिन्न अवधियों (0, 2, 4, और 6 घंटे) की वार्मिंग के बाद की संस्कृति की तुलना करके, हमने दिखाया कि वयस्क ईवेस से एकत्र संस्कृति के 4 घंटे के बाद ऊर्जावान शेष6 और माइक्रोट्यूबुलर सेटअप24 को ठीक करने और उच्च दरार (50.7 ± 3.9% के साथ विकासात्मक क्षमता को बहाल करने में सक्षम हैं; पी< 0.01 ANOVA) और ब्लास्टोसिस्ट दरों (14.40 ± 1.3%; अन्य समय अंक (0, 2 और 6 घंटे) की तुलना में ANOVA P< 0.01); तालिका 4)। इस प्रकार, वार्मिंग के बाद की संस्कृति के 4 घंटे विट्रीफाइड/गरम वयस्क oocytes6के निषेचन के लिए आदर्श समय खिड़की का प्रतिनिधित्व करता है ।

जब किशोर दानदाताओं से एकत्र oocytes के साथ एक ही प्रयोग दोहराया गया था, इन परिणामों को आंशिक रूप से पुष्टि की गई । माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि अन्य समय बिंदुओं (0, 2, 6) की तुलना में वार्मिंग के बाद की संस्कृति के 4 घंटे के बाद विट्रीफाइड/गर्म किशोर ओसाइट्स में अधिक थी; चित्रा 3:ANOVA पी<0.01) । माइटोकॉन्ड्रियल वितरण के कई पैटर्न निम्नलिखित तीन समूहों में देखे और वर्गीकृत किए जाते हैं (जैसा कि21 द्वारा बताया गया है): पैटर्न ए: साइटोप्लाज्म में फैले छोटे दाने के साथ सजातीय ठीक; पैटर्न बी: बड़े दाने के साथ सजातीय दानेदार पूरे साइटोप्लाज्म में फैल गए; पैटर्न सी: विषम क्लस्टर जब विशेष रूप से बड़े दाने मौजूद थे, सभी साइटोप्लाज्म पर फैले हुए थे या विशिष्ट साइटोप्लाज्मिक डोमेन में स्थित थे। एमआईआई में सक्रिय माइटोकॉन्ड्रियल के साइटोप्लाज्म वितरण में विभिन्न फेनोटाइप ओसाइट विकासात्मक क्षमता से संबंधित हो सकते हैं। एक बारीक सजातीय वितरण खराब विकास क्षमता का सूचक है जबकि दानेदार और संकुल वितरण एक बढ़ी हुई माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि से संबंधित है और इसके परिणामस्वरूप उच्च विकासात्मक क्षमता22. माइटोकॉन्ड्रियल वितरण पैटर्न पोस्ट-वार्मिंग संस्कृति के 6 एच के दौरान बदल गया। चित्रा 4 किशोर oocytes के उदाहरण से पता चलता है माइटोकॉन्ड्रियल वितरण के विभिन्न पैटर्न और वार्मिंग के बाद संस्कृति के दौरान उनके उतार चढ़ाव । पैटर्न एक लंबे समय तक इनक्यूबेशन के दौरान काफी वृद्धि हुई है और 6 घंटे के बाद वार्मिंग पर उच्च मूल्य तक पहुंचताहै (चित्रा 4ए:χ2 पी<0.05), पैटर्न बी के बाद के दौरान महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखा वार्मिंग संस्कृति(चित्रा 4Bb),पैटर्न सी लंबे समय तक इनक्यूबेशन के दौरान किसी भी किशोर vitrified/गरम oocyte में नहीं पाया गया था(चित्रा 4Cc:χ2 पी<0.05) ।

