Summary
ترتبط الضامة المرتبطة بالورم (TAM) الشبيهة ب M2 بتطور الورم وضعف التكهن في السرطان. يعمل هذا البروتوكول كدليل مفصل للتمييز والاستقطاب بشكل مستنسخ بين الخلايا الشبيهة بخلايا THP-1 الأحادية في الضامة الشبيهة ب M2 في غضون 14 يوما. هذا النموذج هو الأساس للتحقيق في الآثار المضادة للالتهابات من تام داخل البيئة الدقيقة الورم.
Abstract
الضامة المرتبطة بالورم (TAM) يمكن تبديل التعبير والسيتوكين الشخصي وفقا للمحفزات الخارجية. هذه اللدونة الرائعة تمكن TAM من التكيف مع التغيرات المستمرة داخل البيئة الدقيقة للورم. الضامة يمكن أن يكون إما في المقام الأول الموالية للالتهابات (M1 مثل) أو المضادة للالتهابات (M2 مثل) الصفات ويمكن التبديل باستمرار بين هاتين الولايتين الرئيسيتين. ترتبط الضامة الشبيهة ب M2 داخل بيئة الورم بتطور السرطان وضعف التكهن في عدة أنواع من السرطان. وتستخدم العديد من الطرق المختلفة لتحفيز التمايز والاستقطاب من الخلايا THP-1 للتحقيق في الآليات الخلوية وبين الخلايا وآثار تام داخل البيئة الدقيقة للأورام. حاليا، لا يوجد نموذج راسخ للاستقطاب الضامة M2 مثل باستخدام خط الخلية THP-1، ونتائج التعبير وملامح السيتوكين من الضامة بسبب بعض المحفزات في المختبر تختلف بين الدراسات. يعمل هذا البروتوكول كإرشادات مفصلة للتمييز بين الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 إلى الضامة M0 وزيادة استقطاب الخلايا إلى النمط الظاهري الشبيه ب M2 في غضون 14 يوما. نحن نظهر التغيرات المورفولوجية للخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 ، الضامة المتمايزة ، والكوائش المستقطبة الشبيهة ب M2 باستخدام المجهر الخفيف. هذا النموذج هو الأساس لنماذج خط الخلية التحقيق في الآثار المضادة للالتهابات من TAM وتفاعلاتها مع مجموعات الخلايا الأخرى من البيئة الدقيقة الورم.
Introduction
الضامة المرتبطة بالورم (TAM) ودورها في الالتهاب المزمن ، وظهور السرطان ، وتطور الورم هي أهداف مهمة في الأبحاث الحديثة1،2. الخلايا الأحادية الدم الطرفية التي يتم تجنيدها إلى البيئة الدقيقة الأنسجة من الورم النامية تفرق إلى الضامة ويمكن استقطابها إلى نوعين فرعيين رئيسيين من الضامة3. يمثل الماكروفاج المنشط كلاسيكيا النمط الظاهري المؤيد للالتهابات في المقام الأول M1 ، ويظهر النوع الفرعي المنشط بدلا من M2 خصائص مضادة للالتهابات في الغالب4. الضامة يمكن التبديل بشكل حيوي بين هذين النمطين الظاهريين الرئيسيين اعتمادا على التمثيل الغذائي الخلوي، مع الأنواع الفرعية المتوسطة وجود كل من الصفات الالتهابية والمضادة للالتهابات5. يمثل TAM مجموعة غير متجانسة من كلا النمطين الظاهريين. ومع ذلك ، فإن وظيفة تعزيز الورم وضعف التكهن في أنواع مختلفة من السرطانات ترتبط بشكل خاص بال الضامة الشبيهة ب M26و7و8.
