Summary
M2-achtige tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) zijn geassocieerd met tumorprogressie en slechte prognose bij kanker. Dit protocol dient als een gedetailleerde gids om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen reproduceerbaar te differentiëren en te polariseren in M2-achtige macrofagen. Dit model is de basis om de ontstekingsremmende effecten van TAM in de tumormicro-omgeving te onderzoeken.
Abstract
Tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) kunnen hun expressie en cytokineprofiel veranderen op basis van externe stimuli. Deze opmerkelijke plasticiteit stelt TAM in staat zich aan te passen aan voortdurende veranderingen in de micro-omgeving van de tumor. Macrofagen kunnen voornamelijk pro-inflammatoire (M1-achtige) of ontstekingsremmende (M2-achtige) eigenschappen hebben en kunnen voortdurend schakelen tussen deze twee hoofdtoestanden. M2-achtige macrofagen in de tumoromgeving worden geassocieerd met kankerprogressie en slechte prognose bij verschillende soorten kanker. Veel verschillende methoden voor het induceren van differentiatie en polarisatie van THP-1-cellen worden gebruikt om cellulaire en intercellulaire mechanismen en de effecten van TAM in de micro-omgeving van tumoren te onderzoeken. Momenteel is er geen vastgesteld model voor M2-achtige macrofaagpolarisatie met behulp van de THP-1-cellijn en de resultaten van expressie- en cytokineprofielen van macrofagen als gevolg van bepaalde in vitro stimuli variëren tussen studies. Dit protocol dient als gedetailleerde leidraad om THP-1 monocytachtige cellen te differentiëren in M0-macrofagen en om cellen binnen 14 dagen verder te polariseren tot een M2-achtig fenotype. We demonstreren de morfologische veranderingen van THP-1 monocytachtige cellen, gedifferentieerde macrofagen en gepolariseerde M2-achtige macrofagen met behulp van lichtmicroscopie. Dit model is de basis voor cellijnmodellen die de ontstekingsremmende effecten van TAM en hun interacties met andere celpopulaties van de tumormicro-omgeving onderzoeken.
Introduction
Tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) en hun rol bij chronische ontsteking, het begin van kanker en tumorontwikkeling zijn belangrijke doelen in recent onderzoek1,2. Perifere bloedmonocyten die worden gerekruteerd naar de weefselmicro-omgeving van de zich ontwikkelende tumor differentiëren in macrofagen en kunnen worden gepolariseerd in twee hoofdsubtypen van macrofagen3. De klassiek geactiveerde macrofaag vertegenwoordigt het voornamelijk pro-inflammatoire M1-achtige fenotype en het alternatief geactiveerde M2-achtige subtype vertoont overwegend ontstekingsremmende kenmerken4. Macrofagen kunnen dynamisch schakelen tussen deze twee belangrijkste fenotypen, afhankelijk van hun cellulaire metabolisme, waarbij intermediaire subtypen zowel inflammatoire als ontstekingsremmende eigenschappen hebben5. TAM vertegenwoordigt een heterogene populatie van beide fenotypen. Een tumorbevorderende functie en slechte prognose bij verschillende soorten kanker wordt echter vooral geassocieerd met M2-achtige macrofagen6,7,8.