इसके अलावा, 0, 4 और 6 घंटे(चित्रा 5:इनोवा पी<0.001) की तुलना में पोस्ट-वार्मिंग संस्कृति के 2 घंटे में किशोर ओसाइट्स में आरओएस इंट्रासेलुलर स्तर काफी कम थे। हालांकि, और वयस्क ओसाइट्स में जो पाया गया उसके विपरीत, किशोर ओसाइट्स(चित्रा 6)में वार्मिंग के बाद की संस्कृति के दौरान सहज पार्थेनोजेनेटिक सक्रियण की दर में वृद्धि हुई। इस कारण से, किशोर ओसाइट्स में निषेचन के लिए अनुशंसित समय बिंदु पोस्ट वार्मिंग संस्कृति के बाद 2 घंटे होगा।

Figure 1
चित्रा 1। किशोर और वयस्क दानदाताओं से एकत्र विट्रीफाइड/गर्म ओवाइन ओसाइट की जीवित रहने की दरें । (क) इन विट्रो परिपक्वता के बाद ओसाइट को विट्रीपिफाइड किया गया था । प्रोपिडियम आयोडाइड (10 μg/mL) और Hoechst ३३३४२ (10 μg/mL) के साथ फ्लोरोसेंट स्टेनिंग द्वारा विट्रीफिकेशन और वार्मिंग के बाद जीवित रहने की दर निर्धारित की गई थी । N = 165 वयस्क oocytes और 170 किशोर oocytes. विभिन्न पत्र वयस्क और किशोर oocytes के बीच महत्वपूर्ण अंतर का संकेत: χ2 परीक्षण पी<0.001 । (बी-सी) रूपात्मक मूल्यांकन (100x आवर्धन के साथ उल्टे माइक्रोस्कोप) में अक्षुण्ण (बी) और क्षतिग्रस्त प्लाज्मा झिल्ली (सी) के साथ विट्रीफाइड/गरम किशोर ओसाइट्स के उदाहरण। स्केल बार = 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। किशोर ओविन ओसाइट जीवित रहने की दर और (टीआरएच) और बिना (सीटीआर) ट्रेहलोस (परिपक्वता माध्यम में 100 mM) के साथ परिपक्वता के बाद विट्रो विकासात्मक क्षमता में। (ए-बी) रूपात्मक मूल्यांकन (100x आवर्धन के साथ उल्टे माइक्रोस्कोप) पर ट्रेहैलोस के बिना मीडिया पूरक(ए)के साथ या(बी)में इन विट्रो परिपक्वता के बाद किशोर ओसाइट्स के उदाहरण। स्केल बार = 30 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। विट्रो संस्कृति में वार्मिंग के बाद के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं (0, 2, 4, 6) पर विट्रीफाइड/गर्म किशोर ओसाइट्स में सक्रिय माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस तीव्रता का मात्राकरण। इवीएम ओसाइट्स का उपयोग नियंत्रण (सीटीआर एन = 77) के रूप में किया गया था। कुल 163 (0 एच एन = 45; 2 एच एन = 39; 4 एच एन = 40; 6 एच एन = 39) किशोर ओसाइट्स को तीन स्वतंत्र प्रयोगों में विट्रीपिफाइड और गर्म किया गया। विभिन्न पत्र सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों को इंगित करते हैं (ANOVA पी = 0.0000)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। विट्रो संस्कृति में वार्मिंग के बाद के 6 घंटे के दौरान विट्रीफाइड/गर्म किशोर ओसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल पैटर्न का वितरण। विट्रिफाइड/गर्म किशोर ओसाइट्स में फाइन (ए),दानेदार (बी) और क्लस्टर (सी) माइटोकॉन्ड्रियल डिस्ट्रीब्यूशन की प्रतिनिधि छवियां । (घ) एक अच्छा माइटोकॉन्ड्रियल वितरण दिखा किशोर विट्रीफाइड/गर्म ऊसाइट्स का प्रतिशत; (ङ) एक दानेदार माइटोकॉन्ड्रियल वितरण को दर्शाने वाले किशोर विट्रीफाइड/गर्म ओसाइट्स का प्रतिशत; (च) एक संकुल माइटोकॉन्ड्रियल वितरण दिखाते हुए किशोर विट्रीफाइड/गर्म ओसाइट्स का प्रतिशत । आईवीएम किशोर oocytes नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया (सीटीआर; एन = 77)। कुल 163 (0 एच एन = 45; 2 एच एन = 39; 4 एच एन = 40; 6 एच एन = 39) किशोर ओसाइट्स विट्रीफाइड और तीन स्वतंत्र प्रयोगों में गरम किया गया। विभिन्न पत्र सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मतभेदों को इंगित करते हैं (एए: χ2 पी = 0.026; बीबी: χ2 पी = 0.097; प्रतिलिपि: χ2 पी = 0.014)। स्केल बार = 30 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। विट्रो संस्कृति में वार्मिंग के बाद 6 घंटे के दौरान विट्रीफाइड किशोर ओसाइट्स में इंट्रासेल्युलर आरओएस फ्लोरेसेंस तीव्रता का मात्राकरण। (ए-बी) इन विट्रो परिपक्व(ए)और विट्रीफाइड(बी)किशोर ओसाइट्स में आरओएस फ्लोरेसेंस तीव्रता की प्रतिनिधि छवियां। (ग)आरओएस का इंट्रासेलुलर स्तर विभिन्न समय बिंदुओं पर विट्रीफाइड किशोर ओसाइट्स में फ्लोरेसेंस तीव्रता के मात्राकरण द्वारा निर्धारित (0 एच एन = 45; 2 एच एन = 39; 4 एच एन =40; 6 एच एन = 39) के बाद वार्मिंग इन विट्रो कल्चर के दौरान । इन विट्रो परिपक्व किशोर ओसाइट्स का उपयोग नियंत्रण (सीटीआर एन = 77) के रूप में किया जाता था। विभिन्न पत्र सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों को इंगित करते हैं (ANOVA पी = 0.0000)। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6। विट्रो संस्कृति में वार्मिंग के बाद के 6 घंटे के दौरान विट्रीफाइड किशोर और वयस्क ओसाइट्स में पार्थेनोजेनेटिक सक्रियण। (ए-बी)ओसाइट पार्थेनोजेनेटिक एक्टिवेशन की प्रतिनिधि छवियां:(ए)मेटाफेज II-टेलोफेज II संक्रमण में ओसाइट और(बी)प्रोन्यूक्लिस गठन। (ग)विट्रो कल्चर में पोस्ट वार्मिंग के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं (0, 2, 4, 6 एच) पर पार्थेनोजेनेटिक सक्रिय वयस्क और किशोर ओसाइट्स का प्रतिशत । तारांकन इनक्यूबेशन (ANOVA पी = 0.000) के प्रत्येक समय बिंदु पर किशोर और वयस्क oocytes के बीच सांख्यिकीय मतभेदों का संकेत मिलता है। इस आंकड़े को सेरा एट अल से संशोधित किया गया है।24 स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ऊसाइट्स (एन) जीवित रहने की दर (%) आईवीएफ (एन) उर्वरितएक (%) क्लीवेडबी (%) ब्लास्टोसिस्टसी (%)
सीटीआर 73 75.3* 452 91.1 96.1 14.3
ट्राल 77 85.7 470 92.5 95.4 13
* ची स्क्वायर टेस्ट पी<0.5
आईवीएफ ओसाइट्स पर एक प्रतिशत की गणना की जाती है
बी प्रतिशत की गणना निषेचित ओसाइट्स पर की जाती है
सी प्रतिशत की गणना क्लीवेड ओसाइट्स पर की जाती है

