Summary
Formålet med protokollen er at tilvejebringe en standardmetode til vitrificering af voksne og unge fårekød. Det omfatter alle trin fra forberedelsen af in vitro-modningsmedierne til kulturen efter opvarmningen. Oocytter er forglasset på MII-stadiet ved hjælp af Cryotop for at sikre den minimale væsentlige volumen.
Abstract
I husdyr kan in vitro-embryoproduktionssystemer udvikles og opretholdes takket være det store antal æggestokke og oocytter, der let kan fås fra et slagteri. Voksne æggestokke bærer altid flere antral follikler, mens der i præ-pubertale donorer er det maksimale antal oocytter tilgængelige ved 4 uger, når æggestokke bærer det højeste antal antral follikler. Således betragtes 4 uger gamle lam som gode donorer, selvom den udviklingsmæssige kompetence prepubertal oocytter er lavere sammenlignet med deres voksne modstykke.
Grundforskning og kommercielle anvendelser vil blive styrket af muligheden for med succes cryopreserving vitrified oocytter opnået fra både voksne og prepubertal donorer. Vitrificeringen af oocyt indsamlet fra prepubertal donorer vil også gøre det muligt at forkorte generation intervallet og dermed øge den genetiske gevinst i avlsprogrammer. Men tabet af udviklingspotentiale efter kryopræservering gør pattedyr oocytter sandsynligvis en af de sværeste celletyper at cryopreserve. Blandt de tilgængelige kryopræserveringsteknikker anvendes vitrificering bredt på dyre- og humane oocytter. På trods af de seneste fremskridt i teknikken fremkalder eksponering for høje koncentrationer af kryobeskyttende midler samt nedkøling af skader og osmotisk stress stadig flere strukturelle og molekylære ændringer og reducerer udviklingspotentialet hos pattedyr oocytter. Her beskriver vi en protokol for vitrificering af får oocytter indsamlet fra unge og voksne donorer og modnet in vitro før kryopræservering. Protokollen omfatter alle procedurer fra oocyt in vitro-modning til vitrifikation, opvarmning og inkubationstid efter opvarmning. Oocytes vitrificeret på MII fase kan faktisk befrugtes efter opvarmning, men de har brug for ekstra tid før befrugtning for at genoprette skader på grund af kryopræservering procedurer og for at øge deres udviklingspotentiale. Således post-opvarmning kultur betingelser og timing er afgørende skridt for genoprettelsen af oocyt udviklingspotentiale, især når oocyt er indsamlet fra unge donorer.
Introduction
Langsigtet opbevaring af de kvindelige gameter kan tilbyde en bred vifte af applikationer, såsom forbedring af husdyravl ved genetiske udvælgelsesprogrammer, der bidrager til at bevare biodiversiteten gennem det tidligere sted dyrelivsarters bevaringsprogram og øge in vitro bioteknologisk forskning og applikationer takket være tilgængeligheden af lagrede oocytter, der skal indarbejdes i in vitro-embryoproduktion eller nukleare transplantationsprogrammer1,2,3. Juvenile oocyt vitrification vil også øge den genetiske gevinst ved at forkorte generation intervallet i avlsprogrammer4. Vitrificering ved ultrahurtig køling og opvarmning af oocytter betragtes i øjeblikket som en standardmetode for husdyr oocytter kryopræservering5. I drøvtyggere, før vitrifikation, modnes oocytter normalt in vitro efter hentning fra follikler opnået fra slagteri-afledte æggestokke2. Voksen, og især prepubertal æggestokke4,6, kan faktisk levere et næsten ubegrænset antal oocytter, der skal kryopreserveret.
Hos kvæg, efter oocyt vitrificering og opvarmning, blastocyst udbytter på > 10% er blevet almindeligt rapporteret af flere laboratorier i løbet af det sidste årti3. I små drøvtyggere betragtes oocyt vitrifikation dog stadig som relativt ny for både unge og voksne, og der mangler stadig at blive fastlagt en standardmetode for fåreavl2,5. På trods af de seneste fremskridt præsenterer den forglassede og opvarmede oocyt faktisk flere funktionelle og strukturelle ændringer, der begrænser deres udviklingspotentiale7,8,9. Således har få artikler rapporteret blastocyst udvikling på 10% eller mere i vitrified / opvarmet får oocytes2. Der er blevet undersøgt flere metoder til at reducere ovennævnte ændringer: optimering af sammensætningen af vitrifikations- og optøningsopløsningerne10,11; eksperimentere med brug af forskellige kryo-enheder8,12,13; og anvende specifikke behandlinger under in vitro-modning (IVM)4,14,15 og/eller under restitutionstiden efter opvarmning6.
Her beskriver vi en protokol for vitrificering af fåre oocytter indsamlet fra unge og voksne donorer og modnet in vitro før kryopræservering. Protokollen omfatter alle procedurer fra oocyt in vitro modning til vitrificering, opvarmning og post-opvarmning kultur periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nedenfor beskrevne dyreprotokol og de gennemførte procedurer er i overensstemmelse med de etiske retningslinjer, der gælder på Universitetet i Sassari i overensstemmelse med EU-direktiv 86/609/EF og henstillingen fra Kommissionen for De Europæiske Fællesskaber 2007/526/EF.
1. Forberedelse af medier til oocyt manipulation
- Forbered mediet til transport af opsamlet æggestokke ved at supplere Dulbeccos fosfatbufferet saltvand med 0,1 g/L penicillin og 0,1 g/L streptomycin (PBS).
