Summary
Protokollen tar sikte på å gi en standardmetode for vitrifisering av voksne og unge saueoocytter. Det inkluderer alle trinnene fra utarbeidelsen av in vitro modningsmedier til den etteroppvarmingskulturen. Oocytter er vitrified på MII scenen ved hjelp av Cryotop for å sikre minimum viktig volum.
Abstract
I husdyr kan in vitro embryoproduksjonssystemer utvikles og opprettholdes takket være det store antallet eggstokker og oocytter som lett kan fås fra et slakteri. Voksne eggstokkene bærer alltid flere antralsekkene, mens i pre-pubertal donorer er maksimalt antall oocytter tilgjengelig ved 4 ukers alder, når eggstokkene bærer topp antall antral follikler. Dermed anses 4 uker gamle lam som gode givere, selv om utviklingskompetansen til prepubertal oocytter er lavere sammenlignet med deres voksne motpart.
Grunnleggende forskning og kommersielle applikasjoner ville bli styrket av muligheten for vellykket kryopreservering vitrified oocytter oppnådd fra både voksne og prepubertal givere. Vitrifiseringen av oocytt samlet fra prepubertal donorer ville også tillate å forkorte generasjonsintervallet og dermed øke den genetiske gevinsten i avlsprogrammer. Imidlertid gjør tapet av utviklingspotensial etter kryopreservering pattedyr oocytter sannsynligvis en av de vanskeligste celletypene å kryopreservere. Blant de tilgjengelige kryopreserveringsteknikkene er vitrifisering mye brukt på dyr og menneskelige oocytter. Til tross for nylige fremskritt i teknikken, induserer eksponeringer for høye konsentrasjoner av kryobeskyttende midler samt kjøleskader og osmotisk stress fortsatt flere strukturelle og molekylære endringer og reduserer utviklingspotensialet til pattedyr oocytter. Her beskriver vi en protokoll for vitrifisering av saueoocytter samlet inn fra unge og voksne givere og modnet in vitro før kryopreservering. Protokollen inkluderer alle prosedyrene fra oocytt in vitro modning til vitrifisering, oppvarming og etteroppvarming inkubasjonsperiode. Oocytter vitrifisert på MII-scenen kan faktisk befruktes etter oppvarming, men de trenger ekstra tid før befruktning for å gjenopprette skade på grunn av kryopreserveringsprosedyrer og for å øke utviklingspotensialet. Dermed er postvarmende kulturforhold og timing avgjørende skritt for restaurering av oocytt utviklingspotensial, spesielt når oocytt samles fra ungdomsdonorer.
Introduction
Langsiktig lagring av de kvinnelige gametene kan tilby et bredt spekter av applikasjoner, for eksempel å forbedre husdyravl ved hjelp av genetiske utvalgsprogrammer, bidra til å bevare biologisk mangfold gjennom ex-situ wildlife arts bevaringsprogram, og øke in vitro bioteknologi forskning og applikasjoner takket være tilgjengeligheten av lagrede oocytter som skal innlemmes i in vitro embryo produksjon eller kjernefysisk transplantasjon programmer1,2,3. Juvenil oocytt vitrifisering vil også øke genetisk gevinst ved å forkorte generasjonsintervallet i avlsprogrammer4. Vitrifisering ved ultraraske kjøling og oppvarming av oocytter regnes for tiden som en standard tilnærming for husdyr oocytter kryopreservering5. I drøvtyggere, før vitrifisering, blir oocytter vanligvis modnet in vitro, etter gjenfinning fra follikler hentet fra abattoir-avledede eggstokkene2. Voksen, og spesielt prepubertal eggstokkene4,6, kan faktisk levere et nesten ubegrenset antall oocytter som skal kryopreserveres.
Hos storfe, etter oocytt vitrifisering og oppvarming, blastocyst utbytter på >10% har blitt ofte rapportert av flere laboratorier i løpet av det siste tiåret3. Men i små drøvtyggere er oocytt vitrifisering fortsatt ansett som relativt ny for både juvenile og voksne oocytter, og en standardmetode for sau oocytt vitrifisering gjenstår å etablere2,5. Til tross for nylige fremskritt presenterer den vitrifiserte og varmede oocytten faktisk flere funksjonelle og strukturelle endringer som begrenser deres utviklingspotensial7,8,9. Dermed har få artikler rapportert blastocyst utvikling på 10% eller mer i vitrified / oppvarmet sau oocytter2. Flere tilnærminger har blitt undersøkt for å redusere de ovennevnte endringene: optimalisering av sammensetningen av vitrifiserings- og opptiningsløsningene10,11; eksperimentere med bruk av forskjellige kryo-enheter8,12,13; og bruke spesifikke behandlinger under in vitro modning (IVM)4,14,15 og/eller under restitusjonstiden etter oppvarming6.
Her beskriver vi en protokoll for vitrifisering av saueoocytter samlet inn fra unge og voksne givere og modnet in vitro før kryopreservering. Protokollen inkluderer alle prosedyrene fra oocytt in vitro modning til vitrifisering, oppvarming og post-oppvarming kultur periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokollen og de implementerte prosedyrene beskrevet nedenfor er i samsvar med de etiske retningslinjene som gjelder ved Universitetet i Sassari, i samsvar med EU-direktivet 86/609/EF og anbefaling fra Kommisjonen for De europeiske fellesskap 2007/526/EF.
1. Utarbeidelse av medier for oocyttmanipulering
- Forbered mediet for transport av innsamlede eggstokkene ved å supplere Dulbeccos fosfatbufret saltvann med 0,1 g/l penicillin og 0,1 g/l streptomycin (PBS).