De functionele profielen van macrofagen en hun interactie met andere cellen in de micro-omgeving van de tumor zijn complex en uitdagend om vast te leggen in een voortdurend veranderende omgeving tijdens de voortdurende tumorontwikkeling. Cellijnen kunnen een homogene celpopulatie bieden met een stabiele levensvatbaarheid in cultuur, wat het proces van het aantonen van gedefinieerde cellulaire en intercellulaire mechanismen kan vergemakkelijken. De monocyt-achtige THP-1 cellijn is een legitiem modelsysteem voor primaire menselijke monocyten9. Deze spontaan vereeuwigde cellijn is verkregen uit het perifere bloed van een eenjarig kind met acute monocytische leukemie9,10. De differentiatie en polarisatie van THP-1-cellen zijn gemeld door verschillende studies en zijn op meerdere verschillende manieren uitgevoerd11,12,13,14. Activering en daarom de polarisatie van macrofagen in een M1-achtig fenotype wordt gevolgd door een compenserend ontstekingsremmend reboundmechanisme, dat een M2-achtig fenotype bevordert via cytokines geproduceerd door inflammatoire macrofagen, zoals interleukine 6 (IL-6) of itaconate15,16. Dit kan dienen als een pauzemechanisme om een overschietende ontstekingsreactie na celactivering tedempen 17. Het proces van het differentiëren en polariseren van monocyten en THP-1 monocytachtige cellen tot een ontstekingsremmend M2-achtig fenotype gaat zelf ook gepaard met pro-inflammatoire stimuli die moeten worden overwonnen. Een inflammatoire cytokinerespons kan worden veroorzaakt door mechanische stress18, zoals het veranderen van media om de cellen te voeden, of het toevoegen van chemische verbindingen om THP-1-cellen te differentiëren, zoals phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA), en induceert de productie van tumornecrosefactor α (TNFα), interleukine 1β (IL-1β) of IL-619. Dit veranderde cytokine-expressieprofiel als reactie op PMA kan latere macrofaagpolarisatie beïnvloeden en voorkomen20. Adequate rustperioden, zoals gemeld vóór na PMA-behandeling, zorgen ervoor dat deze ontstekingsreacties verminderen en celpolarisatie vergemakkelijken tot een duidelijk M2-achtig fenotype21.
Dit protocol demonstreert een methode om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen te differentiëren en te polariseren tot een M2-achtig fenotype van macrofagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Een overzicht van de stappen die in dit protocol worden beschreven, wordt weergegeven in figuur 1. De menselijke monocyt-achtige leukemie cellijn THP-1 werd gekocht. Korte tandemherhalingsanalyse werd uitgevoerd om de THP-1-cellijn te verifiëren. Voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden. De THP-1 monocytische cellijn groeit in suspensie en hecht zich niet aan celkweekoppervlakken. Hechting kan worden geïnduceerd door monocyten te differentiëren in macrofaagachtige cellen door bijvoorbeeld mechanische stress of specifieke behandeling metPMA.
1. Kweken en onderhouden van THP-1 monocytachtige cellen
- Stel een timer in voor 150 s. Verwijder de bevroren injectieflacon met de THP-1 cellijn(Tabel van materialen)uit de vloeibare stikstof en ontdooi deze onmiddellijk in een schoonwaterbad (37 °C). Start de timer zodra de injectieflacon in het waterbad is gedaan. Maak de dop los om de druk los te laten die zich opbouwt als gevolg van het ontdooiproces, maar zorg ervoor dat de buisopening niet in contact komt met het water, om verontreiniging te voorkomen. De optimale tijdsperiode voor het ontdooien van de cellen ligt tussen 120-150 s. Ga door met het ontdooien van de celsuspensie totdat een ijschip ter grootte van ongeveer 4 mm in de injectieflacon achterblijft; ga vervolgens onmiddellijk door naar de volgende stap.
- Breng de vloeibare fase van de celsuspensie over in een buis van 15 ml met 9 ml warme (37 °C) groeimedia(tabel met materialen). Breng vervolgens 1 ml van de warme mediumcelsuspensie over in de THP-1-injectieflacon en terug in de buis van 15 ml om de resterende ijschip te smelten en de injectieflacon te spoelen om ervoor te zorgen dat er geen cellen achterblijven.
- Meng de suspensie voorzichtig door op en neer te pipetteren met een pipet van 1000 μL. Verwijder een klein monster (ongeveer 10 μL) om de cellen te tellen op levensvatbaarheid (met trypan blue voor uitsluiting) terwijl ze worden gesponnen. Draai de suspensie van de warme cel gedurende 7 minuten bij 37 °C op 200 x g.