- Forbered mediet til oocytopsamling og modning ved fortynding af 9,5 g vævskulturmedium (TCM) 199 i pulver med 1 L Milli-Q vand suppleret med penicillin (0,1%) og streptomycin (0,1%).
- Efter fortynding filtreres 100 mL medium, og det opbevares ved 4 °C som beholdningsmodningsmedium (SMM), der skal anvendes i en uge.
- Kollektionsmediet (CM) fremstilles ved at supplere de resterende 900 mL med 25 mM HEPES, 0,36 g/L bicarbonat og 0,1% (w/v) polyvinylalkohol (PVA) (pH 7,3, osmolalitet 290 mOsm/kg).
- Modningsmediet fremstilles med SMM suppleret med 0,021 g/L bicarbonat, 10% varmebehandlet østrus fåreserum, 1 IU/mL FSH, 1 IU/mL LH, 100 μL cysteamin og 8 mg/mL pyruvat.
BEMÆRK: Modningsmediet i et volumen på 10 mL skal inkuberes ved standardforhold (i en maksimal befugtet atmosfære ved 39 °C i 5% CO2 i luften) i mindst 4 timer før brug. - Basismediet (BM) forberedes til manipulation af oocyt efter in vitro-modning, bestående af PBS uden Ca++ og Mg++, suppleret med 20% føtal kalveserum (FCS).
2. Oocyte indsamling og modning
- Gendan oocytterne fra unge (30-40 dage, kropsvægt 6-10 kg) og voksne æggestokke.
- De indsamlede æggestokke transporteres fra handelsslagteriet til laboratoriet inden for 1-2 timer i PBS ved 27 °C.
- Efter vask i PBS frisk medium, skive æggestokkene i CM ved hjælp af en mikro-klinge til at frigive follikelindholdet.
- Under en stereomikroskop undersøgelse med 60x forstørrelse, skal du vælge cumulus-oocyt komplekser (COCs) for in vitro modning ved at vælge dem med 4-10 lag granulosa celler, oocyte med en ensartet cytoplasma, homogen fordeling af lipid dråber i cytoplasma og med den ydre diameter på omkring 90 μm (gennemsnit).
- Vask de valgte COCs tre gange i CM og til sidst overføre dem i modning medium.
BEMÆRK: For unge oocytter skal modningsmediet suppleres med 100 μM trehalose for at forbedre overlevelsen efter vitrifikation. - Ved modning af in vitro overføres 30-35 COC'er i 600 μL modningsmedium i firebrønd petriskåle, dækket med 300 μL mineralsk olie, og de inkuberes til 22 (voksne oocytter)/24 (unge oocytter) h i 5% CO2 i luft ved 39 °C.
- Efter in vitro modning, denude COCs af cumulus celler ved forsigtigt pipettering. Efter undersøgelsen under et stereomikroskop med 60x forstørrelse, skal du kun vælge dem, der viser ekstrudering på den første polære krop, og dermed på metafase II (MII) fase, for vitrifikation.
3. Sædopsamling, frysning og optøning
- Basismediet forberedes til syrbeskyttelse af sæd, der består af ramforlænger (200 mM Tris; 70 mM citronsyre; 55 mM fructose; pH 7,2, osmolalitet 300 mOsm/kg) suppleret med æggeblomme 20% (v/v).
- Saml kun sæden i fåreavlssæsonen (oktober-november).
- Få ejakulerer ved kunstig vagina fra voksne væddere (i alderen 2-5 år), opretholdes i et udendørs miljø og fodret med en levende vægt vedligeholdelse ration. Hold væddere isoleret i separate penne, men med visuel kontakt mellem hinanden.
- Gentag sædsamling en om ugen i hele ynglesæsonen for at opnå mindst 8 ejakulerer fra hver mand.
- Sædprøverne transporteres til laboratoriet ved miljøtemperatur inden for 5 minutter efter indsamlingen og behandles straks. Pool ejakulerer af to-tre rams og evaluere sædkoncentration spektrofotometri.
- Efter pooling fortyndes ejakuleringerne op til 400 x 106 spermatozoer/mL med basismedium til sæd kryopræservering suppleret med 4% glycerol. Derefter afkøles den fortyndede sæd til 4 °C over en periode på 2 timer, og den afbalanceres i 20 minutter inden frysning.
- Sædprøverne fryses i pelletform (0,25 mL) på tøris, og derefter kastes de ud i flydende nitrogen.
- Til optøning sættes pelletlen i en steriliseret glasfalk og kaster den i et vandbad i 20 s ved 39 °C.
4. In vitro-befrugtning og embryokultur
- Forbered lagre til grundlov af den syntetiske oviductalvæske (SOF).
- Forbered lager A: 99,4 mL MilliQ-vand; 6,29 g af NaCl; 0,534 g KCl; 0,161 g KH2PO4; 0,182 g mgSO4 ,7H2O; og 0,6 mL natriumlaktat. Ved 4 °C opbevares i op til 3 måneder.
- Forbered lager B: 10 mL MilliQ-vand; 0,210 g NaHCO3; og 2-3 g Phenol Red. Ved 4 °C opbevares i 1 måned.
- Forbered lager C: 10 mL MilliQ-vand; og 0,051 g natrium pyruvat. Ved 4 °C opbevares i 1 måned.
- Forbered lager D: 10 mL MilliQ-vand; og 0,262 g CaCl2 2H2O. Hold ved 4 °C i 1 måned.
- Der fremstilles 10 mL SOF bestående af 7,630 mL MilliQ vand, 1 mL lager A, 1 mL lager B, 0,07 mL lager C og 0,7 mL lager D.
