Summary
Protokollet syftar till att tillhandahålla en standardmetod för vitrifiering av vuxna och juvenila fåroocyter. Det innehåller alla steg från förberedelsen av in vitro-mognadsmedierna till den eftervärmande kulturen. Oocyter förstoras på MII-stadiet med Cryotop för att säkerställa minsta väsentliga volym.
Abstract
I boskap kan in vitro embryoproduktionssystem utvecklas och upprätthållas tack vare det stora antalet äggstockar och äggceller som lätt kan erhållas från ett slakteri. Vuxna äggstockar bär alltid flera antral folliklar, medan i pre-pubertala givare det maximala antalet äggceller är tillgängliga vid 4 veckors ålder, när äggstockar bär toppantal antral folliklar. Således anses 4 veckor gamla lamm vara bra givare, även om utvecklingskompetensen hos prepubertala äggceller är lägre jämfört med deras vuxna motsvarighet.
Grundforskning och kommersiella tillämpningar skulle ökas av möjligheten att framgångsrikt kryopreservera vitrified oocyter som erhållits från både vuxna och prepubertala givare. Vitrifiering av äggceller som samlats in från prepubertala givare skulle också möjliggöra förkortning av produktionsintervallet och därmed öka den genetiska vinsten i avelsprogram. Förlusten av utvecklingspotential efter kryopreservation gör dock däggdjursoocyter förmodligen en av de svåraste celltyperna att kryopreservera. Bland de tillgängliga kryopreservationsteknikerna tillämpas vitrifiering i stor utsträckning på djur och mänskliga äggceller. Trots de senaste framstegen inom tekniken inducerar exponeringar för höga koncentrationer av kryoprotektiva medel samt kylskada och osmotisk stress fortfarande flera strukturella och molekylära förändringar och minskar utvecklingspotentialen hos däggdjursoocyter. Här beskriver vi ett protokoll för vitrifiering av får oocyter samlas in från juvenil och vuxna givare och mogna in vitro före cryopreservation. Protokollet omfattar alla procedurer från oocyt in vitro mognad till vitrification, uppvärmning och efter uppvärmning inkubationstid. Oocyter som förstoras på MII-stadiet kan verkligen befruktas efter uppvärmning, men de behöver extra tid före befruktning för att återställa skador på grund av kryopreservationsförfaranden och för att öka deras utvecklingspotential. Således är eftervärmning kulturförhållanden och timing avgörande steg för återställande av oocyte utvecklingspotential, särskilt när äggceller samlas in från juvenila givare.
Introduction
Långsiktig lagring av kvinnliga gameter kan erbjuda ett brett spektrum av applikationer, såsom att förbättra inhemsk djuruppfödning genom genetiska urvalsprogram, bidra till att bevara den biologiska mångfalden genom ex-situ wildlife species conservation program, och öka in vitro bioteknik forskning och applikationer tack vare tillgången på lagrade äggceller som ska införlivas i in vitro embryoproduktion eller kärntransplantationsprogram1,2,3. Juvenil oocyte vitrification skulle också öka genetisk vinst genom att förkorta produktionsintervallet i avelsprogram4. Vitrifiering genom ultra-snabb kylning och uppvärmning av äggceller anses för närvarande vara en standardmetod för boskap oocyter cryopreservation5. I idisslare, före vitrifiering, mognas äggceller vanligtvis in vitro, efter hämtning från folliklar som erhållits från slakteri-härledda äggstockar2. Vuxna, och särskilt prepubertalaäggstockar 4,6, kan verkligen leverera ett praktiskt taget obegränsat antal äggceller som ska kryopreserveras.
Hos nötkreatur, efter oocyte vitrification och uppvärmning, blastocyst avkastning på >10% har rapporterats ofta av flera laboratorier under det senaste decenniet3. I små idisslare anses dock oocyte vitrification fortfarande vara relativt ny för både juvenila och vuxna äggceller, och en standardmetod för får oocyte vitrification återstår att upprätta2,5. Trots de senaste framstegen presenterar den förstorade och uppvärmda äggcellen verkligen flera funktionella och strukturella förändringar som begränsar deras utvecklingspotential7,8,9. Således har få artiklar rapporterat blastocyst utveckling på 10% eller mer i vitrified / uppvärmda får oocyter2. Flera tillvägagångssätt har undersökts för att minska de ovan nämnda ändringarna: optimera sammansättningen av vitrifierings- och upptiningslösningarna10,11; experimentera med användning av olika cryo-enheter8,12,13; och tillämpa särskilda behandlingar under in vitro-mognad (IVM)4,14,15 och/eller under återhämtningstiden efter uppvärmning6.
Här beskriver vi ett protokoll för vitrifiering av får oocyter samlas in från juvenil och vuxna givare och mogna in vitro före cryopreservation. Protokollet innehåller alla procedurer från oocyt in vitro mognad till vitrification, uppvärmning och efter uppvärmning kulturperiod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurprotokollet och de genomförda förfaranden som beskrivs nedan är förenliga med de etiska riktlinjer som gäller vid Universitetet i Sassari, i enlighet med Europeiska unionens direktiv 86/609/EG och Europeiska gemenskapernas kommissions rekommendation 2007/526/EG.
1. Förberedelse av media för oocytmanipulation
- Förbered mediet för transport av uppsamlade äggstockar genom att komplettera Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning med 0,1 g/L penicillin och 0,1 g/L streptomycin (PBS).
