Summary
Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.
Abstract
Os macrófagos associados ao tumor (TAM) podem mudar sua expressão e perfil de citocina de acordo com estímulos externos. Essa notável plasticidade permite que a TAM se adapte às mudanças contínuas dentro do microambiente tumoral. Os macrófagos podem ter atributos principalmente pró-inflamatórios (semelhantes a M1) ou anti-inflamatórios (semelhantes a M2) e podem alternar continuamente entre esses dois estados principais. Macrófagos semelhantes a M2 no ambiente tumoral estão associados à progressão do câncer e ao prognóstico ruim em vários tipos de câncer. Muitos métodos diferentes para induzir diferenciação e polarização das células THP-1 são usados para investigar mecanismos celulares e intercelulares e os efeitos da TAM dentro do microambiente dos tumores. Atualmente, não há um modelo estabelecido para a polarização macrófago semelhante a M2 usando a linha celular THP-1, e os resultados de perfis de expressão e citocina de macrófagos devido a certos estímulos in vitro variam entre estudos. Este protocolo serve como orientação detalhada para diferenciar células semelhantes ao monócito THP-1 em macrófagos M0 e para polarizar ainda mais as células em um fenótipo semelhante a M2 dentro de 14 dias. Demonstramos as alterações morfológicas das células moncidas THP-1, macrófagos diferenciados e macrófagos polarizados semelhantes a M2 usando microscopia leve. Este modelo é a base para modelos de linha celular que investigam os efeitos anti-inflamatórios da TAM e suas interações com outras populações celulares do microambiente tumoral.
Introduction
Macrófagos associados ao tumor (TAM) e seu papel na inflamação crônica, o aparecimento do câncer e o desenvolvimento de tumores são alvos importantes em pesquisas recentes1,2. Monócitos sanguíneos periféricos que são recrutados para o microambiente tecidual do tumor em desenvolvimento se diferenciam em macrófagos e podem ser polarizados em dois subtipos principais de macrófagos3. O macrófago ativado clássicamente representa o fenótipo m1 principalmente pró-inflamatório e o subtipo alternativo ativado como M2 mostra características predominantemente anti-inflamatórias4. Os macrófagos podem alternar dinamicamente entre esses dois fenótipos principais dependendo do metabolismo celular, com subtipos intermediários com atributos inflamatórios e anti-inflamatórios5. A TAM representa uma população heterogênea de ambos os fenótipos. Uma função promotora de tumores e um prognóstico ruim em diferentes tipos de cânceres está, no entanto, particularmente associado aos macrófagos semelhantes a M26,7,8.
Os perfis funcionais de macrófagos e sua interação com outras células dentro do microambiente tumoral são complexos e desafiadores de capturar em um ambiente em constante mudança durante o desenvolvimento contínuo do tumor. As linhas celulares podem proporcionar uma população celular homogênea com viabilidade estável na cultura, o que pode facilitar o processo de demonstração de mecanismos celulares e intercelulares definidos. A linha celular THP-1 semelhante a monócitos é um sistema modelo legítimo para monócitos humanos primários9. Esta linha celular espontaneamente imortalizada foi obtida a partir do sangue periférico de uma criança de um ano de idade com leucemia monocítica aguda9,10. A diferenciação e polarização das células THP-1 têm sido relatadas por diversos estudos e têm sido realizadas de várias formas diferentes11,12,13,14. Ativação e, portanto, a polarização dos macrófagos em um fenótipo semelhante a M1 é seguida por um mecanismo de recuperação anti-inflamatória compensatória, promovendo um fenótipo semelhante a M2 através de citocinas produzidas por macrófagos inflamatórios, como a interleucina 6 (IL-6) ou a itacina15,16. Isso pode servir como um mecanismo de ruptura para atenuar uma resposta inflamatória exagerada após a ativaçãocelular 17. O processo de diferenciação e polarização de monócitos e células monocitos THP-1 em um fenótipo anti-inflamatório semelhante a M2 é também acompanhado por estímulos pró-inflamatórios que devem ser superados. Uma resposta inflamatória de citocinas pode ser causada por estresse mecânico18,como a mudança de mídia para realimentar as células, ou adicionar compostos químicos para diferenciar células THP-1, como phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA), e induzir a produção de fator de necrose tumoral α (TNFα), interleucina 1β (IL-1β) ou IL-619. Esse perfil de expressão de citocina alterado como resposta ao PMA pode afetar e prevenir a polarização do macrófago subsequente20. Períodos de descanso adequados, como relatado antes após o tratamento da PMA, permitem que essas respostas inflamatórias diminuam e facilitem a polarização celular em um fenótipo21distinto semelhante a M2 .