- Forbered in vitro-befrugtningsmedium (IVF) medium: SOF suppleret med 2% varmebehandlet estøst fåreserum, 10 μg/mL heparin og 1 μg/mL hypoutarine (osmolalitet 280-290 mOsm/kg).
BEMÆRK: IVF-mediet i et volumen på 10 mL skal inkuberes ved standardforhold (i en maksimal befugtet atmosfære ved 39 °C i 5% CO2, 5% O2 og 90% N2) mindst 4 timer før brug.
- Frosne/optøede sædtilførsler overføres i et steriliseret glaskonisk rør under 1,5 mL opvarmet IVF-medium, og de inkuberes i 15 minutter ved 39 °C i fugtig atmosfære ved 5% CO2 i luften.
- Efter inkubation svømmer den bevægelige spermatozoa mod den apikale del af den flydende kolonne. Saml det øverste lag og observere for sædmotilitet evaluering.
BEMÆRK: Sædmotilitetsparametre bør vurderes ved hjælp af et computerassisteret sædanalysesystem (CASA) med følgende indstillinger: 25 billeder erhvervet for at undgå sædspor overlappende, minimum kontrast 10, minimumshastighed af gennemsnitlig sti 30 μm/s og progressiv motilitet > 80% straightness. Dette system har en specifik opsætning til ram sæd evaluering. For hver prøve indlæses 5 μL delstikprøve sædaffjedring i et forvarmet analysekammer med en dybde på 10 μm. Sædmotilitet vurderes ved 37 °C ved 40x ved hjælp af et fasekontrastmikroskop, og mindst 500 sædceller pr. delstikprøve skal analyseres i mindst fire forskellige mikroskopiske felter. Procentdelen af den samlede motile og progressive bevægelige sæd blev evalueret. For IVF bør procentdelen af progressiv bevægelig spermatozoa være ≥ 30%. - Fortynding af swim-up afledt motil spermatozoa ved 1 x 106 spermatozoa/mL endelig koncentration og co-inkubere dem med MII oocytter i 300 μL IVF medium dækket med mineralsk olie i fire-brønd Petri retter.
- Efter 22 timers overførsel overføres de formodede zygoter i fire-brønd Petri retter indeholdende SOF suppleret med 0,4% kvæg serum albumin og essentielle og ikke-essentielle aminosyrer ved oviductal koncentration som rapporteret af16 under mineralsk olie og kultur dem under standardbetingelser op til blastocyst fase.
- Ved 22-, 26- og 32- timers post-insemination registreres antallet af kløvede oocytter, der viser to forskellige blastomerer, ved undersøgelsen under et stereomikroskop med 60x forstørrelse.
- Overhold embryoner dagligt fra den femte til niende dag i kultur og nydannede blastocyster skal registreres ved undersøgelsen under et stereomikroskop med 60x forstørrelse.
5. Oocyte vitrificering og opvarmning
BEMÆRK: Udfør vitrifikation efter metoden med minimumsvolumen (MEV) ved hjælp af anordnings kryopper17.
- Ekvilibrere en gruppe på fem oocytter ved 38,5 °C i 2 min. i BM. Anvendelsen af BM garanterer en lav calciumkoncentration ([Ca2++] 2,2 mg/dL)10.
- Oocytterne dehydreres med en 3 minutters eksponering for ækvilibreringsopløsning, der indeholder 7,5% (v/v) dimethylsulfoxid (DMSO) og 7,5% (v/v) ethylenglycol (EG) i BM.
- Oocytterne overføres til vitrifikationsopløsningen, der indeholder 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG og 0,5 M trehalose i BM, før de læsses i en kryotopanordning og kastes direkte ned i flydende nitrogen inden for 30 s.
- For at opvarme til en biologisk temperatur overføres indholdet af hver vitrifikationsanordning fra flydende nitrogen til 200 μL dråber på 1,25 M trehalose i BM i 1 min ved 38,5 °C og omrøres forsigtigt for at lette blandingen.
- For at fremme fjernelsen af intracellulære kryoprotectanter overføres oocytter trinvist til 200 μL dråber faldende trehaloseopløsninger (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M trehalose i BM) i 30 s ved 38,5 °C, før de ekvilibreres i 10 min ved 38,5 °C i BM.
6. Vurdering af oocytkvalitet efter opvarmning
- Efter opvarmning inkuberes oocytterne i 6 timer i PBS uden Ca++ og Mg++ plus 20% FCS (BM) i 5% CO2 i luft ved 38,5 °C.
BEMÆRK: Oocyte evnen til at genoprette biologiske og strukturelle træk efter vitrifikation er i forhold til de arter og klasser af brugte oocytter. - Da oocyt evne til at inddrive cryopreservation skader er tid-afhængige, vurdere oocyt kvalitet på forskellige tidspunkter af in vitro kultur (0 timer, 2 timer, 4 timer, 6 timer) efter opvarmning, at definere den optimale tidsvindue for oocyt befrugtning.
BEMÆRK: Hos voksne får oocyt er den optimale tid 4 timers efter opvarmning; for prepubertal oocyt er den optimale tid 2 timer efter opvarmning.
7. Oocyte overlevelsesvurdering
- Umiddelbart efter opvarmning og for hvert tidspunkt af post-opvarmning kultur, morfologisk evaluere oocytter ved hjælp af en omvendt mikroskop med 100x forstørrelse.
BEMÆRK: Oocytter med strukturelle ændringer, såsom svag cytoplasma, skader zona pellucida og / eller membran bør klassificeres som degenereret. - Valider membranintegritetsvurderingen ved hjælp af en dobbelt differentialfluorescerende farvning.