तालिका 1. किशोर ओविन ओसाइट्स जीवित रहने की दर और ट्रेहैलोस और विट्रीफिकेशन के बिना परिपक्वता के बाद विट्रो विकासात्मक क्षमता में। TRH = किशोर ओसाइट्स ट्रेहालोस पूरकता (परिपक्वता माध्यम में 100 mm) के साथ परिपक्व होता है। CTR = नियंत्रण किशोर oocytes ट्रेहलोस पूरकता के बिना परिपक्व। प्रोविडियम आयोडाइड (10 μg/mL) और Hoechst ३३३४२ (10 μg/mL) के साथ फ्लोरोसेंट धुंधला होने के बाद जीवित रहने की दर निर्धारित की गई थी । एक इन विट्रो उत्पादन प्रणाली में शामिल होने के बाद ऊसाइट विकासात्मक क्षमता निर्धारित की गई थी। क प्रतिशत आईवीएफ oocytes पर गणना कर रहे हैं। बी प्रतिशत की गणना निषेचित ओसाइट्स पर की जाती है। सी प्रतिशत की गणना क्लीव्ड ओसाइट्स पर की जाती है। *χ 2 टेस्ट पी<0.5। इस तालिका को बर्लिनगुएर एट अल से संशोधित किया गयाहै।