الملامح الوظيفية لل الضامة وتفاعلها مع الخلايا الأخرى داخل البيئة الدقيقة الورم معقدة وصعبة لالتقاط في بيئة متغيرة باستمرار خلال تطور الورم المستمر. يمكن أن توفر خطوط الخلية مجموعة خلايا متجانسة مع قابلية مستقرة للحياة في الثقافة ، والتي يمكن أن تسهل عملية إظهار آليات خلوية وبين الخلايا المحددة. خط الخلية THP-1 الشبيه بالخلايا الأحادية هو نظام نموذج مشروع للخلايا الأحادية البشرية الأولية9. وقد تم الحصول على هذا الخط الخلية خلدت تلقائيا من الدم المحيطي لطفل رضيع يبلغ من العمر سنة واحدة مع سرطان الدم الأحادي الحاد9,10. تم الإبلاغ عن التمايز والاستقطاب من خلايا THP-1 من قبل العديد من الدراسات وتم تنفيذها بطرق مختلفة متعددة11،12،13،14. التنشيط ، وبالتالي ، فإن استقطاب الضامة إلى النمط الظاهري الشبيه ب M1 يتبعه آلية ارتداد تعويضية مضادة للالتهابات ، وتعزيز النمط الظاهري الشبيه ب M2 من خلال السيتوكينات التي تنتجها الضامة الالتهابية ، مثل interleukin 6 (IL-6) أو15،16. قد يكون هذا بمثابة آلية كسر لتوهين استجابة التهابية زائدة بعد تنشيط الخلية17. عملية التفريق والاستقطاب monocytes و THP-1 الخلايا الأحادية مثل في النمط الظاهري المضادة للالتهابات M2 مثل هو في حد ذاته يرافقه أيضا المحفزات الموالية للالتهابات التي يجب التغلب عليها. يمكن أن يكون سبب استجابة السيتوكين الالتهابي الإجهاد الميكانيكي18، مثل تغيير الوسائط لإعادة تغذية الخلايا ، أو إضافة مركبات كيميائية للتمييز بين خلايا THP-1 ، مثل phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ، والحث على إنتاج عامل نخر الورم α (TNFα) ، إنترلوكين 1β (IL-1β) أو IL-619. هذا تغيير التشكيل الجانبي التعبير السيتوكين كاستجابة لPMA يمكن أن تؤثر على ومنع الاستقطاب الضامة اللاحقة20. فترات الراحة الكافية، كما ذكرت من قبل بعد العلاج PMA، تسمح لهذه الاستجابات الالتهابية لتقليل وتسهيل استقطاب الخلايا إلى النمط الظاهري M2 مثلمتميزة 21.
يوضح هذا البروتوكول طريقة لتمييز واستقطاب الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 إلى نمط الظاهري الشبيه ب M2 من الضامة في غضون 14 يوما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة على الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول في الشكل 1. تم شراء خط خلايا سرطان الدم البشري الشبيه بالخلايا الأحادية THP-1. تم إجراء تحليل تكرار ترادفي قصير لمصادقة خط الخلية THP-1. تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة. ينمو خط الخلية أحادية الكيسة THP-1 في التعليق ولا يلتصق بأسطح زراعة الخلايا. يمكن أن يحدث الالتزام عن طريق التمييز بين الخلايا الأحادية في خلايا تشبه الضامة من خلال ، على سبيل المثال ، الإجهاد الميكانيكي أو علاج محدد مع PMA.
1. زراعة وصيانة الخلايا التي تشبه الخلايا الأحادية THP-1
- تعيين مؤقت لمدة 150 ثانية. إزالة القارورة المجمدة التي تحتوي على خط الخلية THP-1(جدول المواد)من النيتروجين السائل وتذوب على الفور في حمام مياه نظيفة (37 درجة مئوية). بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت بمجرد وضع القارورة في حمام الماء. تخفيف الغطاء للافراج عن الضغط الذي يتراكم بسبب عملية ذوبان ولكن تأكد من أن فتح أنبوب لا يتصل بالماء، لتجنب التلوث. الفترة الزمنية المثلى لإذابة الخلايا تقع بين 120-150 s. مواصلة ذوبان تعليق الخلية حتى يتم ترك رقاقة الجليد من حجم حوالي 4 ملم داخل القارورة. ثم انتقل إلى الخطوة التالية فورا.
- نقل المرحلة السائلة من تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 9 مل من وسائل الإعلام الدافئة (37 درجة مئوية) النمو(جدول المواد). ثم، نقل 1 مل من تعليق الخلايا المتوسطة الدافئة في قارورة THP-1 والعودة إلى أنبوب 15 مل لإذابة رقاقة الثلج المتبقية وتدفق القارورة لضمان عدم ترك أي خلايا وراءها.
- اخلط التعليق برفق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع ماصة 1000 ميكرولتر. إزالة عينة صغيرة (حوالي 10 ميكرولتر) لحساب الخلايا من أجل البقاء (باستخدام تريبان الأزرق للاستبعاد) في حين أنها نسج. قم بتدفير تعليق الخلية الدافئ عند 200 × ز لمدة 7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إزالة supernatant تماما وإعادة الإنفاق مع حجم معين من المتوسطة النمو الدافئ لتحقيق كثافة الخلية من 5 × 105/ مل. مزيج تعليق بلطف ونقل 22 مل من حجم في قوارير T-75 ثقافة الخلية (جدول المواد). تخزين قوارير تستقيم في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2)تركيز. تبادل وسائل الإعلام النمو كل 3-4 أيام.