- Forbered mediet for oocyttoppsamling og modning ved å fortynne 9,5 g Tissue Culture Medium (TCM) 199 i pulver med 1 L Milli-Q vann supplert med penicillin (0,1%) streptomycin (0,1 %).
- Etter fortynning, filtrer 100 ml medium og oppbevar det ved 4 °C som lagermodningsmedium (SMM) som skal brukes i en uke.
- Forbered oppsamlingsmediet (CM) ved å supplere de resterende 900 ml med 25 mM HEPES, 0,36 g/l bikarbonat og 0,1 % (w/v) polyvinylalkohol (PVA) (pH 7,3, osmolalitet 290 mOsm/kg).
- Forbered modningsmediet med SMM supplert med 0,021 g/l bikarbonat, 10 % varmebehandlet østrusserum, 1 IE/ml FSH, 1 IE/ml LH, 100 μL cysteamin og 8 mg/ml pyruvat.
MERK: Modningsmediet i et volum på 10 ml må inkuberes ved standardforhold (i en maksimal fuktet atmosfære ved 39 °C i 5 % CO2 i luft) i minst 4 timer før bruk. - Forbered basismediet (BM) for manipulering av oocytt etter in vitro modning, bestående av PBS uten Ca++ og Mg++, supplert med 20% fosterkalvserum (FCS).
2. Oocyte kolleksjon og modning
- Gjenopprett oocyttene fra ungdom (30-40 dager, kroppsvekt 6-10 kg) og voksne eggstokkene.
- Transporter de innsamlede eggstokkene fra det kommersielle slakteriet til laboratoriet innen 1-2 timer i PBS ved 27 °C.
- Etter vask i PBS friskt medium, skjær eggstokkene i CM ved hjelp av et mikroblad for å frigjøre follikkelinnholdet.
- Under en stereomikroskopundersøkelse med 60x forstørrelse, velg cumulus-oocyttkomplekser (COC) for in vitro modning ved å velge de med 4-10 lag granulosa celler, oocytt med en jevn cytoplasma, homogen fordeling av lipiddråper i cytoplasma og med den ytre diameteren på ca 90 μm (gjennomsnitt).
- Vask de valgte COCene tre ganger i CM og overfør dem til slutt i modningsmedium.
MERK: For juvenile oocytter, for å forbedre overlevelsen etter vitrifisering, supplere modningsmediet med 100 μM trehalose. - For in vitro modning, overfør 30-35 COC i 600 μL modningsmedium i fire-brønns Petri-retter, dekket med 300 μL mineralolje og inkuber dem for 22 (voksne oocytter)/24 (juvenile oocytter) h i 5% CO2 i luft ved 39 °C.
- Etter in vitro modning, denude COCs av cumulus celler ved forsiktig pipettering. Etter undersøkelsen under et stereomikroskop med 60x forstørrelse, velg bare de som viser ekstrudering på den første polare kroppen, og dermed på metafase II (MII) stadium, for vitrifisering.
3. Sædoppsamling, frysing og opptining av prosedyrer
- Forbered basismediet for sæd cryopreservation bestående av ramforlenger (200 mM Tris; 70 mM sitronsyre; 55 mM fruktose; pH 7,2, osmolalitet 300 mOsm/kg) supplert med eggeplomme 20% (v / v).
- Samle sæden bare i saueavlsesongen (oktober-november).
- Få ejaklater ved kunstig vagina fra voksne rammer (i alderen 2-5 år), opprettholdt i et utendørs miljø og matet en live-vekt vedlikeholdsrasjon. Hold rammene isolert i separate penner, men med visuell kontakt mellom hverandre.
- Gjenta sædkolleksjonen en i uken i løpet av hele avlssesongen for å få minst 8 ejaklater fra hver mann.
- Transporter sædprøvene til laboratoriet ved miljøtemperatur innen 5 minutter etter innsamling og umiddelbart prosess. Samle utløsningene av to-tre rammer og evaluer sædkonsentrasjonsspektrofotometri.
- Etter sammenslåing fortynner du ejakulerte opptil 400 x 106 spermatozoer/ml med basismedium for sædropopservering supplert med 4% glyserol. Avkjøl deretter den fortynnede sæden til 4 °C over en periode på 2 timer og likevekt den i 20 minutter før frysing.
- Frys sædprøvene i pelletsform (0,25 ml) på tørris og dypp dem deretter i flytende nitrogen.
- For opptining, legg pellet i en sterilisert glassfalk og dypp den i et vannbad i 20 s ved 39 °C.
4. In vitro befruktning og embryokultur
- Forbered lagre for konstitusjon av syntetisk oviduktvæske (SOF).
- Forbered lager A: 99,4 ml MilliQ-vann; 6.29 g NaCl; 0,534 g KCl; 0.161 g KH2PO4; 0,182 g MgSO4 ·7H2O; og 0,6 ml natriumlaktat. Oppbevars ved 4 °C i opptil 3 måneder.
- Forbered lager B: 10 ml MilliQ-vann; 0,210 g NaHCO3; og 2-3 g fenolrød. Oppbevars ved 4 °C i 1 måned.
- Forbered lager C: 10 ml MilliQ-vann; og 0,051 g natriumpyuvatt. Oppbevars ved 4 °C i 1 måned.
- Forbered lager D: 10 ml MilliQ-vann; og 0,262 g CaCl2 2H2O. Oppbevars ved 4 °C i 1 måned.
- Forbered 10 ml SOF bestående av 7.630 ml MilliQ vann, 1 ml lager A, 1 ml lager B, 0,07 ml lager C og 0,7 ml lager D.