- Förbered mediet för oocytuppsamling och mognad genom att späda ut 9,5 g vävnadskulturmedium (TCM) 199 i pulver med 1 L Milli-Q-vatten kompletterat med penicillin (0, 1%) och streptomycin (0,1%).
- Efter utspädning, filtrera 100 ml medium och förvara det vid 4 °C som lagermognadsmedium (SMM) som ska användas i en vecka.
- Förbered uppsamlingsmediet (CM) genom att komplettera resterande 900 ml med 25 mM HEPES, 0,36 g/L bikarbonat och 0,1% (w/v) polyvinylalkohol (PVA) (pH 7,3, osmolalitet 290 mOsm/kg).
- Förbered mognadsmediet med SMM kompletterat med 0,021 g/L bikarbonat, 10% värmebehandlat estrusfårserum, 1 IE/ml FSH, 1 IE/mL LH, 100 μL cysteamin och 8 mg/ml pyruvat.
OBS: Mognadsmediet i en volym av 10 ml måste inkuberas vid standardförhållanden (i en maximal fuktad atmosfär vid 39 °C i 5 % CO2 i luft) i minst 4 timmar före användning. - Förbered basmediet (BM) för manipulering av oocyt efter in vitro-mognad, bestående av PBS utan Ca++ och Mg++, kompletterat med 20% fetalt kalvserum (FCS).
2. Insamling och mognad av oocyter
- Återställ äggcellerna från juvenil (30-40 dagar, kroppsvikt 6-10 kg) och vuxna äggstockar.
- Transportera de insamlade äggstockarna från det kommersiella slakteriet till laboratoriet inom 1–2 timmar i PBS vid 27 °C.
- Efter tvättning i PBS färskt medium, skiva äggstockarna i CM med ett mikroblad för att frigöra follikelinnehållet.
- Under en stereomikroskopundersökning med 60x förstoring, välj cumulus-oocytekomplex (COC) för in vitro-mognad genom att välja de med 4-10 lager granulosaceller, oocyt med en enhetlig cytoplasma, homogen fördelning av lipiddroppar i cytoplasman och med ytterdiametern ca 90 μm (medelvärde).
- Tvätta de valda COCs tre gånger i CM och slutligen överföra dem i mognadsmedium.
OBS: För juvenila äggceller, för att förbättra överlevnaden efter vitrifiering, komplettera mognadsmediet med 100 μM trehalos. - För mognad in vitro, överför 30-35 COC i 600 μL mognadsmedium i fyra-brunns Petri-rätter, täckta med 300 μL mineralolja och inkubera dem för 22 (vuxna äggceller)/24 (juvenila äggceller) h i 5% CO2 i luft vid 39 °C.
- Efter in vitro-mognad, förneka COC av cumulusceller genom att försiktigt pipetting. Efter undersökningen under ett stereomikroskop med 60x förstoring, välj endast de som visar extruderingen på den första polära kroppen, och därmed i metafas II (MII) stadium, för vitrification.
3. Insamling, frysning och upptining av sperma
- Förbered basmediet för sperma cryopreservation bestående av ram extender (200 mM Tris; 70 mM citronsyra; 55 mM fruktos; pH 7,2, osmolalitet 300 mOsm/kg) kompletterad med äggula 20% (v/v).
- Samla sperman endast under fåruppfödningssäsongen (oktober-november).
- Få ejakulat av konstgjord vagina från vuxna baggar (i åldern 2-5 år), underhålls i en utomhusmiljö och matas en levande vikt underhåll ranson. Håll rammar isolerade i separata pennor, men med visuell kontakt mellan varandra.
- Upprepa spermasamlingen en i veckan under hela häckningssäsongen för att få minst 8 ejakulater från varje hane.
- Transportera spermaproverna till laboratoriet vid miljötemperatur inom 5 minuter efter uppsamling och bearbeta omedelbart. Slå samman ejakulaterna av två-tre baggar och utvärdera spermiekoncentrationsspektrofotometri.
- Efter poolning, späd ut ejakulates upp till 400 x 106 spermatozoa/ml med basmedium för sperma cryopreservation kompletterat med 4% glycerol. Kyl sedan den utspädda sperman till 4 °C under en period av 2 timmar och jämka den i 20 minuter före frysning.
- Frys spermaproverna i pelletsform (0,25 ml) på torris och doppa dem sedan i flytande kväve.
- För upptining, lägg pelleten i en steriliserad glasfalk och doppa den i ett vattenbad i 20 s vid 39 °C.
4. Befruktning in vitro och embryokultur
- Förbered bestånden för att skapa den syntetiska oviduktalvätskan (SOF).
- Förbered lager A: 99,4 ml MilliQ-vatten; 6,29 g NaCl; 0,534 g KCl; 0,161 g KH2PO4; 0.182 g MgSO4 ·7H2O; och 0,6 ml natriumlaktat. Håll vid 4 °C i upp till 3 månader.
- Förbered lager B: 10 ml MilliQ-vatten; 0,210 g NaHCO3; och 2-3 g fenolrött. Håll dig på 4 °C i 1 månad.
- Förbered lager C: 10 ml MilliQ-vatten; och 0,051 g natrium pyruvat. Håll dig på 4 °C i 1 månad.
- Förbered lager D: 10 ml MilliQ-vatten; och 0,262 g CaCl2 2H2O. Förvaras vid 4 °C i 1 månad.
- Förbered 10 ml SOF bestående av 7,630 ml MilliQ-vatten, 1 ml lager A, 1 ml lager B, 0,07 ml lager C och 0,7 ml lager D.