2. البذر من THP-1 الخلايا والتمايز في الضامة M0
- إعداد الخلية التي تحتوي على متوسط النمو مع كثافة الخلية المعنية لخلايا البذور في كثافة 3 × 105/ مل / جيدا في لوحات ثقافة الخلية 24 جيدا (جدول المواد). مزيج المتوسطة بلطف وإعداد aliquots من 26 مل، وضعت كل في أنبوب 50 مل. استخدام كل 26 مل aliquot لزرع الخلايا في لوحة كل منها.
- نقل 1 مل من الوسط المحتوي على الخلية إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. امزج الوسائط برفق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا بين عمليات النقل.
- إعداد حل المخزون من PMA (حل 1 ملغ من PMA في 100 ميكرولتر من ديميثيل سلفوإكسيد (DMSO) = ~ 16 ملم حل PMA في DMSO) وتمييعه مع الفوسفات البارد العازلة المالحة (PBS) إلى تركيز العمل النهائي من 10 نانوغرام / ميكرول الحق قبل علاج الخلية(جدول المواد). الحفاظ على الحل على الجليد واستخدامه على الفور. لا تقم بإعادة التجميد. إضافة 100 نانوغرام من PMA لكل بئر. دع كل لوحة خلوية تجلس في الحاضنة دون أي علاج آخر لمدة 72 ساعة.
- بعد 72 ساعة، وإزالة المتوسطة النمو واستبداله مع 1 مل من متوسط النمو الطازج. لا تلمس الجزء السفلي من الآبار مع نصائح ماصة. دع الخلايا ترتاح لمدة 96 ساعة أخرى في الحاضنة.
- بعد 96 ساعة، كرر الخطوة 2.4 (تغيير الوسائط) والسماح للخلايا بقية لمدة 24 ساعة أخرى.
ملاحظة: الضامة M0 جاهزة الآن لاستخدامها في التجارب (الشكل 2). مباشرة قبل علاج الخلايا كجزء من مزيد من التجارب, النظر في تغيير وسائل الإعلام مع RPMI فقط (جدول المواد) منذ نمو وسائل الإعلام ملاحق يمكن أن يسبب التدخل مع الكواشف التي تضاف لعلاج الخلايا. في حالة الحاجة إلى الضامة M2-like، انتقل إلى القسم 3.
3. استقطاب الضامة M0 إلى الضامة M2 مثل
- إعداد محلول المخزون من IL-4 و IL-13 (حل 20 ميكروغرام من IL-4 أو IL-13 في 200 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز) وتمييعه إلى تركيز عمل نهائي من 2 نانوغرام / ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني مباشرة قبل علاج الخلية. الحفاظ على الحل على الجليد واستخدامه على الفور. لا تقم بإعادة التجميد.
- إزالة متوسط النمو واستبداله مع 1 مل من متوسط النمو الطازج. إضافة 20 نانوغرام من إنترلوكين 4 (IL-4) و 20 نانوغرام من إنترلوكين 13 (IL-13) لكل بئر. دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
- بعد 48 ساعة، كرر الخطوة 3.2. دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة أخرى في الحاضنة.
- إزالة متوسط النمو واستبداله مع 1 مل من متوسط النمو الطازج. دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
ملاحظة: الضامة M2 تشبه الآن جاهزة للاستخدام للتجارب (الشكل 2). مباشرة قبل التعامل مع الخلايا كجزء من مزيد من التجارب, النظر في تغيير وسائل الإعلام مع RPMI فقط (جدول المواد) منذ نمو وسائل الإعلام ملاحق يمكن أن يسبب التدخل.
4. فصل وحصاد الضامة لتدفق قياس الخلايا
ملاحظة: استخدم طريقة ميكانيكية تجمع بين الصدمة الباردة وكشط الخلايا لفصل وحصاد الضامة المستقطبة من لوحات لقياس التدفق الخلوي.
- إزالة المتوسطة الخلية الدافئة واستبداله بمزيج من الجليد الباردة PBS (دون الكالسيوم والمغنيسيوم) و 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 1 مل لكل بئر. مباشرة بعد هذا، ضع لوحة الخلية على الجليد لمدة 45 دقيقة. لا تضع لوحة الخلية على الجليد قبل إزالة وسط الخلية الدافئة ، لأن هذا سيقلن من صلاحية الخلية بشكل كبير. إبقاء الخلايا على الجليد فقط بعد إحداث صدمة باردة مع الجليد الباردة PBS/5٪ خليط FBS.