- Forbered in vitro befruktning (IVF) medium: SOF supplert med 2% varmebehandlet østrogen fårserum, 10 μg / ml heparin og 1 μg / ml hypoutarine (osmolalitet 280-290 mOsm / kg).
MERK: IVF-mediet i et volum på 10 ml må inkuberes ved standardforhold (i en maksimal fuktet atmosfære ved 39 °C i 5 % CO2,5 % O2 og 90 % N2) minst 4 timer før bruk.
- Overfør frosne/tinte sæd aliquots i et sterilisert glass konisk rør under 1,5 ml oppvarmet IVF medium og inkuber dem i 15 min ved 39 °C i en fuktet atmosfære ved 5 % CO2 i luften.
- Etter inkubasjon svømmer motile spermatozoa mot den apikale delen av væskekolonnen. Samle topplaget og observere for spermmotilitetsevaluering.
MERK: Sædmotilitetsparametere bør vurderes ved hjelp av et dataassistert sædanalysesystem (CASA) med følgende innstillinger: 25 rammer anskaffet for å unngå at sædsporet overlapper, minimum kontrast 10, minimum hastighet på gjennomsnittlig bane 30 μm / s og progressiv motilitet > 80% retthet. Dette systemet har et spesifikt oppsett for ram sperm evaluering. For hver prøve lastes 5 μL undersample av sædfjæring inn i et forvarmet analysekammer med en dybde på 10 μm. Spermmotilitet vurderes ved 37 °C ved 40x ved hjelp av et fasekontrastmikroskop, og minst 500 sæd per subsample bør analyseres i minst fire forskjellige mikroskopiske felt. Prosentandelen av total motil og progressiv motil sæd ble evaluert. For IVF bør prosentandelen av progressiv motil spermatozoa være ≥ 30%. - Fortynn svømmekonsentrasjonen og inkuber dem med MII oocytter i 300 μL IVF-medium dekket med mineralolje i fire-brønns Petri-retter.
- Etter 22 h overføre presumptive zygotes i fire-brønns Petri retter som inneholder SOF supplert med 0,4% bovint serum albumin og essensielle og ikke-essensielle aminosyrer ved oviduktell konsentrasjon som rapportert av16 under mineralolje og kultur dem under standard forhold opp til blastocyst scenen.
- Ved 22-, 26- og 32-timers post-inseminering registrerer du antall spaltede oocytter, som viser to forskjellige blastomerer, ved undersøkelsen under et stereomikroskop med 60x forstørrelse.
- Vær oppmerksom på embryoene daglig fra femte til niende kulturdag, og nyopprettede blastocyster bør registreres ved undersøkelsen under et stereomikroskop med 60x forstørrelse.
5. Oocyte vitrifisering og oppvarming
MERK: Utfør vitrifisering ved hjelp av metoden for minimum viktig volum (MEV) ved hjelp av enhetens kryotop17.
- Likevekt en gruppe på fem oocytter ved 38,5 °C i 2 minutter i BM. Bruk av BM garanterer lav kalsiumkonsentrasjon ([Ca2++] 2,2 mg/dl)10.
- Dehydrer oocyttene med 3 min eksponering for likevektsløsning som inneholder 7,5 % (v/v) dimetylsulfoksid (DMSO) og 7,5 % (v/v) etylenglykol (EG) i BM.
- Overfør oocyttene til vitrifiseringsløsningen som inneholder 16,5 % (v/v) DMSO, 16,5 % (v/v) EG og 0,5 M trehalose i BM før du laster dem i en kryotopenhet og kaster dem direkte inn i flytende nitrogen innen 30 s.
- For å varme opp til en biologisk temperatur, overfør innholdet i hver vitrifiseringsenhet fra flytende nitrogen til 200 μL dråper på 1,25 M trehalose i BM i 1 min ved 38,5 °C, og rør forsiktig for å lette blandingen.
- For å fremme fjerning av intracellulære kryotokektanter, overfør oocytter trinnvis til 200 μL dråper avtagende trehaloseløsninger (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M trehalose i BM) i 30 s ved 38,5 °C før de blir likevektet i 10 min ved 38,5 °C i BM.
6. Vurdering av oocyttkvalitet etter oppvarming
- Etter oppvarming, inkuber oocyttene i 6 timer i PBS uten Ca++ og Mg++ pluss 20% FCS (BM) i 5% CO2 i luft ved 38,5 °C.
MERK: Oocytt evnen til å gjenopprette biologiske og strukturelle egenskaper etter vitrifisering er i forhold til arter og klasser av brukte oocytter. - Siden oocytt evnen til å gjenopprette kryopreserveringsskader er tidssensant, vurder oocyttkvalitet på forskjellige tidspunkter for in vitrokultur (0 t, 2 t, 4 t, 6 h) etter oppvarming, for å definere det optimale tidsvinduet for oocyttbefruktning.
MERK: Hos voksne sauer oocytt er den optimale tiden 4 timer etter oppvarming; For prepubertal oocytt er den optimale tiden 2 timer etter oppvarming.
7. Oocyte overlevelsesvurdering
- Umiddelbart etter oppvarming og for hvert tidspunkt etter oppvarmingskulturen, evaluerer morfologisk oocytter ved hjelp av et invertert mikroskop med 100x forstørrelse.
MERK: Oocytter med strukturelle endringer, som svak cytoplasma, skade zona pellucida og/eller membran bør klassifiseres som degenerert. - Valider membranintegritetsevalueringen ved hjelp av en dobbel differensialfluorescerende farging.
- Inkuber oocyttene i 2 ml BM som inneholder propidiumjodid (PI; 10 μg/ml) og Hoechst 33342 (10 μg/ml) i 5 minutter i 5 % CO2 i luft ved 38,5 °C.