- Oocytterne indeholder 2 mL BM, der indeholder propidiumididid (PI; 10 μg/mL) og Hoechst 33342 (10 μg/mL) i 5 min. i 5% CO2 i luft ved 38,5 °C.
- Efter vask tre gange i frisk BM observeres oocytterne under et fluorescerende mikroskop ved hjælp af et excitationsfilter på 350 nm og en emission på 460 nm for Hoechst 33342 og et excitationsfilter på 535 nm og en emission på 617 nm for PI.
BEMÆRK: Oocytter med en intakt membran kan genkendes af den blå fluorescens af farvet DNA med Hoechst 33342. Oocyt med beskadigede membraner viser en rød fluorescens på grund af DNA-farvning med PI.
8. Evaluering af mitokondrieaktivitet og ros intracellulært niveau ved confocal laserscanning mikroskopi
- Forbered Sonden MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).
- Indholdet af 1 hætteglas (50 μg) fortyndes med 1 ml DMSO for at opnå en 1 mM opløsning. Hold det fortyndede hætteglas i flydende nitrogen.
- Opløsningen fortyndes 1 mM med DMSO for at opnå 100 μM stamopløsningen og opbevares ved -80 °C i mørke.
- Forbered 2′,7′-dichlordihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) sonde.
- H2DCF-DA fortyndes i 0,1% polyvinyl pyrrolidone (PVA)/PBS for at opnå den første 100 mM opløsning. Opløsningen opbevares ved -80 °C i mørke .
- Den første opløsning fortyndes i 0,1 % PVA/PBS for at opnå 100 μM-stamopløsningen. Opbevar den ved -20 °C i mørke.
- Forbered monteringsmediet (MM): Til 10 mL MM tilsættes 5 mL glycerol, 5 mL PBS og 250 mg natriumanzid. Den opbevares ved -20 °C, indtil den er i brug.
- Oocytterne inkuberes i 30 min ved 38,5 °C i BM med 500 nM MT-Red (stamopløsning: 100 μM i DMSO).
- Efter inkubation med MT-Red sonde vaskes oocytterne tre gange i BM og inkuberes i 20 minutter i samme medie, der indeholder 5 μM H2DCF-DA (stamopløsning: 100 μM i BM).
- Efter udsættelse for sonderne vaskes oocytterne i BM og fastgøres i 2,5% glutaraldehyd/PBS i mindst 15 min.
- Efter fiksering vaskes oocytterne tre gange i BM og monteres på glasrutsjebaner i en 4 μL dråbe MM med 1 mg/mL Hoechst 33342 ved hjælp af vokspuder for at undgå kompression af prøver.
- Der opbevares lysbilleder ved 4 °C i mørke indtil evaluering.
- Udfør analysen af immunolabellerede sektioner med et konfokalt laserscanningsmikroskop. Mikroskopet er udstyret med Ar/He/Ne lasere, ved hjælp af et 40/60x oliemål. Analyser sektionerne efter sekventiel excitation.
- Til mitokondrieevaluering observeres prøverne med en multifotonlaser for at detektere MT-Red (eksponering: 579 nm; emission: 599 nm).
- Brug en argonioneraserstråle ved 488 nm og B-2 A-filteret (495 nm eksponering og 519 nm emission) til at påpege dichlorfluorescein (DCF)18.
- I hver enkelt oocyt måles MT-Red og DCF fluorescensintensiteter ved ækvatorialplanet19.
- Vedligehold parametre relateret til fluorescensintensitet ved konstante værdier under alle billedopsamlinger (laserenergi 26%, Sekventielle indstillinger 1: PMT1 vinder 649-PMT2 gevinst 482; Sekventiel indstilling 2: PMT1 gevinst 625-PMT2 gevinst 589; forskydning 0; pinhole størrelse: 68).
- Udfør kvantitativ analyse af fluorescensintensitet ved hjælp af Softwarepakken Leica LAS AF Lite billedanalyse efter de procedurer, der er standardiseret af20.
- Tag billederne én gang, bevæger sig på Z-aksen, indtil de når ækvatorialplanet.
- For hvert billede blev transformer til grå skala og sluk kanal 1 (relateret til Hoechst blå) slukket. Derefter manuelt trække en region af interesse (ROI) på et afgrænset område, der er omkring den meiotiske spindel.
BEMÆRK: Softwaren kan automatisk læse pixelgennemsnitsværdien på kanal 2 (FITC) og trække værdien af baggrunden fra den. - Registrer gennemsnitsværdierne for pixel, og send til statistisk analyse.
9. Statistiske analyser
- Analysere følgende forskelle: overlevelsesrater hos unge vs. voksne oocytter, overlevelsesrater og udviklingskompetence i kontrol og trehalosebehandlede unge oocytter, overlevelse og delhenogenetiske aktiveringsrater og udviklingskompetence hos voksne oocytter, der er vitrificeret med forskellige calciumkoncentrationsmedier, befrugtningsrater og embryoproduktion i unge oocytter, der er vitrificeret med lav eller høj calciumkoncentration, aktive mitokondrier fænotyper i unge vitrificerede oocytter under forskellige tidspunkter for post-opvarmning kultur og parthenogenetic aktivering satser mellem voksne og unge vitrificeret oocytter ved hjælp af chi kvadratisk test.
- Analysere kavalergang sats og embryo output i vitrified voksne oocytter i forskellige tidspunkter af post-opvarmning kultur, fluorescens intensitet mitokondrie aktivitet og ROS intracellulære niveauer i unge vitrificeret oocytter i forskellige tidspunkter af post-opvarmning kultur af ANOVA efter analyse for homogen varians ved Levene's test. Brug en post-hoc test Tukeys test til at fremhæve forskelle mellem og mellem grupper.