- Verwijder het supernatant volledig en resuspend met een bepaald volume warm groeimedium om een celdichtheid van 5 x 105/ ml te bereiken. Meng de suspensie voorzichtig en breng 22 ml volume over in T-75 celkweekkolven(Materialentabel). Bewaar kolven rechtop in een incubator bij 37 °C met een concentratie van 5% kooldioxide (CO2). Wissel de groeimedia om de 3-4 dagen uit.
2. Zaaien van THP-1-cellen en differentiatie in M0-macrofagen
- Bereid de cel met groeimedium met de respectieve celdichtheid voor zaadcellen met een dichtheid van 3 x 105/ ml / goed in 24-well celkweekplaten(Tabel met materialen). Meng het medium voorzichtig en bereid aliquots van 26 ml, elk in een buis van 50 ml. Gebruik elke 26 ml aliquot voor het zaaien van de cellen in een respectievelijke plaat.
- Breng 1 ml van het celbevattende medium over in elke put van een plaat met 24 putten. Meng de media voorzichtig door tussen de overdrachten op en neer te pipetteren.
- Bereid een stamoplossing van PMA (los 1 mg PMA op in 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO) = ~ 16 mM oplossing van PMA in DMSO) en verdun deze met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindwerkconcentratie van 10 ng / μL vlak voor celbehandeling (Tabel met materialen). Houd de oplossing op ijs en gebruik deze onmiddellijk. Niet opnieuw invriezen. Voeg 100 ng PMA per put toe. Laat elke celplaat 72 uur in de couveuse zitten zonder verdere behandeling.
- Verwijder na 72 uur het groeimedium en vervang het door 1 ml vers groeimedium. Raak de bodem van de putten niet aan met pipetpunten. Laat de cellen nog 96 uur rusten in de couveuse.
- Herhaal na 96 uur stap 2.4 (mediaverandering) en laat de cellen nog 24 uur rusten.
OPMERKING: De M0-macrofagen zijn nu klaar om te worden gebruikt voor experimenten(figuur 2). Onmiddellijk voorafgaand aan de behandeling van de cellen als onderdeel van verdere experimenten, overweeg een mediaverandering met alleen RPMI (Tabel met materialen), omdat groeimediasupplementen interferentie kunnen veroorzaken met reagentia die worden toegevoegd voor celbehandeling. Indien M2-achtige macrofagen nodig zijn, gaat u verder met rubriek 3.
3. Polarisatie van M0-macrofagen in M2-achtige macrofagen
- Bereid een stamoplossing van IL-4 en IL-13 (los 20 μg IL-4 of IL-13 op in 200 μL nucleasevrij water) en verdun deze onmiddellijk voorafgaand aan de celbehandeling tot een eindwerkconcentratie van 2 ng/μL met PBS. Houd de oplossing op ijs en gebruik deze onmiddellijk. Niet opnieuw invriezen.
- Verwijder het groeimedium en vervang het door 1 ml vers groeimedium. Voeg 20 ng interleukine 4 (IL-4) en 20 ng interleukine 13 (IL-13) per put toe. Laat de cellen 48 uur rusten in de couveuse.
- Herhaal stap 3.2 na 48 uur. Laat de cellen nog 48 uur rusten in de couveuse.
- Verwijder het groeimedium en vervang het door 1 ml vers groeimedium. Laat de cellen 48 uur rusten in de couveuse.
OPMERKING: M2-achtige macrofagen zijn nu klaar om te worden gebruikt voor experimenten(figuur 2). Onmiddellijk voorafgaand aan de behandeling van de cellen als onderdeel van verdere experimenten, overweeg een mediaverandering met alleen RPMI (Tabel met materialen), omdat groeimediasupplementen interferentie kunnen veroorzaken.
4. Losmaken en oogsten van macrofagen voor flowcytometrie
OPMERKING: Gebruik een mechanische methode die koud schokken en celschrapen combineert om de gepolariseerde macrofagen van platen los te maken en te oogsten voor flowcytometrie.