- Etter å ha vasket tre ganger i fersk BM, observere oocyttene under et fluorescerende mikroskop ved hjelp av et eksitasjonsfilter på 350 nm og utslipp på 460 nm for Hoechst 33342 og et eksitasjonsfilter på 535 nm og utslipp på 617 nm for PI.
MERK: Oocytter med intakt membran kan gjenkjennes av den blå fluorescensen av farget DNA med Hoechst 33342. Oocytt med skadede membraner viser rød fluorescens på grunn av DNA-farging med PI.
8. Evaluering av mitokondrieaktivitet og ROS intracellulære nivåer ved konfikal laserskanningsmikroskopi
- Klargjør MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red)-proben.
- Fortynn innholdet av 1 hetteglass (50 μg) med 1 ml DMSO for å oppnå en 1 mM løsning. Oppbevar det fortynnede hetteglasset i flytende nitrogen.
- Fortynn oppløsningen 1 mM med DMSO for å oppnå 100 μM lagerløsning og lagre den ved -80 °C i mørket.
- Forbered 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) sonde.
- Fortynn H2DCF-DA i 0,1% polyvinylpyrofin (PVA)/PBS for å oppnå den første 100 mM-løsningen. Hold oppløsningen ved -80 °C i mørket .
- Fortynn den første løsningen i 0,1% PVA / PBS for å oppnå 100 μM lagerløsning. Oppbevar den ved -20 °C i mørket.
- Forbered monteringsmediet (MM): For 10 ml MM, tilsett 5 ml glyserol, 5 ml PBS og 250 mg natriumazid. Oppbevar den ved -20 °C til bruk.
- Inkuber oocyttene i 30 min ved 38,5 °C i BM med 500 nM MT-Rød (lagerløsning: 100 μM i DMSO).
- Etter inkubasjon med MT-Red-sonde, vask oocyttene tre ganger i BM og inkuber i 20 min i samme medium som inneholder 5 μM H2DCF-DA (lagerløsning: 100 μM i BM).
- Etter eksponering for sondene, vask oocyttene i BM og fest i 2,5% glutaraldehyd / PBS i minst 15 minutter.
- Etter fiksering, vask oocyttene tre ganger i BM og monter på glasssklier i en 4 μL dråpe MM med 1 mg / ml Hoechst 33342 ved hjelp av voksputer for å unngå kompresjon av prøver.
- Oppbevar sklier ved 4 °C i mørket til evaluering.
- Utfør analysen av immunmerkede seksjoner med et konfokalt laserskanningsmikroskop. Mikroskopet er utstyrt med Ar/He/Ne-lasere, med et 40/60x oljemål. Analyser inndelingene etter sekvensiell eksitasjon.
- For mitokondrieevaluering, følg prøvene med en multifotonlaser for å oppdage MT-Rød (eksponering: 579 nm; utslipp: 599 nm).
- Bruk en argon ioner laserstråle ved 488 nm og B-2 A-filteret (495 nm eksponering og 519 nm utslipp) for å påpeke dichlorofluorescein (DCF)18.
- I hver enkelt oocytt måler du MT-Red- og DCF-fluorescensintensiteter ved ekvatorialplanet19.
- Oppretthold parametere relatert til fluorescensintensitet ved konstante verdier under alle bildeanskaffelser (laserenergi 26%, Sekvensielle innstillinger 1: PMT1 gain 649-PMT2 gain 482; Sekvensiell innstilling 2: PMT1 få 625-PMT2 få 589; forskyvning 0; pinhole størrelse: 68).
- Utfør kvantitativ analyse av fluorescensintensitet ved hjelp av Leica LAS AF Lite programvarepakken for bildeanalyse, etter prosedyrene som er standardisert av20.
- Ta bildene en gang, beveger seg på Z-aksen, til du når ekvatorialplanet.
- For hvert bilde ble transformering til gråtoner og deaktiver kanal 1 (relatert til Hoechst blå) slått av. Tegn deretter manuelt et område av interesse (ROI) på et omskåret område, som er rundt den meiotiske spindelen.
MERK: Programvaren kan automatisk lese pikselgjennomsnittsverdien på kanal 2 (FITC), og trekke verdien av bakgrunnen fra den. - Registrer gjennomsnittsverdiene for piksler, og send inn for statistisk analyse.
9. Statistiske analyser
- Analyser følgende forskjeller: overlevelsesrater hos juvenile vs voksne oocytter, overlevelsesrater og utviklingskompetanse i kontroll- og trehalosebehandlede juvenile oocytter, overlevelses- og parthenogenetiske aktiveringsrater og utviklingskompetanse hos voksne oocytter vitrifisert med forskjellige kalsiumkonsentrasjonsmedier, befruktningsrater og embryoproduksjon hos juvenile oocytter vitrifisert med lav eller høy kalsiumkonsentrasjon, aktive mitokondrier fenotyper i juvenile vitrified oocytter under ulike tidspunkter for postvarmende kultur og parthenogenetiske aktiveringshastigheter mellom voksne og juvenile vitrified oocytter ved hjelp av kjikvadrattesten.
- Analyser spaltingshastigheten og embryoutgangen i vitrifiserte voksne oocytter under forskjellige tidspunkter for etteroppvarmingskultur, fluorescensintensiteten av mitokondrieaktivitet og ROS-intracellulære nivåer i juvenile vitrifiserte oocytter under forskjellige tidspunkter for etteroppvarmingskultur av ANOVA etter analyse for homogenitet av varians etter Levenes test. Bruk en tukey-test etter hoc-testen for å fremheve forskjeller mellom og mellom grupper.