Este protocolo demonstra um método para diferenciar e polarizar células semelhantes ao monócito THP-1 em um fenótipo semelhante a M2 de macrófagos dentro de 14 dias.
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Protocol
NOTA: Uma visão geral das etapas descritas neste protocolo é mostrada na Figura 1. A linha celular de leucemia semelhante a monócitos humanos THP-1 foi comprada. A análise de repetição em tandem curto foi realizada para autenticar a linha celular THP-1. Realize todas as etapas em condições estéreis. A linha de células monocíticas THP-1 cresce em suspensão e não se prende a superfícies de cultura celular. A adesão pode ser induzida pela diferenciação de monócitos em células semelhantes a macrófagos através, por exemplo, estresse mecânico ou tratamento específico com PMA.
1. Culturação e manutenção de células semelhantes a monícitos THP-1
- Estabeleça um temporizador para 150 s. Remova o frasco congelado contendo a linha celular THP-1(Tabela de Materiais) do nitrogênio líquido e descongele-o imediatamente em um banho de água limpa (37 °C). Inicie o temporizador assim que o frasco for colocado no banho de água. Solte a tampa para liberar a pressão que está aumentando devido ao processo de descongelamento, mas certifique-se de que a abertura do tubo não entre em contato com a água, para evitar contaminação. O período ideal para descongelar as células está entre 120-150 s. Continue descongelando a suspensão da célula até que um chip de gelo do tamanho de cerca de 4 mm seja deixado dentro do frasco; em seguida, prossiga para o próximo passo imediatamente.
- Transfira a fase líquida da suspensão celular para um tubo de 15 mL contendo 9 mL de mídia de crescimento quente (37 °C)(Tabela de Materiais). Em seguida, transfira 1 mL da suspensão de células médias quentes para o frasco THP-1 e volte para o tubo de 15 mL para derreter o chip de gelo restante e lavar o frasco para garantir que nenhuma célula seja deixada para trás.
- Misture a suspensão suavemente por pipetar para cima e para baixo com uma pipeta de 1000 μL. Remova uma pequena amostra (aproximadamente 10 μL) para contar as células para viabilidade (usando azul trypan para exclusão) enquanto elas são giradas. Gire a suspensão da célula quente a 200 x g por 7 min a 37 °C.
- Remova o supernatante completamente e resuspend com um certo volume de meio de crescimento quente para alcançar uma densidade celular de 5 x 105/mL. Misture a suspensão suavemente e transfira 22 mL de volume em frascos de cultura celular T-75(Tabela de Materiais). Armazene frascos eretos em uma incubadora a 37 °C com concentração de 5% de dióxido de carbono (CO2). Troque a mídia de crescimento a cada 3-4 dias.
2. Semeadura de células THP-1 e diferenciação em macrófagos M0
- Prepare a célula contendo meio de crescimento com a respectiva densidade celular para células de sementes a uma densidade de 3 x 105/mL/bem em placas de cultura celular de 24 poços(Tabela de Materiais). Misture o meio suavemente e prepare alíquotas de 26 mL, cada uma colocada em um tubo de 50 mL. Use cada alíquota de 26 mL para semear as células em uma respectiva placa.
- Transfira 1 mL do meio contendo células em cada poço de uma placa de 24 poços. Misture a mídia suavemente, encanar para cima e para baixo entre as transferências.
- Prepare uma solução de estoque de PMA (dissolver 1 mg de PMA em 100 μL de Sulfóxido de Dimetila (DMSO) = ~16 mM solução de PMA em DMSO) e dilui-lo com salina tampão fosfato frio (PBS) para uma concentração final de trabalho de 10 ng/μL logo antes do tratamento celular(Tabela de Materiais). Mantenha a solução no gelo e use-a imediatamente. Não congele novamente. Adicione 100 ng de PMA por poço. Deixe cada placa de célula sentar na incubadora sem qualquer tratamento adicional por 72 h.
- Após 72 h, remova o meio de crescimento e substitua-o por 1 mL de meio de crescimento fresco. Não toque na parte inferior dos poços com pontas de pipeta. Deixe as células descansarem por mais 96 h na incubadora.