- بعد 45 دقيقة على الجليد، كشط قبالة الخلايا باستخدام كاشطات الخلاياالمصغرة( جدول المواد ). نقل بلطف الضامة منفصلة في برنامج تلفزيوني الباردة / 5٪ FBS في أنبوب 15 مل. إبقاء الأنبوب على الجليد في جميع الأوقات حتى يتم تلطيخ الخلايا.
ملاحظة: تجمع ثمانية آبار من الخلايا للوصول إلى عدد الخلايا الكافية للتلطيخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم توصيف الضامة الشبيهة ب M2 ، وتم التحقق من صحة M2-الاستقطاب باستخدام قياس التدفق الخلوي لعلامات مجموعة التمايز (CD) CD14 و CD11b و CD80 (علامة تشبه M1) و CD206 (علامة تشبه M2). تم إجراء تلطيخ قياس التدفق الخلوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم غسل الضامة مع PBS /5٪ FBS واحتضانها مع كتلة مستقبلات Fcγ لتجنب الربط غير المحدد. ثم لطخت الخلايا مع FITC-المقترنة الماوس المضادة للإنسان CD14 وCD80 الأجسام المضادة، مع PE-المقترنة الماوس المضادة للأجسام المضادة CD11b الإنسان، ومع PE-جنبا إلى جنب الماوس المضادة للإنسان CD206 الأجسام المضادة وImG isotype مطابقة (جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي بأربعة ألوان وكمية الفلورية. وقد أجري غاتينغ الخلايا، باستثناء حطام الخلايا وفقا للتشتت إلى الأمام والتشتت الجانبي.
تم التعبير عن علامات monocyte وماكروفاج CD14 و CD11b في 70.9٪ و 74.7٪ من الخلايا، على التوالي (الشكل 3). وأظهرت الخلايا تقريبا أي الإيجابية لCD80 علامة M1 مثل (0.2٪) ومستويات سطح عالية من علامة M2 مثل CD206 في 62.6٪ من الخلايا(الشكل 4).
الماكروفاجيس المستمدة من أسلوب الاستقطاب الموضحة في هذا البروتوكول إظهار التعبير عن CD14 وكذلك علامات CD11b. يمكن أن كلا علامات ولكن ليس من الضروري التعبير عنها في الضامة. ومن المتوقع الإيجابية واضحة لCD206 كعلامة الضامة M2 مثل، في حين أن مستوى التعبير CD80 كعلامة تشبه M1 ينبغي أن تكون منخفضة. أظهر راجي وآخرون نتائج مماثلة باستخدام خلايا الدم المحيطية أحادية النووية (PBMC) ، التي تم استقطابها إلى الضامة الشبيهة ب M222. وتراوح متوسط التعبير عن CD206 بين 50٪ إلى 60٪، في حين تراوح متوسط التعبير عن CD80 بين 20٪ إلى 25٪22.
تم إجراء توصيف إضافي للكوافير M2 التي أنشأها هذا البروتوكول باستخدام PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). وأظهرت الضامة M2 مثل upregulation من IL-6 و C-X-C عزر Chemokine Ligand 10 (CXCL10) بالمقارنة مع THP-1 خلايا تشبه الخلايا الأحادية، فضلا عن upregulation من علامات مضادة للالتهابات CD206، Interleukin 10 (IL-10) وC-C Motif Chemokine Ligand 18 (CCL18) (النتائج غير مبينة، ليتم نشرها).