- Utføre statistisk analyse ved hjelp av det statistiske programmet og vurdere en sannsynlighet for at P < 0,05 er det minste signifikansnivået. Alle resultater uttrykkes som gjennomsnittlig ± S.E.M.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kryotoleransen av oocytt fra ungdomsdonorer er lavere sammenlignet med voksne. Den første effekten som observeres er en lavere overlevelsesrate etter oppvarming sammenlignet med voksne oocytter (Figur 1A; χ2 test P<0,001). Juvenile oocytter viste lavere membranintegritet etter oppvarming (Figur 1B). Bruken av trehalose i modningsmediet var ment å verifisere om dette sukkeret kunne redusere kryoinjuries i juvenile oocytter. Dataene har vist23 at oocytter modnet i 24 timer med trehalosetilskudd viste høyere overlevelsesrate etter vitrifisering/oppvarming sammenlignet med den ikke-behandlede gruppen (Tabell 1: 85,7% vs 75,3% henholdsvis; χ2 test P<0,05). Trehalosetilskudd var faktisk forbundet med høyere membranintegritet etter oppvarming (figur 2A). Dermed økte bruken av trehalose under in vitro modning av juvenile oocytter overlevelsesraten etter vitrifisering (85,7%) verdier som kan sammenlignes med voksne (90,3 %). Spalting, befruktning og utviklingsrater av juvenile oocytter ble imidlertid ikke økt ved trehalosetilskudd (tabell 1).
For å forbedre oocyttkompetansen etter vitrifisering testet vi i voksne ovin oocytter forskjellige vitrifiseringsmedier med kalsiumkonsentrasjoner fra 9,9 til 0,4 mg / dl10. Oppnådde resultater viste at bruk av medier med kalsiumkonsentrasjon lik 2,2 mg/dl økte overlevelsesraten etter oppvarming, forbedret utviklingskompetanse og redusert parthenogenetisk aktivering av voksen oocytt10 (tabell 2). Vi testet dermed de lave kalsium vitrifiseringsmediene for vitrifisering av juvenile oocytter. Som vist i tabell 3viste juvenile oocytter vitrifisert med lav kalsiumkonsentrasjon høyere befruktningshastighet sammenlignet med oocytter vitrifisert med høy kalsiumkonsentrasjon (henholdsvis 44,35% vs. 32,29 %; P<0,05), men det ble ikke funnet forskjeller i embryoproduksjon.
Vitrified / oppvarmede oocytter trenger ekstra tid før befruktning for å gjenopprette skade på grunn av kryopreserveringsprosedyrer og for å øke utviklingspotensialet. En tidligere studie har faktisk vist at ATP intracellulær konsentrasjon, mitokondrieaktivitet og in vitro utviklingskompetanse reduseres i vitrified / tinte oocytter, som også viser høye intracellulære ROS-konsentrasjoner6. Disse endringene er spesielt merket umiddelbart etter oppvarming. Under etteroppvarmingskulturen kan både voksne og juvenile oocytter delvis gjenopprette fra skadene som ble påført under vitrifiseringsprosedyrene6,24. Ved å sammenligne postvarmende kultur av forskjellige varigheter (0, 2, 4 og 6 t), viste vi at etter 4 h kulturoocytter samlet fra voksne ewes er i stand til å gjenopprette den energiske balansen6 og mikrotubulær oppsett24 og å gjenopprette utviklingskompetansen med høyere spalting (50,7 ± 3,9%; P< 0,01 ANOVA) og blastocyst priser (14,40 ± 1,3%; ANOVA P< 0,01) sammenlignet med andre tidspoeng (0, 2 og 6 t; Tabell 4). Dermed representerer 4 t etteroppvarmingskultur det ideelle tidsvinduet for befruktning av vitrifisert / oppvarmet voksen oocytter6.
Da det samme eksperimentet ble gjentatt med oocytter samlet inn fra ungdomsdonorer, ble disse resultatene delvis bekreftet. Mitokondrieaktiviteten var høyere i vitrifiserte/oppvarmede juvenile oocytter etter 4 timer etter oppvarmingskultur sammenlignet med andre tidspunkter (0, 2, 6; Figur 3: ANOVA P<0,01). Flere mønstre av mitokondriefordeling observeres og klassifiseres i følgende tre grupper (som rapportert av21 ): Mønster A: homogen FINE med små granuleringer spredt over cytoplasma; Mønster B: homogen GRANULAR med store granuleringer spredt over cytoplasma; Mønster C: heterogen CLUSTERED når spesielt store granulater var til stede, spredt over cytoplasma eller plassert i spesifikke cytoplasmatiske domener. De ulike fenotypene i cytoplasmafordelingen av aktiv mitokondrie i MII kan relateres til oocyttutviklingskompetanse. En FIN homogen fordeling er en indikator på dårlig utviklingskompetanse, mens en GRANULÆR og CLUSTERED-fordeling er relatert til økt mitokondrieraktivitet og dermed høyere utviklingskompetanse22. Mitokondriefordelingsmønstre endret seg under 6 timer etter oppvarmingskulturen. Figur 4 viser eksempler på at juvenile oocytter har forskjellige mønstre av mitokondriefordeling og deres svingninger under etteroppvarmingskulturen. Mønsteret En økning betydelig under langvarig inkubasjon og når den høyeste verdien ved 6 timer etter oppvarming (Figur 4Aa: χ2 P<0,05), viste mønsteret B ikke signifikante endringer under etter-oppvarmingskultur (Figur 4Bb), ble mønsteret C ikke funnet i noen juvenile vitrifisert/oppvarmet oocytt under langvarig inkubasjon (Figur 4Cc: χ2 P<0,05).