- Depois de 96 horas, repita o passo 2.4 (mudança de mídia) e deixe as células descansarem por mais 24h.
NOTA: Os macrófagos M0 estão agora prontos para serem usados para experimentos(Figura 2). Imediatamente antes de tratar as células como parte de outros experimentos, considere uma mudança de mídia apenas com RPMI(Tabela de Materiais),uma vez que suplementos de mídia de crescimento podem causar interferência com reagentes que são adicionados para tratamento celular. No caso de macrófagos semelhantes a M2 serem necessários, proceda com a seção 3.
3. Polarização de macrófagos M0 em macrófagos semelhantes a M2
- Prepare uma solução de estoque de IL-4 e IL-13 (dissolver 20 μg de IL-4 ou IL-13 em 200 μL de água sem nuclease) e dilui-a a uma concentração final de trabalho de 2 ng/μL com PBS imediatamente antes do tratamento celular. Mantenha a solução no gelo e use-a imediatamente. Não congele novamente.
- Remova o meio de crescimento e substitua-o por 1 mL de meio de crescimento fresco. Adicione 20 ng de interleucina 4 (IL-4) e 20 ng de interleucina 13 (IL-13) por poço. Deixe as células descansarem por 48 h na incubadora.
- Depois das 48h, repita o passo 3.2. Deixe as células descansarem por mais 48 h na incubadora.
- Remova o meio de crescimento e substitua-o por 1 mL de meio de crescimento fresco. Deixe as células descansarem por 48 h na incubadora.
NOTA: Macrófagos semelhantes a M2 estão agora prontos para serem usados para experimentos(Figura 2). Imediatamente antes de tratar as células como parte de outros experimentos, considere uma mudança de mídia apenas com RPMI(Tabela de Materiais),uma vez que suplementos de mídia de crescimento podem causar interferência.
4. Desapegar e colher macrófagos para citometria de fluxo
NOTA: Use um método mecânico que combine a queima de células e raspagem de células para se desprender e colher os macrófagos polarizados das placas para citometria de fluxo.
- Retire o meio da célula quente e substitua-o por uma mistura de PBS gelado (sem cálcio e magnésio) e 5% de soro bovino fetal (FBS), 1 mL por poço. Imediatamente depois disso, coloque a placa de célula no gelo por 45 minutos. Não coloque a placa celular no gelo antes que o meio da célula quente seja removido, uma vez que isso diminuirá significativamente a viabilidade celular. Mantenha as células no gelo somente depois de induzir choque frio com mistura de PBS/5% FBS gelada.
- Após 45 min no gelo, raspe as células usando mini raspadores de células(Tabela de Materiais). Transfira suavemente os macrófagos separados em PBS frio/5% FBS em um tubo de 15 mL. Mantenha o tubo no gelo o tempo todo até que as células estejam manchadas.
NOTA: Poça oito poços de células para atingir a contagem adequada de células para coloração.
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Representative Results
Macrófagos semelhantes a M2 foram caracterizados, e a polarização M2 foi validada usando citometria de fluxo para marcadores de cluster de diferenciação CD14, CD11b, CD80 (marcador semelhante a M1) e CD206 (marcador semelhante a M2). A coloração da citometria de fluxo foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Os macrófagos foram lavados com PBS/5% FBS e incubados com bloco de receptor de Fcγ para evitar ligação inespecífica. As células foram então manchadas com anticorpos anti-humanos de camundongos conjugados fitc e cd80, com anticorpos anti-humanos CD11b de camundongos conjugados pe-tandem, e com anticorpos anti-humanos CD206 de camundongos conjugados pe-tandem e IgG(Tabela de Materiais)por 30 min a 4 °C. Foram realizadas análises citométricas de fluxo de quatro cores e quantitação de fluorescência. Foi realizada a gating de células, excluindo detritos celulares de acordo com dispersão dianteira e dispersão lateral.
Os marcadores monócito e macrófago CD14 e CD11b foram expressos em 70,9% e 74,7% das células, respectivamente (Figura 3). As células não apresentaram quase nenhuma positividade para o marcador M1 CD80 (0,2%) e altos níveis de superfície do marcador M2-like CD206 em 62,6% das células(Figura 4).