الشكل 1:نظرة عامة على نموذج خط خلية الضامة M2.. في اليوم 0، يتم بذر الخلايا في لوحات مع متوسط النمو واحتضانها مع PMA لمدة 72 ساعة. في اليوم 3 واليوم 7 يتم تغيير متوسط الخلية، والذي يتيح للخلايا بقية دون PMA لما مجموعه 120 ساعة. في اليوم الثامن، يتم تغيير متوسط النمو مرة أخرى، ويتم احتضان الخلايا باستخدام IL-4 و IL-13 للحث على الاستقطاب الشبيه ب M2. تتكرر هذه الخطوة بعد يومين، في اليوم 10. في اليوم 12، يتم إجراء التغيير المتوسط الأخير، والخلايا M2 تشبه بقية في المتوسط النمو لمدة 48 ساعة أخرى قبل استخدامها للتجارب (PMA = phorbol 12-myristate-13-خلات; IL = إنترلوكين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:مورفولوجيا الخلايا لخلايا THP-1، الضامة المتمايزة (M0)، والكوائج الشبيهة ب M2 باستخدام المجهر الخفيف. تم بذر الخلايا في 3 × 105 لكل بئر في لوحة من 24 بئرا. (أ,ب) تظهر خلايا THP-1 عند خط الأساس. (C,D) تلقت الضامة M0 المتمايزة علاج PMA لمدة 72 ساعة ، وتغيير متوسط النمو وفترة راحة 96 ساعة. (E,F) تظهر الضامة الشبيهة ب M2 بعد الانتهاء من علاج الاستقطاب باستخدام IL-4 و Il-13 في اليوم 14 من نموذج الخلية هذا (التكبير 20x و 40x؛ المقياس = 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:تحليل فلوسيمتر مضان الخلايا لCD14 (FITC، FL1-H) وCD11b (PE، FL2-H). (A)كثافة مبعثر مؤامرة، وتظهر النسب المئوية للخلايا في كل ربع. (B, C) المدرجات التكرارية لCD14 و CD11b في الضامة M2 مثل مقارنة مع السيطرة السلبية تلطيخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:تحليل مضان قياس التدفق الخلوي لCD80 (FITC، FL1-H) وCD206 (PE-جنبا إلى جنب، FL3-H). (A) كثافة مبعثر مؤامرة، وتظهر النسب المئوية للخلايا في كل ربع. (B, C) المدرجات التكرارية لCD80 و CD206 في الضامة M2 مثل مقارنة مع السيطرة السلبية تلطيخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر هذا البروتوكول الخاص بتمايز واستقطاب الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 في غضون 14 يوما طريقة للحصول على الضامة ذات النمط الظاهري المتميز الشبيه ب M2 بسبب حضانة العلاج الطويلة للخلايا ذات فترات الراحة الكافية بين الخطوات.
بعض الخطوات هامة لهذا البروتوكول. مضاعفة الوقت من الخلايا الأحادية THP-1 هو ما يقرب من 26 ساعة. يمكن تقسيم الخلايا عند كثافة خلايا 9 × 105/mL ويجب أن تكون مصنفة بكثافة 3 × 105/ مل أثناء كل انقسام. يمكن إجراء الانقسام دون إزالة جميع الخلايا المستخدمة (القديمة) المتوسطة - إعادة تغذية الخلايا مع 50٪ فقط من المتوسط الطازج يمكن أن يؤدي في الواقع إلى نمو أسرع للخلايا لأن عوامل النمو في متوسط الخلية المكيفة يمكن أن تعزز الانتشار الخلوي. ومع ذلك، فإن عدم تبادل جميع وسائط الخلية يزيد من خطر تلوث الثقافة، وبالتالي لا ينبغي إجراؤه إلا خلال المقاطع الأولى من الخلايا المستزرعة حديثا. عد الخلايا مهم لتكون قادرة على زراعة الخلايا في الكثافة الصحيحة وتحديد الجدوى الخلوية بعد ذوبان الجليد. يجب ألا تتجاوز نسبة الخلايا الميتة بعد إذابة الخلايا بشكل صحيح 15٪.
يتطلب بذر الخلايا في لوحات خلط لطيف ولكن شامل لتعليق الخلية للحصول على كثافة خلية متسقة في كل بئر. يتم إعداد Aliquots قبل بذر الخلايا في لوحات الثقافة لضمان أن حجم الخلية التي تحتوي على الوسط مختلط بشكل صحيح. كما THP-1 monocytes في المتوسط تميل إلى الغرق إلى الجزء السفلي من قارورة، والخلط لطيف مستمر من حجم نقل أمر بالغ الأهمية لتحقيق كثافة متسقة من الخلايا.
يجب تسخين وسائط الخلية إلى 37 درجة مئوية في جميع الأوقات لتجنب الصدمات الباردة واستجابة الإجهاد الخلوي المؤيد للالتهابات23. لذلك ، أيضا للتغيرات في وسائل الإعلام وعلاج الخلايا ، لا ينبغي ترك لوحات من الحاضنة لأكثر من 15 دقيقة. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تبقى دائما على الجليد المركبات المعنية لعلاج الخلايا، مثل PMA، interleukins، وبرنامج تلفزيوني لتخفيف حلول المخزون قبل علاج الخلايا.