Videre var ROS intracellulære nivåer betydelig lavere i juvenile oocytter ved 2 t etter oppvarmingskultur sammenlignet med 0, 4 og 6 timer (Figur 5: ANOVA P<0,001). Men i motsetning til det som ble funnet i voksne oocytter, økte frekvensen av spontan parthenogenetisk aktivering under postvarmekulturen i juvenile oocytter (Figur 6). Av denne grunn vil det anbefalte tidspunktet for befruktning i juvenile oocytter være 2 timer etter den ettervarmende kulturen.
Figur 1. Overlevelsesraten for vitrifisert/oppvarmet eggstokkoocytt samlet inn fra ungdoms- og voksne donorer. (A) Oocytt ble vitrifisert etter in vitro modning. Overlevelsesraten ble bestemt etter vitrifisering og oppvarming ved fluorescerende farging med propidiumjodid (10 μg/ml) og Hoechst 33342 (10 μg/ml). N = 165 voksne oocytter og 170 juvenile oocytter. Ulike bokstaver indikerer signifikante forskjeller mellom voksne og juvenile oocytter: χ2 test P<0.001. (B-C) Eksempler på vitrifiserte/oppvarmede juvenile oocytter med intakt (B) og skadet plasmamembran (C) ved morfologisk evaluering (invertert mikroskop med 100x forstørrelse). Skalalinje = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Juvenil ovin oocyttoverlevelse og in vitro utviklingskompetanse etter modning med (TRH) og uten (CTR) trehalose (100 mM i modningsmedium). (A-B) Eksempler på juvenile oocytter vitrifisert etter in vitro modning i medier supplert (A) med eller (B) uten trehalose ved morfologisk evaluering (invertert mikroskop med 100x forstørrelse). Skalalinje = 30 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Kvantifisering av aktiv mitokondriefluorescensintensitet i vitrifiserte/oppvarmede juvenile oocytter på forskjellige tidspunkter (0, 2, 4, 6) under postvarmende in vitrokultur. IVM oocytter ble brukt som en kontroll (CTR N = 77). Totalt 163 (0 h N = 45; 2 t N = 39; 4 t N = 40; 6 h N = 39) juvenile oocytter ble vitrifisert og oppvarmet i tre uavhengige eksperimenter. Ulike bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller (ANOVA P = 0,0000). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Distribusjon av mitokondriemønster i vitrifiserte/oppvarmede juvenile oocytter i løpet av 6 timer etter oppvarming av in vitrokultur. Representative bilder av Fine (A), Granular (B) og Clustered (C) mitokondrie distribusjon i vitrified / oppvarmet juvenile oocytter. (D) Prosentandel av juvenile vitrifiserte/oppvarmede oocytter som viser en fin mitokondriefordeling; (E) Prosentandel av juvenile vitrifiserte/oppvarmede oocytter som viser en granulær mitokondriefordeling; (F) Prosentandel av juvenile vitrifiserte/oppvarmede oocytter som viser en klynget mitokondriefordeling. IVM juvenile oocytter ble brukt som kontroll (CTR; N = 77). Totalt 163 (0 h N = 45; 2 t N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) juvenile oocytter vitrifisert og oppvarmet i tre uavhengige eksperimenter ble brukt. Ulike bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller (Aa: χ2 P = 0,026; Bb: χ2 P = 0,097; Kopi: χ2 P = 0,014). Skalalinje = 30 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Kvantifisering av intracellulær ROS fluorescensintensitet i vitrifiserte juvenile oocytter i løpet av 6 timer etter oppvarming av in vitrokultur. (A-B) Representative bilder av ROS fluorescensintensitet i in vitro modnet (A) og vitrified (B) juvenile oocytter. (C) Intracellulære nivåer av ROS som bestemt ved kvantifisering av fluorescensintensitet i vitrifiserte juvenile oocytter på forskjellige tidspunkter (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) under postoppvarming in vitro kultur. In vitro modnede juvenile oocytter ble brukt som en kontroll (CTR N = 77). Ulike bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller (ANOVA P = 0,0000). Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Parthenogenetisk aktivering i vitrified juvenile og voksne oocytter i løpet av 6 timer etter oppvarming in vitro kultur. (A-B) Representative bilder av oocytt parthenogenetisk aktivering: (A) oocytt i metafase II-telophase II overgang og (B) pronucleus formasjon. (C) Prosentandeler av parthenogenetisk aktivert voksen og juvenile oocytter på forskjellige tidspunkter (0, 2, 4, 6 h) under post-oppvarming in vitro kultur. Stjerner indikerer statistiske forskjeller mellom juvenile og voksne oocytter ved hvert inkuberingspunkt (ANOVA P = 0,000). Denne figuren er endret fra Serra et al.24 Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Oocytter (n) | Overlevelsesrate (%) | IVF (n) | Befrukteten (%) | Spaltetb (%) | Blastocystsc (%) | |
| Ctr | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| Trh | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * Chi firkantet test p<0,5 | ||||||
| en prosenter beregnes på IVF oocytter | ||||||