Os macrófagos derivados do método de polarização descrito neste protocolo mostram a expressão de marcadores CD14 e CD11b. Ambos os marcadores podem, mas não têm que ser expressos em macrófagos. Uma clara positividade para CD206 como um marcador de macrófago semelhante a M2 é esperada, enquanto o nível de expressão CD80 como um marcador semelhante a M1 deve ser baixo. Raggi et al. demonstraram resultados semelhantes usando células mononucleares periféricas (PBMC), que foram polarizadas em macrófagos semelhantes a M222. A expressão média do CD206 variou entre 50%-60%, enquanto a expressão média do CD80 variou entre 20%-25%22.
Outra caracterização dos macrófagos semelhantes a M2 criados por este protocolo foi realizada utilizando-se de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Macrófagos semelhantes a M2 mostraram uma regulação de IL-6 e C-X-C Motif Chemokine Ligand 10 (CXCL10) em comparação com células semelhantes a monócitos THP-1, bem como uma regulação dos marcadores anti-inflamatórios CD206, Interleucina 10 (IL-10) e C-C Motif Chemokine Ligand 18 (CCL18) (resultados não mostrados, a serem publicados).
Figura 1: Visão geral do modelo de linha celular macrófago semelhante ao M2. No dia 0, as células são semeadas em placas com meio de crescimento e incubadas com PMA por 72 h. No dia 3 e dia 7 o meio celular é alterado, o que permite que as células descansem sem PMA por um total de 120 h. No dia 8, o meio de crescimento é alterado mais uma vez, e as células são incubadas com IL-4 e IL-13 para induzir a polarização semelhante a M2. Este passo se repete após 2 dias, no dia 10. No dia 12, é realizada a última alteração média, e as células semelhantes a M2 descansam no meio de crescimento por mais 48 h antes de serem utilizadas para experimentos (PMA = phorbol 12-myristate-13-acetato; IL = interleucina). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Morfologia celular de células THP-1, macrófagos diferenciados (M0) e macrófagos semelhantes a M2 usando microscopia leve. As células foram semeadas em 3 x 105 por poço em uma placa de 24 poços. (A,B) As células THP-1 são mostradas na linha de base. (C,D) Os macrófagos M0 diferenciados receberam tratamento PMA por 72h, variação média de crescimento e período de repouso de 96 h. (E,F) Os macrófagos semelhantes a M2 são mostrados após tratamento de polarização concluído com IL-4 e Il-13 no dia 14 deste modelo celular (ampliação de 20x e 40x; escala = 100 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de fluorescência de citometria de fluxo para CD14 (FITC, FL1-H) e CD11b (PE, FL2-H). (A) Gráfico de dispersão de densidade, porcentagens de células são mostradas em cada quadrante. (B,C) Os histogramas para CD14 e CD11b em macrófagos semelhantes a M2 em comparação com um controle de coloração negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise de fluorescência de citometria de fluxo para CD80 (FITC, FL1-H) e CD206 (PE-tandem conjugado, FL3-H). (A) Gráfico de dispersão de densidade, percentagens de células são mostradas em cada quadrante. (B,C) Os histogramas para CD80 e CD206 em macrófagos semelhantes a M2 em comparação com um controle de coloração negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo de diferenciação e polarização de células monocitos THP-1 dentro de 14 dias fornece um método para obter macrófagos com um fenótipo distinto semelhante a M2 devido à longa incubação de células com períodos de descanso adequados entre as etapas.
Certos passos são fundamentais para este protocolo. O tempo de duplicação dos monócitos THP-1 é de aproximadamente 26 h. As células podem ser divididas a uma densidade celular de 9 x 105/mL e devem ser semeadas a uma densidade de 3 x 105/mL durante cada divisão. A divisão pode ser realizada sem remover todo o meio celular usado (antigo) - realimentar as células com apenas 50% do meio fresco pode de fato levar a um crescimento celular mais rápido, pois fatores de crescimento no meio celular condicionado podem aumentar a proliferação celular. A não troca de todos os meios celulares, no entanto, aumenta o risco de contaminação cultural e, portanto, só deve ser realizada durante as primeiras passagens de células recém-cultivadas. Contar as células é importante para poder cultivar células na densidade certa e determinar a viabilidade celular após o descongelamento. A proporção de células mortas após o descongelamento das células corretamente não deve exceder 15%.