الضامة الحية التي تختلف عن monocytes عن طريق العلاج PMA تلتزم سطح الآبار. خلال التغييرات وسائل الإعلام وغيرها من خطوات العلاج الأخرى، نصائح ماصة لا ينبغي أن تلمس الجزء السفلي من بئر داخل لوحة لمنع تلف الخلايا.
لأداء قياس التدفق الخلوي مع الضامة المتمايزة أو المستقطبة ، يجب حصاد الخلايا المرفقة بالصفائح. هناك إما تقنيات انزيمية أو ميكانيكية لفصل الخلايا ، بما في ذلك التريبسينيز ، والعلاج بخليط الإنزيم مع النشاط البروتيوليك والكولاجينوليتيكي ، أو حمض الإيثيلينديامينتتراستيك (EDTA) ، أو الصدمة الباردة ، أو كشط الخلايا ، أو حتى الانفصال من خلال الضغط الصوتي24،25. مفرزة انزيمية من الضامة يمكن أن يؤدي إلى تغيير التعبير علامة سطح الخلية، وبالتالي ليس الخيار الأول للتحليلات الظاهري أو وظيفية25. وعلى النقيض من التقارير الأخرى، أظهرت التجارب التي أجريت هنا أن الجمع بين الصدمة الباردة وكشط الضامة أظهر قدرة جيدة على البقاء في الخلية (>90٪) باستخدام استبعاد صبغة تريبان الزرقاء. لذلك ، يوصى باستخدام هذه التقنية لفصل الخلايا ، مع التعليق التوضيحي أنه بمجرد حدوث صدمة باردة ، يجب الحفاظ على برودة الخلايا على الجليد في جميع الأوقات.
وهناك قيود على هذا البروتوكول هو استخدام خط الخلية مثل monocyte كأساس لمحاكاة آليات الضامة في الجسم الحي. دراسات ثقافة الخلية باستخدام الضامة الأولية، ومع ذلك، يمكن أن تظهر استجابات الخلوية المتغيرة وآليات يمكن أن تكون ملثمين بسبب تغايرية الخلية26. خط الخلية THP-1 هو نظام نموذج المنشأة ل monocytes الإنسان الأساسي9. نظرا لتجانس مجموعة خلايا THP-1 في بيئة ثقافية خاضعة للرقابة ، من المحتمل أن تكون الاستجابات الخلوية قابلة للاستنساخ بشكل أكثر دقة. وعلاوة على ذلك، بعض التقنيات تحسين THP-1 الخلايا كنموذج لتشبه monocytes الأولية. خطوة هامة هي فترة الراحة من 5 أيام بعد العلاج PMA، مما يزيد من حجم الخلايا البلاستيكية والالتزام سطح الخلية مماثلة لتلك التي من الخلايا المشتق منها أحاديةالخلية 21.
وهناك قيد آخر هو إنشاء نوع الظاهري الضامة M2 مثل معينة التي لها خصائص أخرى من الضامة M2 مثل التي استخدمت في الدراسات السابقة. وقد تم الإبلاغ عن العديد من التقنيات المختلفة للتمييز والاستقطاب THP-1 الخلايا، وعدم وجود توصيف خط الأساس يعقد الاستنساخ بين11و12و13و14. لذلك، من المهم توصيف الضامة المستخدمة في دراسة عند خط الأساس، اعتمادا على الآليات التي يتم التحقيق فيها. بعد ذلك ، يجب إثبات الاستجابات الخلوية بعد العلاج المعني.
الضامة M2 مثل التي تنتجها اتباع هذا البروتوكول هي أساس متين للتحقيق في الاستجابات الخلوية في بداية الورم والتقدم في أنواع مختلفة من السرطان، التئام الجروح، أو التليف. مع هذا البروتوكول، يمكن استخدام إما M0-الضامة أو M2-الضامة في المختبر،والخلايا هي مناسبة لاستخدامها في نماذج الزراعة المشتركة. وهذا يوفر مجموعة واسعة من التطبيقات من النمط الظاهري M2 تشبه M2 المتميزة التي يتم التحكم فيها بقوة في المختبر مع مرور الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
معهد برايس للبحوث الجراحية، جامعة لويز فيل، مدعوم ماليا من قبل جون دبليو برايس وباربرا قوة الدفع أتوود برايس ترست. ولم يكن لمصادر التمويل أي دور في تصميم الدراسة وتنفيذها وكذلك في جمع البيانات وإدارتها وتحليلها وتفسيرها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