- Verwijder het warme celmedium en vervang het door een mengsel van ijskoud PBS (zonder calcium en magnesium) en 5% foetaal runderserum (FBS), 1 ml per put. Plaats direct hierna de celplaat gedurende 45 minuten op ijs. Plaats de celplaat niet op ijs voordat het warme celmedium is verwijderd, omdat dit de levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk zal verminderen. Houd de cellen alleen op ijs na het induceren van koude schokken met ijskoud PBS / 5% FBS-mengsel.
- Na 45 minuten op ijs, schraap de cellen af met behulp van mini-celschrapers(Table of Materials). Breng de losgemaakte macrofagen in koude PBS/5% FBS voorzichtig over in een buis van 15 ml. Houd de buis te allen tijde op ijs totdat de cellen gekleurd zijn.
OPMERKING: Pool acht putten van cellen om voldoende celtellingen voor kleuring te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
M2-achtige macrofagen werden gekarakteriseerd en M2-polarisatie werd gevalideerd met behulp van flowcytometrie voor Cluster of Differentiation markers (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1-achtige marker) en CD206 (M2-achtige marker). Flowcytometriekleuring werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Macrofagen werden gewassen met PBS/5% FBS en geïncubeerd met Fcγ-receptorblok om niet-specifieke binding te voorkomen. Cellen werden vervolgens gekleurd met FITC-geconjugeerde muis anti-humane CD14- en CD80-antilichamen, met PE-geconjugeerde muis anti-menselijke CD11b-antilichamen en met PE-tandem-geconjugeerde muis anti-humane CD206-antilichamen en isotype-gematchte IgG (Table of Materials) gedurende 30 minuten bij 4 °C. Vierkleurenstromingcytometrische analyse en fluorescentiekwantificering werden uitgevoerd. Gating van cellen werd uitgevoerd, met uitzondering van celresten volgens voorwaartse verstrooiing en zijverstrooiing.
De monocyten- en macrofaagmarkers CD14 en CD11b werden uitgedrukt in respectievelijk 70,9% en 74,7% van de cellen(figuur 3). Cellen vertoonden bijna geen positiviteit voor de M1-achtige marker CD80 (0,2%) en hoge oppervlakteniveaus van de M2-achtige marker CD206 in 62,6% van de cellen(figuur 4).
De macrofagen afgeleid van de polarisatiemethode die in dit protocol wordt beschreven, tonen de expressie van CD14- en CD11b-markers. Beide markers kunnen maar hoeven niet in macrofagen te worden uitgedrukt. Een duidelijke positiviteit voor CD206 als een M2-achtige macrofaagmarker wordt verwacht, terwijl het niveau van CD80-expressie als een M1-achtige marker laag zou moeten zijn. Raggi et al. toonden vergelijkbare resultaten met behulp van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC), die werden gepolariseerd in M2-achtige macrofagen22. De gemiddelde expressie van CD206 varieerde tussen 50% -60%, terwijl de gemiddelde expressie van CD80 varieerde tussen 20% -25%22.
Verdere karakterisering van de M2-achtige macrofagen gecreëerd door dit protocol werd uitgevoerd met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). M2-achtige macrofagen vertoonden een upregulatie van IL-6 en C-X-C Motif Chemokine Ligand 10 (CXCL10) in vergelijking met THP-1 monocyt-achtige cellen, evenals een upregulatie van de ontstekingsremmende markers CD206, Interleukin 10 (IL-10) en C-C Motif Chemokine Ligand 18 (CCL18) (resultaten niet getoond, te publiceren).