- Udfør statistisk analyse ved hjælp af det statistiske softwareprogram, og overvej en sandsynlighed for, at P < 0,05, er det mindste niveau af betydning. Alle resultater udtrykkes som middel ± S.E.M.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kryotopen af oocyt fra unge donorer er lavere sammenlignet med voksne. Den første observerede effekt er en lavere overlevelsesrate efter opvarmning sammenlignet med voksne oocytter(figur 1A; χ2-test P<0,001). Unge oocytter viste en lavere membranintegritet efter opvarmning (Figur 1B). Anvendelsen af trehalose i modningsmediet havde til formål at kontrollere, om dette sukker kunne reducere kryodomstolene hos unge oocytter. Dataene har vist23, at oocytter modnet i 24 timer med trehalosetilskud viste højere overlevelsesrater efter vitrificering/opvarmning sammenlignet med den ikke-behandlede gruppe(tabel 1: henholdsvis 85,7% mod 75,3%; χ2 test P<0,05). Trehalosetilskud var faktisk forbundet med højere membranintegritet efter opvarmning (Figur 2A). Anvendelsen af trehalose under in vitro-modningen af unge oocytter øgede således overlevelsesraten efter vitrifikation (85,7%) værdier, der kan sammenlignes med voksne (90,3 %). Imidlertid blev spaltning, befrugtning og udviklingshastigheder for unge oocytter ikke forøget ved trehalosetilskud(tabel 1).
For at forbedre oocytkompetencen efter vitrifikation testede vi i voksne får forskellige vitrifikationsmedier med calciumkoncentrationer fra 9,9 til 0,4 mg/dL10. De opnåede resultater viste, at brugen af medier med calciumkoncentration svarende til 2,2 mg/dL øgede overlevelsesraten efter opvarmningen, forbedrede udviklingskompetencen og reducerede parthenogenetiske aktiveringer af voksen oocyt10 (tabel 2). Vi testede således de lave calcium vitrifikationsmedier til vitrificering af unge oocytter. Som det fremgår af tabel 3, viste unge oocytter, der var beglaseret med lav calciumkoncentration, højere befrugtningsrater sammenlignet med oocytter, der var forglasset med høj calciumkoncentration (henholdsvis 44,35 % mod 32,29 %; P<0,05), men der blev ikke fundet nogen forskelle i embryoproduktionen.
Vitrificerede/opvarmede oocytter har brug for ekstra tid før befrugtning for at genoprette skader på grund af kryopræserveringsprocedurer og for at øge deres udviklingspotentiale. En tidligere undersøgelse har faktisk vist, at ATP intracellulær koncentration, mitokondrieaktivitet og in vitro-udviklingskompetence reduceres i forglaserede/optøede oocytter, som også udviser høje intracellulæreROS-koncentrationer 6. Disse ændringer er særligt markante umiddelbart efter opvarmning. Under den post-opvarmning kultur, både voksne og unge oocytter er i stand til delvist at komme sig efter de skader, der er lidt under vitrificering procedurer6,24. Ved at sammenligne post-opvarmning kultur af forskellig varighed (0, 2, 4 og 6 h), viste vi, at efter 4 timers kultur oocytter indsamlet fra voksne moderfår er i stand til at inddrive den energiske balance6 og mikroubkulære setup24 og til at genoprette udviklingskompetence med højere kavalergang (50,7 ± 3,9%; P< 0,01 ANOVA) og blastocyst satser (14,40 ± 1,3%; ANOVA P< 0,01) sammenlignet med andre tidspoint (0, 2 og 6 timer; Tabel 4) Således repræsenterer 4 timers postopvarmningskultur det ideelle tidsvindue til befrugtning af forglassede / opvarmede voksne oocytter6.
Når det samme eksperiment blev gentaget med oocytter indsamlet fra unge donorer, blev disse resultater delvist bekræftet. Mitokondrieaktiviteten var højere i forglassede/opvarmede unge oocytter efter 4 timers kultur efter opvarmning sammenlignet med andre tidspunkter (0, 2, 6; Figur 3: ANOVA P<0.01). Der observeres og klassificeres flere mønstre for mitokondriefordelingen i følgende tre grupper (som rapporteret af21): Mønster A: homogen FIN med små granulater spredt over hele cytoplasmaet; Mønster B: homogen GRANULAT med store granulater spredt ud over hele cytoplasmaet Mønster C: heterogen CLUSTERED, når der var særligt store granulater til stede, spredt ud over hele cytoplasmaet eller placeret i specifikke cytoplasmiske domæner. De forskellige fænotyper i cytoplasmafordelingen af aktivt mitokondrie i MII kan relateres til oocyt udviklingskompetence. En FIN homogen fordeling er en indikator for dårlig udviklingskompetence , mens en GRANULAR - og CLUSTERED-fordeling er relateret til en øget mitokondrieraktivitet og dermed højere udviklingskompetence22. Mitokondriefordelingsmønstre ændrede sig i løbet af 6 timer af postopvarmningskulturen. Figur 4 viser eksempler på unge oocytter med forskellige mønstre for mitokondriefordeling og deres udsving i kulturen efter opvarmningen. Mønsteret A stiger betydeligt under den langvarige inkubation og når den højere værdi ved 6 timers efteropvarmning (figur 4Aa: χ2 P<0,05), mønster B viste ingen væsentlige ændringer under efteropvarmningen1984, s. 1333),blev mønster C ikke fundet i nogen ungforglasset/opvarmet oocyt under den langvarige inkubation(figur 4Cc:χ2 P<0.05).