| b Prosenter beregnes på befruktede oocytter | ||||||
| c Prosenter beregnes på spaltede oocytter | ||||||
Tabell 1. Juvenile ovine oocytter overlevelsesraten og in vitro utviklingskompetanse etter modning med og uten trehalose og vitrifisering. TRH = juvenile oocytter modnet med trehalosetilskudd (100 mM i modningsmedium). CTR = kontroll juvenile oocytter modnet uten trehalosetilskudd. Overlevelsesraten ble bestemt etter fluorescerende farging med propidiumjodid (10 μg/ml) og Hoechst 33342 (10 μg/ml) vitrifiserte/oppvarmede oocytter. Oocyte utviklingskompetanse ble bestemt etter innlemmelse i et in vitro produksjonssystem. a Prosenter beregnes på IVF-oocytter. b Prosenter beregnes på befruktede oocytter. c Prosenter beregnes på spaltede oocytter. * χ2 test P<0,5. Denne tabellen er endret fra Berlinguer et al.23
| Grupper | [Ca++] mg/dl | N oocytt | Spontan parthenogenetisk aktivering (%) | Vitrifiserte oocytter | Overlevde og IVF oocytter (%) | Spalting (%) | Blastocysts utgang (%) |
| TCM/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41,2)a | 150 | 124 (82,7)a | 40 (32,5)a | 2 (1,6)a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35,3)ac | 115 | 88 (76,5)a | 33 (37,5)ae | 1 (1.1)a |
| PBSCaMg gratis/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12.7)b | 126 | 115 (91.3)b | 74 (64,3)b | 12 (10.4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25.3)c | 110 | 90 (81,8)a | 18 (20)c | 0 (0)a |
| PBSCaMg gratis/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11.5)b | 149 | 123 (82,5)a | 57 (46.3)de | 3 (2.4)b |
Tabell 2. Utviklingskompetanse for in vitro modnede voksne oocytter vitrifisert i vitrifiseringsmedier (16,5% etylenglykol + 16,5% dimetylsulfoksid) som inneholder forskjellige kalsiumkonsentrasjoner. Overlevelses- og befruktningsrater beregnes på vitrifiserte oocytter; totale spaltings- og blastocystrater beregnes på overlevde oocytter. Verdier med forskjellig senket skrift i samme kolonne er signifikant forskjellige: χ2 test P<0,05. Denne tabellen er endret fra Succu et al.10
| [Ca 2++] i vitrifiseringsmedier | Nei. Oocytter | Overlevelsesrate etter vitrifisering (%) | Gjødsel (%) | Spalting (%) | Blastocyst-utgang (%) |
| Høy [9,9 mg/dl] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| Lav [2,2 mg/dl] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44,35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
Tabell 3. Gjødsel og utviklingsrater etter in vitro befruktning og kultur av vitrifisert/oppvarmet juvenil oocytt ved bruk av høy ([Ca 2++] = 9,9 mg/dl) og lav ([Ca 2++] = 2,2 mg/dl) kalsiumkonsentrasjon i vitrifiseringsmedier. Ulike bokstaver indikerer statistisk forskjell (en ≠ b P<0,05 χ2 test).
| Timer med etteroppvarming inkubasjon | Spaltingshastighet (n) | Embryo utgang (n) |
| 0 | 19,2 ± 3 %a (82) | 0 %a (17) |
| 2 | 41,8 ± 3 %b (100) | 6,5 ± 1,3 %b (42) |
| 4 | 50,7 ± 3 %b (92) | 14,4 ± 1,3 %c (48) |
| 6 | 26 ± 3 %a (92) | 0 %a (23) |
Tabell 4. Spaltingshastighet og embryoutgang i vitrifiserte/oppvarmede voksne oocytter befruktet på forskjellige tidspunkter for etteroppvarmingskulturen. Ulike bokstaver angir statistisk forskjell i samme kolonne: ANOVA P<0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oocyte kryopreservering hos husdyr kan tillate ikke bare langsiktig bevaring av kvinnelige genetiske ressurser, men også fremme utviklingen av embryonale bioteknologier. Dermed vil utviklingen av en standardmetode for oocytt vitrifisering være til nytte for både husdyr og forskningssektoren. I denne protokollen presenteres en komplett metode for voksen sau oocytt vitrifisering og kan representere et solid utgangspunkt for utvikling av et effektivt vitrifiseringssystem for ungdomsoocytt.
En av de viktigste fordelene med den foreslåtte metoden er at den inkluderer alle trinnene fra oocyttsamling, in vitro modning, vitrifisering og oppvarming. Videre inkluderer det en post-oppvarming kulturperiode for å tillate oocytter å komme seg fra skadene som oppstår under vitrifiseringsprosedyren før de befruktes. Den optimale tiden for befruktning bør skreddersys i henhold til metoden for kryopreservering, innledende oocyttkvalitet, pasientalder og arter, og er avgjørende for å vurdere både aspekter av tidsgjenoppretting og oocytt aldring25,26. Dermed er det utfordrende å velge varigheten av inkubasjonsperioden etter oppvarming, og det kan påvirke utfallet av oocytt vitrifiseringsprogrammer. Basert på resultatene oppnådd i form av spaltingshastigheter og embryoutgang, og under forholdene beskrevet i den presenterte protokollen, er den optimale tiden for befruktning av vitrifiserte voksne sauer oocytter etter 4 timer etter oppvarming inkubasjon (Tabell 4)6. Denne informasjonen er avgjørende når du designer et oocytt vitrifiseringsprogram.