Figuur 1: Overzicht van het M2-achtige macrofaag cellijnmodel. Op dag 0 worden cellen in platen met een groeimedium gezaaid en gedurende 72 uur geïncubeerd met PMA. Op dag 3 en dag 7 wordt het celmedium veranderd, waardoor de cellen in totaal 120 uur zonder PMA kunnen rusten. Op dag 8 wordt het groeimedium opnieuw veranderd en worden cellen geïncubeerd met IL-4 en IL-13 om M2-achtige polarisatie te induceren. Deze stap wordt herhaald na 2 dagen, op dag 10. Op dag 12 wordt de laatste mediumverandering uitgevoerd en rusten M2-achtige cellen nog 48 uur in het groeimedium voordat ze worden gebruikt voor experimenten (PMA = phorbol 12-myristate-13-acetaat; IL = interleukine). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Celmorfologie van THP-1 cellen, gedifferentieerde (M0) macrofagen en M2-achtige macrofagen met behulp van lichtmicroscopie. Cellen werden gezaaid met 3 x 105 per put in een 24-well plaat. (A,B) THP-1-cellen worden weergegeven bij baseline. (C,D) De gedifferentieerde M0-macrofagen kregen PMA-behandeling gedurende 72 uur, groeimediumverandering en een rustperiode van 96 h. (E,F) De M2-achtige macrofagen worden getoond na voltooide polarisatiebehandeling met IL-4 en Il-13 op dag 14 van dit celmodel (20x en 40x vergroting; schaal = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Flowcytometrie fluorescentieanalyse voor CD14 (FITC, FL1-H) en CD11b (PE, FL2-H). (A) Dichtheidsverstrooiingsgrafiek, percentages cellen worden in elk kwadrant weergegeven. (B, C) De histogrammen voor CD14 en CD11b in M2-achtige macrofagen vergeleken met een negatieve kleuringscontrole. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Flowcytometrie fluorescentieanalyse voor CD80 (FITC, FL1-H) en CD206 (PE-tandemconjugaat, FL3-H). (A) Dichtheidsspreidingsgrafiek, percentages cellen worden weergegeven in elk kwadrant. (B, C) De histogrammen voor CD80 en CD206 in M2-achtige macrofagen vergeleken met een negatieve kleuringscontrole. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol voor het differentiëren en polariseren van THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen biedt een methode om macrofagen te verkrijgen met een duidelijk M2-achtig fenotype als gevolg van lange behandeling incubatie van cellen met voldoende rustperioden tussen stappen.
Bepaalde stappen zijn van cruciaal belang voor dit protocol. De verdubbelingstijd van THP-1 monocyten is ongeveer 26 uur. Cellen kunnen worden gesplitst met een celdichtheid van 9 x 105/ ml en moeten worden gezaaid met een dichtheid van 3 x 105/ ml tijdens elke splitsing. De splitsing kan worden uitgevoerd zonder al het gebruikte (oude) celmedium te verwijderen - het opnieuw voeden van de cellen met slechts 50% van het verse medium kan inderdaad leiden tot snellere celgroei omdat groeifactoren in geconditioneerd celmedium de cellulaire proliferatie kunnen bevorderen. Het niet uitwisselen van alle celmedia verhoogt echter het risico op kweekbesmetting en mag daarom alleen worden uitgevoerd tijdens de eerste passages van vers gekweekte cellen. Het tellen van de cellen is belangrijk om cellen met de juiste dichtheid te kunnen kweken en om de cellulaire levensvatbaarheid na het ontdooien te bepalen. Het aandeel dode cellen na het goed ontdooien van cellen mag niet hoger zijn dan 15%.
Het zaaien van cellen in platen vereist een zachte maar grondige menging van de celsuspensie om een consistente celdichtheid in elke put te verkrijgen. Aliquots worden bereid voordat de cellen in kweekplaten worden gezaaid om ervoor te zorgen dat het volume van het celbevattende medium goed wordt gemengd. Aangezien THP-1-monocyten in het medium de neiging hebben om naar de bodem van een injectieflacon te zinken, is het continue zachte mengen van het overdrachtsvolume cruciaal om een consistente dichtheid van cellen te bereiken.
Celmedia moeten te allen tijde worden opgewarmd tot 37 °C om koude schokken en een pro-inflammatoire cellulaire stressrespons te voorkomen23. Daarom mogen platen, ook voor mediaveranderingen en celbehandeling, niet langer dan 15 minuten uit de couveuse worden weggelaten. Bovendien moeten de respectieve verbindingen voor celbehandeling, zoals PMA, interleukine en de PBS voor het verdunnen van stamoplossingen voorafgaand aan de behandeling van de cellen, altijd op ijs worden gehouden om afbraak te voorkomen.