समूहों [Ca++]मिलीग्राम/डीएल एन ओसाइट सहज पार्थेनोजेनेटिक एक्टिवेशन (%) विट्रीफाइड ओसाइट्स बच गया और आईवीएफ ओसाइट्स (%) दरार (%) ब्लास्टोसिस्ट आउटपुट (%)
टीसीएम/एफसीएस 9.9 80 33 (41.2)क 150 124 (82.7)क 40 (32.5)क 2 (1.6)क
पीबीएस/एफसीएस 4.4 82 29 (35.3)एसी 115 88 (76.5)क 33 (37.5)एई 1 (1.1)क
पीबीएसकामीमीमुक्त/एफसीएस 2.2 86 11 (12.7)ख 126 115 (91.3)ख 74 (64.3)ख 12 (10.4)ख
पीबीएस/बीएसए 3.2 83 21 (25.3)c 110 90 (81.8)क 18 (20)सी 0 (0)एक
पीबीएसकामीमी मुक्त/बीएसए 0.4 87 10 (11.5)ख 149 123 (82.5)क 57 (46.3)डे 3 (2.4)ख

तालिका 2. विट्रो परिपक्व वयस्क ओसाइट्स की विकासात्मक क्षमता विट्रीफिकेशन मीडिया (16.5% एथिलीन ग्लाइकोल + 16.5% डिमेथाइल सल्फॉक्साइड) में विभिन्न कैल्शियम सांद्रता युक्त है। अस्तित्व और निषेचन दरों की गणना विट्रीफाइड ओसाइट्स पर की जाती है; कुल दरार और ब्लास्टोसिस्ट दरों की गणना जीवित ओसाइट्स पर की जाती है। एक ही कॉलम के भीतर अलग-अलग सबस्क्रिप्ट वाले मान काफी अलग हैं: χ2 परीक्षण पी<0.05। इस तालिका को सुक्कन एट अल से संशोधित किया गयाहै।

[Ca 2++]vitrification मीडिया में नहीं। ऊसाइट्स पोस्ट-विट्रीफिकेशन सर्वाइवल रेट (%) निषेचन दर (%) दरार (%) ब्लास्टोसिस्ट आउटपुट (%)
उच्च [9.9 मिलीग्राम/डीएल] 190 161 (84.73) 52/161 (32.29)क 43/161 (26.7) 0
कम [2.2 मिलीग्राम/डीएल] 150 124 (82.66) 55/124 (44.35)ख 41/124 (33.1) 0

तालिका 3. विट्रो निषेचन और उच्च ([Ca 2 ++] = ९.९ मिलीग्राम/डीएल) और कम ([Ca 2 ++] = २.२ मिलीग्राम/डीएल) के उपयोग से विट्रो निषेचन और संस्कृति के बाद निषेचन और विकास दरों में विट्रीफाइड/गरम किशोर oocyte का उपयोग कर vitrification मीडिया में कैल्शियम एकाग्रता । विभिन्न अक्षरों में सांख्यिकीय अंतर (बी पी<0.05 χ2 परीक्षण) ≠ का संकेत मिलता है।