Desuden var de intracellulære mængder for ros betydeligt lavere i unge oocytter ved 2 timer af kulturen efter opvarmning sammenlignet med 0, 4 og 6 timer(figur 5: ANOVA P<0.001). Men i modsætning til, hvad der blev fundet hos voksne oocytter, steg antallet af spontane parthenogenetiske aktiveringer under den postopvarmende kultur i unge oocytter (figur 6). Af denne grund ville det anbefalede tidspunkt for befrugtning i unge oocytter være 2 timer efter opvarmningskulturen.
Figur 1. Overlevelsesraten for forglassede/opvarmede får, der er indsamlet fra unge og voksne donorer. (A) Oocyte blev vitrificeret efter in vitro-modning. Overlevelsesraten blev fastsat efter vitrificering og opvarmning ved fluorescerende farvning med propidiumididid (10 μg/mL) og Hoechst 33342 (10 μg/mL). N = 165 voksne oocytter og 170 unge oocytter. Forskellige bogstaver angiver signifikante forskelle mellem voksne og unge oocytter: χ2 test P<0,001. (B-C) Eksempler på vitrificerede/opvarmede unge oocytter med intakt (B) og beskadiget plasmamembran (C) ved den morfologiske vurdering (omvendt mikroskop med 100x forstørrelse). Skalalinje = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Overlevelsesrater for unge får og udvikling af vitro efter modning med (TRH) og uden (CTR) trehalose (100 mM i modningsmedium). (A-B) Eksempler på unge oocytter, der er forglasset efter in vitro-modning i medier suppleret (A) med eller (B) uden trehalose ved den morfologiske vurdering (omvendt mikroskop med 100x forstørrelse). Skalalinje = 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Kvantificering af aktiv mitokondriefluorescensintensitet i forglassede/opvarmede unge oocytter på forskellige tidspunkter (0, 2, 4, 6) under postopvarmning in vitro-kulturen. IVM oocytter blev anvendt som kontrol (CTR N = 77). I alt 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) blev unge oocytter forglasset og opvarmet i tre uafhængige forsøg. Forskellige bogstaver angiver statistisk signifikante forskelle (ANOVA P = 0,0000). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Fordeling af mitokondriemønster i forglassede/opvarmede unge oocytter i løbet af 6 timers postopvarmning in vitro-kultur. Repræsentative billeder af Fine (A), Granulat (B) og Grupperet (C) mitokondriefordeling i forglassede/opvarmede unge oocytter. D) Procentdel af juvenificerede/opvarmede oocytter, der udviser en fin mitokondriefordeling (E) Procentdel af juvenificerede/opvarmede oocytter med en granulær mitokondriefordeling F) Procentdel af juvenificerede/opvarmede oocytter, der udviser en grupperet mitokondriefordeling. IVM-unge oocytter blev anvendt som kontrol (CTR; N = 77). I alt blev der anvendt 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 timer N = 40; 6 h N = 39) unge oocytter, der var forglasset og opvarmet i tre uafhængige forsøg. Forskellige bogstaver angiver statistisk signifikante forskelle (Aa: χ2 P = 0,026; Bb: χ2 P = 0,097; Cc: χ2 P = 0,014). Skalalinje = 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Kvantificering af intracellulær ROS-fluorescensintensitet i forglassede unge oocytter i løbet af 6 timer efter opvarmning in vitro-kulturen. (A-B) Repræsentative billeder af ROS-fluorescensintensiteten i in vitro modnet (A) og forglasset (B) unge oocytter. (C) Intracellulære niveauer af fortjeneste ved salg som bestemt ved kvantificering af fluorescensintensiteten i forglassede unge oocytter på forskellige tidspunkter (0 h N=45; 2 h N=39; 4 h N=40; 6 h N=39) under in vitro-kulturen efter opvarmningen. In vitro modnede unge oocytter blev anvendt som kontrol (CTR N = 77). Forskellige bogstaver angiver statistisk signifikante forskelle (ANOVA P = 0,0000). Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Parthenogenetisk aktivering i vitrificerede unge og voksne oocytter i løbet af 6 timers postopvarmning in vitro kultur. (A-B) Repræsentative billeder af oocyt parthenogenetisk aktivering: (A) oocyt i metafase II-telophase II overgang og (B) pronucleus dannelse. (C) Procentdele af delhenogenetiske aktiverede voksne og unge oocytter på forskellige tidspunkter (0, 2, 4, 6 h) under in vitro-kulturen efter opvarmningen. Stjerner angiver statistiske forskelle mellem unge og voksne oocytter på hvert inkubationstidspunkt (ANOVA P = 0,000). Dette tal er blevet ændret fra Serra et al.24 Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Oocytter (n) | Overlevelsesrate (%) | IVF (n) | Befrugteta (%) | Kløvetb (%) | Blastocystsc (%) | |
| Ctr | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| Trh | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * Chi firkantet test p<0,5 | ||||||
| Der beregnes en procentsats på IVF-oocytter | ||||||
| b Procenter beregnes på befrugtede oocytter | ||||||
| c Procenter beregnes på kløvede oocytter | ||||||
Tabel 1. Unge får overlevelsesrater og in vitro udviklingskompetence efter modning med og uden trehalose og vitrifikation. TRH = unge oocytter modnet med trehalosetilskud (100 mM i modningsmedium). CTR = kontrol unge oocytter modnet uden trehalose tilskud. Overlevelsesraten blev fastsat efter fluorescerende farvning med propidiumidid (10 μg/mL) og Hoechst 33342 (10 μg/mL) for forglassede/opvarmede oocytter. Oocyte udviklingskompetence blev fastlagt efter inkorporering i et in vitro produktionssystem. a Procenter beregnes på IVF oocytter. b Procenter beregnes på befrugtede oocytter. c Procenter beregnes på kløvede oocytter. * χ2 test P<0.5. Tabellen er ændret fra Berlinguer m.fl.