- Bered in vitro-befruktning (IVF) medium: SOF kompletterat med 2% värmebehandlat eströesrum, 10 μg/ml heparin och 1 μg/mL hypoutarin (osmolalitet 280-290 mOsm/kg).
OBS: IVF-mediet i en volym av 10 ml måste inkuberas vid standardförhållanden (i en maximal fuktad atmosfär vid 39 °C i 5 % CO2,5 % O2 och 90 % N2)minst 4 timmar före användning.
- Överför frysta/tinade sperma alikvoter i ett steriliserat glaskoniskt rör under 1,5 ml varmt IVF-medium och inkubera dem i 15 min vid 39 °C i en fuktad atmosfär vid 5% CO2 i luft.
- Efter inkubation simmar den motila spermatozoa mot den apatiska delen av vätskekolonnen. Samla det översta lagret och observera för spermiemotilitetsutvärdering.
OBS: Parametrar för spermiers motilitet bör bedömas med hjälp av ett datorassisterat spermieanalyssystem (CASA) med följande inställningar: 25 ramar som förvärvats för att undvika spermiespår överlappande, minsta kontrast 10, minsta hastighet på genomsnittlig väg 30 μm/s och progressiv motilitet > 80% rakhet. Detta system har en specifik inställning för ram spermier utvärdering. För varje prov laddas 5 μL delsampel av spermieupphängning i en förvärmd analyskammare med ett djup av 10 μm. Spermiernas motilitet bedöms vid 37 °C vid 40x med hjälp av ett faskontrastmikroskop och minst 500 spermier per delprov bör analyseras i minst fyra olika mikroskopiska fält. Andelen totala motile och progressiva motila spermier utvärderades. För IVF bör andelen progressiv motil spermatozoa vara ≥ 30%. - Späd upp den malila spermatozoa vid 1 x 106 spermatozoa/ml slutlig koncentration och saminkubera dem med MII-äggceller i 300 μL IVF-medium täckt med mineralolja i fyra brunns petriskålar.
- Efter 22 h överföring de presumtiva zygotes i fyra-brunn Petri rätter som innehåller SOF kompletteras med 0,4% nötkreatur serum albumin och väsentliga och icke-essentiella aminosyror vid oviductal koncentration som rapporterasav 16 under mineralolja och odla dem under standardförhållanden fram till blastocyst stadium.
- Vid 22-, 26- och 32- h post-insemination, registrera antalet klyvda äggceller, visar två distinkta blastomeres, genom undersökningen under ett stereomikroskop med 60x förstoring.
- Observera embryona dagligen från den femte till nionde dagen av kulturen och nybildade blastocyster bör registreras av undersökningen under ett stereomikroskop med 60x förstoring.
5. Oocytvitrifiering och uppvärmning
OBS: Utför vitrifiering enligt metoden med minsta väsentliga volym (MEV) med hjälp av enhetens cryotops17.
- Jämvikt en grupp på fem äggceller vid 38,5 °C i 2 minuter i BM. Användningen av BM garanterar en låg kalciumkoncentration ([Ca2++] 2,2 mg/dL)10.
- Dehydrera äggcellerna med en 3 min exponering för jämviktslösning som innehåller 7,5% (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO) och 7,5% (v/v) etylenglykol (EG) i BM.
- Överför äggcellerna till vitrifieringslösningen som innehåller 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG och 0,5 M trehalos i BM innan du laddar dem i en kryotopenhet och direkt störtar dem i flytande kväve inom 30 s.
- För att värma till en biologisk temperatur, överför innehållet i varje vitrifikationsanordning från flytande kväve till 200 μL droppar på 1,25 M trehalos i BM i 1 min vid 38,5 °C och rör försiktigt om för att underlätta blandningen.
- För att främja avlägsnande av intracellulära kryoprotekter, överför äggceller stegvis till 200 μL droppar minskande trehaloslösningar (0, 5 M, 0, 25 M, 0,125 M trehalose i BM) för 30 s vid 38,5 °C innan de jämviktas i 10 min vid 38,5 °C i BM.
6. Bedömning av oocytkvalitet efter uppvärmning
- Efter uppvärmning, inkubera äggcellerna i 6 h i PBS utan Ca++ och Mg++ plus 20% FCS (BM) i 5% CO2 i luft vid 38,5 °C.
OBS: Oocyt förmåga att återställa biologiska och strukturella funktioner efter vitrification är i förhållande till arten och klasserna av använda äggceller. - Eftersom oocyt förmåga att återställa cryopreservation skador är tidsbekymrar, bedöma oocyte kvalitet vid olika tidpunkter för in vitro kultur (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) efter uppvärmning, för att definiera det optimala tidsfönstret för oocyt befruktning.
OBS: Hos vuxna fåroocyt är den optimala tiden 4 timmar efter uppvärmning; för prepubertal oocyt är den optimala tiden 2 timmar efter uppvärmning.
7. Oocyt överlevnadsbedömning
- Omedelbart efter uppvärmning och för varje tidpunkt av eftervärmningskulturen utvärderar morfologiskt oocyter med hjälp av ett inverterat mikroskop med 100x förstoring.
OBS: Oocyter med strukturella förändringar, såsom svag cytoplasma, skadezona pellucida och/eller membran, ska klassificeras som urartade. - Validera membranintegritetsutvärderingen med hjälp av en dubbel differential fluorescerande färgning.