वार्मिंग के बाद के घंटे इनक्यूबेशन दरार दर(n) भ्रूण उत्पादन (n)
0 19.2 ± 3%एक (82) 0%एक (17)
2 41.8 ± 3%बी (100) 6.5 ± 1.3%b (42)
4 50.7 ± 3%b (92) 14.4 ± 1.3%सी (48)
6 26 ± 3%एक (92) 0%एक (23)

तालिका 4. दरार दर और vitrified/गरम वयस्क oocytes में भ्रूण उत्पादन के बाद वार्मिंग संस्कृति के विभिंन समय बिंदुओं पर निषेचित । विभिन्न अक्षर एक ही कॉलम के भीतर सांख्यिकीय अंतर का संकेत देते हैं: ANOVA P<0.01।

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Discussion

घरेलू जानवरों में Oocyte क्रायोप्रिजर्वेशन न केवल महिला आनुवंशिक संसाधनों के दीर्घकालिक संरक्षण की अनुमति दे सकता है, बल्कि भ्रूणीय जैव प्रौद्योगिकी के विकास को भी आगे बढ़ा सकता है। इस प्रकार, ओसाइट विट्रीफिकेशन के लिए एक मानक विधि के विकास से पशुधन और अनुसंधान क्षेत्र दोनों को लाभ होगा। इस प्रोटोकॉल में, वयस्क भेड़ ओसाइट विट्रीफिकेशन के लिए एक पूर्ण विधि प्रस्तुत की जाती है और किशोर ओसाइट के लिए एक कुशल विट्रीफिकेशन प्रणाली के विकास के लिए एक ठोस प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व कर सकती है।

प्रस्तावित विधि के मुख्य फायदों में से एक यह है कि इसमें ओसाइट संग्रह, इन विट्रो परिपक्वता, विट्रीफिकेशन और वार्मिंग के सभी चरण शामिल हैं। इसके अलावा, इसमें एक वार्मिंग संस्कृति अवधि शामिल है ताकि ओसाइट्स को निषेचित होने से पहले विट्रीफिकेशन प्रक्रिया के दौरान होने वाले नुकसान से उबरने की अनुमति दी जा सके। निषेचन के लिए इष्टतम समय क्रायोप्रिजर्वेशन की विधि, प्रारंभिक ओसाइट गुणवत्ता, रोगी आयु और प्रजातियों के अनुसार सिलवाया जाना चाहिए, समय वसूली और ऊसाइट एजिंग25, 26के दोनों पहलुओं पर विचार करने के लिए आवश्यक होना चाहिए। इस प्रकार, पोस्ट-वार्मिंग इनक्यूबेशन अवधि की अवधि का चयन करना चुनौतीपूर्ण है और यह ओसाइट विट्रीफिकेशन कार्यक्रमों के परिणाम को प्रभावित कर सकता है। दरार दरों और भ्रूण उत्पादन के संदर्भ में प्राप्त परिणामों के आधार पर, और प्रस्तुत प्रोटोकॉल में वर्णित शर्तों के तहत, विट्रीफाइड वयस्क भेड़ ओसाइट्स के निषेचन के लिए इष्टतम समय वार्मिंग के बाद के 4 घंटे के बाद इनक्यूबेशन(तालिका 4)6है। एक ओसाइट विट्रीफिकेशन प्रोग्राम डिजाइन करते समय यह जानकारी महत्वपूर्ण है।