A semeadura das células em placas requer uma mistura suave, mas completa da suspensão celular, para obter uma densidade celular consistente em cada poço. As alíquotas são preparadas antes de semear as células em placas de cultura para garantir que o volume do meio que contém células seja misturado corretamente. Como os monócitos THP-1 no meio tendem a afundar-se ao fundo de um frasco, a mistura suave contínua do volume de transferência é crucial para alcançar uma densidade consistente de células.
A mídia celular deve ser aquecida a 37 °C o tempo todo para evitar choques frios e uma resposta de estresse celular pró-inflamatória23. Portanto, também para alterações de mídia e tratamento celular, as placas não devem ficar de fora da incubadora por mais de 15 minutos. Além disso, os respectivos compostos para tratamento celular, como PMA, interleucinas e PBS para diluir soluções de estoque antes do tratamento das células, devem ser sempre mantidos no gelo para evitar a degradação.
Macrófagos vivos que se diferenciam dos monócitos pelo tratamento pma aderem à superfície dos poços. Durante as alterações da mídia e outras etapas adicionais de tratamento, as pontas de pipeta não devem tocar na parte inferior de um poço dentro da placa para evitar danos celulares.
Para a realização da citometria de fluxo com macrófagos diferenciados ou polarizados, as células que estão presas às placas devem ser colhidas. Existem técnicas enzimáticas ou mecânicas para desprender células, incluindo trippsinização, tratamento com misturas enzimáticas com atividade proteolítica e colagenoítica, ou ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA), choque frio, raspagem celular ou mesmo desprendimento através da pressão acústica24,25. O descolamento enzimático dos macrófagos pode levar à expressão alterada do marcador de superfície celular e, portanto, não é a primeira escolha para análises fenotípicas ou funcionais25. Em contraste com outros relatos, os experimentos realizados aqui mostraram que a combinação de frio chocante e raspagem de macrófagos mostrou boa viabilidade celular (>90%) usando a exclusão de corante Trypan Blue. Portanto, recomenda-se usar essa técnica para desprender as células, com a anotação de que uma vez que um choque frio é induzido, as células têm que ser mantidas frias no gelo o tempo todo.
Uma limitação deste protocolo é o uso de uma linha celular semelhante a monócitos como base para imitar mecanismos de macrófago in vivo. Estudos de cultura celular usando macrófagos primários, no entanto, podem mostrar respostas celulares variáveis e mecanismos podem ser mascarados devido à heterogeneidade celular26. A linha celular THP-1 é um sistema de modelo estabelecido para monócitos humanos primários9. Devido à população homogênea de células THP-1 em um ambiente de cultura controlada, as respostas celulares são potencialmente mais precisamente reprodutíveis. Além disso, certas técnicas otimizam as células THP-1 como modelo para se assemelhar a monócitos primários. Um passo importante é o período de repouso de 5 dias após o tratamento pma, que aumenta o volume citoplasmático e a adesão da superfície celular semelhante à das células diferenciadas derivadas do moncida21.
Outra limitação é a criação de um certo fenótipo de macrófago semelhante a M2 que tenha outras características além de macrófagos semelhantes a M2 que foram usados em estudos anteriores. Muitas técnicas diferentes para diferenciar e polarizar células THP-1 foram relatadas, e a falta de caracterização da linha de base complica a reprodutibilidade interstudy11,12,13,14. Por isso, é importante caracterizar os macrófagos utilizados em um estudo na linha de base, dependendo dos mecanismos que são investigados. Depois disso, as respostas celulares após um respectivo tratamento devem ser demonstradas.
Os macrófagos semelhantes a M2 produzidos seguindo este protocolo são uma base sólida para a investigação de respostas celulares no aparecimento e progressão do tumor em diferentes tipos de cânceres, cicatrização de feridas ou fibrose. Com este protocolo, m0-macrófagos ou macrófagos M2 podem ser usados in vitro, e as células são adequadas para serem usadas em modelos de cocultura. Isso fornece uma grande variedade de aplicações de um fenótipo de macrófago distinto semelhante ao M2 que é robustamente controlado in vitro ao longo do tempo.
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Disclosures
Os autores não declaram potenciais conflitos de interesse.
Acknowledgments
O Price Institute of Surgical Research, Universidade de Louisville, é apoiado financeiramente pela John W. Price e Barbara Thruston Atwood Price Trust. As fontes de financiamento não tiveram papel na concepção e condução do estudo, bem como na coleta, gestão, análise e interpretação dos dados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
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