- Inkubera äggcellerna i 2 ml BM som innehåller propidiumididid (PI; 10 μg/ml) och Hoechst 33342 (10 μg/ml) i 5 min i 5 % CO2 i luft vid 38,5 °C.
- Efter att ha tvättat tre gånger i färsk BM, observera äggcellerna under ett fluorescerande mikroskop med hjälp av ett excitationsfilter på 350 nm och utsläpp på 460 nm för Hoechst 33342 och ett excitationsfilter på 535 nm och utsläpp på 617 nm för PI.
OBS: Oocyter med intakt membran kan kännas igen av den blå fluorescensen av färgat DNA med Hoechst 33342. Oocyt med skadade membran visar en röd fluorescens på grund av DNA-färgning med PI.
8. Utvärdering av mitokondriell aktivitet och ROS intracellulära nivåer genom konfokal laserskanningsmikroskopi
- Förbered MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red) sonden.
- Späd ut halten av 1 injektionsflaska (50 μg) med 1 ml DMSO för att få en 1 mM lösning. Förvara den utspädda injektionsflaskan i flytande kväve.
- Späd lösningen 1 mM med DMSO för att få 100 μM lagerlösningen och förvara den vid -80 °C i mörker.
- Förbered 2′,7′-diklordihydrofluoresceindiaktat (H2DCF-DA) sond.
- Späd H2DCF-DA i 0,1% polyvinyl pyrrolidon (PVA)/PBS för att få den första 100 mM lösningen. Håll lösningen vid -80 °C i mörker .
- Späd den första lösningen i 0,1% PVA/PBS för att få 100 μM stamlösning. Förvara den vid -20 °C i mörker.
- Förbered monteringsmediet (MM): för 10 ml MM, tillsätt 5 ml glycerol, 5 ml PBS och 250 mg natriumazid. Förvara den vid -20 °C tills den används.
- Inkubera äggcellerna i 30 min vid 38,5 °C i BM med 500 nM MT-Red (stamlösning: 100 μM i DMSO).
- Efter inkubation med MT-Röd sond, tvätta äggcellerna tre gånger i BM och inkubera i 20 minuter i samma medium som innehåller 5 μM H2DCF-DA (stamlösning: 100 μM i BM).
- Efter exponering för sonderna, tvätta äggcellerna i BM och fixera i 2,5% glutaraldehyd/PBS i minst 15 min.
- Efter fixering, tvätta äggcellerna tre gånger i BM och montera på glasrutschbanor i en 4 μL droppe MM med 1 mg/ml Hoechst 33342 med vaxkuddar för att undvika kompression av prover.
- Förvara diabilderna vid 4 °C i mörker tills de utvärderas.
- Utför analysen av immunolabellerade sektioner med ett konfokalt laserskanningsmikroskop. Mikroskopet är utrustat med Ar/He/Ne-lasrar med hjälp av ett 40/60x oljemål. Analysera avsnitten genom sekventiell excitation.
- För mitokondriell utvärdering, observera proverna med en multifotonlaser för att upptäcka MT-Röd (exponering: 579 nm; utsläpp: 599 nm).
- Använd en argonjonlaserstråle vid 488 nm och B-2 A-filtret (495 nm exponering och 519 nm utsläpp) för att peka ut diklorfluorescein (DCF)18.
- Mät MT-Red och DCF fluorescensintensiteter vid ekvatorialplanet 19 i varje enskildoocyt.
- Underhåll parametrar relaterade till fluorescensintensitet vid konstanta värden under alla bildförvärv (laserenergi 26%, Sekventiella inställningar 1: PMT1 vinst 649-PMT2 vinst 482; Sekventiell inställning 2: PMT1 vinst 625-PMT2 vinst 589; förskjutning 0, pinhole storlek: 68).
- Utför kvantitativ analys av fluorescensintensitet med hjälp av Leica LAS AF Lite bildanalysprogrampaket, enligt procedurerna standardiserade med20.
- Fånga bilderna en gång, flytta på Z-axeln tills du når ekvatorialplanet.
- För varje foto stängdes transformeringen till gråskala och stäng av kanal 1 (relaterad till Hoechst blå). Rita sedan manuellt en region av intresse (ROI) på ett begränsat område, det vill säga runt den meiotiska spindeln.
OBS: Programvaran kan automatiskt läsa pixelgenomsnittet på kanal 2 (FITC), subtrahera värdet på bakgrunden från den. - Registrera medelvärdena för pixlar och skicka in för statistisk analys.
9. Statistiska analyser
- Analysera följande skillnader: överlevnadsgrad i juvenila jämfört med vuxna äggceller, överlevnadsgrad och utvecklingskompetens inom kontroll och trehalosbehandlade juvenila äggceller, överlevnad och delhenogen aktiveringshastigheter och utvecklingskompetens hos vuxna oocyter vitrifierade med olika kalciumkoncentrationsmedier, befruktningshastigheter och embryoproduktion hos unga äggceller vitrified med låg eller hög kalciumkoncentration, aktiva mitokondrier fenotyper hos juvenila vitrified oocyter under olika tidpunkter för eftervärmningskulturen och parthenogenetiska aktiveringshastigheter mellan vuxna och juvenila vitrifierade äggceller med hjälp av chi-kvadrattestet.
- Analysera klyvningshastigheten och embryoproduktionen i förförda vuxna äggceller under olika tidpunkter för eftervärmningskulturen, fluorescensintensiteten hos mitokondriell aktivitet och ROS intracellulära nivåer hos juvenila vitrifierade oocyter under olika tidpunkter för eftervärmningskulturen av ANOVA efter analys för homogenitet av varians genom Levenes test. Använd ett post hoc-test Tukeys test för att markera skillnader mellan och mellan grupper.