हालांकि, यह प्रोटोकॉल विट्रीफाइड/गर्म वयस्क ओसाइट्स से भ्रूण उत्पादन के संदर्भ में स्वीकार्य परिणाम देते हुए, यदि किशोर ओसाइट्स पर लागू होता है तो अभी भी शून्य भ्रूण की ओर कम होता है । कई संरचनात्मक और कार्यात्मक सीमाएं प्रीपॉबर्टल ओसाइट विकासात्मक क्षमता को ख़राब करती हैं, जैसे कि छोटे आकार, क्यूमुलस कोशिकाओं और ओसाइट्स के बीच दोषपूर्ण युग्मन, अमीनो एसिड तेज में कमी, कम प्रोटीन संश्लेषण और ऊर्जा चयापचय 27,28,29। पिछले अध्ययन में हमने बताया था कि प्रीपॉबर्टल ओसाइट्स विट्रीफिकेशन प्रक्रिया30के प्रति उच्च संवेदनशीलता दिखाते हैं । विट्रीफिकेशन और वार्मिंग के बाद दिखाई गई कम विकासात्मक क्षमता शायद साइटोस्केलेटन के पुनर्गठन में शामिल साइटोप्लाज्मिक कारकों को नुकसान का परिणाम है और (या) परिपक्वता को बढ़ावा देने वाले कारक30की सक्रियता में। जैसा कि तालिका 1में दिखाया गया है, ट्रेहलोस के साथ परिपक्वता माध्यम की पूरकता, एक गैर-पारगम्य क्रायोप्रोप्रोटेक्टेंट, वयस्क ओसाइट्स4के बराबर मूल्यों के लिए विट्रीफिकेशन और वार्मिंग के बाद जीवित रहने की दर में वृद्धि करने में सक्षम थी। इसी तरह, कम कैल्शियम सांद्रता के साथ विट्रीफिकेशन समाधान का उपयोग विट्रीफिकेशन और वार्मिंग के बाद किशोर ओसाइट्स की निषेचन दरों को बढ़ाता है, जैसा कि तालिका 3में दिखाया गया है। इस प्रकार, इन विट्रो परिपक्वता और विट्रीफिकेशन मीडिया संरचना के दौरान संस्कृति की स्थितियों पर अनुकूलन दोनों ही विट्रीफिकेशन और वार्मिंग के बाद किशोर ओसाइट की गुणवत्ता बढ़ाने में मदद कर सकते हैं। किशोर ओसाइट्स विट्रीफिकेशन प्रक्रिया द्वारा प्रेरित नुकसान से उबरने की कुछ क्षमता दिखाते हैं, जैसा कि चित्र 3, 4और 5में दिखाया गया है।

हालांकि, वार्मिंग के बाद संस्कृति के दौरान सहज पार्थेनोजेनेटिक सक्रियण की उच्च दरें अभी भी उनकी विकास क्षमता को सीमित करते हैं। एथिलीन ग्लाइकोल और डीएमएसओ, जो आमतौर पर क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंटों का उपयोग करते हैं, वास्तविक निषेचन से पहले ओसाइट को कृत्रिम रूप से सक्रिय कर सकते हैं, जिससे निषेचन की सफलता और भ्रूण विकास सीमित हो जाता है। वे वास्तव में इंट्रासेलुलर सीए2 + एकाग्रता31में क्षणिक वृद्धि का कारण बन सकते हैं, इस प्रकार कॉर्टिकल ग्रैन्यूल एक्सोसाइटोसिस, प्रोन्यूक्लियी गठन और मेयोटिक बहाली32को ट्रिगर कर सकते हैं। वास्तव में, विट्रीफिकेशन वास्तविक निषेचन से पहले ओसाइट को कृत्रिम रूप से सक्रिय कर सकता है, जिससे निषेचन की सफलता और भ्रूण विकास सीमित हो जाता है। इस प्रकार कैल्शियम चेलेटर का उपयोग किशोर ओसाइट्स में सहज सक्रियण की दर को सीमित करने के उद्देश्य से विट्रीफिकेशन प्रक्रिया के दौरान कैल्शियम की उपलब्धता को और सीमित करने के लिए किया जा सकता है।