| grupper | [Ca++] mg/dL | 1984 1988 | Spontan parthenogenetisk aktivering (%) | Vitrificerede oocytter | Overlevede og IVF oocytes (%) | Kavalergang (%) | Blastocysts output (%) |
| TCM/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41.2)a | 150 | 124 (82,7)a | 40 (32,5)a | 2 (1,6)a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35.3)ac | 115 | 88 (76,5)a | 33 (37,5)ae | 1 (1.1)a |
| PBSCaMg gratis/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12.7)b | 126 | 115 (91,3)b | 74 (64,3)b | 12 (10.4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25.3)c | 110 | 90 (81,8)a | 18 (20)c | 0 (0)a |
| PBSCaMg gratis/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11.5)b | 149 | 123 (82,5)a | 57 (46.3)de | 3 (2.4)b |
Tabel 2. Udviklingsmæssige kompetence in vitro modnet voksne oocytter vitrified in vitrifikation medier (16,5% ethylenglycol + 16,5% dimethyl sulfoxid) indeholder forskellige calciumkoncentrationer. Overlevelses- og befrugtningsrater beregnes på forglassede oocytter; de samlede spaltnings- og blastocysthastigheder beregnes på grundlag af overlevede oocytter. Værdier med forskellig sænket skrift i samme kolonne er væsentligt forskellige: χ2 test P<0,05. Denne tabel er ændret fra Succu et al.10
| [Ca 2++] i vitrificeringsmedier | Nej. Oocyter | Overlevelsesraten efter vitrifikationen (%) | Befrugtningshastighed (%) | Kavalergang (%) | Blastocyst-udgang (%) |
| Høj [9,9 mg/dL] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| Lav [2,2 mg/dL] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44,35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
Tabel 3 . Befrugtnings- og udviklingshastigheder efter in vitro-befrugtning og kultur af vitrificeret/opvarmet ung oocyt med højt ([Ca 2++] = 9,9 mg/dL) og lavt ([Ca 2++] = 2,2 mg/dL) calciumkoncentration i vitrifikationsmedier. Forskellige bogstaver angiver statistisk forskel (en ≠ b P<0,05 χ2 test).
| Timer med inkubation efter opvarmning | Kavalergangshastighed (n) | Embryonproduktion (n) |
| 0 | 19,2 ± 3%a (82) | 0%a (17) |
| 2 | 41,8 ± 3%b (100) | 6,5 ± 1,3%b (42) |
| 4 | 50,7 ± 3%b (92) | 14,4 ± 1,3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%a (92) | 0%a (23) |
Tabel 4 . Kavalergang sats og embryo output i vitrified / opvarmet voksne oocytter befrugtet på forskellige tidspunkter af post-opvarmning kultur. Forskellige bogstaver angiver statistisk forskel inden for samme kolonne: ANOVA P<0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oocyte cryopreservation hos husdyr kan ikke kun tillade langsigtet bevarelse af kvindelige genetiske ressourcer, men også fremme udviklingen af embryonale bioteknologier. Udviklingen af en standardmetode til oocyt vitrifikation vil således være til fordel for både husdyrsektoren og forskningssektoren. I denne protokol præsenteres en komplet metode til bekæmpelse af voksne fåreavl, og den kan udgøre et solidt udgangspunkt for udviklingen af et effektivt vitrificeringssystem for ungfisk.
En af de vigtigste fordele ved den foreslåede metode er, at den omfatter alle trin fra oocytsamling, in vitro-modning, vitrifikation og opvarmning. Desuden omfatter det en kulturperiode efter opvarmningen for at gøre det muligt for oocytter at komme sig efter de skader, der er opstået under vitrificeringsproceduren, før de befrugtes. Den optimale tid til befrugtning bør skræddersys i henhold til metoden til kryopræservering, indledende oocytkvalitet, patientalder og art, der er afgørende for at overveje begge aspekter af tidsgendannelse og oocyt aldrende25,26. Således er det udfordrende at vælge varigheden af inkubationsperioden efter opvarmning, og det kan påvirke resultatet af oocyt vitrificeringsprogrammer. På grundlag af de resultater, der er opnået med hensyn til spaltningshastigheder og embryonproduktion, og på de betingelser, der er beskrevet i den forelagte protokol, er den optimale tid til befrugtning af forglassede voksne fårekød efter 4 timers inkubation efter opvarmning (tabel 4)6. Disse oplysninger er afgørende, når du designer et oocyt vitrifikationsprogram.