- Utför statistisk analys med hjälp av det statistiska programmet och betrakta sannolikheten för P < 0,05 som den minsta signifikansnivån. Alla resultat uttrycks som ± S.E.M.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kryotolerance av oocyte från juvenil givare är lägre jämfört med vuxna. Den första effekten som observeras är en lägre överlevnad efter uppvärmningen jämfört med vuxna äggceller (figur 1A; χ2 test P<0.001). Juvenila äggceller visade en lägre membranintegritet efter uppvärmningen (figur 1B). Användningen av trehalos i mognadsmediet var avsedd att kontrollera om detta socker kunde minska kryoinjuries hos juvenila äggceller. Data har visat23 att oocyter mognat i 24 timmar med trehalose tillskott visade högre överlevnad efter vitrification/uppvärmning jämfört med den icke-behandlade gruppen (Tabell 1:85,7% vs 75,3% respektive; χ2 test P<0,05). Trehalose tillskott var verkligen associerad med högre membran integritet efter uppvärmning (Figur 2A). Användningen av trehalos under in vitro-mognad av juvenila äggceller ökade således överlevnadsgraden efter vitrifiering (85,7%) värden som är jämförbara med vuxna (90,3 %). Klyvning, befruktning och utvecklingshastigheter av juvenila äggceller ökades dock inte genom trehalose tillskott (tabell 1).
För att förbättra oocyt kompetens efter vitrification testade vi i vuxna får oocyter olika vitrification media med kalcium koncentrationer som sträcker sig från 9,9 till 0,4 mg/dL10. Erhållna resultat visade att användningen av medier med kalciumkoncentration motsvarande 2, 2 mg/dL ökade överlevnaden efter uppvärmningen, förbättrad utvecklingskompetens och minskad parthenogen aktivering av vuxen oocyt10 (tabell 2). Vi testade således de låga kalcium vitrification media för vitrification av juvenila äggceller. Såsom framgår av tabell 3visade juvenila äggceller som förstorats med låg kalciumkoncentration högre befruktningsgrad jämfört med äggceller som förstorats med hög kalciumkoncentration (44,35 % respektive 32,29 %. P<0,05), men inga skillnader hittades i embryoproduktionen.
Vitrified/uppvärmda äggceller behöver extra tid före befruktning för att återställa skador på grund av kryopreservation förfaranden och att öka deras utvecklingspotential. En tidigare studie har verkligen visat att ATP intracellulär koncentration, mitokondriell aktivitet och in vitro utvecklingskompetens reduceras i förförda/tinade äggceller, som också visar höga intracellulära ROS koncentrationer6. Dessa förändringar är särskilt markerade omedelbart efter uppvärmning. Under den eftervärmande kulturen kan både vuxna och unga äggceller delvis återhämta sig från de skador som lidits under vitrifieringsförfarandena6,24. Genom att jämföra eftervärmningskulturen med olika varaktigheter (0, 2, 4 och 6 h) visade vi att efter 4 h kulturoocyter som samlats in från vuxna tackor kan återställa den energiskabalansen 6 och mikrotubulärinställning 24 och återställa utvecklingskompetensen med högre klyvning (50,7 ± 3,9%; P< 0,01 ANOVA) och blastocysthastigheter (14,40 ± 1,3%; ANOVA P< 0,01) jämfört med andra tidpunkter (0, 2 och 6 h; Tabell 4). Således representerar 4 h efter uppvärmningskultur det perfekta tidsfönstret för befruktning av vitrified / uppvärmda vuxna äggceller6.
När samma experiment upprepades med äggceller som samlats in från juvenila givare, bekräftades dessa resultat delvis. Mitokondriell aktivitet var högre i vitrified/uppvärmda juvenil äggceller efter 4 h av post-warming kultur jämfört med andra tidpunkter (0, 2, 6; Figur 3: ANOVA P<0.01). Flera mönster för mitokondriell fördelning observeras och klassificeras i följande tre grupper (enligt21 ): Mönster A: homogena FIN med små granuleringar spridda över hela cytoplasman; Mönster B: Homogen GRANULAt med stora granuleringar spridda över hela cytoplasman; Mönster C: heterogena klustrade när särskilt stora granuleringar var närvarande, spridda över hela cytoplasman eller belägna i specifika cytoplasma domäner. De olika fenotyperna i cytoplasm fördelningen av aktiva mitokondriellt i MII kan relateras till oocyte utvecklingskompetens. En fin homogen fördelning är en indikator på dålig utvecklingskompetens medan en granulat- och klusterdistribution är relaterad till en ökad mitokondriverksamhet och därmed högre utvecklingskompetens22. Mitokondriell fördelning mönster ändras under 6 h av post-warming kultur. Figur 4 visar exempel på unga äggceller med olika mönster av mitokondriell fördelning och deras fluktuationer under kulturen efter uppvärmningen. Mönstret En ökning avsevärt under den långvariga inkubationen och når det högre värdet vid 6 h efter uppvärmningen (Figur 4Aa: χ2 P<0.05), mönstret B visade inte signifikanta förändringar under eftervärmningskulturen (Figur 4Bb), mönstret C hittades inte i någon juvenil vitrified / uppvärmd oocyt under den långvariga inkubationen ( Figur4Cc: χ2 P<0.05).