यह भी विचार किया जाना चाहिए कि, धीमी ठंड के विपरीत, विट्रीफिकेशन एक विशेष रूप से मैनुअल तकनीक है और इस प्रकार यह ऑपरेटर निर्भर33,34है। इस प्रकार, प्रशिक्षित कर्मियों की उपलब्धता इस विधि की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है । सबसे पहले, ऑपरेटर को विट्रिफाइड होने के लिए ओसाइट्स का ठीक से चयन करना होगा। आईवीएम के बाद, ओसाइट्स को धीरे-धीरे क्यूमुलस कोशिकाओं से छुटकारा दिया जाता है और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए चयन करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत मूल्यांकन किया जाता है, केवल एक समान साइटोप्लाज्म वाले, साइटोप्लाज्म में लिपिड बूंदों के सजातीय वितरण और लगभग 90 माइक्रोन के बाहरी व्यास के साथ। इसके अलावा, केवल पहले ध्रुवीय शरीर पर निष्कासन दिखा oocytes, और इस तरह MII चरण में, चुना जाना चाहिए ।

ओसाइट्स का रूपात्मक मूल्यांकन कुछ ही मिनटों में पूरा किया जाना चाहिए और ऑपरेटर-भरोसेमंद होने के नाते, यह इसके उचित कार्यान्वयन में भिन्नता के प्रति बहुत संवेदनशील है। चयन प्रक्रिया को मानकीकृत करने में मदद करने के लिए, विधि वयस्क ओसाइट्स के लिए इन विट्रो परिपक्वता के लिए संस्कृति के समय को 22 घंटे तक सीमित करने का सुझाव देती है। इस समय बिंदु पर, उच्च गुणवत्ता के भेड़ ओसाइट्स पहले से ही पहले मेयोटिक डिवीजन22 पूरा कर चुके हैं और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए चुने जा सकते हैं। इस तरह कम गुणवत्ता वाले ओसाइट्स का उन्मूलन, जो पहले मेयोटिक डिवीजन के पूरा होने में सबसे धीमे हैं, सरल होना चाहिए।

ऑपरेटर को तरल नाइट्रोजन में विसर्जन के लिए क्रायोप्रोटेक्टेंट के पहले एक्सपोजर से विट्रीफिकेशन प्रक्रिया के लिए निर्धारित समय का भी कड़ाई से सम्मान करना चाहिए। एक और महत्वपूर्ण कदम उपयोग किए जाने वाले विट्रिफिकेशन डिवाइस में ओसाइट की लोडिंग है। प्रक्रिया को ठंडा करने की दर बढ़ाने के लिए न्यूनतम नमूना मात्रा का उपयोग करना चाहिए और कोशिकाओं को तेजी से चरण संक्रमण तापमान से गुजरने में मदद करनी चाहिए, जिससे क्रायोइंज की चोटें35कम हो जाती हैं। क्रायोटॉप एक धारक से जुड़ी पॉलीप्रोपाइलीन पट्टी का उपयोग करता है। इस विधि में, विट्रीफिकेशन समाधान (<0.1 माइक्रोल) में ओसाइट्स तेजी से फिल्म पट्टी के शीर्ष पर एक ग्लास केशिका के साथ भरे हुए हैं। फिर, समाधान को हटा दिया जाना चाहिए, एक पतली परत को पीछे छोड़ते हुए कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त क्रायोप्रेयर्ड किया जाना चाहिए। एक बार फिर, इस चरण को विट्रिफिकेशन समाधान की उच्च क्रायोप्रोटेक्टेंट सांद्रता तक ओसाइट्स के जोखिम को सीमित करने के लिए जितनी जल्दी हो सके पूरा किया जाना चाहिए, जो ऑस्मोटिक शॉक का कारण बन सकता है और कोशिकाओं के लिए विषाक्त है।

इन कारणों से इस विधि से जुड़ी एक बड़ी चुनौती मैनुअल हैंडलिंग और कुशल तकनीशियन की जरूरत है। अन्य लेखकों ने बताया कि ओसाइट विट्रीफिकेशन परिणाम "लर्निंग वक्र" प्रभाव से प्रभावित दिखाई देता है, क्योंकि मैनुअल कौशल का अधिग्रहण विट्रीफिकेशन प्रक्रिया34द्वारा प्रेरित जैविक क्षति को काफी कम कर सकता है। शोधकर्ताओं ने इस प्रकार विट्रीफिकेशन प्रक्रिया के परिणाम के मूल्यांकन में "ऑपरेटर प्रभाव" को ध्यान में रखना चाहिए।