Denne protokol giver imidlertid, samtidig med at den giver acceptable resultater med hensyn til embryonproduktion fra forglassede/opvarmede voksne oocytter, men fører stadig til embryoner med lavt indhold af nul, hvis den anvendes på unge oocytter. Flere strukturelle og funktionelle begrænsninger forringe prepubertal oocyt udviklingsmæssige kompetence, såsom lille størrelse, defekt kobling mellem cumulus celler og oocytter, fald i aminosyre optagelse, reduceret proteinsyntese og energi metabolisme 27,28,29. I en tidligere undersøgelse rapporterede vi, at prepubertal oocytter viser høj følsomhed over for vitrificeringsproceduren30. Den lave udviklingskompetence, der er vist efter vitrificering og opvarmning, er sandsynligvis et resultat af skader på cytoplasmiske faktorer, der er involveret i reorganiseringen af cytoskelet og (eller) i aktiveringen af modningsfremmende faktor30. Som det fremgår af tabel 1, var suppleringen af modningsmediet med trehalose, et ikke-gennemtrængeligt kryobeskyttende middel, i stand til at øge overlevelsesraten efter vitrificering og opvarmning til værdier, der kan sammenlignes med værdierne for voksneoocytter 4. På samme måde øger anvendelsen af vitrifikationsopløsning med lave calciumkoncentrationer befrugtningshastigheden af unge oocytter efter vitrifikation og opvarmning, som vist i tabel 3. Således kan både optimeringen af kulturforholdene under in vitro-modningen og af vitrificeringsmediesammensætningen bidrage til at øge kvaliteten af den unge oocyt efter vitrificering og opvarmning. Unge oocytter viser en vis evne til at komme sig efter de skader, der er forårsaget af vitrificeringsproceduren, som vist i figur 3, 4 og 5.
Men den høje grad af spontan parthenogenetisk aktivering under post-opvarmning kultur stadig begrænse deres udviklingspotentiale. Ethylenglycol og DMSO, som er almindeligt anvendte kryobeskyttende midler, kan kunstigt aktivere oocyten før den faktiske befrugtning og derved begrænse befrugtningssuccesen og embryoudviklingen. De kan faktisk forårsage en forbigående stigning i intracellulær Ca2 + koncentration31, hvilket udløser kortikale granulat exocytose, pronuclei dannelse, og meiotisk genoptagelse32. Faktisk kan vitrificering kunstigt aktivere oocyten før den faktiske befrugtning og derved begrænse befrugtningssucces og embryoudvikling. Calciumchelator kan således anvendes til yderligere at begrænse tilgængeligheden af calcium under vitrifikationsprocessen med henblik på at begrænse antallet af spontane aktiveringer i unge oocytter.
Det bør også antages, at vitrificering i modsætning til langsom frysning er en udelukkende manuel teknik, og den er således operatørafhængig33,34. Tilgængeligheden af uddannet personale er således en nøglefaktor for denne metodes succes. Først og fremmest skal operatøren korrekt vælge de oocytter, der skal vitrificeres. Efter IVM, oocytter er forsigtigt denuded af cumulus celler og evalueres under et stereomikroskop til at vælge for cryopreservation kun dem med en ensartet cytoplasma, homogen fordeling af lipid dråber i cytoplasma og med den ydre diameter på ca 90 μm. Desuden må der kun vælges oocytter, der viser ekstrudering på den første polære krop og dermed på MII-stadiumet.
Den morfologiske vurdering af oocytterne skal være afsluttet om et par minutter og være operatørafhængig, den er meget følsom over for variationer i dens korrekte gennemførelse. For at hjælpe med at standardisere udvælgelsesproceduren foreslår metoden at begrænse kulturtiden for in vitro-modning til 22 timer for voksne oocytter. På dette tidspunkt har fåre oocytter af høj kvalitet allerede afsluttet den første meiotiske division22 og kan vælges til kryopræservering. På denne måde bør elimineringen af oocytter af lav kvalitet, som er de langsomste i færdiggørelsen af den første meiotiske division, være enklere.
Driftslederen skal også nøje overholde den tid, der er fastsat for vitrificeringsproceduren, fra den første eksponering for kryobeskytteren til nedsænkningen i flydende nitrogen. Et andet kritisk skridt er lastning af oocyten i den anvendte vitrifikationsanordning. Proceduren skal anvende mindste prøvemængder for at øge kølehastigheden og hjælpe cellerne med at passere gennem faseovergangstemperaturen hurtigt og derved mindske kryotårene35. Cryotop bruger en polypropylenstrimmel fastgjort til en holder. I denne metode lastes oocytterne i vitrifikationsopløsningen (<0,1 μL) hurtigt med en glaskapillær oven på filmstrimlen. Derefter skal opløsningen fjernes og efterlade et tyndt lag, der er tilstrækkeligt til at dække de celler, der skal kryopreserveres. Endnu en gang skal dette trin afsluttes så hurtigt som muligt for at begrænse oocyternes eksponering for de høje kryobeskyttende koncentrationer af vitrifikationsopløsningen, hvilket kan forårsage osmotisk stød og er giftige for cellerne.
Af disse grunde er en stor udfordring forbundet med denne metode behovet for manuel håndtering og dygtig tekniker. Andre forfattere rapporterede, at resultatet af oocyt vitrificeringen synes påvirket af en "indlæringskurve"-effekt, da erhvervelsen af manuelle færdigheder i væsentlig grad kan reducere den biologiske skade, der fremkaldes ved vitrificeringsproceduren34. Forskerne bør derfor tage hensyn til "operatøreffekten" i evalueringen af resultatet af vitrifikationsproceduren.
Yderligere undersøgelser vil fokusere både på standardisering af oocytudvælgelsesproceduren og bedre tilpasning af mediesammensætning og kulturforhold til ungdomsprotes behov. I denne henseende kan både brugen af calcium chelat og antioxidanter tilbyde lovende muligheder. På samme måde vil optimeringen af protokollen gøre det muligt at øge udviklingskompetencen hos levedygtige/opvarmede voksne oocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne modtog ingen specifik finansiering til dette arbejde. Professor Maria Grazia Cappai og Dr. Valeria Pasciu er taknemmeligt anerkendt for video voiceover og for at oprette laboratoriet under videofremstillingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A.
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).