Dessutom var ROS intracellulära nivåer signifikant lägre hos juvenila äggceller vid 2 h av eftervärmningskulturen jämfört med 0, 4 och 6 h (Figur 5:ANOVA P<0.001). Men i motsats till vad som hittades hos vuxna äggceller ökade frekvensen av spontan parthenogenetisk aktivering under den postuppvärmande kulturen hos unga äggceller (figur 6). Av denna anledning skulle den rekommenderade tidpunkten för befruktning i juvenila äggceller vara 2 h efter eftervärmningskulturen.
Figur 1. Överlevnadsgraden för vitrified/uppvärmda får oocyt samlas in från juvenila och vuxna givare. A) Oocyt förstorades efter in vitro mognad. Överlevnaden fastställdes efter vitrifiering och uppvärmning genom fluorescerande färgning med propidiumididid (10 μg/ml) och Hoechst 33342 (10 μg/ml). N = 165 vuxna äggceller och 170 juvenila äggceller. Olika bokstäver indikerar betydande skillnader mellan vuxna och juvenila äggceller: χ2 test P<0.001. (B-C) Exempel på vitrified/uppvärmda juvenila äggceller med intakt (B) och skadat plasmamembran (C) vid morfologisk utvärdering (inverterat mikroskop med 100x förstoring). Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Juvenil får oocyt överlevnad och in vitro utvecklingskompetens efter mognad med (TRH) och utan (CTR) trehalose (100 mM i mognad medium). Jag är inte så bra på att se till att det finns en Exempel på juvenila äggceller vitrified efter in vitro mognad i media kompletteras (A) med eller (B) utan trehalose vid morfologiska utvärdering (inverterat mikroskop med 100x förstoring). Skalstreck = 30 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3. Kvantifiering av aktiv mitokondriell fluorescens intensitet i vitrified/uppvärmda juvenil oocyter vid olika tidpunkter (0, 2, 4, 6) under post-warming in vitro kultur. IVM-äggceller användes som kontroll (CTR N = 77). Totalt 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) juvenila äggceller var förförligade och uppvärmda i tre oberoende experiment. Olika bokstäver indikerar statistiskt signifikanta skillnader (ANOVA P = 0,0000). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. Fördelning av mitokondriellt mönster i vitrified/uppvärmda juvenil äggceller under 6 timmar av post-warming in vitro kultur. Representativa bilder av Fina (A), Granulat (B) och Klustrade (C) mitokondriell distribution i vitrified/uppvärmda juvenila äggceller. D) Procentandel unga förstorade/uppvärmda äggceller som uppvisar en fin mitokondriell fördelning. e) Procentandel unga förstorade/uppvärmda äggceller som uppvisar en granulär mitokondriell fördelning. F) Procentandel unga förstorade/uppvärmda äggceller som uppvisar en klustrad mitokondriell fördelning. IVM juvenila äggceller användes som kontroll (CTR; N = 77). Totalt användes 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) juvenila äggceller vitrified och värms i tre oberoende experiment. Olika bokstäver indikerar statistiskt signifikanta skillnader (Aa: χ2 P = 0,026; Bb: χ2 P = 0,097; Cc: χ2 P = 0,014). Skalstreck = 30 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Kvantifiering av intracellulära ROS fluorescens intensitet i vitrified juvenil äggceller under 6 timmar efter uppvärmning in vitro kultur. Jag är inte så bra på att se till att det finns en Representativa bilder av ROS fluorescens intensitet i in vitro mognade (A) och vitrified (B) juvenila äggceller. C)Intracellulära halter av ROS som bestäms genom kvantifiering av fluorescensintensiteten hos förförligade juvenila äggceller vid olika tidpunkter (0 h N=45; 2 h N=39; 4 h N=40; 6 h N=39) under in vitro-kulturen efter uppvärmningen. In vitro mogna juvenila äggceller användes som en kontroll (CTR N = 77). Olika bokstäver indikerar statistiskt signifikanta skillnader (ANOVA P = 0,0000). Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Parthenogenetic aktivering i vitrified juvenil och vuxna äggceller under 6 timmar av post-warming in vitro kultur. (A-B) Representativa bilder av oocyte parthenogenetic aktivering: (A) oocyt i metafas II-telophase II övergång och (B) pronucleus bildas. C)Procentandelar parthenogenetiska aktiverade vuxna och juvenila äggceller vid olika tidpunkter (0, 2, 4, 6 timmar) under in vitro-kulturen efter uppvärmningen. Asterisker indikerar statistiska skillnader mellan juvenila och vuxna äggceller vid varje inkubationspunkt (ANOVA P = 0,000). Denna siffra har ändrats från Serra et al.24 Skala bar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Äggceller (n) | Överlevnadsgrad (%) | IVF (n) | Befruktad a (%) | Klyvdb (%) | Blastocysterc (%) | |
| Ctr | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| Trh | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * Chi kvadrattest p<0.5 | ||||||
| a Procentsatser beräknas på IVF-äggceller | ||||||
| b Procentsatser beräknas på befruktade äggceller | ||||||
| c Procentsatser beräknas på klyvda äggceller | ||||||
Tabell 1. Juvenila får oocyter överlevnad och in vitro utvecklingsmässiga kompetens efter mognad med och utan trehalose och vitrification. TRH = juvenila äggceller mognade med trehalose tillskott (100 mM i mognad medium). CTR = kontrollera juvenila äggceller mogna utan trehalose tillskott. Överlevnadsfrekvensen fastställdes efter fluorescerande färgning med propidiumidid (10 μg/ml) och Hoechst 33342 (10 μg/mL) av förbenade/uppvärmda äggceller. Oocyte utvecklingskompetens fastställdes efter införlivande i ett in vitro-produktionssystem. a (på alla) Procentsatser beräknas på IVF-äggceller. b Procentsatser beräknas på befruktade äggceller. c Procentsatser beräknas på klyvda äggceller. * χ2 test P<0.5. Denna tabell har ändrats från Berlinguer m.fl.