आगे के अध्ययनों में ओसाइट चयन प्रक्रिया और किशोर ओसाइट्स की जरूरतों के लिए बेहतर सिलाई मीडिया संरचना और संस्कृति की स्थिति दोनों पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा । इस संबंध में, कैल्शियम चेलेटर और एंटीऑक्सीडेंट दोनों का उपयोग आशाजनक अवसर प्रदान कर सकता है। इसी प्रकार, प्रोटोकॉल के अनुकूलन से विट्रीफाइड/गर्म वयस्क ओसाइट्स की विकासात्मक क्षमता में वृद्धि होगी ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखकों को इस काम के लिए कोई विशिष्ट धन प्राप्त नहीं हुआ । प्रोफेसर मारिया ग्रेजिया कपपाई और डॉ वेलेरिया पास्सियू को वीडियो वॉयसओवर के लिए और वीडियो बनाने के दौरान लैब स्थापित करने के लिए कृतज्ञता से स्वीकार किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate Sigma-Aldrich D-6883
Albumin bovine fraction V, protease free Sigma-Aldrich A3059
Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) Sigma-Aldrich 14533
Calcium chloride (CaCl2 2H20) Sigma-Aldrich C8106
Citric acid Sigma-Aldrich C2404
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems GmbH,Wetzlar TCS SP5 DMI 6000CS
Cryotop Kitazato Medical Biological Technologies
Cysteamine Sigma-Aldrich M9768
D- (-) Fructose Sigma-Aldrich F0127
D(+)Trehalose dehydrate Sigma-Aldrich T0167
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Dulbecco Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Egg yolk Sigma-Aldrich P3556
Ethylene glycol (EG) Sigma-Aldrich 324558
FSH Sigma-Aldrich F4021
Glutamic Acid Sigma-Aldrich G5638
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycine Sigma-Aldrich G8790
Heparin Sigma-Aldrich H4149
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Hypoutarine Sigma-Aldrich H1384
Inverted microscope Diaphot, Nikon
L-Alanine Sigma-Aldrich A3534
L-Arginine Sigma-Aldrich A3784
L-Asparagine Sigma-Aldrich A4284
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A4534
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352
L-Cystine Sigma-Aldrich C8786
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126
LH Sigma-Aldrich L6420
L-Histidine Sigma-Aldrich H9511
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I7383
L-Leucine Sigma-Aldrich L1512
L-Lysine Sigma-Aldrich L1137
L-Methionine Sigma-Aldrich M2893
L-Ornithine Sigma-Aldrich O6503
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P5030
L-Proline Sigma-Aldrich P4655
L-Serine Sigma-Aldrich S5511
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T1020
L-Valine Sigma-Aldrich V6504
Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) Sigma-Aldrich M2393
Makler Counting Chamber Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l.
Medium 199 Sigma-Aldrich M5017
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410
MitoTracker Red CM-H2XRos ThermoFisher M7512
New born calf serum heat inactivated (FCS) Sigma-Aldrich N4762
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) Sigma-Aldrich P8136
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P5405
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4170
Sheep serum Sigma-Aldrich S2263
Sodium azide Sigma-Aldrich S2202
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
Sodium dl-lactate solution syrup Sigma-Aldrich L4263
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Sperm Class Analyzer Microptic S.L. S.C.A. v 3.2.0
Statistical software Minitab 18.1 2017 Minitab
Stereo microscope Olimpus SZ61
Streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
Taurine Sigma-Aldrich T7146
TRIS Sigma-Aldrich 15,456-3

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 173 क्रायोप्रिजर्वेशन गेमेट वार्मिंग के बाद संस्कृति व्यवहार्यता विकासात्मक क्षमता क्रायोटॉप माइटोकॉन्ड्रिया आरओएस
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Succu, S., Serra, E., Gadau, S., Varcasia, A., Berlinguer, F. Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep. J. Vis. Exp. (173), e62272, doi:10.3791/62272 (2021).

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