Denne protokollen, men mens den gir akseptable resultater når det gjelder embryoutgang fra vitrifiserte / oppvarmede voksne oocytter, fører det fortsatt til lave til null embryoer hvis de brukes på juvenile oocytter. Flere strukturelle og funksjonelle begrensninger svekker prepubertal oocytt utviklingskompetanse, for eksempel liten størrelse, defekt kobling mellom cumulusceller og oocytter, reduksjon i aminosyreopptak, redusert proteinsyntese og energimetabolisme 27,28,29. I en tidligere studie rapporterte vi at prepubertal oocytter viser høy følsomhet for vitrifiseringsprosedyren30. Den lave utviklingskompetansen vist etter vitrifisering og oppvarming er sannsynligvis et resultat av skader på cytoplasmatiske faktorer involvert i omorganiseringen av cytoskjelettet og (eller) i aktiveringen av modning som fremmer faktor30. Som vist i tabell 1, var tilskudd av modningsmediet med trehalose, et ikke-gjennomtrengelig kryoprekt middel, i stand til å øke overlevelsesraten etter vitrifisering og oppvarming til verdier som kan sammenlignes med verdiene til voksne oocytter4. På samme måte øker bruken av vitrifiseringsløsning med lave kalsiumkonsentrasjoner befruktningsgraden av juvenile oocytter etter vitrifisering og oppvarming, som vist i tabell 3. Dermed kan både optimaliseringen på kulturforhold under in vitro modning og av vitrifiseringsmediesammensetningen bidra til å øke kvaliteten på ungdomsoocytten etter vitrifisering og oppvarming. Juvenile oocytter viser noen evne til å gjenopprette fra skadene forårsaket av vitrifiseringsprosedyren, som vist i figur 3, 4 og 5.
Imidlertid begrenser de høye frekvensene av spontan parthenogenetisk aktivering under etteroppvarmingskulturen fortsatt deres utviklingspotensial. Etylenglykol og DMSO, som ofte brukes kryobeskyttende midler, kan kunstig aktivere oocytten før selve befruktningen, og dermed begrense befruktningssuksess og embryoutvikling. De kan faktisk forårsake en forbigående økning i intracellulær Ca2 + konsentrasjon31, og dermed utløse kortikale granulat exocytosis, pronuclei formasjon og meiotisk gjenopptakelse32. Faktisk kan vitrifisering kunstig aktivere oocytten før selve befruktningen, og dermed begrense befruktningssuksess og embryoutvikling. Kalsiumchelator kan dermed brukes til å ytterligere begrense kalsiumtilgjengeligheten under vitrifiseringsprosessen med sikte på å begrense frekvensen av spontan aktivering i juvenile oocytter.
Det bør også vurderes at, i motsetning til langsom frysing, er vitrifisering en utelukkende manuell teknikk, og det er dermed operatøravhengig33,34. Dermed er tilgjengeligheten av opplært personell en nøkkelfaktor for suksessen til denne metoden. Først av alt må operatøren velge oocyttene som skal vitrifiseres. Etter IVM blir oocytter forsiktig denuded av cumulus celler og evaluert under et stereomikroskop for å velge for kryopreservering bare de med en jevn cytoplasma, homogen fordeling av lipiddråper i cytoplasma og med den ytre diameteren på ca 90 μm. Videre må bare oocytter som viser ekstrudering på den første polare kroppen, og dermed på MII-scenen, velges.
Den morfologiske evalueringen av oocyttene må fullføres om noen få minutter og være operatøravhengig, det er svært følsomt for variasjoner i riktig implementering. For å bidra til å standardisere utvelgelsesprosedyren foreslår metoden å begrense kulturtiden for in vitro modning til 22 timer for voksne oocytter. På dette tidspunktet har sauoocytter av høy kvalitet allerede fullført den første meiotiske divisjonen22 og kan velges for kryopreservering. På denne måten bør eliminering av lavkvalitets oocytter, som er de tregeste i ferdigstillelsen av den første meiotiske divisjonen, være enklere.
Operatøren må også respektere tidspunktet som er angitt for vitrifiseringsprosedyren, fra den første eksponeringen til kryopreotektanten til nedsenking i flytende nitrogen. Et annet kritisk trinn er lasting av oocytten i vitrifiseringsenheten som brukes. Prosedyren må bruke minimum prøvevolum for å øke kjølehastigheten og for å hjelpe cellene til å passere gjennom faseovergangstemperaturen raskt, og dermed redusere kryoinjuries35. Cryotop bruker en polypropylenstrimmel festet til en holder. I denne metoden er oocyttene i vitrifiseringsløsningen (<0,1 μL) raskt lastet med en glasskapillær på toppen av filmstripen. Deretter må løsningen fjernes, og etterlater et tynt lag som er tilstrekkelig til å dekke cellene som skal kryopreservert. Nok en gang må dette trinnet fullføres så raskt som mulig for å begrense eksponeringen av oocyttene til de høye kryotopektantkonsentrasjonene av vitrifiseringsløsningen, noe som kan forårsake osmotisk sjokk og er giftige for cellene.
Av disse grunnene er en stor utfordring knyttet til denne metoden behovet for manuell håndtering og dyktig tekniker. Andre forfattere rapporterte at oocytt vitrifiseringsresultatet virker påvirket av en "læringskurve" -effekt, da oppkjøpet av manuelle ferdigheter kan redusere den biologiske skaden som induseres betydelig av vitrifiseringsprosedyren34. Forskeren bør derfor ta hensyn til "operatøreffekten" i evalueringen av utfallet av vitrifiseringsprosedyren.
Videre studier vil fokusere både på å standardisere oocyttvalgsprosedyren og bedre skreddersy mediesammensetning og kulturforhold til behovene til ungdomsoocyttene. I denne forbindelse kan både bruk av kalsiumchelator og antioksidanter gi lovende muligheter. På samme måte vil optimaliseringen av protokollen tillate å øke utviklingskompetansen til vitrifiserte / oppvarmede voksne oocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne fikk ingen konkrete midler til dette arbeidet. Professor Maria Grazia Cappai og Dr. Valeria Pasciu er takknemlig anerkjent for video voiceover og for å sette opp laboratoriet under videoproduksjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A.
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).