| grupper | [Ca++] mg/dL | N oocyt | Spontan parthenogenetisk aktivering (%) | Vitrifierade oocyter | Överlevde och IVF-äggceller (%) | Klyvning (%) | Blastocysts utgång (%) |
| TCM/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41,2)a | 150 | 124 (82,7)a | 40 (32,5)a | 2 (1,6)a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35,3)ac | 115 | 88 (76,5)a | 33 (37,5)ae | 1 (1.1)a |
| PBSCaMg gratis/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12,7)b | 126 | 115 (91,3)b | 74 (64,3)b | 12 (10,4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25.3)c | 110 | 90 (81,8)a | 18 (20)c | 0 (0)a |
| PBSCaMg gratis/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11,5)b | 149 | 123 (82,5)a | 57 (46,3)de | 3 (2,4)b |
Tabell 2. Utvecklingskompetens hos in vitro mogna vuxna oocyter vitrified i vitrification media (16,5% etylenglykol + 16,5% dimetylsulfoxid) som innehåller olika kalciumkoncentrationer. Överlevnads- och befruktningsgraden beräknas på förrikade äggceller. totala klyvning och blastocyst priser beräknas på överlevde äggceller. Värden med olika nedsänkta inom samma kolumn skiljer sig avsevärt: χ2 test P<0.05. Denna tabell har ändrats från Succu et al.10
| [Ca 2++] i vitrification media | Lol Äggceller | Överlevnad efter vitrifiering (%) | Befruktningsgrad (%) | Klyvning (%) | Blastocyst utgång (%) |
| Hög [9,9 mg/dL] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| Låg [2,2 mg/dL] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44.35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
Tabell 3. Befruktning och utvecklingshastigheter efter in vitro-befruktning och odling av vitrified/uppvärmd juvenil oocyt med hög ([Ca 2++] = 9,9 mg/dL) och låg ([Ca 2++] = 2,2 mg/dL) kalciumkoncentration i vitrifikationsmedier. Olika bokstäver anger statistisk skillnad (ett ≠ b P<0,05 χ2-test).
| Timmar av inkubation efter uppvärmningen | Klyvningshastighet (n) | Embryoproduktion (n) |
| 0 | 19,2 ± 3 %a (82) | 0 %a (17) |
| 2 | 41,8 ± 3 %b (100) | 6,5 ± 1,3 %b (42) |
| 4 | 50,7 ± 3 %b (92) | 14,4 ± 1,3 %c (48) |
| 6 | 26 ± 3 %a (92) | 0 %a (23) |
Tabell 4. Klyvningshastighet och embryoproduktion i förförda/uppvärmda vuxna äggceller befruktade vid olika tidpunkter för eftervärmningskulturen. Olika bokstäver anger statistisk skillnad inom samma kolumn: ANOVA P<0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oocyte cryopreservation hos husdjur kan inte bara möjliggöra långsiktigt bevarande av kvinnliga genetiska resurser, men också främja utvecklingen av embryonala bioteknik. Utvecklingen av en standardmetod för oocytevitrifiering skulle således gynna både boskapen och forskningssektorn. I detta protokoll presenteras en komplett metod för vuxna får oocyte vitrification och kan representera en solid utgångspunkt för utvecklingen av ett effektivt vitrification system för juvenil äggceller.
En av de främsta fördelarna med den föreslagna metoden är att den innehåller alla steg från oocytsamling, in vitro-mognad, vitrifiering och uppvärmning. Dessutom innehåller det en kulturperiod efter uppvärmningen för att tillåta äggceller att återhämta sig från de skador som uppstod under vitrifieringsförfarandet innan de befruktades. Den optimala tiden för befruktning bör skräddarsys enligt metoden för kryopreservation, initial oocytekvalitet, patientålder och arter, vilket är viktigt för att överväga både aspekter av tidsåterhämtning och oocyt åldrande25,26. Således är det utmanande att välja varaktigheten av inkubationsperioden efter uppvärmningen och det kan påverka resultatet av oocyte vitrification-program. På grundval av de resultat som erhålls i fråga om klyvningshastigheter och embryoproduktion, och under de förhållanden som beskrivs i det framlade protokollet, är den optimala tiden för befruktning av förförda vuxna fåroocyter efter 4 timmars inkubation efter uppvärmningen (tabell 4)6. Denna information är avgörande när du utformar ett oocyte vitrification program.