Levende macrofagen die zich onderscheiden van monocyten door PMA-behandeling hechten zich aan het oppervlak van de putten. Tijdens mediawisselingen en andere verdere behandelingsstappen mogen pipetpunten de bodem van een put in de plaat niet raken om celbeschadiging te voorkomen.
Voor het uitvoeren van flowcytometrie met gedifferentieerde of gepolariseerde macrofagen moeten de cellen die aan de platen zijn bevestigd, worden geoogst. Er zijn enzymatische of mechanische technieken om cellen los te maken, waaronder trypsinisatie, behandeling met enzymmengsels met proteolytische en collagenolytische activiteit, of ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), koude shock, celschrapen of zelfs loslating door akoestische druk24,25. Enzymatische loslating van macrofagen kan leiden tot veranderde expressie van het celoppervlak en is daarom niet de eerste keuze voor fenotypische of functionele analyses25. In tegenstelling tot andere rapporten toonden de hier uitgevoerde experimenten aan dat de combinatie van koud schokken en afschrapen van macrofagen een goede levensvatbaarheid van cellen vertoonde (>90%) met behulp van Trypan Blue kleurstofuitsluiting. Daarom wordt aanbevolen om deze techniek te gebruiken om de cellen los te maken, met de aantekening dat zodra een koudeschok wordt geïnduceerd, de cellen te allen tijde koud op ijs moeten worden gehouden.
Een beperking van dit protocol is het gebruik van een monocytachtige cellijn als basis om macrofaagmechanismen in vivo na te bootsen. Celkweekstudies met behulp van primaire macrofagen kunnen echter variabele cellulaire responsen aantonen en mechanismen kunnen worden gemaskeerd als gevolg van celheterogeniteit26. De THP-1 cellijn is een gevestigd modelsysteem voor primaire menselijke monocyten9. Vanwege de homogene THP-1-celpopulatie in een gecontroleerde kweekomgeving zijn cellulaire responsen mogelijk nauwkeuriger reproduceerbaar. Bovendien optimaliseren bepaalde technieken THP-1-cellen als een model om op primaire monocyten te lijken. Een belangrijke stap is de rustperiode van 5 dagen na PMA-behandeling, die het cytoplasmatische volume en de hechting van het celoppervlak verhoogt, vergelijkbaar met die van gedifferentieerde van monocyten afgeleide cellen21.
Een andere beperking is de creatie van een bepaald M2-achtig macrofaagfenotype dat andere kenmerken heeft dan M2-achtige macrofagen die in eerdere studies werden gebruikt. Er zijn veel verschillende technieken gemeld om THP-1-cellen te differentiëren en te polariseren, en een gebrek aan baselinekarakterisering bemoeilijkt de reproduceerbaarheid van interstudy11,12,13,14. Daarom is het belangrijk om de macrofagen te karakteriseren die in een studie bij baseline worden gebruikt, afhankelijk van de mechanismen die worden onderzocht. Daarna moeten de cellulaire reacties na een respectievelijke behandeling worden aangetoond.
De M2-achtige macrofagen geproduceerd door het volgen van dit protocol zijn een solide basis voor het onderzoek van cellulaire reacties bij het begin en de progressie van tumoren bij verschillende soorten kanker, wondgenezing of fibrose. Met dit protocol kunnen M0-macrofagen of M2-macrofagen in vitroworden gebruikt en zijn de cellen geschikt om te worden gebruikt in cocultuurmodellen. Dit biedt een breed scala aan toepassingen van een duidelijk M2-achtig macrofaagfenotype dat in de loop van de tijd robuust in vitro wordt gecontroleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen potentiële belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Het Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, wordt financieel ondersteund door de John W. Price en Barbara Thruston Atwood Price Trust. De financieringsbronnen speelden geen rol in de opzet en uitvoering van het onderzoek en in het verzamelen, beheren, analyseren en interpreteren van de gegevens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
References
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