Detta protokoll ger dock godtagbara resultat när det gäller embryoproduktion från förrikade/uppvärmda vuxna äggceller, men leder fortfarande till låga till noll embryon om de appliceras på juvenila äggceller. Flera strukturella och funktionella begränsningar försämrar prepubertal oocyte utvecklingskompetens, såsom liten storlek, defekt koppling mellan cumulus celler och äggceller, minskning av aminosyra upptag, minskad proteinsyntes och energimetabolism 27,28,29. I en tidigare studie rapporterade vi att prepubertala oocyter visar hög känslighet för vitrification förfarande30. Den låga utvecklingskompetens som visas efter vitrifiering och uppvärmning är förmodligen resultatet av skador på cytoplasma faktorer som är involverade i omorganiseringen av cytoskeleton och (eller) vid aktivering av mognad främja faktor30. Som visas i tabell 1,tillskott av mognadsmediet med trehalose, en icke-genomsläpplig kryoprotectant, kunde öka överlevnaden efter vitrifiering och uppvärmning till värden jämförbara med vuxna äggceller4. På samma sätt ökar användningen av vitrifieringslösning med låga kalciumkoncentrationer befruktningsgraden hos juvenila äggceller efter vitrifiering och uppvärmning, vilket visas i tabell 3. Således kan både optimeringen på odlingsförhållandena under in vitro-mognad och vitrifieringsmediesammansättningen bidra till att öka kvaliteten på juvenil oocyt efter vitrifiering och uppvärmning. Unga äggceller visar viss förmåga att återhämta sig från de skador som orsakas av vitrifieringsförfarandet, vilket visas i figur 3,4 och 5.
De höga frekvenserna av spontan parthenogenetisk aktivering under eftervärmningskulturen begränsar dock fortfarande deras utvecklingspotential. Etylenglykol och DMSO, som ofta används kryoprotektiva medel, kan artificiellt aktivera äggcellen före den faktiska befruktningen, vilket begränsar befruktningsframgången och embryoutvecklingen. De kan verkligen orsaka en övergående ökning av intracellulär Ca2 + koncentration31, vilket utlöser när granulat exocytos, pronukleibildning och meiotisk återupptagande32. Faktum är att vitrifiering på konstgjord väg kan aktivera äggcellen före den faktiska befruktningen, vilket begränsar befruktningsframgången och embryoutvecklingen. Kalcium kelat kan således användas för att ytterligare begränsa kalciumtillgången under vitrifieringsprocessen i syfte att begränsa frekvensen av spontan aktivering hos unga äggceller.
Det bör också anses att vitrifiering, till skillnad från långsam frysning, är en uteslutande manuell teknik och att den därför ärberoende av operatören 33,34. Tillgången till utbildad personal är således en nyckelfaktor för att denna metod ska lyckas. Först och främst måste operatören korrekt välja de äggceller som ska förstoras. Efter IVM dementeras oocyter försiktigt av cumulusceller och utvärderas under ett stereomikroskop för att välja för kryopreservation endast de med en enhetlig cytoplasma, homogen fördelning av lipiddroppar i cytoplasman och med ytterdiametern ca 90 μm. Dessutom måste endast oocyter som visar extruderingen på den första polära kroppen, och därmed på MII-stadiet, väljas.
Den morfologiska utvärderingen av äggcellerna måste slutföras om några minuter och eftersom den är verksamhetsberoende är den mycket känslig för variationer i dess korrekta genomförande. För att hjälpa till att standardisera urvalsförfarandet föreslår metoden att odlingstiden för in vitro-mognad ska begränsas till 22 h för vuxna äggceller. Vid denna tidpunkt har fåroocyter av hög kvalitet redan slutfört den första meiotiska division22 och kan väljas för kryopreservation. På så sätt bör elimineringen av lågkneliga äggceller, som är de långsammaste i slutförandet av den första meiotiska uppdelningen, vara enklare.
Verksamhetsutövaren skall också strikt respektera den tidpunkt som fastställts för vitrifieringsförfarandet, från den första exponeringen för kryoprotekten till nedsänkningen i flytande kväve. Ett annat kritiskt steg är belastningen av äggcellen i den vitrifieringsenhet som används. Förfarandet måste använda minsta provvolymer för att öka kylhastigheten och för att hjälpa celler att snabbt passera genom fasövergångstemperaturen och därigenom minska kryoinjuries35. Cryotop använder en polypropylenremsa fäst vid en hållare. I denna metod laddas äggcellerna i vitrifieringslösningen (<0,1 μL) snabbt med ett glas kapillär ovanpå filmremsan. Sedan måste lösningen avlägsnas och lämna efter sig ett tunt lager som är tillräckligt för att täcka cellerna som ska kryopreserveras. Återigen måste detta steg slutföras så snabbt som möjligt för att begränsa oocyternas exponering för de höga kryoprotektantkoncentrationerna i vitrifieringslösningen, vilket kan orsaka osmotisk chock och är giftiga för cellerna.
Av dessa skäl är en stor utmaning i samband med denna metod behovet av manuell hantering och skicklig tekniker. Andra författare rapporterade att oocyte vitrification resultatet verkar påverkas av en "lärande kurva" effekt, eftersom förvärvet av manuella färdigheter kan avsevärt minska den biologiska skada inducera genom vitrificationförfarande 34. Forskarna bör därför ta hänsyn till "operatörseffekten" vid utvärderingen av resultatet av vitrifieringsförfarandet.
Ytterligare studier kommer att inriktas både på att standardisera oocyte urvalsförfarandet och bättre skräddarsy mediesammansättning och kulturförhållanden till behoven hos de unga äggcellerna. I detta avseende kan både användningen av kalcium kelatator och antioxidanter erbjuda lovande möjligheter. På samma sätt kommer optimeringen av protokollet att göra det möjligt att öka utvecklingskompetensen hos förrikade/uppvärmda vuxna äggceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna fick ingen särskild finansiering för detta arbete. Professor Maria Grazia Cappai och Dr. Valeria Pasciu är tacksamt erkända för videoröstningen och för att ha satt upp labbet under videotillverkningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A.
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).
